Le but de notre travail était l’étude des dysfonctions artérielle et musculaire dans des modèles d’agression aiguë et chronique puis l’évaluation de l’effet de la modulation pharmacologique du stress oxydant sur les anomalies vasculaires induites. Dans le modèle aigu de choc endotoxinique chez la souris, l’administration d’albumine humaine a permis d’augmenter leur survie, d’améliorer l’hyporéactivité vasculaire et la dysfonction endothéliale grâce à des propriétés ,concentration-dépendante, anti-oxydantes, modulatrices de l’inflammation, aboutissant à une diminution de l’expression de la NOS inductible et à une amélioration fonctionnelle et quantitative de la NOS endothéliale. L’administration chronique chez le rat de ciclosporine ou d’évérolimus induit une dysfonction endothéliale caractérisée par une altération de la voie de signalisation du NO et de l’EDHF et associée à une augmentation locale du stress oxydant. Au niveau musculaire cardiaque, seul l’évérolimus induit une augmentation de radicaux libres et une diminution de la respiration mitochondriale ventriculaire droite. L’administration préventive de polyphénols a permis, une amélioration de la composante EDHF de la dysfonction endothéliale, ciclosporine-induite, via une diminution de la surexpression de la NADPH oxydase et du stress oxydant vasculaire. Ainsi, le stress oxydant est une entité commune, impliquée dans la genèse de dysfonctions vasculaire et musculaire. Sa modulation par l’administration d’albumine ou de polyphénols a permis respectivement l’amélioration de l’hyporéactivité vasculaire du choc endotoxinique et de la dysfonction endothéliale dans nos deux modèles. / The aim of this work was to study the arterial and muscular dysfunctions in two rodent models of acute and chronic injuries, then the evaluation of pharmacological evaluation of oxidative stress on vascular abnormalities induced in these models.In the acute model, a mouse endotoxic shock, human serum albumin administration improved survival, endothelial dysfunction and reduced vascular hyporeactivity thanks to its concentration-dependant , anti-oxidative and anti-inflammatory properties, leading to a decrease of inductible NOS expression and an qualitative and quantitative increase of endothelial NOS.In the chronic model, rat’s administration of ciclopsorine and everolimus induced an endothelial dysfunction characterized by alterations of both NO and EDHF pathways and associated with an in situ oxidative stress. In the cardiac muscle, an increase of reactive oxygen species and a decrease of right ventricle mitochondrial respiratory chain complexes activities was observed only with everolimus. The preventive administration of polyphenols markedly increased the blunted EDHF component, but not the NO component, of the cyclosporine-induced endothelial dysfunction by reducing NADPH oxidase over expression and oxidative vascular stress. Finally, oxidative stress is a common entity, implicated in genesis of vascular and muscular dysfunctions. Its modulation by human albumin or polyphenols administration improves respectively arterial hyporeactivity of endotoxinic shock and endothelial dysfunction in our two models.

Le muscle squelettique a la capacité de se régénérer suite à une lésion grâce aux cellules satellites qui sont les cellules souches du muscle. Après dommage musculaire, les cellules satellites s’activent, prolifèrent, se différencient et fusionnent afin de reformer le muscle lésé. Cependant les cellules myogéniques ne sont pas les seules cellules impliquées dans la régénération musculaire. Des études précédentes réalisées au laboratoire ont montré chez la souris que les macrophages sont des cellules essentielles à la régénération musculaire. En effet, peu de temps après un dommage musculaire, les monocytes infiltrent le tissu lésé et se différencient en macrophages pro-inflammatoires Ly6Cpos (M1). Ces macrophages stimulent la prolifération des myoblastes et inhibent leur fusion. Puis les macrophages pro-inflammatoires changent de phénotype et deviennent des macrophages anti-inflammatoires Ly6Cneg (M2) qui stimulent la différenciation des myoblastes et les protègent de l’apoptose. Ainsi, en fonction de leur phénotype, les macrophages exercent des rôles trophiques séquentiels sur les myoblastes tout au long du processus de régénération musculaire. Dans la première partie de notre étude, nous montrons in vitro que les macrophages humains soutiennent les différentes étapes de la myogenèse. Les macrophages M1 sont fortement attirés par les myoblastes. De plus ils stimulent la prolifération des myoblastes et inhibent leur fusion. Les macrophages M2 attirent les myoblastes et stimulent leur différenciation permettant ainsi la formation de larges myotubes. En utilisant des anticorps bloquants spécifiques, nous avons identifié plusieurs molécules sécrétées par les macrophages régulant la myogenèse chez l’homme. Nos analyses in vivo chez l'homme confirment nos résultats obtenus in vitro. En effet, les macrophages M1 sont préférentiellement associés aux aires de régénération contenant des myoblastes non différenciés alors que les macrophages M2 sont associés aux aires de régénération contenant des myoblastes en différenciation. Dans un contexte de myopathie dégénérative, nous avons montré que les macrophages adoptent des phénotypes et des fonctions totalement différents des macrophages présents au cours de la régénération musculaire. Nous avons observé chez la souris et chez l’homme, que les macrophages exprimant des marqueurs M1 sont associés à la fibrose et qu’un traitement anti-inflammatoire réduit leur nombre dans le muscle dystrophique murin. Par isolement spécifique et cocultures ex vivo, nous avons montré qu'au cours de la régénération musculaire, les macrophages Ly6Cneg stimulent la production de collagène par les fibroblastes. A l'inverse au cours des myopathies dégénératives, ce sont les macrophages Ly6Cpos qui stimulent fortement l’établissement de la fibrose en agissant directement sur les fibroblastes. De plus, ces macrophages Ly6Cpos, qui régulent négativement les fibroblastes au cours de la régénération musculaire, stimulent la différenciation des fibroblastes et myofibroblastes dans les myopathies. De plus, ils les protègent de l'apoptose, participant ainsi à la persistance de ces cellules fibrosantes. Ainsi, nous avons confirmé chez l’homme in vitro et in vivo, le rôle de support séquentiel des macrophages au cours de la régénération musculaire. De plus, nous avons identifié différents effecteurs sécrétés par les macrophages M1 et M2 impliqués dans la régulation du processus myogénique chez l'adulte. Nous avons également montré que lors des myopathies dégénératives et au cours de la régénération musculaire, les macrophages adoptent un phénotype et des fonctions totalement différents, avec notamment un rôle profibrotique des macrophages pro-inflammatoires. / Skeletal muscle has the ability to regenerate after a chemical or physical injury thanks to satellite cells, the muscle stem cells. After damage, satellite cells proliferate, differentiate and fused to reform muscle. Myogenic cells are not the only on cells involved. Previous studies in the laboratory showed that, in mice, macrophages are crucial for skeletal muscle regeneration. Soon after an injury, macrophages infiltrate damaged muscle and differentiate into Ly6Cpos pro-inflammatory (M1) macrophages. They stimulate proliferation of myoblasts and inhibit their fusion. Then, pro-inflammatory macrophages skew towards a Ly6Cneg anti-inflammatory phenotype (M2). Anti-inflammatory macrophages stimulate differentiation of myoblasts and protect them from apoptosis. Thus, depending on their phenotype, macrophages exert sequential trophic roles on myoblasts throughout muscle regeneration. Here, we showed in vitro that human macrophages also support different steps of myogenesis. M1 macrophages are strongly attracted by mpcs. Moreover, they secrete molecules, which stimulate proliferation of mpcs and inhibit their fusion. M2 macrophages attract mpcs and stimulate differentiation of mpcs in order to form large myotubes. Using specific blocking antibodies, we identified molecules involved in the regulation of myogenesis by M1 and M2 macrophages in a human in vitro system. In vivo analysis of regenerating human muscle sections confirmed our results obtained in vitro. M1 macrophages are preferentially associated with proliferating myogenic cells while M2 macrophages are associated with differentiating myogenic cells. In degenerative myopathies, we showed that macrophages are completely different from those present during skeletal muscle regeneration. We observed in mouse and human that M1 marker-expressing macrophages are associated with fibrosis while anti-inflammatory treatment reduced this population, in association with an improvement of the dystrophic muscle. Isolated Ly6Cneg macrophages exhibit a mixed M1/M2 phenotype. In ex-vivo coculture experiments, we showed that Ly6Cpos macrophages strongly favor establishment of fibrosis by directly acting on fibroblasts while in regenerating muscle, these Ly6Cpos macrophages negatively regulate fibrosis. To resume, we confirm in human the supportive sequential roles of macrophages during skeletal muscle regeneration in vitro and in vivo. Moreover, we identified effectors secreted by M1 and M2 macrophages involved in the regulation of the myogenic process. We also highlight that during muscle regeneration and in degenerative myopathies, macrophages exhibit different phenotype associated with opposite functions, with a pro-fibrotic role for pro-inflammatory macrophages.

Rationnel : L’artérite à cellules géantes (ACG) est une vascularite primitive des gros vaisseaux dont le diagnostic repose sur la mise en évidence d’un infiltrat inflammatoire et de cellules géantes à la biopsie d’artère temporale (BAT). On note également un remodelage de la paroi vasculaire lié à une prolifération des cellules musculaires lisses vasculaires (CMLV) pouvant aboutir à une occlusion artérielle. Objectif : Caractériser les auto-anticorps dirigés contre les cellules endothéliales (CE) et les CMLV au cours de l’ACG et préciser le rôle des CMLV dans le remodelage pariétal. Méthodes : La recherche d’auto-anticorps a reposé sur un immunoblot 2D couplé à la spectrométrie de masse. Les protéomes des CMLV d’artère ombilicale, d’artère pulmonaire et d’aorte humaines normales a été comparés par protéomique différentielle (2D-DIGE). Nous avons utilisé la 2D-DIGE et des puces d’expression pan-génomiques pour comparer les CMLV issues de BAT de patients suspects d’ACG (avec un diagnostic final d’ACG ou non), afin d’identifier les mécanismes contribuant à la prolifération des CMLV. Résultats : Chez 15 patients atteints d’ACG, nous avons notamment identifié la lamine, la vinculine et l’annexine A5 comme cible des auto-anticorps anti-CMLV. Les antigènes cibles identifiés sont liés à Grb2, une protéine adaptatrice impliquée dans la prolifération des CMLV. Nous avons mis en évidence des protéomes différents au sein des CMLV humaines normales selon leur origine vasculaire et avons principalement identifié des protéines du cytosquelette et du métabolisme énergétique.A partir des CMLV isolées des BAT et à l’aide d’Ingenuity®, nous avons identifié l’endothéline 1 (ET-1) et la paxilline comme des molécules impliquées dans le remodelage vasculaire. En immunohistochimie et par qPCR, nous avons confirmé l’expression de l’ET-1 et de ses récepteurs ETAR et ETBR au sein des artères temporales de patients atteints d’ACG. Enfin, nous avons inhibé la prolifération des CMLV avec du macitentan, un inhibiteur d’ETAR et en particulier avec son métabolite actif, mais pas avec d’autres inhibiteurs des récepteurs de l’ET-1. Conclusion : Nous avons identifié chez les patients atteints d’ACG des anticorps anti-CMLV dont le rôle pathogéne potentiel reste à définir. Les différences protéiques observées à partir des CMLV humaines normales pourraient correspondre à des phénotypes différents. A partir d’un matériel biologique unique, nous avons pu montrer que la prolifération excessive des CMLV au cours de l’ACG pouvait être inhibée par le macitentan ce qui permet d’envisager un usage thérapeutique de cette molécule. / Background : Giant cell arteritis (GCA) is a large vessel vasculitis and its diagnosis usually relies on the identification of an inflammatory infiltrate made of mononuclear cells and giant cells upon temporal artery biopsy. There is also a remodeling process in the arterial wall due to an excessive proliferation of vascular smooth muscle cells (VSMC) which can sometimes lead to arterial occlusion. Purpose: Identify auto-antibodies targeting either endothelial cells (EC) and/or VSMC during GCA and better understand the role of VSMC in the remodeling process. Methods : Auto-antibodies were detected by a 2-dimensionnal immunoblot and their target antigens were identified by mass spectrometry. Proteoms of umbilical artery, pulmonary artery and aorta VSMC were compared by 2 dimension differential in gel electrophoresis (2D-DIGE). In order to identify mechanisms involved in VSMC proliferation in GCA, we used both 2D-DIGE and pan genomic chips in order to compare VSMC isolated at the time of temporal artery biopsy (TAB) from patients with a final diagnosis of GCA or another diagnosis. Results : In 15 patients with GCA, we identified lamin, vinculin and Annexin A5 as target antigens of anti-VSMC antibodies. Target antigens were linked with Grb2, an adaptator protein involved in VSMC proliferation. Normal VSMC originating from different vascular beds have differ in protein contents with differential expression of cytoskeleton and energy metabolism proteins. We compared VSMC from TAB with Ingenuity software and identified endothelin-1 (ET-1) and paxillin as proteins involved in vessel remodeling. We confirmed by immunohistichemistry and qPCR that ET-1 and its receptor ETAR and ETBR were expressed in temporal arteries from patients with GCA. Last, we reduced VSMC proliferation with Macitentan, an ETAR and ETBR antagonist and significantly inhibited VSMC proliferation with its active metabolite whereas other ET-1 inhibitors had no effect. Conclusion : We identified anti-VSMC auto-antibodies in patients with GCA. Their pathogenic role remains to be determined. Normal VSMC from different vascular locations differ in protein conten which might reflect different phenotypes and different properties. The escessive proliferation of VSMC from patients with GCA was inhibited by Macitentan. This drug might constitute a future therapeutic option.

J’ai étudié trois protéines qui participent à deux vois différentes de méchano-transduction qui est la conversion des stimuli physiques en un signal biochimique.Dans une culture cellulaire en 2D, lorsque les cardiomyocytes sont étirés, MLP est transloqué vers le noyau. Sans translocation, les cellules ne parviennent pas à répondre à la stimulation. Les patients porteurs de mutations dans MLP développent une cardiomyopathie comme les souris MLP knock-out (MLP-/-). Mon objectif a été d’élucider le rôle de MLP dans ces cardiomyopathies en surexprimant des mutations de MLP dans les cardiomyocytes isolés des souris MLP-/- néonataux. Dans les cultures 2D mais pas 3D, MLP n’était pas transloqué vers le noyau après l’étirement des cellules. Bien que je n’aie pas pu résoudre ce problème, j’ai mis au point les expériences nécessaires à la poursuite de ce projet.Nesprins s’intègrent dans un complexe transmembranaire de l’enveloppe nucléaire (EN), le LINC complexe, qui connecte le cytosquelette à l’intérieur du noyau. Les myoblastes isolés des patients porteurs des mutations de Nesprin ou de Lamin, qui est associé au LINC complexe, ont présenté des noyaux déformés ainsi que des anomalies de réponses méchanosensibles : Si cultivées sur supports mous, les cellules affichaient un niveau élevé de fibres musculaires stressées et d’adhésions focales. Le knock-down de FHOD, une cible en aval de ROCK et SRC, qui également étaient actives dans ces myoblastes, a réduit ce phénotype. Bien que l’on ait émis l’hypothèse que les mutations dans Nesprins et Lamins conduisent à une instabilité mécanique de l’EN, ces résultats indiquent que les voies de signalisation par l’EN sont perturbées aussi. / I studied three striated muscle proteins that are participating in two different pathways of mechanotransduction, which is the translation of a physical stimulus into a biochemical signal.When isolated cardiomyocytes are stretched in 2D, MLP shuttles to the nucleus. Without shuttling MLP, these cells fail to respond to the stretch stimulus. Human patients with MLP-mutations develop cardiomyopathies, as well as mice with a knock-out of MLP (MLP-/-). By expressing mutated MLP in neonatal cardiomyocytes of MLP-/- mice, I wanted to elucidate the role of mutant MLP. Surprisingly, MLP did shuttle after stretching of 2D but not 3D cell cultures. Although I could not solve this issue, I prepared the setup for subsequent experiments.Nesprins are part of the nuclear envelope (NE) spanning LINC complex, which connects the cytoskeleton with the nucleus. Myoblasts from patients with mutations in Nesprins or LINC-associated Lamins displayed deformed nuclei and had defects in mechanosensitive responses with an elevated level of stress fibers and focal adhesions on soft surfaces. This phenotype could be rescued by knock-down of formin FHOD1, a downstream target of ROCK and SRC, which also were highly active in the mutant cells. While mutations in Nesprins and Lamins are thought to lead to mechanical instability of the NE, these results indicate that signaling pathways through the NE are disturbed as well.

La thérapie cellulaire est une envisagée pour traiter des pathologies cardiaques ou squelettiques basée sur la médecine régénérative. Les progéniteurs cellulaires classiquement utilisés (myoblastes ou cellules mésenchymateuses) n'ont démontré qu'une efficacité limitée. Dans ce contexte, notre laboratoire a identifié une nouvelle catégorie de progéniteurs, sur la base de leur activité enzymatique aldéhyde déshydrogénase (ALDH) mise en évidence par un substrat fluorescent, l'Aldéfluor, et en association avec le marqueur CD34. Les ALDH sont impliquées dans le métabolisme et la détoxification des aldéhydes, et constituent un nouveau marqueur des cellules souches. Ce travail de thèse a permis de mieux caractériser les progéniteurs myogéniques (ALDH+/CD34-) et non myogéniques (ALDH+/CD34+), dans différents contextes physiopathologiques. Leur présence dans différents muscles de primates humains ou non humains, leur persistance au cours du vieillissement naturel ou lors d'atteinte par la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) chez l'Homme et dans des modèles animaux, suggèrent une utilisation possible des cellules ALDH+/CD34- pour des développements thérapeutiques ultérieurs. L'étude phénotypique révèle que des marqueurs transmembranaires sont associés à des sous-populations de cellules ALDH myogéniques ou non myogéniques dont la comparaison permettra de proposer de meilleurs candidats de thérapie cellulaire. En parallèle, les caractérisations histologiques et cytologiques ont identifié des sous-populations exprimant des isoenzymes et les analyses d'expressiongénique réalisées ex vivo et en culture suggèrent que certaines sont impliquées dans l'homéostasie musculaires. / Cell therapy is a regenerative medicine strategy considered for the treatment of cardiac or skeletal muscle diseases. The cellular progenitors used to date (myoblasts or mesenchymal stem cells) provided mitigated success, thus mandating the identification and characterization of new categories of progenitors. Our laboratory has identified new populations of progenitors, based on their Aldehyde Deshydrogenase activity (ALDH) detectable using the fluorescent substrate Aldefluor, associated with the expression of the CD34 marker. ALDH are involved in metabolism and detoxification of aldehydes, they play important roles in cell survival and differentiation and are considered a new marker of stem cells. The present project allowed characterizing extensively the myogenic (ALDH+/CD34-) and non myogenic (ALDH+/CD34+) progenitors, in several physiopathological contexts and animal models. The presence of ALDH+/CD34- cells in distinct muscle groups in Human and non-human Primates, their persistence through natural ageing and despite the ongoing degenerative process observed in Duchenne muscular dystrophy in Human patients and animal models suggest their future use for therapeutic applications. The phenotypic characterization indicated that membrane markers are associated to myogenic or non myogenic sub-populations of ALDH cells. The comparison on their efficacies in vito and in vivo will allow proposing new candidates for cell therapy. In parallele, histological and cytological analysis identified cell populations expressing isoenzymes The analysis of gene expressions suggested that, at least, some of them are involved in muscle homeostasis in situ or in vitro.

La fatigue musculaire est un phénomène transitoire communément expérimenté dans la vie quotidienne. Principalement associée à un déficit de production de force, elle s’accompagne également d’une augmentation de l’effort mental à fournir pour déployer un niveau de force particulier. L’augmentation du taux de décharge des afférences nociceptives de petit diamètre (groupes III et IV) lors de contractions fatigantes modifie l’expression des commandes motrices – notamment en raison de processus inhibiteurs associés à leur intégration aux niveaux spinal et supraspinal – ce qui affecte finalement la production motrice. C’est la raison pour laquelle une intention motrice similaire avec et sans fatigue se traduira par des formes gestuelles différentes. Une problématique qui n’a jusque-là jamais été abordée dans la littérature concerne la capacité du Système Nerveux Central (SNC) à anticiper les effets de la fatigue musculaire de façon prédictive. Cette capacité prédictive sera étudiée dans ce travail de thèse au moyen de paradigmes expérimentaux faisant intervenir des processus de contrôle prédictifs de la posture, i.e. les Ajustements Posturaux Anticipés (APAs). Du fait que de nombreux travaux montrent que les APAs sont modulés en fonction des caractéristiques mécaniques du mouvement à venir, l’altération des capacités des muscles focaux grâce à des protocoles de fatigue maîtrisés nous a permis d’apprécier la capacité du SNC à en prédire les effets. Nous verrons que cette capacité est condition-dépendante, à savoir qu’elle dépend de la nature des contractions effectuées (volontaires vs. électro-induites) et du niveau de contraintes cognitives et temporelles imposées lors de la préparation du mouvement / Muscle fatigue is a transient and commonly experienced phenomenon. It is mainly associated with loss of force and leads to higher effort to produce a particular force level. The increased discharge rate of the nociceptive afferents (group III and IV) during fatiguing contractions alters motor command expression and finally motor production. An issue that has never been addressed in the literature is the Central Nervous System (CNS) capacity to anticipate muscle fatigue effects in a predictive fashion. This predictive capacity will be investigated thanks to experimental paradigms involving postural predictive processes of control, namely Anticipatory Postural Adjustments (APAs). Because numerous works show that APAs are modulated as a function of the mechanical properties of the upcoming movement, the induction of muscle fatigue at the levels of the focal muscles allowed us to appreciate the CNS capacity to predict muscle fatigue effects. We will demonstrate that this capacity is condition-dependent, i.e. it depends on the nature of the fatiguing contractions performed (voluntary vs. electro-induced) and on the level of cognitive and temporal constraints during movement preparation

La dystrophie myotonique de type 1 (DM1) ou maladie de Steinert est la maladie génétique neuromusculaire la plus commune avec une incidence de 1/8000 à travers le monde. Cette maladie multisystémique touche particulièrement les muscles squelettiques (myotonie, faiblesse et perte musculaires) et le coeur qui présente des symptômes variés comme des troubles de la conduction et des arythmies. La DM1 est causée par une expansion instable de répétitions CTG dans la région 3’ non traduite du gène DMPK. Les individus sains possèdent entre 5 et 37 répétitions CTG tandis que les patients DM1 portent entre 50 et plusieurs milliers de répétitions. Il est bien établi que les expansions de répétitions non codantes forment des foci dans les noyaux musculaires où elles séquestrent le facteur d'épissage MBNL1. Toutefois, l'implication de la stabilisation et l'accumulation de CUGBP1 hyperphosphorylé par la PKC dans la maladie est un sujet controversé dans la communauté DM1. Dernièrement, en plus de la rupture de l'équilibre entre MBNL1/CUGBP1, plusieurs mécanismes ont été mis en cause dans la pathogenèse de la DM1. Parmi eux, l'expression perturbée de facteurs de transcription, la maturation altérée de miARNs, l'activation de kinases... chacune de ces altérations menant au final à une perturbation du transcriptome. Afin d'étudier l'effet de la toxicité des répétitions sur les phénotypes et lestranscriptomes, nous avons généré trois lignées de Drosophile inductibles et site-spécifiques exprimant 240, 600 et 960 répétitions de triplets. Nous avons travaillé en parallèle sur une lignée atténuée pour mbl (orthologue de MBNL1) et deux lignées gain de fonction bru -3 (orthologue de CUGBP1). Exprimées dans les muscles somatiques, les répétitions CTG conduisent à une mobilité réduite, le fractionnement des fibres musculaires, une réduction de leur taille et une altération du processus de fusion des myoblastes de manière dépendante de Mbl et Bru-3. En outre, l'expression des répétitions cause une hypercontraction musculaire dépendante de Mbl et due à un mauvais épissage de dSERCA. L'analyse transcriptionnelle comparative réalisée sur les muscles larvaires des différentes conditions pathologiques montre que l'atténuation de mbl reproduit 70-82% des dérégulations transcriptomiques des larves DM1 alors que le gain de fonction bru-3 représente 32-53% des altérations transcriptomiques des lignées DM1. Ainsi Mbl est un facteur clé des dérégulations observées dans les muscles somatiques des lignées DM1. Au contraire, les analyses physiologiques effectuées sur les coeurs adultes suggèrent que Bru-3 est un facteur clé dans la mise en place des phénotypes cardiaques. En effet, d'une part, l'atténuation de mbl dans le coeur cause une cardiomyopathie dilatée, un symptôme rarement diagnostiqué chez les patients. D'autre part, les lignées gain de fonction bru-3 et DM1 présentent de la fibrillation qui évolue avec l'âge ou la taille des répétitions vers un phénotype qui rappelle l'insuffisance cardiaque chez les patients. / Myotonic Dystrophy Type 1 (DM1) or Steinert's disease is the most common genetic neuromuscular disorder affecting 1 out of 8000 people worldwide. This multisystemic disease affects particularly the skeletal muscles (myotonia, muscle weakness and wasting) and the heart, which can exhibit various symptoms like conduction disturbances and arrhythmia (auricular fibrillation and flutter). DM1 is caused by an unstable CTG repeat expansion in the 3' non-translated region of the DMPK gene. In healthy individuals, the number of CTG repeats ranges from 5 to 37 whereas DM1 patients carry from 50 to thousands repeats. It is well established that when expanded non-coding repeats aggregate into foci within muscle nuclei and sequester the MBNL1 splicing factor. However, the involvement of the stabilization and accumulation of CUGBP1 following PKC hyper-phosphorylation in the disease is a controversial matter in the DM1 community. Lately, in addition to the disruption of the balance between MBNL1/CUGBP1, several mechanisms were identified as part of the DM1 pathogenesis. Among them, transcription factors perturbations, altered maturation of miRNA, kinases activation… each of them leading eventually to transcriptomic alterations. In order to investigate the effect of toxic repeat expression on phenotypic and transcriptomic alterations, we generated three inducible site-specific Drosophila lines expressing 240, 600 and 960 triplet repeats. We worked in parallel on a mbl (MBNL1 orthologue) knocked-down line and two bru-3 (CUGBP1 orthologue) gain of function lines. When expressed in somatic muscles, CTG repeats lead to altered motility, fiber splitting, reduced fiber size and affected myoblast fusion process in a Mbl and Bru-3 dependent manner. In addition, toxic repeats cause fiber hyper-contraction in a Mbldependentmanner due to dSERCA mis-splicing. Comparative transcriptional profiling performed on larval muscles of different conditions show that mbl attenuation reproduces 70-82% of DM1 transcriptomic deregulations whereas bru-3 gain of function represents 32-53% of transcritomic alterations. Thus Mbl appears as a key factor of transcripts deregulations observed in DM1 muscles. On the contrary, physiologic analyses performed on adult hearts suggest that Bru-3 is a key factor for cardiac phenotypes. Indeed, on one hand, mbl attenuated flies display dilated cardiomyopathy, a symptom barely diagnosed in patients. On the other hand, bru-3 gain of function line and DM1 lines display fibrillation, which evolves withage or repeat size into a phenotype reminiscent of heart insufficiency in patients.

Le diabète de type 2, défini par une hyperglycémie chronique, résulte d'un déficit de la sécrétion d'insuline et d'une insulinorésistance. Durant le prédiabète qui précède la maladie, la cellule ß pancréatique est capable d'établir une hyperactivité sécrétoire compensatrice de l'insulinorésistance. Les NO synthases neuronales (nNOS) pancréatique et musculaire contrôlent respectivement la sécrétion d'insuline induite par le glucose dans la cellule ß et la force contractile, la captation et l'utilisation du glucose dans les myocytes. Dans le modèle génétique du rat obèse Zucker fa/fa mimant l'état prédiabétique associant un hyperinsulinisme et une insulinorésistance, nous avons retrouvé au niveau de la cellule ß une forte augmentation du complexe entre la nNOS et son inhibiteur endogène PIN (Protein Inhibitor of Neuronal NOS) au niveau des granules de sécrétion d'insuline. Ce complexe, grâce à une interaction accrue avec la myosine V, participe à l'hyperactivité sécrétoire de la cellule ß pancréatique. En effet, des molécules inhibant spécifiquement l'interaction nNOS-PIN permettent de rétablir, chez le rat fa/fa, une sécrétion d'insuline normale. Au niveau musculaire, nous avons observé, dans ce modèle animal, une diminution d'expression de la nNOS sans variation du taux d'ARNm, traduisant une protéolyse accrue de la protéine. L'inhibition de la dégradation protéasomale permet de restaurer l'expression et l'activité catalytique de la nNOS dans le muscle squelettique. Cette perte de fonctionnalité de l'enzyme participerait à l'installation de l'insulinorésistance. Ces travaux ont permis de valider la nNOS comme une cible potentielle pour la prévention du diabète de type 2. / Type 2 diabetes is a chronic disorder defined by chronic hyperglycemia resulting from a deficiency of insulin secretion and an insulin resistance in peripheral tissues and liver. A long lasting silent phase, called prediabetes, precedes the disease and in which pancreatic ß cell is able to improve insulin secretion to compensate for the insulin resistance. The pancreatic and muscular neuronal nitric oxide synthases (nNOS) control respectively glucose-induced insulin secretion in pancreatic ß cell and glucose uptake and utilization in myocytes. In the genetic model of obese Zucker fa/fa rat mimicking the prediabetic state characterized by hyperinsulinemia and insulin resistance, we found a high increase in the amount of the complex between nNOS and its endogenous inhibitor PIN (Protein Inhibitor of Neuronal NOS) at the level of insulin secretory granules within the ß cell. This complex, through an increased interaction with myosin V, participates in the secretory hyperactivity of the pancreatic ß cell, observed in this model of prediabetes. Indeed, molecules that specifically inhibit nNOS-PIN interaction allow to restore a normal insulin secretion in fa/fa rat. In skeletal muscle of this model, we observed a decreased expression of nNOS protein with no change in mRNA levels, suggesting an increased proteolysis of the protein. Inhibition of proteasomal degradation restores the expression and the catalytic activity of nNOS in skeletal muscle. Thus, this loss of functionality of the enzyme could participate in the installation of insulin resistance. This work therefore validated nNOS as a potential target for the prevention of type 2 diabetes.

Le vieillissement s'accompagne d'une perte progressive de la masse et de la fonction musculaire, appelée sarcopénie. Différents mécanismes ont été proposés pour expliquer la sarcopénie. Cependant, la majorité d'entre eux ont été identifiés dans le contexte d'une atrophie induite expérimentalement (par dénervation, immobilisation, jeûne...) ou via des études corrélatives chez l'homme. Ainsi nous ne connaissons pas aujourd'hui l'importance et la chronologie de ces facteurs dans le contexte du vieillissement physiologique. Caenorhabditis elegans est un organisme modèle de référence pour les études de longévité. Grâce aux outils génétiques disponibles chez le nématode C. elegans, des voies moléculaires, qui contrôlent la longévité et dont le rôle est conservé chez les mammifères, ont pu être identifiées, comme la voie du récepteur de l'insuline/IGF-1. Toutefois le vieillissement musculaire a été très peu étudié dans cet organisme.Le premier objectif de mon projet de thèse était de décrire chez C. elegans les changements subcellulaires qui sont associés la perte de mobilité avec l'âge afin d'identifier des biomarqueurs potentiels du vieillissement musculaire. Le deuxième objectif était d'utiliser ces biomarqueurs comme outil pour identifier des gènes modificateurs de la sarcopénie. Nous avons ainsi pu mettre en évidence une diminution de l'expression de gènes impliqués dans la structure et la fonction musculaire très tôt au cours de la vie adulte. Ce phénotype est suivi par une fragmentation progressive des mitochondries puis une accumulation de vésicules d'autophagie. Ces biomarqueurs ont été utilisés pour tester le rôle potentiel, dans le maintien du muscle, de facteurs impliqués dans la différenciation musculaire au cours de l'embryogenèse.L'ensemble des résultats obtenus nous permettent de proposer un modèle selon lequel le facteur de transcription unc-120, orthologue du Serum Response Factor, agirait en aval de la voie de signalisation de l'insuline/IGF-1 dans le contrôle des différents biomarqueurs du vieillissement musculaires / Aging is accompanied by a progressive loss of muscle mass and function, named sarcopenia. Different mechanisms have been proposed to explain it. Furthermore most of them have been identified in the context of an experimental induced atrophy (by denervation, immobilization, fasting...) or via correlative studies in humans. Thus today we do not know the importance and chronology of these factors in the context of physiological aging. Caenorhabditis elegans is a reference model organism for longevity studies. Thanks to genetics tools available for the nematode C. elegans, evolutionarily conserved molecular pathways, which control longevity, have been identified, such as the Insulin/IGF-1 receptor pathway. However muscle aging has been very poorly studied in this organism. The first aim of my thesis project was to describe, in C. elegans, subcellular changes that are associated with mobility loss with age in order to determine potential biomarkers of muscle aging. The second aim was to use these biomarkers as tools to identify genes able to modify sarcopenia. Specifically, we could highlight a decrease of expression of genes involved in muscle mass and function very early during adulthood. This phenotype is followed by a gradual mitochondrial fragmentation then an accumulation of autophagic vesicles.These biomarkers have been used to test the potential role in muscle maintenance, of factors involved in muscle differentiation during embryogenesis. Altogether these results suggest a model in which the transcription factor unc-120, ortholog of Serum Response Factor, would act downstream in the insulin/IGF-1 signalization pathway on the control of the different biomarkers of muscle aging

Le système musculo-squelettique se compose des muscles, du squelette et du tissu conjonctif qui comprend, entre autres, les tendons et le tissu conjonctif musculaire. Le tissu conjonctif musculaire contribue à l'élasticité et à la rigidité des muscles, alors que les tendons transmettent les forces musculaires à l'os nécessaires aux mouvements du corps. Contrairement au muscle et au squelette, la mise en place et la formation du tissu conjonctif restent à ce jour peu étudiées. Afin d'identifier les mécanismes moléculaires sous-jacents à la formation du tissu conjonctif au cours du développement du membre, cinq facteurs de transcription à doigt de zinc ont été examinés : OSR1, OSR2, EGR1, KLF2 et KLF4. Ces facteurs de transcription sont exprimés dans différents sous-compartiments du système musculo-squelettique et leur surexpression influence la différentiation des cellules mésenchymateuses du membre. Afin d'élucider leurs rôles au niveau de la régulation génique, plusieurs stratégies à haut-débit (RNA-seq, ChIP-seq) ont été mises en place. Ces stratégies ont permis : (i) d'identifier que les facteurs de transcription partagent des fonctions régulatrices communes liées à la transduction du signal, à la communication cellulaire et à l'adhésion cellulaire ; (ii) de révéler que les gènes différentiellement exprimés étaient enrichis pour des signatures d'activation et de répression chromatiniennes, suggérant qu'ils sont dynamiquement régulés ; (iii) de distinguer les gènes cibles directs des cibles indirectes. Ces résultats fournissent ainsi une base pour des travaux futurs visant à mieux comprendre l'inter-connectivité entre les différents composants de l'appareil locomoteur. / The musculoskeletal system is composed of muscles, skeletal elements and connective tissues such as tendon and muscle connective tissue. Muscle connective tissue contributes to the elasticity and rigidity of muscles, while tendons transmit forces generated by muscles to the bone to allow body motion. In contrast to muscle and skeleton, connective tissue patterning and formation remain poorly investigated. In order to identify molecular mechanisms underlying connective tissue formation during limb development, five zinc-finger transcription factors were investigated: OSR1, OSR2, EGR1, KLF2 and KLF4. These transcription factors are expressed in distinct subcompartments of the musculoskeletal system and influence the differentiation of limb mesenchymal cells upon overexpression. To further investigate their roles at the molecular level, several genome-wide strategies (RNA-seq, ChIP-seq) were employed. These strategies enabled: (i) to identify that the transcription factors share common regulatory functions and positively regulate biological processes related to signal transduction, cell communication and biological adhesion; (ii) to reveal that the differentially expressed genes were enriched for both active and repressive chromatin signatures at their promoters, suggesting that they are dynamically regulated; (iii) to distinguish between indirect and direct target genes. Altogether, these results provide a framework for future investigations to better understand the interconnectivity between components of the musculoskeletal system.