Le Syndrome d’Ehlers-Danlos classique (EDSc) est une maladie génétique du tissu conjonctif lié, dans 90% des cas, à des mutations sur les gènes du collagène V (COLV). Elle se caractérise par une peau fine, vulnérable et hyper-extensible, des défauts de cicatrisation et une hypermobilité articulaire. Afin d’établir un lien entre le génotype et le tableau clinique des patients, j’ai étudié l’impact de mutations identifiées sur le N-propeptide de la chaine α1 de COLV, particulièrement la mutation S254L associée à un syndrome chevauchant EDSC/UCMD (Dystrophie Musculaire Congénitale d’Ullrich), sur la maturation de COLV, la production et l’organisation de la matrice extracellulaire (MEC), et sur l’intégrité et la fonction des fibroblastes du derme.J’ai ainsi montré que seule la mutation S254L abolit le clivage BMP-1 du N-propeptide, étape importante de la maturation de COLV. Le COLV muté est normalement sécrété dans la MEC qui va toutefois présenter une organisation anarchique des fibres de collagène et du réseau de collagène VI. À l’aide de tests de blessure sur couche cellulaire, j’ai observé que les fibroblastes EDSc (fb/EDSc) et S254L (fb/SL) ont un niveau de cicatrisation inférieur à celui observé chez les fibroblastes sains (fb/WT). Ce défaut de recouvrement est associé à des défauts de migration et à un plus faible niveau de prolifération. De plus, les fb/SL ont une surface d’adhésion inférieure à celle des fb/WT. J’ai également observé une augmentation du flux autophagique chez les fb/EDSc et fb/SL par rapport aux fb/WT. L’autophagie des fb/SL, contrairement au fb/EDSc, n’est pas associée à un stress du réticulum endoplasmique mais à la mitophagie, un mécanisme permettant la dégradation spécifique des mitochondries qui sont altérées chez les fb/SL.Mon étude portant sur les mutations du N-propeptide a ainsi permis de caractériser certains des processus biologiques associés à la pathogénèse de l’EDSc et ceux spécifiquement liée au syndrome chevauchant EDS/UCMD. / Classic Ehlers-Danlos syndrome is a heritable connective tissue disorder, characterized by fragile and hyperextensible skin, and joint hypermobility. 90% of patients harboured a mutation in the COL5A1 gene, which encode the pro α1(V) chain of the collagen V, that could assemble with the pro α2(V) chain to form the predominant isoform of collagen V, the heterotrimer α1(V) ₂ α2(V). This isoform is expressed in bones, skin and tendons and is able to control collagen fibrillogenesis. Here we described for the first time a mutation, localized in the BMP-1 cleavage site on the α1(V) chain in a patient exhibiting muscular contractures and weakness, an abnormal skin and problems with nerve conductions, which could remind an UCMD pathology, which is normally due to mutations in the collagen VI molecule. We first showed that this new mutation totally abolished the maturation of the pro α1(V) chain by the BMP-1 enzyme but didn’t affect the secretion of the collagen V in the ECM. Analysis of fibroblasts from this patient showed that the collagen V is secreted but that the collagen fibrils are not correctly organized in the ECM of the cells. Our analysis also revealed that fibroblasts migration is affected, compared to wild-type cells and that number, area and length of vinculin-containing focal adhesion are reduced. Interestingly, there is an increase of the autophagic flux in those cells, associated with mitophagy but without ER stress. These data highlight that a mutation in the COL5A1 gene could leads to a new pathology in which skin, muscle and nerves are affected.

Les changements de forme des cellules épithéliales sont cruciaux pour la morphogenèse embryonnaire. Chez les embryons de C. elegans, l'activité musculaire sous les cellules épidermiques est l'une des deux forces mécaniques qui dirigent ce processus. Cependant, les mécanismes moléculaires détaillés à travers lesquels l'activité musculaire favorise l'allongement polarisé le long de l'axe antérieur / postérieur (A / P) restent à être totalement compris. Ici, en utilisant l'imagerie rapide-3D, on découvre que les embryons tournent après l'activation musculaire et on décrit le schéma local et global de la rotation de l'embryon induite par activité musculaire. En outre, on a observé que les muscles des côtés opposés de l'embryon se contractent alternativement, expliquant les rotations de l'embryon. Par conséquent, les jonctions adhérentes sont étirées le long de la direction A / P pendant les rotations de l'embryon et sont donc sous une tension plus élevée. Nos résultats préliminaires d'imagerie en molécule unique ont montré que plus de E-cadhérine, matériau de jonction, fusionne avec des jonctions orientées A / P quand il y a une tension élevée sur ces jonctions. / Epithelial cell shape changes is essential for embryonic morphogenesis. In C. elegans embryos, muscle activity from underneath epidermal cells is one of the two mechanical force inputs driving this process. However, the detailed molecular mechanisms through which muscle activity promotes the polarized elongation along the anterior/posterior (A/P) axis remains to be fully understood. Here, using fast-3D imaging, we discover that embryos rotate after muscle activation and we describe the local and global pattern of embryo rotation induced by muscle activity. Furthermore, we observed that muscles located on opposite sides of the embryo mostly contract alternatively, accounting for embryo rotations. As a consequence, adherens junctions get stretched along the A/P direction during embryo rotations and therefore are under higher tension. Our preliminary results from single molecule imaging showed that more junction material E-cadherin fuses with A/P oriented junctions when there is high tension on these junctions.

La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est la conséquence de la perte de la dystrophine, protéine sous membranaire indispensable au maintien mécanique et fonctionnel du sarcolemme. Cette déficience augmenterait les influx cationiques par des microruptures de la membrane ou par la dérégulation de canaux tels que les canaux activés par l'étirement (SACs: Stretch-activated channel). Dans ce travail, les effets d'une stimulation mécanique ont été explorés sur des cardiomyocytes dans le contexte pathologique de la cardiomyopathie dilatée associée à la DMD. L'utilisation de fibres de carbone a permis de réaliser un étirement axial similaire aux conditions physiologiques de remplissage ventriculaire. Dans ces conditions, l'exploration de la topographie membranaire par la microscopie de conductance ionique à balayage n'a montré aucune évolution de la surface ni de lésion du sarcolemmel dans les conditions d'étirement. L'étude s'est donc focalisée sur l'activité de candidats moléculaires des SACs et plus particulièrement ceux appartenant à la famille des TRPs (Transient Receptor Potential) dans le dérèglement de l'homéostasie calcique induite par l'étirement. Les influx cationiques évalués par la technique d'extinction de fluorescence et l'étude de la concentration intracellulaire de Ca2+ ([Ca2+]i) grâce à la sonde Fluo8 montrent une implication des canaux TRPV2 et TRPCs. Les premiers semblent responsables d'une entrée cationique et d'une augmentation de [Ca2+]i importante dans les cardiomyocytes mdx. Les seconds, bien que responsables d'un influx, ne participeraient pas à l'augmentation de [Ca2+]i. Ces résultats révèlent que les canaux TRPV2 pourraient jouer un rôle important dans la dérégulation calcique observée dans les cardiomyocytes déficients en dystrophine. / Duchenne muscular dystrophy (DMD) is the consequence of the loss of dystrophin, a subsarcolemmal protein essential for mechanical and functional maintenances of the sarcolemma. This deficiency could increase cationic influxes by membrane microruptures or by dysregulation of channels such as stretch-activated channels (SACs). In this work, the effects of a mechanical stretch were explored on cardiomyocytes in the pathological context of dilated cardiomyopathy associated with DMD. Using carbon fibers, an homogenous axial stretch was performed to mimic physiological conditions of ventricular filling. In these conditions, exploration of membrane topography using the scanning ion conductance microscopy did not show any surface evolution or sarcolemma disruption in stretch condition. The study was thus focused on activity and identification of molecular candidates for SACs, especially the TRPs (Transient Receptor Potential) channels in the stretch-induced. Ca2+ homeostasis dysregulation. Cationic influxes assessed by Mn2+-quenching and assessment of the intracellular Ca2+ concentration ([Ca2+]i) using fluo-8 fluorescence demonstrated an involvement of TRPV2 and TRPCs channels. The first ones seem to be responsible for cationic entry and [Ca2+]i increase in mdx cardiomyocytes. The latter, though responsible for an influx, do not contribute to [Ca2+]i increase. These findings reveal that TRPV2 channels could play an important role in calcium dysregulation observed in dystrophin-deficient cardiomyocytes.

La forme des mitochondries change continuellement grâce aux actions combinées d'événements de fission et de fusion rendant le réseau mitochondrial très dynamique. Les processus mitochondriaux de fission et de fusion sont finement régulés par des GTPases de la famille des dynamines qui sont bien conservées entre les espèces. Chez C. elegans, la fission est régulée par DRP-1, la fusion de la membrane interne par EAT-3, homologue d’OPA1, et la fusion de la membrane externe par FZO-1, homologue de MFN1. Dans les cellules musculaires du nématode sauvage, les mitochondries tubulaires et circulaires sont dans des proportions égales et organisées le long du sarcomère. Cependant, durant la dégénérescence musculaire dystrophine-dépendante, une fragmentation du réseau mitochondrial dans les cellules musculaires apparaît. Or le rôle des acteurs de la dynamique mitochondriale dans les mécanismes moléculaires menant à la dégénérescence musculaire dystrophine-dépendante reste encore incompris. Nous avons trouvé que: (i) la dégénérescence musculaire dystrophine-dépendante s'accompagnait d'une augmentation drastique de la fragmentation mitochondriale qui peut être sauvée par des manipulations génétiques de la dynamique mitochondriale (ii) la perte de fonction du gène de fission drp-1 ou la surexpression des gènes de fusion eat-3 et fzo-1 provoquent une réduction de la dégénérescence musculaire et une mobilité améliorée des mutants dystrophiques (iii) les fonctions de DRP-1 dans l'apoptose et d’autres acteurs de l’apoptose sont importants pour la mort des cellules musculaires déficientes en dystrophine (iv) L’implication de DRP-1 dans l’apoptose est également importante pour la dégénérescence musculaire liée au vieillissement. En conclusion, nos résultats pointent vers un mécanisme impliquant la dynamique mitochondriale pour impacter la dégénérescence musculaire via l’apoptose chez Caenorhabditis elegans / Mitochondrial shape is continually changing thanks to the combined actions of fission and fusion events making the mitochondrial network very dynamic. The mitochondrial fission and fusion processes are finely regulated by GTPases of the family of dynamins that are well conserved between species. In C. elegans, fission is regulated by DRP-1, fusion of the inner membrane by EAT-3, homologue of OPA1, and fusion of the outer membrane by FZO-1, homologue of MFN1. In the muscle cells of wild nematode, tubular and circular mitochondria are in equal proportions and organized along the sarcomere. However, during dystrophin-dependent muscle degeneration, fragmentation of the mitochondrial network in muscle cells occurs. But the role of the actors of mitochondrial dynamics in the molecular mechanisms leading to dystrophin-dependent muscle degeneration is still misunderstood. We found that: (i) dystrophin-dependent muscle degeneration was accompanied by a drastic increase in mitochondrial fragmentation that can be saved by genetic manipulation of mitochondrial dynamics (ii) loss of function of the fission gene drp-1 or overexpression of the eat-3 and fzo-1 fusion genes causes a reduction in muscle degeneration and improved mobility of dystrophic mutants (iii) DRP-1 functions in apoptosis and other are important for the death of dystrophin-deficient muscle cells (iv) The involvement of DRP-1 in apoptosis is also important for age-dépendant muscle degeneration. In conclusion, our results point toward a mechanism involving mitochondrial dynamics to impact muscle degeneration via apoptosis in Caenorhabditis elegans

Le but de notre travail était l’étude des dysfonctions artérielle et musculaire dans des modèles d’agression aiguë et chronique puis l’évaluation de l’effet de la modulation pharmacologique du stress oxydant sur les anomalies vasculaires induites. Dans le modèle aigu de choc endotoxinique chez la souris, l’administration d’albumine humaine a permis d’augmenter leur survie, d’améliorer l’hyporéactivité vasculaire et la dysfonction endothéliale grâce à des propriétés ,concentration-dépendante, anti-oxydantes, modulatrices de l’inflammation, aboutissant à une diminution de l’expression de la NOS inductible et à une amélioration fonctionnelle et quantitative de la NOS endothéliale. L’administration chronique chez le rat de ciclosporine ou d’évérolimus induit une dysfonction endothéliale caractérisée par une altération de la voie de signalisation du NO et de l’EDHF et associée à une augmentation locale du stress oxydant. Au niveau musculaire cardiaque, seul l’évérolimus induit une augmentation de radicaux libres et une diminution de la respiration mitochondriale ventriculaire droite. L’administration préventive de polyphénols a permis, une amélioration de la composante EDHF de la dysfonction endothéliale, ciclosporine-induite, via une diminution de la surexpression de la NADPH oxydase et du stress oxydant vasculaire. Ainsi, le stress oxydant est une entité commune, impliquée dans la genèse de dysfonctions vasculaire et musculaire. Sa modulation par l’administration d’albumine ou de polyphénols a permis respectivement l’amélioration de l’hyporéactivité vasculaire du choc endotoxinique et de la dysfonction endothéliale dans nos deux modèles. / The aim of this work was to study the arterial and muscular dysfunctions in two rodent models of acute and chronic injuries, then the evaluation of pharmacological evaluation of oxidative stress on vascular abnormalities induced in these models.In the acute model, a mouse endotoxic shock, human serum albumin administration improved survival, endothelial dysfunction and reduced vascular hyporeactivity thanks to its concentration-dependant , anti-oxidative and anti-inflammatory properties, leading to a decrease of inductible NOS expression and an qualitative and quantitative increase of endothelial NOS.In the chronic model, rat’s administration of ciclopsorine and everolimus induced an endothelial dysfunction characterized by alterations of both NO and EDHF pathways and associated with an in situ oxidative stress. In the cardiac muscle, an increase of reactive oxygen species and a decrease of right ventricle mitochondrial respiratory chain complexes activities was observed only with everolimus. The preventive administration of polyphenols markedly increased the blunted EDHF component, but not the NO component, of the cyclosporine-induced endothelial dysfunction by reducing NADPH oxidase over expression and oxidative vascular stress. Finally, oxidative stress is a common entity, implicated in genesis of vascular and muscular dysfunctions. Its modulation by human albumin or polyphenols administration improves respectively arterial hyporeactivity of endotoxinic shock and endothelial dysfunction in our two models.

Le muscle squelettique a la capacité de se régénérer suite à une lésion grâce aux cellules satellites qui sont les cellules souches du muscle. Après dommage musculaire, les cellules satellites s’activent, prolifèrent, se différencient et fusionnent afin de reformer le muscle lésé. Cependant les cellules myogéniques ne sont pas les seules cellules impliquées dans la régénération musculaire. Des études précédentes réalisées au laboratoire ont montré chez la souris que les macrophages sont des cellules essentielles à la régénération musculaire. En effet, peu de temps après un dommage musculaire, les monocytes infiltrent le tissu lésé et se différencient en macrophages pro-inflammatoires Ly6Cpos (M1). Ces macrophages stimulent la prolifération des myoblastes et inhibent leur fusion. Puis les macrophages pro-inflammatoires changent de phénotype et deviennent des macrophages anti-inflammatoires Ly6Cneg (M2) qui stimulent la différenciation des myoblastes et les protègent de l’apoptose. Ainsi, en fonction de leur phénotype, les macrophages exercent des rôles trophiques séquentiels sur les myoblastes tout au long du processus de régénération musculaire. Dans la première partie de notre étude, nous montrons in vitro que les macrophages humains soutiennent les différentes étapes de la myogenèse. Les macrophages M1 sont fortement attirés par les myoblastes. De plus ils stimulent la prolifération des myoblastes et inhibent leur fusion. Les macrophages M2 attirent les myoblastes et stimulent leur différenciation permettant ainsi la formation de larges myotubes. En utilisant des anticorps bloquants spécifiques, nous avons identifié plusieurs molécules sécrétées par les macrophages régulant la myogenèse chez l’homme. Nos analyses in vivo chez l'homme confirment nos résultats obtenus in vitro. En effet, les macrophages M1 sont préférentiellement associés aux aires de régénération contenant des myoblastes non différenciés alors que les macrophages M2 sont associés aux aires de régénération contenant des myoblastes en différenciation. Dans un contexte de myopathie dégénérative, nous avons montré que les macrophages adoptent des phénotypes et des fonctions totalement différents des macrophages présents au cours de la régénération musculaire. Nous avons observé chez la souris et chez l’homme, que les macrophages exprimant des marqueurs M1 sont associés à la fibrose et qu’un traitement anti-inflammatoire réduit leur nombre dans le muscle dystrophique murin. Par isolement spécifique et cocultures ex vivo, nous avons montré qu'au cours de la régénération musculaire, les macrophages Ly6Cneg stimulent la production de collagène par les fibroblastes. A l'inverse au cours des myopathies dégénératives, ce sont les macrophages Ly6Cpos qui stimulent fortement l’établissement de la fibrose en agissant directement sur les fibroblastes. De plus, ces macrophages Ly6Cpos, qui régulent négativement les fibroblastes au cours de la régénération musculaire, stimulent la différenciation des fibroblastes et myofibroblastes dans les myopathies. De plus, ils les protègent de l'apoptose, participant ainsi à la persistance de ces cellules fibrosantes. Ainsi, nous avons confirmé chez l’homme in vitro et in vivo, le rôle de support séquentiel des macrophages au cours de la régénération musculaire. De plus, nous avons identifié différents effecteurs sécrétés par les macrophages M1 et M2 impliqués dans la régulation du processus myogénique chez l'adulte. Nous avons également montré que lors des myopathies dégénératives et au cours de la régénération musculaire, les macrophages adoptent un phénotype et des fonctions totalement différents, avec notamment un rôle profibrotique des macrophages pro-inflammatoires. / Skeletal muscle has the ability to regenerate after a chemical or physical injury thanks to satellite cells, the muscle stem cells. After damage, satellite cells proliferate, differentiate and fused to reform muscle. Myogenic cells are not the only on cells involved. Previous studies in the laboratory showed that, in mice, macrophages are crucial for skeletal muscle regeneration. Soon after an injury, macrophages infiltrate damaged muscle and differentiate into Ly6Cpos pro-inflammatory (M1) macrophages. They stimulate proliferation of myoblasts and inhibit their fusion. Then, pro-inflammatory macrophages skew towards a Ly6Cneg anti-inflammatory phenotype (M2). Anti-inflammatory macrophages stimulate differentiation of myoblasts and protect them from apoptosis. Thus, depending on their phenotype, macrophages exert sequential trophic roles on myoblasts throughout muscle regeneration. Here, we showed in vitro that human macrophages also support different steps of myogenesis. M1 macrophages are strongly attracted by mpcs. Moreover, they secrete molecules, which stimulate proliferation of mpcs and inhibit their fusion. M2 macrophages attract mpcs and stimulate differentiation of mpcs in order to form large myotubes. Using specific blocking antibodies, we identified molecules involved in the regulation of myogenesis by M1 and M2 macrophages in a human in vitro system. In vivo analysis of regenerating human muscle sections confirmed our results obtained in vitro. M1 macrophages are preferentially associated with proliferating myogenic cells while M2 macrophages are associated with differentiating myogenic cells. In degenerative myopathies, we showed that macrophages are completely different from those present during skeletal muscle regeneration. We observed in mouse and human that M1 marker-expressing macrophages are associated with fibrosis while anti-inflammatory treatment reduced this population, in association with an improvement of the dystrophic muscle. Isolated Ly6Cneg macrophages exhibit a mixed M1/M2 phenotype. In ex-vivo coculture experiments, we showed that Ly6Cpos macrophages strongly favor establishment of fibrosis by directly acting on fibroblasts while in regenerating muscle, these Ly6Cpos macrophages negatively regulate fibrosis. To resume, we confirm in human the supportive sequential roles of macrophages during skeletal muscle regeneration in vitro and in vivo. Moreover, we identified effectors secreted by M1 and M2 macrophages involved in the regulation of the myogenic process. We also highlight that during muscle regeneration and in degenerative myopathies, macrophages exhibit different phenotype associated with opposite functions, with a pro-fibrotic role for pro-inflammatory macrophages.

Rationnel : L’artérite à cellules géantes (ACG) est une vascularite primitive des gros vaisseaux dont le diagnostic repose sur la mise en évidence d’un infiltrat inflammatoire et de cellules géantes à la biopsie d’artère temporale (BAT). On note également un remodelage de la paroi vasculaire lié à une prolifération des cellules musculaires lisses vasculaires (CMLV) pouvant aboutir à une occlusion artérielle. Objectif : Caractériser les auto-anticorps dirigés contre les cellules endothéliales (CE) et les CMLV au cours de l’ACG et préciser le rôle des CMLV dans le remodelage pariétal. Méthodes : La recherche d’auto-anticorps a reposé sur un immunoblot 2D couplé à la spectrométrie de masse. Les protéomes des CMLV d’artère ombilicale, d’artère pulmonaire et d’aorte humaines normales a été comparés par protéomique différentielle (2D-DIGE). Nous avons utilisé la 2D-DIGE et des puces d’expression pan-génomiques pour comparer les CMLV issues de BAT de patients suspects d’ACG (avec un diagnostic final d’ACG ou non), afin d’identifier les mécanismes contribuant à la prolifération des CMLV. Résultats : Chez 15 patients atteints d’ACG, nous avons notamment identifié la lamine, la vinculine et l’annexine A5 comme cible des auto-anticorps anti-CMLV. Les antigènes cibles identifiés sont liés à Grb2, une protéine adaptatrice impliquée dans la prolifération des CMLV. Nous avons mis en évidence des protéomes différents au sein des CMLV humaines normales selon leur origine vasculaire et avons principalement identifié des protéines du cytosquelette et du métabolisme énergétique.A partir des CMLV isolées des BAT et à l’aide d’Ingenuity®, nous avons identifié l’endothéline 1 (ET-1) et la paxilline comme des molécules impliquées dans le remodelage vasculaire. En immunohistochimie et par qPCR, nous avons confirmé l’expression de l’ET-1 et de ses récepteurs ETAR et ETBR au sein des artères temporales de patients atteints d’ACG. Enfin, nous avons inhibé la prolifération des CMLV avec du macitentan, un inhibiteur d’ETAR et en particulier avec son métabolite actif, mais pas avec d’autres inhibiteurs des récepteurs de l’ET-1. Conclusion : Nous avons identifié chez les patients atteints d’ACG des anticorps anti-CMLV dont le rôle pathogéne potentiel reste à définir. Les différences protéiques observées à partir des CMLV humaines normales pourraient correspondre à des phénotypes différents. A partir d’un matériel biologique unique, nous avons pu montrer que la prolifération excessive des CMLV au cours de l’ACG pouvait être inhibée par le macitentan ce qui permet d’envisager un usage thérapeutique de cette molécule. / Background : Giant cell arteritis (GCA) is a large vessel vasculitis and its diagnosis usually relies on the identification of an inflammatory infiltrate made of mononuclear cells and giant cells upon temporal artery biopsy. There is also a remodeling process in the arterial wall due to an excessive proliferation of vascular smooth muscle cells (VSMC) which can sometimes lead to arterial occlusion. Purpose: Identify auto-antibodies targeting either endothelial cells (EC) and/or VSMC during GCA and better understand the role of VSMC in the remodeling process. Methods : Auto-antibodies were detected by a 2-dimensionnal immunoblot and their target antigens were identified by mass spectrometry. Proteoms of umbilical artery, pulmonary artery and aorta VSMC were compared by 2 dimension differential in gel electrophoresis (2D-DIGE). In order to identify mechanisms involved in VSMC proliferation in GCA, we used both 2D-DIGE and pan genomic chips in order to compare VSMC isolated at the time of temporal artery biopsy (TAB) from patients with a final diagnosis of GCA or another diagnosis. Results : In 15 patients with GCA, we identified lamin, vinculin and Annexin A5 as target antigens of anti-VSMC antibodies. Target antigens were linked with Grb2, an adaptator protein involved in VSMC proliferation. Normal VSMC originating from different vascular beds have differ in protein contents with differential expression of cytoskeleton and energy metabolism proteins. We compared VSMC from TAB with Ingenuity software and identified endothelin-1 (ET-1) and paxillin as proteins involved in vessel remodeling. We confirmed by immunohistichemistry and qPCR that ET-1 and its receptor ETAR and ETBR were expressed in temporal arteries from patients with GCA. Last, we reduced VSMC proliferation with Macitentan, an ETAR and ETBR antagonist and significantly inhibited VSMC proliferation with its active metabolite whereas other ET-1 inhibitors had no effect. Conclusion : We identified anti-VSMC auto-antibodies in patients with GCA. Their pathogenic role remains to be determined. Normal VSMC from different vascular locations differ in protein conten which might reflect different phenotypes and different properties. The escessive proliferation of VSMC from patients with GCA was inhibited by Macitentan. This drug might constitute a future therapeutic option.

J’ai étudié trois protéines qui participent à deux vois différentes de méchano-transduction qui est la conversion des stimuli physiques en un signal biochimique.Dans une culture cellulaire en 2D, lorsque les cardiomyocytes sont étirés, MLP est transloqué vers le noyau. Sans translocation, les cellules ne parviennent pas à répondre à la stimulation. Les patients porteurs de mutations dans MLP développent une cardiomyopathie comme les souris MLP knock-out (MLP-/-). Mon objectif a été d’élucider le rôle de MLP dans ces cardiomyopathies en surexprimant des mutations de MLP dans les cardiomyocytes isolés des souris MLP-/- néonataux. Dans les cultures 2D mais pas 3D, MLP n’était pas transloqué vers le noyau après l’étirement des cellules. Bien que je n’aie pas pu résoudre ce problème, j’ai mis au point les expériences nécessaires à la poursuite de ce projet.Nesprins s’intègrent dans un complexe transmembranaire de l’enveloppe nucléaire (EN), le LINC complexe, qui connecte le cytosquelette à l’intérieur du noyau. Les myoblastes isolés des patients porteurs des mutations de Nesprin ou de Lamin, qui est associé au LINC complexe, ont présenté des noyaux déformés ainsi que des anomalies de réponses méchanosensibles : Si cultivées sur supports mous, les cellules affichaient un niveau élevé de fibres musculaires stressées et d’adhésions focales. Le knock-down de FHOD, une cible en aval de ROCK et SRC, qui également étaient actives dans ces myoblastes, a réduit ce phénotype. Bien que l’on ait émis l’hypothèse que les mutations dans Nesprins et Lamins conduisent à une instabilité mécanique de l’EN, ces résultats indiquent que les voies de signalisation par l’EN sont perturbées aussi. / I studied three striated muscle proteins that are participating in two different pathways of mechanotransduction, which is the translation of a physical stimulus into a biochemical signal.When isolated cardiomyocytes are stretched in 2D, MLP shuttles to the nucleus. Without shuttling MLP, these cells fail to respond to the stretch stimulus. Human patients with MLP-mutations develop cardiomyopathies, as well as mice with a knock-out of MLP (MLP-/-). By expressing mutated MLP in neonatal cardiomyocytes of MLP-/- mice, I wanted to elucidate the role of mutant MLP. Surprisingly, MLP did shuttle after stretching of 2D but not 3D cell cultures. Although I could not solve this issue, I prepared the setup for subsequent experiments.Nesprins are part of the nuclear envelope (NE) spanning LINC complex, which connects the cytoskeleton with the nucleus. Myoblasts from patients with mutations in Nesprins or LINC-associated Lamins displayed deformed nuclei and had defects in mechanosensitive responses with an elevated level of stress fibers and focal adhesions on soft surfaces. This phenotype could be rescued by knock-down of formin FHOD1, a downstream target of ROCK and SRC, which also were highly active in the mutant cells. While mutations in Nesprins and Lamins are thought to lead to mechanical instability of the NE, these results indicate that signaling pathways through the NE are disturbed as well.

La thérapie cellulaire est une envisagée pour traiter des pathologies cardiaques ou squelettiques basée sur la médecine régénérative. Les progéniteurs cellulaires classiquement utilisés (myoblastes ou cellules mésenchymateuses) n'ont démontré qu'une efficacité limitée. Dans ce contexte, notre laboratoire a identifié une nouvelle catégorie de progéniteurs, sur la base de leur activité enzymatique aldéhyde déshydrogénase (ALDH) mise en évidence par un substrat fluorescent, l'Aldéfluor, et en association avec le marqueur CD34. Les ALDH sont impliquées dans le métabolisme et la détoxification des aldéhydes, et constituent un nouveau marqueur des cellules souches. Ce travail de thèse a permis de mieux caractériser les progéniteurs myogéniques (ALDH+/CD34-) et non myogéniques (ALDH+/CD34+), dans différents contextes physiopathologiques. Leur présence dans différents muscles de primates humains ou non humains, leur persistance au cours du vieillissement naturel ou lors d'atteinte par la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) chez l'Homme et dans des modèles animaux, suggèrent une utilisation possible des cellules ALDH+/CD34- pour des développements thérapeutiques ultérieurs. L'étude phénotypique révèle que des marqueurs transmembranaires sont associés à des sous-populations de cellules ALDH myogéniques ou non myogéniques dont la comparaison permettra de proposer de meilleurs candidats de thérapie cellulaire. En parallèle, les caractérisations histologiques et cytologiques ont identifié des sous-populations exprimant des isoenzymes et les analyses d'expressiongénique réalisées ex vivo et en culture suggèrent que certaines sont impliquées dans l'homéostasie musculaires. / Cell therapy is a regenerative medicine strategy considered for the treatment of cardiac or skeletal muscle diseases. The cellular progenitors used to date (myoblasts or mesenchymal stem cells) provided mitigated success, thus mandating the identification and characterization of new categories of progenitors. Our laboratory has identified new populations of progenitors, based on their Aldehyde Deshydrogenase activity (ALDH) detectable using the fluorescent substrate Aldefluor, associated with the expression of the CD34 marker. ALDH are involved in metabolism and detoxification of aldehydes, they play important roles in cell survival and differentiation and are considered a new marker of stem cells. The present project allowed characterizing extensively the myogenic (ALDH+/CD34-) and non myogenic (ALDH+/CD34+) progenitors, in several physiopathological contexts and animal models. The presence of ALDH+/CD34- cells in distinct muscle groups in Human and non-human Primates, their persistence through natural ageing and despite the ongoing degenerative process observed in Duchenne muscular dystrophy in Human patients and animal models suggest their future use for therapeutic applications. The phenotypic characterization indicated that membrane markers are associated to myogenic or non myogenic sub-populations of ALDH cells. The comparison on their efficacies in vito and in vivo will allow proposing new candidates for cell therapy. In parallele, histological and cytological analysis identified cell populations expressing isoenzymes The analysis of gene expressions suggested that, at least, some of them are involved in muscle homeostasis in situ or in vitro.

La fatigue musculaire est un phénomène transitoire communément expérimenté dans la vie quotidienne. Principalement associée à un déficit de production de force, elle s’accompagne également d’une augmentation de l’effort mental à fournir pour déployer un niveau de force particulier. L’augmentation du taux de décharge des afférences nociceptives de petit diamètre (groupes III et IV) lors de contractions fatigantes modifie l’expression des commandes motrices – notamment en raison de processus inhibiteurs associés à leur intégration aux niveaux spinal et supraspinal – ce qui affecte finalement la production motrice. C’est la raison pour laquelle une intention motrice similaire avec et sans fatigue se traduira par des formes gestuelles différentes. Une problématique qui n’a jusque-là jamais été abordée dans la littérature concerne la capacité du Système Nerveux Central (SNC) à anticiper les effets de la fatigue musculaire de façon prédictive. Cette capacité prédictive sera étudiée dans ce travail de thèse au moyen de paradigmes expérimentaux faisant intervenir des processus de contrôle prédictifs de la posture, i.e. les Ajustements Posturaux Anticipés (APAs). Du fait que de nombreux travaux montrent que les APAs sont modulés en fonction des caractéristiques mécaniques du mouvement à venir, l’altération des capacités des muscles focaux grâce à des protocoles de fatigue maîtrisés nous a permis d’apprécier la capacité du SNC à en prédire les effets. Nous verrons que cette capacité est condition-dépendante, à savoir qu’elle dépend de la nature des contractions effectuées (volontaires vs. électro-induites) et du niveau de contraintes cognitives et temporelles imposées lors de la préparation du mouvement / Muscle fatigue is a transient and commonly experienced phenomenon. It is mainly associated with loss of force and leads to higher effort to produce a particular force level. The increased discharge rate of the nociceptive afferents (group III and IV) during fatiguing contractions alters motor command expression and finally motor production. An issue that has never been addressed in the literature is the Central Nervous System (CNS) capacity to anticipate muscle fatigue effects in a predictive fashion. This predictive capacity will be investigated thanks to experimental paradigms involving postural predictive processes of control, namely Anticipatory Postural Adjustments (APAs). Because numerous works show that APAs are modulated as a function of the mechanical properties of the upcoming movement, the induction of muscle fatigue at the levels of the focal muscles allowed us to appreciate the CNS capacity to predict muscle fatigue effects. We will demonstrate that this capacity is condition-dependent, i.e. it depends on the nature of the fatiguing contractions performed (voluntary vs. electro-induced) and on the level of cognitive and temporal constraints during movement preparation