Faithful replication of genomic DNA is crucial for the survival of a cell. In order to achieve high-level accuracy in copying its genome, all cells employ replicative DNA polymerases that have intrinsic high fidelity. When an error occurs on the template DNA strand, in the form of lesions caused by diverse chemicals, reactive oxygen species, or UV light, the high-fidelity replicative DNA polymerases are stalled. To bypass these replication blocks, cells harbor multiple specialized translesion DNA polymerases that are error-prone and therefore able to accommodate the lesions and continue DNA synthesis. As a result of their low fidelity, the translesion polymerases are associated with increased mutagenesis, drug resistance, and cancer. Therefore, the access of the translesion polymerases to DNA needs to be tightly controlled, but how this is achieved has been the subject of debate. This Thesis presents the development of a co-localization single-molecule spectroscopy (CoSMoS) method to directly visualize the loading of the Escherichia coli replicative polymerase on DNA, as well as the exchange between the replicative polymerase and the translesion polymerases Pol II and Pol IV. In contrast to the toolbelt model for the exchange between the polymerases, this work shows that the translesion polymerases Pol II and Pol IV do not form a stable complex with the replicative polymerase Pol IIIα on the β-clamp. Furthermore, we find that the sequential activities of the replication proteins: clamp loader, clamp, and Pol IIIα, are highly organized while the exchange with the translesion polymerases is disordered. This exchange is not determined by lesion-recognition but instead a concentration-dependent competition between the replicative and translesion polymerases for the hydrophobic groove on the surface of the β-clamp. Hence, our results provide a unique insight into the temporal organization of events in DNA replication and translesion synthesis.

Introduction : L'hémophilie est une maladie génétique de la coagulation due à un déficit en facteur VIII ou en facteur IX. Ces déficits sont responsables d'un déficit du complexe ténase intrinsèque (VIIIa-IXa). De plus, le complexe ténase extrinsèque (facteur tissulaire - VIIa) est physiologiquement rapidement inhibé par le TFPI lié au facteur Xa. Nous avons évalué la capacité d'une forme tronquée du facteur Xa (GDXa), dépourvue de domaine Gla à se lier au TFPI et à soulager l'inhibition physiologique du complexe ténase extrinsèque. Matériel et Méthodes : Dans une première partie, nous avons évalué la capacité du GDXa à restaurer la génération de thrombine de plasmas d'hémophiles A et B sévères sans et avec inhibiteurs. Nous avons également comparé les profils de génération de thrombine obtenus après addition du GDXa à ceux obtenus en présence d'anticorps neutralisants anti-TFPI ou anti-antithrombine. Enfin, nous avons comparé les cinétiques enzymatiques de neutralisation du facteur Xa et du GDXa par le TFPI et l'antithrombine. Dans une seconde partie, nous avons étudié in silico les interactions entre la chaîne lourde du facteur Xa et le TFPI pour détecter les zones d'interaction défavorables. Cette étude a identifié des acides aminés du facteur Xa qui pourraient être substitués pour optimiser l'interaction avec le TFPI. Les résultats in silico ont orienté nos choix de mutagenèse dirigée pour concevoir différents variants moléculaires du GDXa (R138F, R138G, R138I) où l'arginine 138 est substituée. Ces variants protéiques ont été produits de façon recombinante dans des cellules HEK293E. La capacité des différents variants à restaurer la génération de thrombine de plasmas d'hémophiles a été testée avec les surnageants de culture cellulaires correspondants. Résultats : Dans la première partie, nous avons montré que le GDXa est capable de restaurer la génération de thrombine de plasmas d'hémophiles A et B sans et avec inhibiteurs. Comparativement au facteur Xa, le GDXa montre une affinité moindre pour le TFPI tandis que les affinités du GDXa et du facteur Xa pour l'antithrombine sont identiques. Enfin, malgré une demi-vie courte, l'effet du GDXa sur la génération de thrombine est maintenu pendant au moins une heure. Dans la seconde partie, nous avons produit les différents variants R138F, R138G et R138I en cellules HEK293E et montré que les surnageants de culture cellulaire étaient capables de restaurer la génération de thrombine de plasmas d'hémophiles de façon plus efficace que le GDXa. Conclusion : Comme le GDXa est capable de restaurer la génération de thrombine de plasmas d'hémophiles, nos résultats suggèrent que le GDXa pourrait être une alternative efficace aux thérapeutiques hémostatiques court-circuitantes actuelles chez les hémophiles sans ou avec inhibiteurs. Les résultats obtenus renforcent l'hypothèse que l'activité pro-coagulante du GDXa serait liée à la formation d'un complexe GDXa-TFPI limitant la formation du complexe Xa-TFPI nécessaire à l'inhibition physiologique du complexe ténase extrinsèque. De plus, notre approche rationnelle basée sur une étude in silico visant à augmenter l'affinité du TFPI pour le GDXa a permis de produire différents variants moléculaires du GDXa dont l'activité procoagulante in vitro est augmentée par rapport au GDXa. / Background: Hemophilia is caused by deficiencies in coagulation factor VIII or IX, resulting in direct blockade of the intrinsic tenase complex and indirect blockade of the extrinsic tenase complex which is rapidly inhibited upon binding of factor Xa to tissue factor pathway inhibitor (TFPI). We evaluated the ability of Gla-domainless factor Xa (GDXa), a truncated form of factor Xa devoid of procoagulant properties, to bind to TFPI and to alleviate the physiological inhibition of the extrinsic tenase. Design and Methods: In the first part of this work, we evaluated the ability of GDXa to restore coagulation in plasmas from hemophilia A and B patients without and with inhibitors, using a thrombin generation assay triggered by a low concentration of tissue factor. We then compared its efficacy to generate thrombin to depletion of antithrombin or TFPI by specific antibodies. Finally, we compared the kinetics of neutralization of factor Xa and GDXa by antithrombin and TFPI. In the second part of this work, we realized an in silico study of the interactions between factor Xa heavy chain and TFPI. The aim was to detect unfavorable interactions and to identify amino-acid candidates for mutagenesis in order to increase affinity for TFPI. Taking into account the results of this in silico study, we produced by genic engienering different molecular variants of GDXa (R138F, R138G, R138I) where Arg138 was substituted by site directed mutagenesis. Proteins were produced in HEK293E cells. We tested dialyzed cell culture supernatants containing each variant to restore thrombin generation in plasmas from severe hemophilia patients. Results: In the first part of this work, we showed that GDXa was able to restore thrombin generation in plasma samples from hemophiliacs. This effect was observed for plasma from hemophilia A patients without or with inhibitors and for plasma from hemophilia B patients. GDXa had a lower affinity than factor Xa for TFPI whereas the affinities of both proteins for antithrombin were similar. Finally, despite a short half-life in plasma, the effect of GDXa on thrombin generation was sustained for at least one hour. In the second part of this work, we produced the different variants R138F, R138G et R138I in HEK293E cells and showed that cell culture supernatants were able to restore thrombin generation in a more efficient way than GDXa. Conclusions: As GDXa was able to restore thrombin generation in plasma from hemophilia patients, our results suggest that it may be an effective alternative to current treatments for hemophilia with or without inhibitors. Results sustained the hypothesis that GDXa coagulant activity is through TFPI binding and competition with factor Xa to bind TFPI resulting in limiting factor Xa-TFPI formation, which is essential for inhibition of extrinsic tenase complex. Furthermore, rational design of GDXa variants based on an in silico study lead to production of proteins whose coagulant activity is increased compared to GDXa."

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:51:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 568781 bytes, checksum: e6beb96802418d9a09f3cb5c6661297e (MD5) Previous issue date: 2013-08-30 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The use P solubilizing microorganisms are an alternative for a sustainable use of P against a backdrop of depletion of high-grade ores. Nevertheless, the chemical characteristics of rock phosphates (RP), particularly the level of toxic elements, can affect the efficiency of microbial solubilization. Fluoride (F-) released from fluorapatites has been shown to significantly inhibit P solubilization by Aspergillus niger, stimulating the search for alternatives to overcome F- toxicity. Thus, the aim of this study was to select A. niger mutants efficient at P solubilization in the presence of F-. Three selected mutants were also characterized as to their P solubilization mechanisms and the solubilization potential of different P sources. Twenty-nine mutants were obtained that presented changes in their phosphate solubilization activity in comparison to the wild type (WT). The mutant FS1-331 showed higher solubilization of Araxá RP, while FS1-555 promoted higher soluble P when grown in media with calcium phosphate supplemented with F- and in those with pure P sources. These mutants also showed higher tolerance to F- than the WT and displayed changes in the production of organic acids. The higher production of oxalic acid by FS1-331 and FS1-555 correlated with their improved capacity of Araxá RP solubilization. A mutant with decreased P solubilization capacity showed lower production of organic acids, corroborating the importance of these compounds for RP solubilization. FS1-331 was more efficient at solubilizing Araxá, Catalão, and Patos de Minas RPs than the WT and FS1-555. The variation in P solubilization capacity of the mutants obtained in this work may help clarify the RP solubilization mechanisms by A. niger. Moreover, the mutants with better performance selected in this work show potential for use in microbial RP solubilization systems with P sources rich in fluoride. / O uso dos micro-organismos solubilizadores de fosfato (P) é uma alternativa para o uso sustentável do P tendo em vista a diminuição das reservas fosfáticas de alta qualidade. As características químicas dos fosfatos de rocha (FR), em especial o nível de elementos tóxicos, podem influenciar a eficiência de solubilização microbiana. O fluoreto (F-) liberado de fluorapatitas inibi significativamente o processo de solubilização por Aspergillus niger FS1. Assim, o objetivo deste estudo foi selecionar mutantes de A. niger eficientes na solubilização de fosfato na presença de F-. Três mutantes selecionados foram também caracterizados quanto aos mecanismos de solubilização de fosfato e ao potencial de solubilização de diferentes fontes de P. Vinte e nove mutantes com alterações na solubilização de fosfato foram obtidos. O mutante FS1-331 demonstrou maior potencial de solubilização de fosfato de Araxá, enquanto que o mutante FS1-555 aumentou o P solubilizado em meio de cultura com fosfato de cálcio suplementado com F- e naqueles com fontes sintéticas de P. Os mutantes avaliados mostraram maior tolerância ao F- do que o tipo selavagem e tiveram a produção de ácidos orgânicos alterada. A maior produção de ácido oxálico pelos mutantes FS1-331 e FS1-555 relacionou-se com o melhor desempenho dessas estiprpes na solubilização de fosfato de Araxá. Um mutante com solubilização de P diminuída (FS1-375) apresentou menor produção de ácidos orgânicos quando comparado ao tipo selvagem, corroborando a importância desses compostos para o processo de solubilização de FRs. O mutante FS1-331 foi o mais eficiente na solubilização dos FRs de Araxá, Catalão e Patos de Minas. A variação na solubilização de P das estirpes fúngicas estudadas pode contribuir para a melhor compreensão do processo de solubilização de fosfatos por A. niger. Além disso, os mutantes mais eficientes obtidos apresentam alto potencial de aplicação em sistemas microbianos de solubilização de fosfatos com fontes de P ricas em fluoreto.

A exposição a tintas, as quais contêm solventes orgânicos e metais, pode levar a danos no DNA e formação de espécies reativas (ER), que podem lesar diversas classes de moléculas. Em vista disso, este trabalho teve como objetivo avaliar possíveis danos oxidativos, genotóxicos e mutagênicos em 33 indivíduos, do sexo masculino, ocupacionalmente expostos a tintas há, no mínimo, 6 meses. Para o grupo controle, foram selecionados 29 indivíduos saudáveis, não expostos a tintas, pareados em idade com o grupo exposto. A fim de verificar a influência do descanso do fim de semana, foram realizadas coletas na segunda-feira pela manhã e na sexta-feira ao final da jornada de trabalho. Os danos oxidativos foram avaliados pelos produtos de reação com o ácido tiobarbitúrico (TBARS), proteínas carboniladas (PC) e atividade das enzimas antioxidantes superóxido dismutase (Sod) e catalase (Cat). Foram medidos, ainda, o ácido hipúrico (AH) e o ácido deltaaminolevulínico (ALA), marcadores urinários de exposição ao tolueno e ao chumbo, respectivamente. A genotoxicidade foi avaliada pelo ensaio cometa (em sangue periférico) e pelo teste de micronúcleos (MN) (em linfócitos e células da mucosa bucal). Não foi observado aumento significativo nos níveis de TBARS no grupo exposto quando comparado ao grupo controle. Entretanto, verificou-se, neste grupo, um maior índice de danos aos lipídeos nas amostras coletadas na sexta-feira comparado com as amostras coletadas na segunda-feira (p = 0,008; z = -2,637). Ao final da semana (amostras coletadas na sexta-feira), os indivíduos expostos a tintas apresentaram mais danos às proteínas em comparação com o grupo controle (p = 0,032; z = -2,14). Observou-se também, que os trabalhadores expostos a tintas tiveram uma diminuição nas atividades de Sod (p = 0,003; z = 2,935) e Cat (p = 0,025; z = -2,247) nas amostras de segunda-feira, bem como valores mais elevados de AH (p = 0,010; z = - 2,591) e de ALA (p = 0,000; z = -4,487). A exposição a tintas induziu um aumento significativo dos danos ao DNA (principalmente classes um e dois), tanto nas amostras coletadas na segunda (p = 0,000; z = - 5,356) quanto nas de sexta-feira (p = 0,000; z = -6,456). Apesar de não ter sido encontrado um aumento na frequência de MN em linfócitos ou em células da mucosa bucal no grupo exposto, observou-se um aumento de nuclear buds (NBUDs) (segunda-feira, p = 0,004, z = - 2,894), uma diminuição do índice de divisão nuclear (IDN) (sexta-feira, p = 0,000, z = -4,78) nos linfócitos e um aumento na frequência de células com cromatina condensada nas células da mucosa bucal (segunda-feira, p = 0,000, z = -4,503; sexta-feira, p = 0,000, z = -5,203), indicativo de amplificação gênica e indução de mecanismos apoptóticos nestas células. Observou-se uma correlação positiva entre o índice de danos no DNA (ensaio cometa) e o tempo de exposição a tintas (r = 0,376; p = 0,031), assim como entre o tempo diário de exposição a tintas e a frequência de micronúcleos (segunda-feira, r = 0,450; p = 0,018) e de NBUDs (sexta-feira, (r = 0,402; p = 0,038) nos indivíduos expostos. Embora outros estudos sejam necessários, esses resultados mostram que a exposição ocupacional a tintas pode induzir um aumento de danos no DNA, os quais parecem estar sendo reparados durante o descanso do final de semana. / Submitted by Marcelo Teixeira (mvteixeira@ucs.br) on 2014-05-29T19:53:19Z No. of bitstreams: 1 Dissertacao Carina Cassini.pdf: 626115 bytes, checksum: 4477a810de80e2c9702e22c8302fba89 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-05-29T19:53:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao Carina Cassini.pdf: 626115 bytes, checksum: 4477a810de80e2c9702e22c8302fba89 (MD5) / Organic solvents and metals, widely used in paints, can lead to DNA damages and reactives species (RS) generation. The aim of this study was to evaluate possibles oxidative, genotoxic and mutagenic damages in 33 male workers exposed for at least six months to paint. To constitute the control group 29 healthy individuals were choosen, without paint exposure, which matched in age with exposed group. Two sampling were performed to verify a possible DNA repair during the weekend: in the beginning and at the end of work week. The oxidative damages were evaluated by thiobarbituric acid reaction products (TBARS), carbonylated proteins (CP), superoxide dismutase (Sod) and catalase (Cat) activities. Hippuric acid (HA) and delta-aminolevulinic acid (ALA) were used as toluene and lead markers exposure, respectively. The genotoxicity was evaluated by comet assay (in peripherical blood) and by micronucleus (MN) test (in limphocytes and exfoliated buccal cells). The results showed no significant increase in TBARS levels in exposed group in relation to the control group. However, the lipidic damages was higher in Friday samples comparing to Monday samples (p = 0.008; z = -2.637). The proteins damage was higher in exposed group in comparison to control group exclusively in Friday samples (p = 0.032; z = -2.14). It was also observed that the workers exposed to paints showed lower Sod (p = 0.003; z = 2.935) and Cat (p = 0.025; z = -2.247) activities in Monday samples. The exposed group presented HA levels (p = 0.010; z = - 2.591) and ALA levels (p = 0.000; z = -4.487) higher than the control group. The workers exposed to paints presented a significant increase in DNA damage in both Monday (p = 0.000; z = -5.356) and Friday (p = 0.000; z = -6.456) samples. No increase was observed in MN frequency in limphocytes and buccal cells. However, the individuals exposed to paints showed an increase in nuclear buds (NBUDS) (Monday samples, p = 0.004, z = -2.894), a reduction in nuclear division index (NDI) (Friday samples, p = 0.000, z = -4.78) in lymphocytes and an increase in condensed chromatin frequency in buccal cells (Monday samples, p = 0.000, z = -4.503; Friday samples, p = 0.000, z = -5.203), indicating genic amplification and apoptosis induction. The DNA damage index (comet assay) correlated positively with average working time (r = 0.376; p = 0.031). It was also observed a positive correlation between time daily exposure and MN (Monday samples, r = 0.450; p = 0.018) and NBUDs (Friday samples: r = 0.402; p = 0.038) frequency. These results showed that paint exposure is able to generate DNA damages and these damages are being repaired during the weekend.

Made available in DSpace on 2014-12-17T14:13:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 LucilaCME.pdf: 777399 bytes, checksum: 0872bb60e8e228e6574e4fe1b87a20f8 (MD5) Previous issue date: 2006-12-21 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Cient?fico e Tecnol?gico / The Pitimbu River is located at the oriental portion of the State of Rio Grande do Norte, including three importants cities named Maca?ba, Parnamirim e Natal. Although its high importance as a water source, which supplys great part of the South Zone of the Natal city, this river receives a large quantity of domestic and industrial waste water without treatment. The Pitimbu River headhas its river-head located in the city of Macaiba, goes through Parnamirim, then it flowing into at the Jiqui Lake in Natal. The aim of this study was to evaluate, qualitatively and quantitatively, the environmental quality of the Pitimbu River by genotoxicity bio-assays, which are important tools for genetics toxicological evaluation. In this work, five samples sites, distributed along the river, were used to collect water samples. Another point site, located near Jiqui lake, was used to collect drinkable water, which was treated by CAERN, the water treatment entreprise of Rio Grande do Norte. The following assays where used to evaluate the quality of these samples: Allium cepa assay; Comet assay; Micronuclei (MN) assay; and Ames test. For the Allium cepa assay, sixteen specimes where used for each water sample from the sample sites. In this assay both microscopic, like cytogenetic damage, and macroscopic aspects, as morphological variation were evaluated. Red blood cells from periferical blood of the Crenicichla menezesi native specie were used not only for the MN assay, but also for the Comet assay. These fishes were collected at different points on the Pitimbu River and the negative control was developed using fishes of the same species that were bring to the laboratory and maintained for 100 days in the optimal experimental conditions. For the Ames test, TA100, YG1042, TA98 and YG1041 strains were used in the directed method without metabolic activation. The results found by the Allium cepa assay showed that two water sample sites induced increase of mitotic index (IM). Additionally, compared to the control, all the water samples increased the chromossomal aberrations frequency and/or micronucleus. Among the sample sites, two also showed an abnormal growth rate in its root and two samples induced morphological alteration. With the MN test in red blood cells, a high frequence of MN was observed in tree sample. By comparing all the results obtained on the water sample points and with the negative control, a significant variation on the MN frequency was observed. Positive results were also observed for the same sample to water test by the Comet assay. These results allow concluding that the proposed specie Crenicichla menezesi has a good profile as a bio-indicator for the evaluation of environmental water quality and the MN and comet test can be usuful for in situ evaluation. By the Ames test, it was possible to detect the mutagenic activity on the waters from the Pitimbu River in different levels of mutagenicity. This result suggests that this river has several substances that induced changes directly to the DNA. The mechanisms involved to this phenomenon could be by both processes, by changing of the reading frame and by nucleotide substitution. These data set indicate the presence of mutagenic agents, which can represent in risk to biot and human beens / O rio Pitimbu localiza-se no litoral oriental do Estado do Rio Grande do Norte, mais precisamente na grande Natal, nos munic?pios de Maca?ba, Parnamirim e Natal. Embora se trate de um importante manancial, abastecendo parte da zona sul da capital do Estado, suas ?guas t?m sido alvo de dejetos industriais e dom?sticos, os quais n?o recebem tratamento adequado. O rio Pitimbu tem sua nascente situada no munic?pio de Maca?ba e des?gua na lagoa do Jiqu?, e parte em dire??o a praia de Pirangi, lan?ando suas ?guas no mar. O presente estudo teve como objetivo avaliar quantitativamente e qualitativamente a qualidade das ?guas do rio Pitimb?, atrav?s de bioensaios de genotoxicidade que s?o ferramentas de grande import?ncia nos estudos de gen?tica toxicol?gica. Neste trabalho foram coletadas amostras de ?gua de cinco pontos distribu?dos ao longo do rio e amostras da ?gua da lagoa do Jiqui ap?s tratamento feito pela CAERN (Companhia de ?guas e Esgotos do Rio Grande do Norte). Essas amostras foram analisadas atrav?s dos seguintes ensaios: teste de Allium cepa; o ensaio Cometa; o teste de Micron?cleo (MN); e o teste de Ames. Para realiza??o do teste em Allium cepa foram utilizados 16 indiv?duos para cada amostra testada, foram feitas an?lises dos aspectos microsc?picos (danos citogen?ticos) e macrosc?picos (varia??es morfol?gicas). Eritr?citos de sangue perif?rico da esp?cie nativa Crenicichla menezesi, foram utilizados tanto para execu??o do teste de MN como para o ensaio Cometa, os exemplares desta esp?cie foram coletados em diferentes pontos do rio Pitimbu e o controle negativo foi realizado com peixes da mesma esp?cie que foram trazidos para o laborat?rio e mantidos por 100 dias em condi??es ideais. Para execu??o do teste de Ames foram utilizadas as linhagens TA100, YG1042, TA98 e YG1041, sem ativa??o metab?lica, o qual foi realizado pelo m?todo direto. Os resultados obtidos no teste de Alium cepa monstraram que dois pontos de coleta de ?gua induziram altera??es no ?ndice mit?tico (?ndice de prolifera??o celular); al?m disso, todas as amostras de ?gua do rio induziram aumento na freq??ncia de aberra??es cromoss?micas e/ou de MN, em rela??o ao grupo controle. Dois dos pontos de coleta tamb?m apresentaram altera??o no crescimento da raiz e dois pontos produziram modifica??es morfol?gicas. Com o teste MN em eritr?citos uma alta freq??ncia de MN foi observada para tr?s amostras coletadas. Resultados positivos nas mesmas amostras teste tamb?m foram obtidos com o ensaio cometa. Estes resultados sugerem que a esp?cie Crenicichla menezesi pode ser considerado como um bom bioindicador para an?lise de qualidade ambiental e que os testes de MN e cometa s?o vi?veis para an?lise in situ. No teste de Ames, foi poss?vel detectar a presen?a de atividade mutag?nica nas ?guas do rio Pitimbu em diferentes n?veis de mutagenicidade, sugerindo a presen?a de compostos que agem de forma direta no DNA tanto por mudan?a do quadro de leitura quanto por substitui??o de pares de bases. Em conjunto os dados indicam a presen?a de agentes mutag?nicos, o que pode representar risco para a biota e os seres humanos

Cytochromes P450 represent a large group of proteins metabolizing variety of substrates. Many of them are responsible for metabolism of xenobiotics including drugs and chemical carcinogens. Heme-protein cytochrome b5 is a single-electron donor cooperating with a NADPH:cytochrome P450 reductase and NADH:cytochrome b5 reductase 3 enzyme. Cytochrome b5 can affect the xenobiotic metabolism via modulation of the cytochromes P450 activity. One of the goals of the Ph.D. thesis was to utilize site directed mutagenesis of cytochromes P450 family 1 to elucidate the mechanism of their nitroreductase activity. Another aim was to study the interaction between cytochrome b5 and cytochromes P450 of the 1A subfamily using site directed mutagenesis on presumed protein-protein contact interface. Another goal was to utilize the combination of theoretical and experimental approaches to explain variance in the reduction state of several human cytochromes P450 heterologously expressed in intact bacterial cells. The results found in the thesis show that nitroreductase activity of CYP1A1, CYP1A2 and CYP1B1 is mediated by the presence of a particular hydroxyl group in their active centre. Single mutation introducing a hydroxyl group to the specific part of CYP1B1 active site to the active site turned on its artificial...

A exposição a tintas, as quais contêm solventes orgânicos e metais, pode levar a danos no DNA e formação de espécies reativas (ER), que podem lesar diversas classes de moléculas. Em vista disso, este trabalho teve como objetivo avaliar possíveis danos oxidativos, genotóxicos e mutagênicos em 33 indivíduos, do sexo masculino, ocupacionalmente expostos a tintas há, no mínimo, 6 meses. Para o grupo controle, foram selecionados 29 indivíduos saudáveis, não expostos a tintas, pareados em idade com o grupo exposto. A fim de verificar a influência do descanso do fim de semana, foram realizadas coletas na segunda-feira pela manhã e na sexta-feira ao final da jornada de trabalho. Os danos oxidativos foram avaliados pelos produtos de reação com o ácido tiobarbitúrico (TBARS), proteínas carboniladas (PC) e atividade das enzimas antioxidantes superóxido dismutase (Sod) e catalase (Cat). Foram medidos, ainda, o ácido hipúrico (AH) e o ácido deltaaminolevulínico (ALA), marcadores urinários de exposição ao tolueno e ao chumbo, respectivamente. A genotoxicidade foi avaliada pelo ensaio cometa (em sangue periférico) e pelo teste de micronúcleos (MN) (em linfócitos e células da mucosa bucal). Não foi observado aumento significativo nos níveis de TBARS no grupo exposto quando comparado ao grupo controle. Entretanto, verificou-se, neste grupo, um maior índice de danos aos lipídeos nas amostras coletadas na sexta-feira comparado com as amostras coletadas na segunda-feira (p = 0,008; z = -2,637). Ao final da semana (amostras coletadas na sexta-feira), os indivíduos expostos a tintas apresentaram mais danos às proteínas em comparação com o grupo controle (p = 0,032; z = -2,14). Observou-se também, que os trabalhadores expostos a tintas tiveram uma diminuição nas atividades de Sod (p = 0,003; z = 2,935) e Cat (p = 0,025; z = -2,247) nas amostras de segunda-feira, bem como valores mais elevados de AH (p = 0,010; z = - 2,591) e de ALA (p = 0,000; z = -4,487). A exposição a tintas induziu um aumento significativo dos danos ao DNA (principalmente classes um e dois), tanto nas amostras coletadas na segunda (p = 0,000; z = - 5,356) quanto nas de sexta-feira (p = 0,000; z = -6,456). Apesar de não ter sido encontrado um aumento na frequência de MN em linfócitos ou em células da mucosa bucal no grupo exposto, observou-se um aumento de nuclear buds (NBUDs) (segunda-feira, p = 0,004, z = - 2,894), uma diminuição do índice de divisão nuclear (IDN) (sexta-feira, p = 0,000, z = -4,78) nos linfócitos e um aumento na frequência de células com cromatina condensada nas células da mucosa bucal (segunda-feira, p = 0,000, z = -4,503; sexta-feira, p = 0,000, z = -5,203), indicativo de amplificação gênica e indução de mecanismos apoptóticos nestas células. Observou-se uma correlação positiva entre o índice de danos no DNA (ensaio cometa) e o tempo de exposição a tintas (r = 0,376; p = 0,031), assim como entre o tempo diário de exposição a tintas e a frequência de micronúcleos (segunda-feira, r = 0,450; p = 0,018) e de NBUDs (sexta-feira, (r = 0,402; p = 0,038) nos indivíduos expostos. Embora outros estudos sejam necessários, esses resultados mostram que a exposição ocupacional a tintas pode induzir um aumento de danos no DNA, os quais parecem estar sendo reparados durante o descanso do final de semana. / Organic solvents and metals, widely used in paints, can lead to DNA damages and reactives species (RS) generation. The aim of this study was to evaluate possibles oxidative, genotoxic and mutagenic damages in 33 male workers exposed for at least six months to paint. To constitute the control group 29 healthy individuals were choosen, without paint exposure, which matched in age with exposed group. Two sampling were performed to verify a possible DNA repair during the weekend: in the beginning and at the end of work week. The oxidative damages were evaluated by thiobarbituric acid reaction products (TBARS), carbonylated proteins (CP), superoxide dismutase (Sod) and catalase (Cat) activities. Hippuric acid (HA) and delta-aminolevulinic acid (ALA) were used as toluene and lead markers exposure, respectively. The genotoxicity was evaluated by comet assay (in peripherical blood) and by micronucleus (MN) test (in limphocytes and exfoliated buccal cells). The results showed no significant increase in TBARS levels in exposed group in relation to the control group. However, the lipidic damages was higher in Friday samples comparing to Monday samples (p = 0.008; z = -2.637). The proteins damage was higher in exposed group in comparison to control group exclusively in Friday samples (p = 0.032; z = -2.14). It was also observed that the workers exposed to paints showed lower Sod (p = 0.003; z = 2.935) and Cat (p = 0.025; z = -2.247) activities in Monday samples. The exposed group presented HA levels (p = 0.010; z = - 2.591) and ALA levels (p = 0.000; z = -4.487) higher than the control group. The workers exposed to paints presented a significant increase in DNA damage in both Monday (p = 0.000; z = -5.356) and Friday (p = 0.000; z = -6.456) samples. No increase was observed in MN frequency in limphocytes and buccal cells. However, the individuals exposed to paints showed an increase in nuclear buds (NBUDS) (Monday samples, p = 0.004, z = -2.894), a reduction in nuclear division index (NDI) (Friday samples, p = 0.000, z = -4.78) in lymphocytes and an increase in condensed chromatin frequency in buccal cells (Monday samples, p = 0.000, z = -4.503; Friday samples, p = 0.000, z = -5.203), indicating genic amplification and apoptosis induction. The DNA damage index (comet assay) correlated positively with average working time (r = 0.376; p = 0.031). It was also observed a positive correlation between time daily exposure and MN (Monday samples, r = 0.450; p = 0.018) and NBUDs (Friday samples: r = 0.402; p = 0.038) frequency. These results showed that paint exposure is able to generate DNA damages and these damages are being repaired during the weekend.

A troponina (Tn) regula a contração do músculo estriado esquelético de vertebrados. Ela é composta de três subunidades: troponina I (TnI), troponina C (TnC) e troponina T (TnT). A TnI tem a função inibitória que é neutralizada pela ligação de Ca2+ nos sítios regulatórios do N-domínio da TnC, e a TnT posiciona o complexo no filamento fino. Para monitorar o sinal do Ca2+ sendo transmitido da TnC para a TnI as propriedades espectrais únicas do 5-hidroxitriptofano (5HW) foram utilizadas. O 5HW foi incorporado em mutantes pontuais de TnI com um único códon para triptofano. Foram identificadas duas sondas espectrais intrínsecas na TnI capazes de detectar a ligação de Ca2+ na Tn: as TnIs com 5HW nas posições 100 e 121. Complexos troponina reconstituídos com estes mutantes fluorescentes de TnI, Tn-TnIF100HW e Tn-TnIM121HW, apresentaram respectivamente 12 e 70 % de aumento na intensidade do espectro de emissão devido à ligação de Ca2+ na TnC. Nos complexos binários (TnC-TnI) as TnIs com 5HW nas posições 106 e 121 também captam a ligação do Ca2+ na TnC. A análise da fluorescência destas sondas demonstrou que: 1) as regiões da TnI que respondem ao N-domínio regulatório da TnC ocupado com Ca2+ são a região inibitória da TnI, resíduos 96 até 116, e a região vizinha que inclui a posição 121 da TnI; 2) mutações pontuais e a incorporação de 5HW na TnI podem afetar tanto a afinidade como a cooperatividade da ligação de Ca2+ na TnC, confirmando o papel da TnI em modular a afinidade da TnC por Ca2+; 3) as constantes de dissociação de Ca2+ surpreendentemente altas, Kd ~ 10-8 M, calculadas a partir dos sinais das sondas na região inibitória da TnI, sugerem a possibilidade de que os sítios do domínio N-terminal da TnC sejam os sítios de ligação de Ca2+ de maior afinidade no complexo troponina. / Vertebrate striated muscle contraction is regulated by troponin (Tn). Tn is composed of three subunits: troponin I (TnI), troponin C (TnC) and troponin T (TnT). TnI has an inhibitory role that is neutralized by calcium binding to the regulatory sites in the N-domain of TnC, and TnT positions the troponin complex on the thin filament. In order to follow the Ca2+ induced conformational change that is transmitted from TnC to TnI, the unique spectral properties of 5-hydroxytryptophan (5HW) incorporated as point-mutants of TnI were used. It was possible to identify two new TnI intrinsic spectral probes sensitive to Ca2+ binding to Tn: TnI with single 5HW at positions 100 and 121. Trimeric troponin complexes reconstituted with two fluorescent mutants of TnI, Tn-TnIF100HW and Tn-TnIM121HW, showed respectively 12 and 70 % increase in the emission spectra when Ca2+ bound to TnC. In the binary complexes (TnC-TnI) two TnIs with 5HW at positions 106 and 121 were also sensitive to Ca2+ binding to TnC. Fluorescence analysis of these probes showed: 1) the regions in TnI that respond to Ca2+ binding to the regulatory N-domain of TnC are the inhibitory region of TnI (residues 96 to 116), and a neighbor region that includes position 121; 2) point mutations and incorporation of 5HW in TnI can affect both the affinity and the cooperativity of Ca2+ binding to TnC, confirming the role of TnI as a modulator of the Ca2+ affinity of TnC; 3) the high dissociation constant for sites in the N-terminal domain of TnC (Kd ~ 10-8 M), derived from data using probes in the inhibitory region of TnI suggested the possibility that these sites are the high affinity Ca2+ binding sites in the troponin complex.

Nesse projeto, foi desenvolvido um sistema biológico que denominamos Dosímetro de DNA, com o objetivo de avaliar a ação genotóxica da radiação UV solar a partir da produção de lesões na molécula de DNA. Para determinar os diferentes tipos de danos, utilizamos enzimas de reparo de DNA e anticorpos específicos. Complementando estas análises, foram ainda realizados ensaios de frequência de mutação e da taxa de inativação biológica de DNA. Através da utilização dessa tecnologia foi possível confirmar a produção de lesões CPDs e 6-4PPs após a irradiação em lâmpadas de UVB e UVA. Outro fator importante foi a maior indução de danos oxidativos que a banda de UVA apresentou em relação à de UVB. Exposições ambientais demonstram claramente que a luz solar possui diferentes perfís de indução de lesões de DNA, que variam de acordo com a localidade da irradiação, e que fenômenos biológicos como inativação de DNA e mutagênese são diretamente dependentes da presença de fotoprodutos na molécula de DNA e não estão associados aos danos oxidativos. Portanto, o sistema Dosímetro de DNA é capaz de fornecer uma ampla compreensão da ação genotóxica da luz solar e informações inovadoras que poderão ser utilizadas no desenvolvimento de substâncias fotoprotetoras mais eficientes. / To better understand the impact of solar UV radiation upon DNA molecule, we developed a biological system based on the exposure of plasmid DNA to artificial and natural UV sources. The quantification of DNA lesions was performed through the use of specific DNA repair enzymes and antibodies. The biological effects of sunlight, as well as artificial UV-radiation, were evaluated through the determination of the DNA inactivation rate and mutagenesis frequency. Through the application of this technology, we could detect the induction of CPDs and 6-4PPs after exposures to UVB and UVA lamps. Interestingly, the induction of oxidative damages was significantly higher after UVA than UVB radiation. Surprisingly, the profiles of induction of DNA damages observed after sunlight exposures have presented variations especially according to the latitude. In addition, our data clearly indicate that the induction of these biological effects is directly related to the presence of photoproducts in UV-exposed DNA samples, and suggest that oxidative damages are not related to these biological processes. Therefore, a very suitable system was developed capable of providing a wide comprehension of the biological effects of solar-UV radiation upon the DNA molecule.

O presente trabalho teve por objetivo desenvolver tecnologia in vitro e associá-la à mutagênese, e avaliar plantas V 5 e V6 quanto aos caracteres agronômicos de produção em área de ocorrência da doença fusariose, visando ao melhoramento genético da pimenta-do-reino para obtenção de plantas tolerantes e/ou resistentes à doença fusariose. A aplicação das técnicas in vitro iniciou-se através da obtenção de plantas doadoras de explantes, a partir de estacas em casa-de-vegetação e, de sementes e embriões zigóticos in vitro. O processo de micropropagação foi desenvolvido a partir de gemas de plantas obtidas in vitro através do estabelecimento de condições adequadas de cultivo em meios de cultura apropriados para multiplicação de gemas, enraizamento e obtenção de "plantlets", e de tipo de substrato para aclimatação e formação de mudas. Após a definição deste processo, gemas de plantas de casa-de-vegetação foram submetidas a diferentes tratamentos de assepsia e as sobreviventes micropropagadas. Seleção in vitro foi estabelecida ao cultivar isolados patogênicos do fungo Fusarium solani f. sp. piperis em meio Czapek-Dox e, através da curva de crescimento foi estabelecido o período de 28 dias de cultivo mais adequado para obtenção de filtrado da cultura do fungo. Diferentes concentrações de filtrado e formas de esterilização foram testadas em meio de cultura de multiplicação de gemas e determinou-se a concentração de 55% do filtrado do fungo (v/v) sob a esterilização por duas autoclavagens, adequada para causar 100% de mortalidade de gemas susceptíveis à doença. Simultaneamente, testes de radiossensitividade foram desenvolvidos através da irradiação gama em gemas in vitro e a dose de 20Gy foi escolhida para indução de mutações. As gemas irradiadas que passaram por vários ciclos de multiplicação e sobreviveram ao agente seletivo, filtrado de cultura do fungo, estão sendo clonadas para serem submetidas à seleção artificial com esporos do fungo em casa-de-vegetação, seleção natural em campo de ocorrência da doença e avaliação agronômica. Testes indicaram, a concentração de 2x10 6 esporos/ml em suspensão e a aplicação no solo do fungo adequada para seleção em casa-de-vegetação. As plantas V5 e V6 avaliadas em campo quanto a mortalidade e caracteres de produção apresentaram performance semelhante às plantas da cultivar original quanto à média de comprimento de espiga (8,4 cm), peso (4,42g) e número de frutos (40 frutos) por espiga, peso de 100 frutos (10,67g) e rendimento de pimenta preta (> 30%). Entretanto, melhores resultados para a média de produção de pimenta verde (3.290g) e sobrevivência em área de ocorrência da fusariose. As análises por componentes principais e variáveis canônicas apresentaram divergência genética entre as plantas originadas por estacas que sofreram irradiação gama e aquelas da cultivar original. / The purposes of the present work were to develop in vitro technology, associating it with mutagenesis, and to evaluate the V5 and V6 plants based on agronomical characters of production in Fusarium incidence areas, aiming at the genetic improvement of black pepper to obtain tolerant and/or resistant plants to the disease. The use of in vitro techniques started with the production of explant donor plants from greenhouse-grown cuttings and from seeds and in vitro zygotic embryos. The micropropagation process was developed using young shoots of in vitro plants by establishment of proper growing conditions in culture media for multiplication, rooting and production of plantlets, and by determining a suitable substrate type for acclimatization and growing of plantlets. After the process was defined, young shoots obtained from greenhouse grown plants underwent different aseptic treatments and the surviving plantlets were micropropagated. In vitro selection was carried out by cultivating pathogenic isolates of Fusarium solani f. sp. piperis in Czapek-Dox medium and, by using a growing curve, the most suitable growing period (28 days) for obtaining the fungus culture filtrate was defined. Different filtrate concentrations and sterilization techniques were tested in culture medium for young shoot multiplication. A concentration of 55% (v/v) of fungus filtrate under sterilization by double autoclavation was considered adequate to cause 100% mortality of fusariosis susceptible young shoots. Simultaneously, radiosensitivity tests were carried out through gamma irradiation of in vitro young shoots and dose of 20Gy was selected for mutation induction. Irradiated young shoots which underwent several multiplication cycles and survived the selective agent, fungus culture filtrate, are being cloned in order to be submitted to artificial selection with the fungus spores in greenhouse, to natural selection in a disease incidence area and to agronomical evaluation. These tests indicated that the concentration of 2x10 6 spores/ml in suspension and the application of the fungus on soil were appropriate for greenhouse selection. The V5 and V6 plants evaluated in field conditions for mortality and production characters showed similar performance to the original cultivar plants regarding average height (8.4 cm), weight (4.42g) and number of fruits (40 fruits) per spike, weight of 100 fruits (10.67g) and black pepper yield (>30%). However, better results were observed for average green pepper production (3,290g) and survival rates in a fusariosis incidence area. Analyses of principal components and canonic variables evidenced genetic divergence between plants grown from gamma-irradiated cuttings and the original cultivar ones.