FundaÃÃo de Amparo à Pesquisa do Estado do Cearà / O cÃncer oral representa um sÃrio problema de saÃde pÃblica mundial. Entre os tumores deste sÃtio anatÃmico, os carcinomas de cÃlulas escamosas orais (CCEO) respondem por atà 94% do total. Os mecanismos moleculares envolvidos na gÃnese e desenvolvimento tumoral ainda nÃo estÃo completamente elucidados. Algumas evidÃncias tÃm sugerido a participaÃÃo viral neste processo. AlÃm disso, estes tumores ainda carecem de marcadores confiÃveis para determinar o perfil de agressividade. Neste contexto, o presente estudo teve como objetivo avaliar a expressÃo das proteÃnas p53, E-caderina, COX-2, p16, MLH1 e MYC numa sÃrie de CCEO, considerando tambÃm a marcaÃÃo citoplasmÃtica eventualmente observada para as Ãltimas trÃs proteÃnas, confrontando os resultados entre elas e com as caracterÃsticas demogrÃficas e clÃnico-patolÃgicas. AlÃm de avaliar a prevalÃncia do PapilomavÃrus Humano (HPV) e do VÃrus Epstein-Barr (EBV) na amostra e comparÃ-las com a expressÃo das referidas proteÃnas. Materiais e MÃtodos â Cem espÃcimes de CCEO, fixados em formalina e incluÃdos em blocos de parafina, foram submetidos à imunohistoquÃmica para a detecÃÃo das referidas proteÃnas e à hibridaÃÃo in situ para detecaÃà de HPV e EBV. Resultados â Foi observada associaÃÃo referente à perda de expressÃo concomitante de p16 e MLH1 (p=0,029) e na coexpressÃo de p53 e COX-2 (p=0,045). Ademais, foi verificado que a COX-2 e o MYC nuclear estavam relacionados com a marcaÃÃo citoplasmÃtica de MLH1 (p=0,060 e p=0,018; respectivamente). A anÃlise combinada dos marcadores revelou cinco grupos principais de expressÃo alterada que eram constituÃdos, em sua maioria, de tumores mais agressivos, principalmente o grupo MLH1(-)/COX-2(+)/p16(-). Os casos com marcaÃÃo citoplasmÃtica para p16, MLH1 e/ou MYC foram mais frequentes em tumores avanÃados (p=0,009) e naqueles com metÃstases em linfonodos (p=0,001). Trinta e um casos demonstraram marcaÃÃo para HPV em tecido tumoral. O EBV nÃo foi detectado em nenhum dos casos investigados, nem no tecido tumoral nem no epitÃlio nÃo neoplÃsico. O grupo HPV(+) exibiu elevada positividade para o p16 nuclear (p=0,029) e MYC cytoplasmÃtico (p=0,039), tambÃm uma maior perda de expressÃo nuclear de MLH1 (p=0,031). Houve ainda uma tendÃncia referente ao aumento da positividade de COX-2 no grupo infectado (p=0,084). ConclusÃes â As significÃncias verificadas entre p16 e MLH1 sugerem que a ausÃncia do membro do sistema de reparo de encaixe (MMR) tambÃm favoreÃa a ocorrÃncia de mutaÃÃes no gene p16, culminando na inativaÃÃo deste supressor tumoral. As associaÃÃes de COX-2 e MYC com o MLH1 de expressÃo citoplasmÃtica suscitam um mecanismo de bloqueio de entrada de MLH1 no nÃcleo. A anÃlise combinada das proteÃnas, bem como, a marcaÃÃo citoplasmÃtica de p16, MLH1 e MYC, podem representar indicadores Ãteis na avaliaÃÃo do perfil de agressividade e, provavelmente, de prognÃstico em CCEO. Acerca dos vÃrus, nossos achados sugerem que o HPV esteja envolvido em uma importante parcela de casos de CCEO e que possa promover a expressÃo de p16 nuclear, MYC citoplasmÃtico e COX-2, e suprimir a expressÃo nuclear de MLH1. Quanto ao EBV, nÃo foram detectados EBERs (EBV-encoded small RNAs) na amostra. / The oral cancer represents a serious world public health problem. The oral squamous cell carcinomas (OSCC) account for up to 94% of the tumors of this anatomic site. The molecular mechanisms involved in the genesis and progression are still not well elucidated. Some evidences have suggested the involvement of viruses in this process. Also, these tumors still lack of reliable markers to determine the aggressiveness profile. In this context, the aim of the present study was to evaluate the expression of the proteins p53, E-cadherin, COX-2, p16, MLH1 and MYC in a serie of OSCC, including the cytoplasmic staining eventually observed for the latter three proteins, confronting the results between them and with demographic and clinico-pathological features. Besides evaluating the prevalence of Human Papillomavirus (HPV) and Epstein-Barr virus (EBV) in the sample and compare them with the expression of the referred proteins. Materials and Methods â One hundred formalin-fixed paraffin-embedded OSCC specimens were submitted to immunohistochemistry for detection of the referred proteins, and to in situ hybridization for HPV and EBV detection. Results â OSCC was associated with a concomitant lack of expression of p16 and MLH1 (p=0.029) and coexpression of p53 and COX-2 (p=0.045). Additionally, COX-2 and nuclear MYC were found to be related to exclusively cytoplasmic staining of MLH1 (p=0.060 and p=0.018, respectively). The combination analyses of the markers revealed five main groups of altered protein expression, which were mostly of the more aggressive tumors, mainly the MLH1(-)/COX-2(+)/p16(-) group. The cases with cytoplasmic staining for p16, MLH1 and/or MYC were more frequent in advanced tumors (p=0.009) and in those with lymph node metastasis (p=0.001). Thirty-one cases showed staining for HPV in tumor tissue. The EBV was not detected in any case investigated, neither in the tumor tissue nor in the non-neoplastic epithelium. The HPV(+) group demonstrated high positivity for nuclear p16 (p=0,029) and cytoplasmic MYC (p=0,039), and an increase of the lack of MLH1 nuclear expression (p=0,031). There was also a trend related to the increase of the COX-2 positivity in the HPV(+) group (p=0,084). Conclusions â The significance between p16 and MLH1 suggests that the lack of this member of mismatch repair system also favors the occurrence of mutations in the p16 gene, culminating in inactivation of this tumor suppressor. The associations of COX-2 and MYC with cytoplasmic MLH1 suggest a blocking mechanism for the entry of MLH1 into the nucleus. The combined analyses of the proteins investigated, as well as the cytoplasmic staining of p16, MLH1 and MYC, may be useful in the evaluation of the aggressive profile and probably prognosis of OSCC. Regarding the viruses, our findings suggest that the HPV is involved in an important portion of OSCC cases and that may promote the expression of the nuclear p16, cytoplasmic MYC and COX-2, and suppress the nuclear expression of MLH1. About EBV, it was not detected the EBV-encoded small RNAs (EBERs) in the sample.

Le Myélome Multiple (MM) est une hémopathie maligne caractérisée par la prolifération de plasmocytes tumoraux médullaires. MYC occupe un rôle central dans l'oncogenèse du MM car son activation est responsable de la progression du stade précurseur de MGUS en MM symptomatique. Dans ce travail, nous rapportons que l’expression de LIN28B est corrélée à celle de MYC et est associée à un mauvais pronostic dans le MM. Nous montrons que l'axe LIN28B/let-7 module l'expression de l’ARNm de MYC, lui-même cible de let-7. De plus, la perturbation de l'axe LIN28B/let-7 induit une régulation la prolifération des lignées cellulaires de MM in vitro et in vivo. L'analyse par séquençage d’ARN de modèles de KO par utilisation de la technologie CRISPR a montré que l'axe LIN28B/let-7 régule les voies de signalisation de MYC et du cycle cellulaire dans MM. Nous avons de plus établi une preuve de principe thérapeutique de la possibilité de cibler MYC par l’emploi de LNA-GapmeR contenant une séquence analogue à let-7b. Dans un modèle de xénogreffe murin, nous montrons que des niveaux élevés d'expression de let-7, par administration de LNA-GapmeR let-7b, répriment la croissance tumorale en régulant l’expression de MYC. Ces résultats révèlent un nouveau mécanisme de ciblage thérapeutique de MYC via l'axe LIN28B/let-7 dans MM. Nous nous sommes ensuite intéressés à évaluer de nouvelles formes de biomarqueurs moléculaires dans le MM par étude des miARN contenus dans les exosomes circulants. Nous avons examiné le rôle pronostique des miARN exosomaux dans une cohorte de 156 échantillons de patients uniformément traités pour un MM au diagnostic. Après analyse du profil de miARN exosomaux par séquençage de nouvelle génération, nous avons utilisé technique de qRT-PCR pour étudier la corrélation entre le niveau d’expression de 22 miARN et la survie sans progression (SSP) et la survie globale (SG). Deux miARN, à savoir let-7b et miR-18a, étaient significativement associés à la SSP et SG en analyse univariée, et étaient statistiquement significatifs après ajustement pour le système international de stratification du risque (ISS) et les marqueurs cytogénétique en analyse multivariée. Nos résultats confirment le niveau d’expression des miARN let-7b et miR-18a au sein des exosomes circulants permettent d’améliorer la stratification du risque chez les patients atteints de MM. Enfin, pour mieux comprendre le programme oncogénique piloté par MYC, nous avons étudié l’efficacité thérapeutique d’une librairie de petites sur des lignées cellulaires avec une forte expression de MYC, dans le MM. Les résultats ont permis d’identifier les rocaglates, une famille de composés inhibant l’initiation de la traduction, comme étant les plus actifs. L’étude du profil transcriptionnel par séquençage de l’ARN de lignées cellulaires de MM traitées par CMLD010509 ou DMSO a révélé l’activation d’un programme de transcription et l’inhibition d’un programme traductionnel, caractéristique de l’inactivation de HSF1 secondaire à l’inhibition de la traduction. Le profile traductionnel était étudié par spectrométrie de masse quantitative, permettant d’identifier un ensemble de protéines, tels que MYC, MDM2, CCND1, MAF et MCL-1, spécifiquement affectées par l’inhibition de la traduction liée au composé CMLD010509 dans le MM. Nous avons confirmé l’efficacité thérapeutique des rocaglates dans plusieurs modèles murins de MM. Ces résultats démontrent la possibilité de cibler le programme de traduction oncogénique lié à MYC dans MM. / MYC is a major oncogenic driver of Multiple Myeloma (MM) and yet almost no therapeutic agents exist that target MYC in MM. Here we report that the let-7 biogenesis inhibitor LIN28B correlates with MYC expression in MM and is associated with adverse outcome. We also demonstrate that the LIN28B/let-7 axis modulates the expression of MYC, itself a let-7 target. Further, perturbation of the axis regulates the proliferation of MM cells in vivo in a xenograft tumor model. RNA-sequencing and gene set enrichment analyses of CRISPR-engineered cells suggested that the LIN28/let-7 axis regulates MYC and cell cycle pathways in MM. We provide proof of principle for therapeutic regulation of MYC through let-7 with an LNA-GapmeR (locked nucleic acid-GapmeR) containing a let-7b mimic in vivo, demonstrating that high levels of let-7 expression repress tumor growth by regulating MYC expression. These findings reveal a novel mechanism of therapeutic targeting of MYC through the LIN28B/let-7 axis in MM. We next sought to establish new biomarkers in MM, enable to capture the molecular alterations of the disease. For this purpose, we examined the prognostic significance of circulating exosomal microRNAs (miRNAs) in a cohort of 156 patients with newly diagnosed MM, uniformly treated and followed. Circulating exosomal miRNAs were isolated and used to perform small RNA sequencing analysis on 10 samples and a qRT-PCR array on 156 samples. We studied the relationship between miRNA levels and patient outcomes including progression-free survival (PFS) and overall survival (OS). We identified miRNAs as the most predominant small RNAs present in exosomes isolated from the serum of MM patients and healthy controls by small RNA sequencing of circulating exosomes and used a qRT-PCR assay to measure the expression of 22 exosomal miRNAs. Two of them, namely let-7b and miR-18a, were significantly associated with both PFS and OS in the univariate analysis, and were still statistically significant after adjusting for the International Staging System (ISS), and adverse cytogenetics in the multivariate analysis. Our findings support the use of circulating exosomal let-7b and miR-18a improves the identification of patients with newly diagnosed MM with poor outcomes. Finally, to better understand the oncogenic program driven by MYC and investigate its potential as a therapeutic target, we screened a chemically diverse small molecule library for anti-MM activity in cell lines with high expression of MYC. The most potent hits identified were rocaglate-scaffold inhibitors of translation initiation. Expression profiling of MM cells revealed reversion of the oncogenic MYC-driven transcriptional program by CMLD010509, the most promising rocaglate. Proteome-wide, reversion correlated with selective depletion of short-lived proteins that are key to MM growth and survival, most notably MYC, MDM2, CCND1, MAF, and MCL-1. The efficacy of CMLD010509 in several mouse models of MM confirmed the therapeutic relevance of these findings in vivo and supports the feasibility of targeting the oncogenic MYC-driven translation program in MM with rocaglates.

As células Y-1 pertencem a uma linhagem clonal de células funcionais de córtex adrenal de camundongo, que respondem a ACTH. Em células Y-1, ACTH promove a esteroidogênese (função) e tem efeitos regulatórios complexos na transição G0→G1→S do ciclo celular. ACTH promove a transição G0→G1, mas inibe a transição G1→S. É possível que a regulação do ciclo celular por ACTH seja mediada pelo controle da expressão dos proto-oncogenes das famílias fos, jun e myc. Nosso laboratório mostrou, anteriormente, que ACTH induz a expressão dos genes fos e jun, mas inibe c-myc. O objetivo deste trabalho foi identificar pontos de controle na expressão dos genes fos, jun e myc e na atividade dos fatores de transcrição AP-1 (dímeros da proteínas Fos e Jun) por ACTH, derivados de cAMP (ativadores de PKA), PMA (ativador de PKC) e FCS (soro fetal bovino). ACTH, PMA e dcAMP aumentam a atividade de ligação de AP-1 a DNA, independentemente de síntese protéica. Ensaios de elongação de cadeia nascente de RNA (run off transcription) mostram que ACTH, PMA e FCS são fortes indutores de c-fos, c-jun e junB, enquanto dcAMP induz apenas c-fos e junB. Hibridizações Northern permitiram estimar a meia-vida dos mRNAs de c-fos e c-jun em 30 min, independentemente do tratamento com ACTH ou PMA. Diferentemente de c-fos, o mRNA de fosB é superinduzido por ActinomicinaD em células Y-1 tratadas com ACTH e PMA. / The Y-1 cells belong to a clonal lineage of functional mouse adrenocortical cells, which are responsive to ACTH. In Y-1 cells, ACTH promotes esteroidogenesis (function) and has complex effects on the G0→G1→S transition of the Y-1 cell cycle. ACTH induces the G0→G1 transition but inhibits the G1+S transition. Probably, the cell cycle regulation by ACTH is mediated by the expression control of the proto-oncogenes from the fos, jun and myc families. Our laboratory has previously shown that ACTH induces the fos and jun genes expression, but inhibits c-myc expression. The target of this work was to identify control points in the fos, jun and myc genes expression and in the AP-1 transcription factors (Fos and Jun proteins dimers) by ACTH, cAMP derivatives (PKA activators), PMA (PKC activator) and FCS (Fetal Calf Serum). ACTH, PMA and dcAMP raise the AP-1 DNA binding activity, independently of protein synthesis. Run off transcription assays show that ACTH, PMA and FCS are strong c-fos, c-jun and junB inducers, while dcAMP induces only c-fos and junB. Northern hybridisations allowed us to estimate the half life of the fos and jun mRNAs in about 30 min, independently of ACTH or PMA treatment. Differently of c-fos, fosB mRNA is superinduced by ActinomicinD treatment in Y-1 cells treated with ACTH or PMA.

Le rétinoblastome, un cancer pédiatrique de la rétine en développement, est la tumeur intraoculaire la plus fréquente chez l’enfant et représente environ 4 % de tous les cancers infantiles. Bien qu'il s'agisse d'une maladie rare, l'hôpital Curie (centre de référence pour le rétinoblastome en France) accueille environ 50 à 60 nouveaux patients chaque année. Notre groupe a précédemment caractérisé deux sous-types de rétinoblastomes. Les tumeurs de type « cone-like » ou sous-type 1 sont plutôt différenciées et homogènes, présentent une surexpression des gènes liés aux cellules cônes (photorécepteurs) de la rétine, sont diagnostiquées cliniquement plus tôt et regroupent la majorité des formes héréditaires et bilatérales. Les tumeurs « mixed-type » ou sous-type 2, présentent une hétérogénéité intra-tumorale et une surexpression des gènes liés aux cellules des cônes et des cellules ganglionnaires de la rétine, sont enrichies en patients unilatéraux qui sont diagnostiqués cliniquement à des âges plus avancés. Nous avons caractérisé le paysage moléculaire et génomique de 102 rétinoblastomes provenant de trois institutions : l'Institut Curie (France), l'Hôpital Garrahan (Argentine) et l'Hôpital Sant Joan de Déu (Espagne). Le développement d'une signature de méthylation par pyroséquençage pour la classification des échantillons nous a permis d'élargir nos échantillons classés, d'une première série de 72 à notre dernière série de 102 tumeurs. L'analyse du paysage mutationnel de notre série a révélé que les tumeurs du sous-type 2 avaient plus de mutations somatiques par échantillon que les tumeurs du sous-type 1. De plus les gènes BCOR et ARID1A étaient les deux seuls gènes mutés de manière récurrente, et identifiés uniquement dans le sous-type 2. En divisant notre cohorte de tumeurs en sous-type 1 et 2, la distribution des mutations le long de RB1 était significativement différente. Par ailleurs, nous avons identifié une région de la protéine RB1 (dans le Domaine A) enrichie en mutations provenant des tumeurs du sous-type 2, avec très peu de mutations du sous-type 1. En plus, nous avons caractérisé deux événements récurrents de fusion chromosomique perturbant le gène DACH1. Les tumeurs de sous-type 2 sont caractérisées par une surexpression de TFF1, non exprimée dans la rétine normale. L'analyse par immunohistochimie de TFF1 dans des tumeurs localement invasives provenant de l'hôpital Garrahan a révélé la présence de cellules TFF1+ envahissant la région rétrolaminaire du nerf optique. Nous avons exploré un possible rôle oncogène de TFF1 dans le rétinoblastome lié à la survie cellulaire, à la migration cellulaire et à l'invasion cellulaire, qui n'a finalement pas été mis en évidence in vitro. Le sous-type moléculaire 2 regroupe les tumeurs MYCN amplifiées et les tumeurs avec une activation de la voie de signalisation MYC et des gènes cibles de MYC. L'utilisation de JQ1 et OTX015 (inhibiteurs des protéines BET) a fortement réduit la viabilité in vitro de lignées cellulaires de rétinoblastomes représentatives du sous-type 2, avec une régulation négative significative du gène et de la protéine MYC/MYCN. Nos résultats préliminaires suggèrent une nouvelle piste thérapeutique par l'inhibition des protéines BET dans le rétinoblastome. Les modèles précliniques largement utilisés dans la recherche sur le rétinoblastome n'ont pas été caractérisés ou classés au niveau moléculaire. Nous avons utilisé la même approche que pour la classification des tumeurs primaires et avons constaté que la plupart des modèles cellulaires et PDX étudiés étaient classés dans le sous-type moléculaire 2 et partageaient des caractéristiques moléculaires, génomiques et protéiques trouvés dans les tumeurs primaires de ce sous-type moléculaire. En conclusion, nous avons pu caractériser de façon plus approfondie le sous-type 2 des rétinoblastomes, qui semble présenter un phénotype plus agressif et qui est le sous-type représenté dans les modèles précliniques analysés. / Retinoblastoma (RB) is a rare pediatric cancer of the developing retina that represents the most common intraocular tumor in children, and accounts for about 4% of all childhood cancers. Although being a rare disease, the Curie Hospital (the referral center for retinoblastoma in France) treats about 50-60 new patients each year. Our group has previously characterized two retinoblastoma subtypes. The cone-like or subtype 1 tumors rather differentiated and homogenous, presenting an overexpression of genes related to cone photoreceptor retinal cells, clinically diagnosed earlier and grouping the majority of hereditary and bilateral forms. The mixed-type or subtype 2 tumors, displaying an intra-tumoral heterogeneity and showing overexpression of genes related to cone and retinal ganglion cells, are enriched in unilateral patients clinically diagnosed at older ages. The general goal of my thesis was to extend the molecular characterization of these subtype 2 retinoblastomas. We characterized the molecular and genomic landscape of retinoblastoma in a series of 102 primary tumors, integrating samples from three institutions: the Curie Institute (France), the Garrahan Hospital (Argentina) and Sant Joan de Déu Hospital (Spain). The development of a pyrosequencing-based tool for sample classification allowed us to enlarge our classed samples, from an initial series of 72, to our final series of 102 tumors. Analysis of the mutational landscape in our series revealed that tumors from the subtype 2 had significantly more somatic mutations per sample than tumors from the subtype 1. Besides RB1 gene, BCOR and ARID1A where the only two recurrently mutated genes, and identified only in the subtype 2. Distribution of mutations alongside the RB1 gene has so far been analyzed in terms of a single group of retinoblastomas. When splitting our cohort in subtype 1 and subtype 2 tumors, the distribution of mutations was significantly different. Besides, we identified a region of the RB1 protein (in Domain A) enriched in mutations from tumors of the subtype 2, and devoid of mutations of the subtype 1. Besides somatic mutations, we characterized two recurrent chromosomal fusion events disrupting DACH1. Subtype 2 tumors are characterized by an overexpression of TFF1, not expressed in the normal retina. Immunohistochemical analysis of TFF1 in locally invasive tumors coming from the Garrahan Hospital revealed the presence of TFF1+ cells invading the retrolaminar region of the optic nerve. We then explored a possible oncogenic role of TFF1 in retinoblastoma related to cell survival, cell migration and cell invasion, which was not fully uncovered. Molecular subtype 2 regroups the MYCN amplified tumors and tumors with MYC signaling pathway activation and upregulation of hallmark MYC target genes. The use of JQ1 and OTX015 (BET bromodomains inhibitors) strongly reduced the viability in vitro of retinoblastoma cell lines representatives of the subtype 2, together with a significant MYC/MYCN gene and protein downregulation. We provided preliminary results to explore a new therapeutic avenue of BET protein inhibition in retinoblastoma. Preclinical models widely used in retinoblastoma research has not been characterized or classified at the molecular level. We have used the same approach as for primary human tumor’s classification, and found that most cellular and PDX models studied classed in the molecular subtype 2 and shared many of the molecular, genomic and protein characteristics found in primary tumors of this molecular subtype. Taken together, we have performed a deeper characterization of subtype 2 retinoblastomas, which seems to represent a more aggressive phenotype, and is the represented subtype in the preclinical models analyzed.

Während der letzten Jahre zeigten einige Studien, dass die Behandlung mit Knochenmark- Stammzellen (KMSZ) eine vielversprechende neue Therapieoption für den geschädigten Herzmuskel darstellen könnte. In dieser Arbeit wurde untersucht, ob es unter Behandlung mit Stammzellen zu einer zellulären Antwort in angezüchteten Kardiomyozyten (KMZ) kommt. Dafür wurden subkonfluente Kulturen aus Herzmuskelzellen von neonatalen Ratten für drei Tage mit Vybrant CM-DiI-markierten, sternalen humanen Knochenmarkstammzellen co-kultiviert. Im Anschluss wurden immunohistochemische Färbungen sowie eine quantitative Analyse mittels Western Blot für das Protoonkogen c-Myc durchgeführt. Des Weiteren wurde die Dichte der Beta-Adrenozeptoren unter Anwendung einer Histoautoradiographie mittels [125I]- iodocyanopindolol-Bindung analysiert. Die Auswertung der Immunohistochemie und der Western Blots zeigte eine signifikante Erhöhung der Expression von c-Myc in den Kardiomyozyten, welche in naher Umgebung der Stammzellen lagen. Dieser Effekt war direkt abhängig von der Entfernung der KMZ zur SZ. Die Histoautoradiographie zeigte eine signifikant höhere Beta-Rezeptor-Dichte in Kardiomyozyten in direkter Nähe zur Stammzelle. Mit steigender Entfernung von der Stammzelle verringerte sich die Rezeptordichte. Somit konnte gezeigt werden, dass eine kleine Anzahl von Knochenmark-Stammzellen ausreicht, um eine große Zahl von Kardiomyozyten zu beeinflussen, indem eine intrazelluläre Signalkaskade über c-Myc aktiviert und die Anzahl der Beta-Adrenozeptoren erhöht wird.

Der adoptive Transfer von TZR-modifizierten T Zellen ist mit potentiellen Risiken verbunden. Autoimmunreaktionen können auftreten, wenn Tumor-assoziierte Antigene auf normalem Gewebe erkannt werden, Fehlpaarung der TZR-Ketten zur Bildung eines autoreaktiven Rezeptors führen oder ein sonst anerger auto-reaktiver endogener Rezeptor aktiviert wird. Auch besteht das Risiko der malignen Transformation der Zelle durch Insertionsmutagenese. Daher ist es notwendig, die transferierten T Zellen im Fall schwerer Nebenwirkungen eliminieren zu können. Derzeit verfügbare Sicherheitsmechanismen sind für die Therapie mit TZR-modifizierten T Zellen ungeeignet. In dieser Arbeit wurde ein neuer Sicherheitsansatz entwickelt, der auf einem TZR-intrinsischen Depletionsmechanismus beruht und TZR-veränderte T Zellen eliminieren kann. Durch Einfügen eines myc-tags in murine (OT-I, P14) und humane (gp100) TZRs konnten TZR-exprimierende T Zellen in vitro und in vivo mittels eines myc-spezifischen Antikörpers depletiert werden. Die T Zellen behielten vergleichbare Funktionalität hinsichtlich Antigenerkennung und Zytokinsekretion wie Zellen, die den Wild-Typ Rezeptor exprimierten. Die Depletion adoptiv transferierter T Zellen verhinderte lethalen Diabetes in einem Mausversuch. Im verwendeten Modell wurden Splenozyten, die einen myc-getagten OT-I TZR exprimierten, in RIP-mOVA Mäuse injiziert, welche in den Inselzellen des Pankreas das OT-I-spezifische Antigen Ovalbumin exprimieren. Zerstörung der Inselzellen durch die T-Zellen induzierte lethalen Diabetes in unbehandelten Mäusen. Tiere, denen ein myc-spezifischer Antikörper verabreicht wurde, zeigten keine Symptome. Dieser neuartige Sicherheitsmechanismus erlaubt es, adoptive T Zelltherapie abzubrechen, falls schwere Nebenwirkungen auftreten. Im Gegensatz zu früheren Strategien muss kein zusätzliches Sicherheitsgen eingebaut werden und die Sicherheit des Ansatzes wird durch Verlust oder Herunterregulierung des Transgens nicht beeinflusst. / Adoptive transfer of TCR gene-modified T lymphocytes into patients is associated with potential risk factors. First, auto-immunity may occur if a tumor-associated antigen is targeted on normal tissue, if TCR chain mispairing leads to the formation of an auto-reactive receptor or if an otherwise anergic endogenous receptor specific for an auto-antigen becomes activated. Second, retroviral integration could lead to malignant transformation of the T cell. Therefore, it is essential to have the possibility to deplete the transferred T cells in vivo in case of severe side effects. The available safety modalities comprise disadvantages rendering them less feasible for the application in therapy with TCR gene-modified T cells. In this study, a safeguard based on a TCR-intrinsic depletion mechanism has been developed that eliminates auto-reactive TCR-redirected T cells. By introducing a myc-tag into the murine (OT-I, P14) or human (gp100) TCRs it was possible to deplete TCR-expressing T cells in vitro and in vivo with a myc-specific antibody. The T cells maintained equal function compared to cells expressing the wild-type receptor as shown by antigen binding and cytokine secretion. Importantly, the in vivo depletion of adoptively transferred T cells prevented disease in an auto-immune mouse model. Here, splenocytes transduced with a myc-tagged OT-I TCR were injected into RIP-mOVA mice expressing the OT-I-specific antigen ovalbumin in the pancreatic beta-cells. Destruction of these cells by the adoptively transferred T cells led to severe diabetes in untreated mice. Animals receiving a myc-specific antibody after T cell transfer showed no increase in blood glucose levels. The developed safeguard allows termination of adoptive therapy in case of severe side-effects. The strategy is superior to previous ones as it relies on a TCR-intrinsic mechanism which does not require introduction of an additional gene and safety is not hampered by loss or low expression of the transgene.

Myc deregulation critically contributes to many cancer etiologies. Recent work suggests that Myc and its direct interactors can confer a distinct epigenetic state. Our goal is to better understand the Myc-conferred epigenetic status of cells. We have previously identified the long non-coding RNA (lncRNA), H19, as a target of Myc regulation and shown it to be important for transformation in lung and breast cells. These results prompted further analysis to identify similarly important Myc-regulated lncRNAs. Myc-regulated lncRNAs associated with the cell cycle and transformation have been identified by microarray analysis. A small number of candidate lncRNAs that were differentially expressed in both the cell cycle and transformation have been validated. Given the increasing importance of lncRNAs and epigenetics to cancer biology, the discovery of Myc-induced, growth associated lncRNAs could provide insight into the mechanisms behind Myc-related epigenetic signatures in both normal and disease states.

Les facteurs de transcription du réseau c-Myc/Max/Mxd assurent le contrôle de la transcription de plus de 1600 gènes. L'hétérodimérisation compétitive entre les membres du réseau et la protéine Max permet des réponses cellulaires opposées. En effet, le complexe c-Myc/Max est associé à l'activation de la transcription de gènes sous l'influence de promoteurs contenant des sites E-Box, pendant que les complexes Mxd/Max permettent l'inhibition de la transcription à ces mêmes promoteurs. Cependant, l'activité oncogénique associée à la surexpression de c-Myc dans plusieurs cancers semble être assurée par l'inhibition de la transcription de gènes cytostatiques causée par l'association de Miz-1 au complexe c-Myc/Max. De manière encourageante, la réintroduction de Mxdl permet de réduire la prolifération et la croissance cellulaire et constitue une avenue thérapeutique intéressante. Cette thèse rapporte l'élucidation de l'identité de résidus spécifiques impliqués dans la reconnaissance moléculaire de Mxdl et de Max et la détermination de la structure hétérodimérique minimale requise afin de permettre une liaison stable à l'ADN. La reconnaissance moléculaire est dictée par des déterminants structuraux spécifiques contenus dans les régions HLH et LZ. L'hétérodimérisation spécifique nécessite 2 étapes essentielles : 1) la déstabilisation des homodimères, assurée par des répulsions électrostatiques à l'interface de dimérisation des 2 domaines, et 2) l'hétérodimérisation avec Max. Dans notre premier article, nous avons confirmé que l'unique résidu acide D112a, situé à l'interface de dimérisation du LZ, prévient la formation des homodimères. Nous avons démontré que le retrait de la charge acide par la mutation D112N ou par l'abaissement du pH permettait d'augmenter de façon équivalente la population homodimérique. De plus, nos résultats démontrent que l'augmentation de l'homodimérisation du LZ et/ou de la région HLH obtenue par la mutation D112N soutient efficacement la liaison à un site E-Box. Le deuxième article a permis l'identification des résidus impliqués dans l'hétérodimérisation spécifique des régions b-HLH-LZ des protéines Mxdl et Max. L'augmentation de l'hydrophobicité de l'interface dimérique de la protéine Max par les mutations N78VH81L (VL) avait ultérieurement permis d'augmenter considérablement l'homodimérisation et de stabiliser la liaison à l'ADN. Dans cette optique prometteuse, nous avons augmenté l'hydrophobicité de l'interface dimérisation du LZ de Mxdl par la mutation D112V. Des essais de digestions enzymatiques et de CD ont confirmés l'augmentation de la stabilité du LZ de Mxdl. Cependant, cette mutation permettant d'accroître le taux d'hélices [alpha] ne permet toutefois pas de stabiliser la liaison à l'ADN. Certaines répulsions électrostatiques, possiblement impliquées dans la déstabilisation des homodimères de Mxdl et obtenues par le rapprochement des régions HLH, ont été hypothétiquement identifiées par modélisation moléculaire. Nous avons ensuite utilisé des essais d'hétérodimérisation limites strictement à certaines régions dimériques pour démontrer que les régions HLH hétérodimérisent de manière favorable indépendamment de la présence de LZ homodimériques. Cependant, la liaison à l'ADN nécessite l'hétérodimérisation des régions LZ même si l'interaction des régions HLH est observée en absence d'ADN. L'hétérodimérisation complète des domaines HLH et LZ, essentielle à la liaison de l'ADN par l'hétérodimère, survient uniquement lorsque l'interaction favorable des régions HLH surpasse la stabilité des LZ homodimériques et soutient indirectement la formation des hétérodimères des régions LZ. Nous avons également fait la démonstration que l'hétérodimérisation précède la liaison à l'ADN tel que proposée par d'autres groupes et ne peut être décrite par le mécanisme d'hétérodimérisation empruntant le «monomer pathway» qui correspondrait à la liaison successive de l'ADN par les monomères de Mxdl et de Max avant l'hétérodimérisation.

Medulloblastomas are the most frequent malignant childhood brain tumors, arising in the posterior fossa of children. The overall 5-year survival is 70%, although children often suffer severe long-term side effects from standard medical care. To improve progression-free survival and quality of life for these children, finding new therapeutic targets in medulloblastoma is imperative. Medulloblastoma is divided in to four molecular subgroups (WNT, SHH, Group 3 and Group 4) based on key developmental pathways essential for the initiation and maintenance of tumor development. The MYC family of proto-oncogenes regulates cell proliferation and differentiation in normal brain. Aberrant expression of MYC proteins occurs commonly in medulloblastoma. Our studies on Group 3 medulloblastoma identify the transcription factor SOX9 as a novel target for the E3 ubiquitin ligase FBW7, and show that increased stability of SOX9 confers an increased metastatic potential in medulloblastoma. Moreover, SOX9-positive cells drive distant recurrences in medulloblastoma when combining two regulatable TetON/OFF systems. MYCN depletion leads to increased SOX9 expression in Group 3 medulloblastoma cells, and the recurring tumor cells are more migratory in vitro and in vivo. Segueing to treatment of medulloblastoma, we show that BET bromodomain inhibition specifically targets MYC-amplified medulloblastoma cells by downregulating MYC and MYC-transcriptional targets, and that combining BET bromodomain- and cyclin-dependent kinase- inhibition improves survival in mice compared to single therapy. Combination treatment results in decreased MYC levels and increased apoptosis, and RNA-seq confirms upregulation of apoptotic markers along with downregulated MYC target genes in medulloblastoma cells. This thesis addresses novel findings in transcription factor biology, recurrence and treatment in Group 3 medulloblastoma, the most malignant subgroup of the disease.

No description available.