Produzida por macrófagos e células dendríticas, a IL-27 é uma citocina heterodimérica capaz de induzir células Tr1 produtoras de IL-10 e consequentemente regular linfócitos Th1, Th2 e Th17, dependendo da doença envolvida. Partindo-se do pressuposto de que a infecção causada por Trypanosoma cruzi normalmente induz miocardite refletida pela migração intensa de linfócitos Th1 para o tecido cardíaco, nós analisamos o papel regulador da IL-27 nesta condição inflamatória. Nós inicialmente verificamos que a IL-27 foi prontamente induzida in vitro em células infectadas com T. cruzi. Para gerar miocardite intensa coordenada por linfócitos Th1, nós polarizamos linfócitos T naïves para o padrão Th1 na ausência de moléculas relacionadas ao perfil Th17 (camundongos IL-17R-/-, IL-23-/- e IL-6-/-). Como esperado, a inflamação cardíaca intensa e o dano tecidual foram observados na ausência das moléculas do padrão Th17, o que contribuiu para a morte prematura dos animais IL-17R-/-, IL-23-/- e IL-6-/-, precisa e notoriamente pela indução da migração excessiva de linfócitos Th1 para o tecido cardíaco via CXCL-9 e CXCL-10. Para explorar os mecanismos pelos quais a IL-27 controla a miocardite induzida pelo T. cruzi, nós encontramos um recrutamento substancial de macrófagos produtores de IL-27 para o tecido cardíaco, o qual foi mediado pelas quimiocinas CCL3 e CCL4 na ausência de moléculas do padrão Th17. Para determinar quais os receptores necessários para a produção de IL-27, nós observamos que macrófagos derivados da medula óssea de camundongos deficientes de TLR4-/-, TLR9-/- e NLRP3-/- aboliram completamente a produção desta citocina após a infecção in vitro com T. cruzi, enquanto o receptor TLR2 foi dispensável. Nós também verificamos que macrófagos produtores de IL-27 suprimiram linfócitos Th1 através da indução de células Tr1 produtoras de IL-10 após a infecção com T. cruzi. Em seguida, nós avaliamos se a IL-27 foi correlacionada com a proteção cardíaca durante a doença de Chagas. Nós observamos níveis séricos elevados de IL-27 tanto em pacientes com a forma clínica indeterminada ou cardíaca leve, enquanto pacientes com cardiomiopatia moderada ou grave produziram níveis reduzidos de IL-27. Neste estudo, nós descrevemos um novo mecanismo regulador desempenhado por macrófagos produtores de IL-27 no controle da miocardite induzida por T. cruzi. Macrófagos produtores de IL-27 podem suprimir processos inflamatórios desencadeados por linfócitos Th1, os principais vilões na doença de Chagas. / IL-27 is a heterodimeric cytokine produced by macrophages and dendritic cells known to induce IL-10-producing Tr1 cells and to regulate Th1, Th2, and Th17 lymphocytes, depending on the underlying disease. Because the infection caused by Trypanosoma cruzi normally induces myocarditis mirrored by an outstanding migration of Th1 cells to the heart tissue, we analyzed the regulatory role of IL-27 in this inflammatory condition. We firstly verified that IL-27 was promptly induced by in vitro T. cruzi-infected spleen cells. To generate a robust myocarditis coordinated by Th1 lymphocytes, we polarized lymphocytes to a Th1 pattern by infecting mice in the absence of Th17-related molecules (IL-17R-/-, IL-23-/-, and IL-6-/- mice). As expected, an impressive cardiac inflammation and damage was observed in the absence of Th17-related molecules, leading IL-17R-/-, IL-23-/-, and IL-6-/- mice to the premature death, precisely and notably by inducing an exuberant Th1 migration to the heart tissue via CXCL9 and CXCL10 chemokines. To explore the mechanisms by which IL-27 controls T. cruzi-induced myocarditis, we found a striking recruitment of IL-27-producing macrophages to the heart tissue mediated by increased levels of CCL3 and CCL4 chemokines in the absence of Th17-associated molecules. To gain further insights into the receptors required to IL-27 production, we observed that bone marrow-derived macrophages from TLR4-/-, TLR9-/-, and NLRP3-/- mice completely abolished IL-27 production after in vitro T. cruzi infection, while TLR2 was dispensable. We also verified that IL-27-producing macrophages supressed Th1 lymphocytes by inducing IL-10-producing Tr1 cells after T. cruzi infection. We next assessed whether IL-27 was correlated to cardiac protection during Chagas Disease. We observed augmented serum levels of IL-27 in either patients with indeterminate (asymptomatic) form or mild cardiac form, whereas patients with moderate or severe cardiomyopathy were poor producers of IL-27. Here, we described a novel regulatory mechanism developed by IL-27-producing macrophages in the control of T. cruzi-induced myocarditis. IL-27-producing macrophages can suppress inflammatory processes caused by Th1 lymphocytes, the bona fide culprits of Chagas Disease.

Submitted by Andreia Grizzo null (grizzo.andreia@gmail.com) on 2017-09-12T01:10:55Z No. of bitstreams: 1 MESTRADO 11_09.pdf: 2257201 bytes, checksum: 16dbde33ba443c1645e05a71110959e4 (MD5) / Approved for entry into archive by Monique Sasaki (sayumi_sasaki@hotmail.com) on 2017-09-12T17:39:02Z (GMT) No. of bitstreams: 1 grizzo_a_me_bot.pdf: 2261723 bytes, checksum: 6c5484268fa35ad436d271ab196ecc86 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-09-12T17:39:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 grizzo_a_me_bot.pdf: 2261723 bytes, checksum: 6c5484268fa35ad436d271ab196ecc86 (MD5) Previous issue date: 2017-06-09 / INTRODUÇÃO: Cardiomiopatia é uma alteração do miocárdio em que o músculo do coração é estruturalmente e/ou funcionalmente anormal, na ausência de doença de artérias coronárias, hipertensão arterial, doenças valvares e cardiopatias congênitas. A Cardiomiopatia dilatada é o tipo mais frequente na faixa etária pediátrica, caracterizando-se por apresentar dilatação do ventrículo esquerdo com disfunção sistólica na ausência de condições de carga anormais, com incidência de aproximadamente 0,57 casos/100.000 habitantes ao ano e maior prevalência no sexo masculino. Apresenta curso progressivo, elevado custo de tratamento e é a principal causa de transplante cardíaco em pediatria. Em cinco anos de acompanhamento, aproximadamente 2,5% evoluem com morte súbita e 29% tem indicação de transplante cardíaco. A etiologia ao diagnóstico é pouco conhecida, permanecendo a causa idiopática como a mais frequente, incluindo entre elas causas genéticas e familiares não identificadas, seguida das miocardites. O diagnóstico é baseado em sintomas de insuficiência cardíaca congestiva (ICC) ou alterações em exames de imagem na ausência de sinais de ICC. O exame complementar mais importante é o ecocardiograma com doppler colorido que permite a avaliação da dilatação do VE, fração de ejeção do VE (FEVE) <55% e/ou hipocinesia de VE. O tratamento na fase aguda da doença deve ser baseado na classificação hemodinâmica, sendo utilizados inibidores da enzima de conversão da angiotensina (IECA), betabloqueadores, diuréticos e drogas inotrópicas positivas, principalmente nos casos de descompensação clínica mais grave. OBJETIVO: Padronizar um protocolo para o diagnóstico e tratamento da cardiomiopatia dilatada na faixa etária pediátrica de acordo com nossa realidade institucional, baseado nas melhores evidências disponíveis na literatura. METODOLOGIA:Estudo de revisão da literatura realizado nas principais fontes: Pubmed, Embase, LILACS, Cochrane e Uptodate; priorizando os publicados nos últimos 10 anos. RESULTADO:Há poucos estudos sobre o diagnóstico e tratamento de cardiomiopatia dilatada em pediatria com bom nível de evidência. Um algoritmo para o diagnóstico e tratamento baseado nas melhores evidências disponíveis na literatura e nas condições existentes em nosso serviço foi construído e será disponibilizado junto aos médicos responsáveis pelo atendimento aos pacientes pediátricos com diagnóstico de cardiomiopatia dilatada. CONCLUSÃO: A utilização de protocolo poderá proporcionar a otimização dos recursos hospitalares utilizados para o diagnóstico e o tratamento de cardiomiopatia dilatada com aumento do diagnóstico precoce e instituição do tratamento mais adequado. / INTRODUTION: Cardiomyopathy is a myocardial disorder in which the heart muscle is structurally and/or functionally abnormal, in the absence of coronary artery disease, arterial hypertension, valvular heart disease and congenital heart disease. Dilated Cardiomyopathy is the most common type in the pediatric age group, characterized by a dilation of the left ventricle with systolic dysfunction in the absence of abnormal loading conditions, with an incidence of approximately 0.57 cases/100,000 inhabitants per year and higher prevalence in the male gender. It is a progressive disease, with a high cost of treatment and is the major cause of heart transplantation in pediatrics. In five years of following up, nearly 2.5% evolve with sudden death and 29% have an indication for heart transplantation. The etiology to diagnosis is little known, and the idiopathic cause remains the most frequent one, including among them unidentified genetic and familial causes, followed by myocarditis. The diagnosis is based on symptoms of congestive heart failure (HF), or changes in imaging tests, in the absence of signs of HF. The most important complementary exam is the color Doppler echocardiography, which allows an assessment of the LV dilation, Left Ventricular ejection fraction (LVFE) < 55% and/or LV hypokinesis. Treatment in the acute phase of the disease should be based on hemodynamic classification, using angiotensin-converting enzyme (ACE) inhibitors, beta-blockers, diuretics and positive inotropic drugs, especially in cases of more severe clinical decompensation. OBJECTIVE: To standardize a protocol for dilated cardiomyopathy diagnosis and treatment in the pediatric age group according to our institutional reality based on the best evidence available in the literature. METHODOLOGY:A revision of the literature performed in the main sources: Pubmed, Embase, LILACS, Cochrane and Uptodate; prioritizing those published in the last 10 years. RESULT:There are a few studies on dilated cardiomyopathy diagnosis and treatment in pediatrics with good level of evidence. An algorithm for diagnosis and treatment based on the best evidence available in the literature and in the conditions existing in our service was built and will be make available to physicians in charge of the care of pediatric patients diagnosed with dilated cardiomyopathy. CONCLUSION: The use of protocol may provide the optimization of hospital resources used for the diagnosis and treatment of dilated cardiomyopathy with increased early diagnosis and the institution of the most appropriate treatment.

INTRODUÇÃO: Atualmente, a maior limitação ao transplante cardíaco, em todo o mundo, é a escassez de doadores cujo número está sempre aquém do número de pacientes portadores de doença cardíaca terminal, e esse hiato fica ainda maior pelo fato de cerca de 25 % dos corações doados não serem utilizados, por estarem acometidos por acentuada disfunção. A descarga catecolaminérgica associada à morte encefálica poderia ser um dos elementos implicados nesta disfunção. Assim, intervenções terapêuticas com intuito de minimizar o exacerbado estímulo simpático visam, em última instância, ampliar a oferta de órgãos para o transplante. OBJETIVOS: Investigar a hipótese de que a anestesia peridural torácica seja capaz de bloquear a tempestade autonômica inerente à morte encefálica por hipertensão intracraniana aguda, minimizando as alterações hemodinâmicas, reduzindo a resposta inflamatória e, por conseguinte, melhorando a condição do enxerto. MÉTODOS: Ratos Wistar machos (250-350 g) anestesiados (isoflurano 5 %) e monitorados continuamente para o registro da pressão arterial média foram submetidos à inserção de cateter no espaço peridural em nível torácico e, em seguida, submetidos à morte encefálica por hipertensão intracraniana aguda pela xxi insuflação de um cateter de Fogarty® introduzido por trepanação. Os animais (n = 28) foram alocados em 4 grupos: grupo salina - infusão de 20 uL de solução salina pelo cateter peridural antes da indução da morte encefálica; grupo bupi-pré - infusão de 20 uL de solução de bupivacaína a 0,5 % pelo cateter peridural, antes da indução da morte encefálica; grupo bupi-20 - infusão de 20 uL de solução de bupivacaína a 0,5 % pelo cateter peridural 20 minutos após a indução da morte encefálica; grupo bupi-60 - infusão de 20 ?L de solução de bupivacaína a 0,5 % pelo cateter peridural 60 minutos após a indução da morte encefálica. Após 6 horas os animais foram submetidos à eutanásia por exsanguinação. Foram realizadas dosagens séricas e no tecido cardíaco das citocinas interleucina (IL)-1beta e fator de necrose tumoral (TNF)-alfa pelo método de ELISA. As moléculas de adesão endoteliais, vascular adhesion molecule (VCAM)-1 e intercellular adhesion molecule (ICAM)-1, proteínas envolvidas no processo de apoptose, Bcl-2 e caspase-3, e a alfa-actina foram avaliadas no tecido miocárdico por técnica imunohistoquímica. Cortes longitudinais do coração foram corados com hematoxilina/eosina e avaliados quanto à presença de edema, infiltrado leucocitário e congestão vascular. Contagens totais de leucócitos circulantes foram realizadas antes da indução da morte encefálica e 3 e 6 horas após. RESULTADOS: Logo após a insuflação do cateter de Fogarty® todos animais evoluíram com sinais clínicos de morte encefálica: midríase bilateral fixa e ausência de reflexo corneano. O aumento súbito e efêmero da pressão arterial foi observado em todos os animais, à exceção do grupo que recebeu a bupivacaína previamente à indução da morte encefálica (grupo bupi-pré) (p<0,05). Houve acentuada e progressiva leucopenia em todos os grupos. As citocinas IL-1beta, TNF-alfa, tanto no soro quanto no miocárdio, não apresentaram diferenças significativas entre os grupos. As moléculas de adesão VCAM-1 e ICAM-1, as proteínas Bcl-2 e caspase-3, a alfa-actina, bem como a análise histológica do miocárdio não apresentaram diferenças significativas entre os grupos. CONCLUSÕES: A anestesia peridural torácica foi efetiva em bloquear o pico hipertensivo associado à morte encefálica. Contudo, tal bloqueio não se correlacionou a alterações na concentração de citocinas, expressão de moléculas de adesão, expressão de proteínas envolvidas com o processo apoptótico e alfa-actina, e alterações histológicas e do leucograma. Portanto, a tempestade autonômica não parecer ser a responsável pela ativação da resposta inflamatória e, em última instância, pela disfunção miocárdica associada à morte encefálica / BACKGROUND: Currently, the main limitation to cardiac transplantation, worldwide, is the shortage of donors whose number is always smaller than the number of patients with terminal heart disease, and this gap is even greater because about 25 % of donated hearts are not used due to severe dysfunction of unknown cause. Brain-death associated catecholaminergic storm may be implicated in this dysfunction. Thus, therapeutic interventions aiming to reduce the sympathetic stimulation result, ultimately, in an increase in the number of organs for transplantation. OBJECTIVES: To investigate the hypothesis that thoracic epidural anesthesia is capable of blocking the sympathetic discharge inherent to brain death, by acute intracranial hypertension, minimizing hemodynamic changes, and reducing the inflammatory response improving, therefore, the graft outcome. METHODS: Male Wistar rats (250 - 350 g) anesthetized (5 % isoflurane) and continuously monitored to record mean arterial pressure, underwent insertion of a catheter into the epidural space, at the thoracic level. Brain death was induced by acute intracranial hypertension by inflating an intracranially inserted Fogarty catheter. The animals (n = 28) were divided into 4 groups: saline group - infusion of 20 uL of saline through the epidural catheter before induction of brain death; pre-bup group - infusion of 20 uL of bupivacaine through epidural catheter before induction of brain death; bup-20 group - infusion of 20 uL of bupivacaine through epidural catheter 20 min after induction of brain death; bup-60 group - infusion of 20 uL of bupivacaine through epidural catheter 60 min after induction of brain death. After 6 h the animals were exsanguinated. Serum and cardiac tissue concentrations of cytokines, interleukin (IL)-1beta and tumor necrosis factor (TNF)-alfa, were performed by ELISA. The endothelial adhesion molecules, vascular adhesion molecule (VCAM)-1 and intercellular adhesion molecule (ICAM)-1, proteins involved in apoptosis, Bcl-2 and caspase-3, and ?-actin were evaluated in myocardial tissue by immunohistochemistry. Longitudinal sections of the heart were stained with hematoxylin/eosin and evaluated for the presence of edema, vascular congestion and leukocyte infiltration. White blood cell counts were obtained prior to induction of brain death, 3 and 6 h thereafter. RESULTS: Clinical signs of brain death, fixed dilated pupils and absence of corneal reflex, were observed immediately after catheter insuflation. The sudden increase in mean arterial pressure was observed in all animals except in those receiving bupivacaine prior to brain death induction (pre-bup) (p<0.05). There was a marked and progressive leukopenia in all groups. Cytokine levels, IL-1beta and TNF-alfa, in serum and cardiac tissue, showed no significant differences among groups. Adhesion molecules, VCAM-1 and ICAM-1, the proteins, Bcl-2, caspase-3 and ?-actin, and the histological analysis of the myocardium showed no significant differences among groups. CONCLUSIONS: The thoracic epidural anesthesia was effective to block the hypertensive peak associated with brain death. However, this blockage does not correlate to changes in the levels of cytokines, expression of adhesion molecules and expression of apoptosis-linked proteins, and alfa-actin. Furthermore, no changes in histological analysis and white blood cell counts were observed. The autonomic storm does not seem to be responsible for the activation of the inflammatory response and, ultimately, for the myocardial dysfunction associated with brain death

A Cardiomiopatia Chagásica Crônica (CCC) é uma cardiopatia dilatada inflamatória caracterizada por remodelamento cardíaco, uma miocardite rica em células T e macrófagos, hipertrofia e fibrose. Essa acomete 30% dos pacientes infectados com Trypanossoma cruzi (T. cruzi). Os pacientes com CCC apresentam uma pior sobrevida e prognóstico quando comparados com pacientes portadores de cardiomiopatia de etiologia não inflamatória, como a cardiomiopatia dilatada idiopática (CDI). No processo de remodelamento cardíaco, ocorre uma reestruturação da matriz extracelular (MEC), mediada em grande parte por proteínas como as enzimas proteolíticas, metaloproteinases da matriz (MMPs) e seus inibidores específicos (TIMPs), sendo que a alteração e/ou atividade de algumas dessas enzimas em particular está relacionado com as doenças cardiovasculares. Dentro deste contexto, a hipótese deste trabalho é a de que o perfil da expressão e atividade das MMPs e de seus inibidores TIMPs na CCC será distinto do encontrado na CDI. Foi avaliado por qRT-PCR a expressão gênica e por \"Western blotting\" a expressão proteica das MMPs: -1, -2, -3, -8, -9, -12-13 e EMMPRIN e dos seguintes inibidores TIMPs: -1, -2, -3, -4 e RECK e atividade da MMP-2 e -9 por zimografia, em amostras de miocárdio (ventrículo esquerdo) de pacientes com CCC, pacientes com CDI e doadores de órgãos, obtidos durante o procedimento de transplante. Embora algumas das alterações da expressão das MMPs, TIMPs, e RECK tenham sido compartilhadas com a CDI, observamos que os pacientes com CCC apresentam o aumento da atividade da MMP-2 e MMP-9 e aumento exclusivo da proteína MMP-9. Analisamos através da razão entre a atividade da MMP-2 e MMP-9 com a expressão proteica dos inibidores TIMPs e RECK, observamos o aumento da atividade da MMP-2 e MMP-9 e a diminuição dos TIMPs: -1, -2, -3 e -4 e TIMPs -1, -2 e -3, respectivamente em pacientes com CCC, ocasionando um desequilíbrio entre sua ativação e inibição o que contribui com o remodelamento do miocárdio. Também foi avaliado a fração de colágeno intersticial por Picrosirius Red, observamos que o aumento de colágeno em pacientes com CCC e CDI, o que indica que o aumento da atividade da MMP-2 e MMP-9 está modulando a síntese, conformação e organização do colágeno, contribuindo com a fibrose em pacientes com CCC. Com objetivo de verificar se estas MMPs e seus inibidores estariam sob-regulação pós-transcricional, realizamos análise in silico e identificamos 8 microRNAs (miR): miR-21, miR-29- 5p, miR-146a-5p, miR-155-5p, miR-188-5p, miR-214-3p, miR-491-5p e miR885-5p e analisamos suas expressões por qRT-PCR, mas não observamos correlação com as MMPs e seus inibidores, sugerindo que estas proteínas não estão sob regulação pós-transcricional pelos miRs analisados. Em conjunto, nossos resultados sugerem que a expressão diferencial de MMPs e seus inibidores TIMPs estudados contribuem com a fibrose, remodelamento do miocárdio e disfunção cardíaca, observado em pacientes com CCC. Desta forma, este trabalho pode ajudar na elucidação dos mecanismos de desenvolvimento da patogênese da doença de Chagas / Chronic Chagas Cardiomyopathy (CCC) is an inflammatory dilated cardiomyopathy characterized by cardiac remodeling, a myocarditis rich in T cells and macrophages, hypertrophy and fibrosis. This affects 30% of patients infected with Trypanosoma cruzi (T. cruzi). Patients with CCC have a poorer prognosis and survival when compared with cardiomyopathy patients with non-inflammatory etiology, such as idiopathic dilated cardiomyopathy (IDC). In cardiac remodeling process, there is a restructuring of the extracellular matrix (ECM), largely mediated by proteins such as proteolytic enzymes, matrix metalloproteinases (MMPs) and their specific inhibitors (TIMPs). The alteration and/or activity of some these particular enzymes is associated with cardiovascular disease. Taking this into account, the hypothesis of this study is that the expression profile and activity of MMPs and their TIMPs inhibitors in the CCC will be different from those found in IDC. The gene expression was evaluated by qRT-PCR, the MMP protein expression: -1, -2, -3, -8, -9, -12-13 and EMMPRIN by \"Western blotting\" and the following TIMP inhibitors: -1 , -2, -3, -4 and RECK and MMP-2 and -9 activity by zymography, in myocardial samples (left ventricle) of CCC and IDC patients and organ donors (Control) obtained upon transplantation. Although some of these changes in the expression of MMPs, TIMPs and RECK were shared with the IDC, we observed that patients with CCC have increased MMP-2 and MMP-9 activity and exclusive increase in MMP-9 protein. Through the ratio of MMP-2 and MMP-9 activity with protein expression of TIMPs and RECK inhibitors, we found that the increase in MMP-2 and MMP-9 activity and the decrease in TIMP: -1, -2, -3, and -4 and TIMP -1, -2 and -3, respectively, in myocardial samples of CCC patients causes an imbalance in their activation and inhibition, contributing to the myocardium remodeling. The fraction of interstitial collagen as stained by Picrosirius Red, indicates increase in collagen in patients with CCC and IDC, indicating that the increase of MMP-2 and MMP-9 activity is modulating the synthesis and conformation of collagen organization, contribute to fibrosis in patients with CCC. Aiming to verify whether these MMPs and their inhibitors would be under post-transcriptional regulation, we performed in silico analysis and it was identified 8 microRNAs (miR): miR-21, miR-29-5p, miR-146a-5p, miR-155-5p , miR-188-5p, miR-214-3p, miR-491-5p and miR885-5p, but no correlation was found with the MMPs and their inhibitors, suggesting that these proteins are not under post-transcriptional regulation by miRs analyzed. Together our results suggest that differential expression of MMPs and their TIMPs inhibitors studied contribute to fibrosis, myocardial remodeling and cardiac dysfunction observed in patients with CCC. Thus, this work may help in elucidating the development of mechanisms of the pathogenesis of Chagas disease

Produzida por macrófagos e células dendríticas, a IL-27 é uma citocina heterodimérica capaz de induzir células Tr1 produtoras de IL-10 e consequentemente regular linfócitos Th1, Th2 e Th17, dependendo da doença envolvida. Partindo-se do pressuposto de que a infecção causada por Trypanosoma cruzi normalmente induz miocardite refletida pela migração intensa de linfócitos Th1 para o tecido cardíaco, nós analisamos o papel regulador da IL-27 nesta condição inflamatória. Nós inicialmente verificamos que a IL-27 foi prontamente induzida in vitro em células infectadas com T. cruzi. Para gerar miocardite intensa coordenada por linfócitos Th1, nós polarizamos linfócitos T naïves para o padrão Th1 na ausência de moléculas relacionadas ao perfil Th17 (camundongos IL-17R-/-, IL-23-/- e IL-6-/-). Como esperado, a inflamação cardíaca intensa e o dano tecidual foram observados na ausência das moléculas do padrão Th17, o que contribuiu para a morte prematura dos animais IL-17R-/-, IL-23-/- e IL-6-/-, precisa e notoriamente pela indução da migração excessiva de linfócitos Th1 para o tecido cardíaco via CXCL-9 e CXCL-10. Para explorar os mecanismos pelos quais a IL-27 controla a miocardite induzida pelo T. cruzi, nós encontramos um recrutamento substancial de macrófagos produtores de IL-27 para o tecido cardíaco, o qual foi mediado pelas quimiocinas CCL3 e CCL4 na ausência de moléculas do padrão Th17. Para determinar quais os receptores necessários para a produção de IL-27, nós observamos que macrófagos derivados da medula óssea de camundongos deficientes de TLR4-/-, TLR9-/- e NLRP3-/- aboliram completamente a produção desta citocina após a infecção in vitro com T. cruzi, enquanto o receptor TLR2 foi dispensável. Nós também verificamos que macrófagos produtores de IL-27 suprimiram linfócitos Th1 através da indução de células Tr1 produtoras de IL-10 após a infecção com T. cruzi. Em seguida, nós avaliamos se a IL-27 foi correlacionada com a proteção cardíaca durante a doença de Chagas. Nós observamos níveis séricos elevados de IL-27 tanto em pacientes com a forma clínica indeterminada ou cardíaca leve, enquanto pacientes com cardiomiopatia moderada ou grave produziram níveis reduzidos de IL-27. Neste estudo, nós descrevemos um novo mecanismo regulador desempenhado por macrófagos produtores de IL-27 no controle da miocardite induzida por T. cruzi. Macrófagos produtores de IL-27 podem suprimir processos inflamatórios desencadeados por linfócitos Th1, os principais vilões na doença de Chagas. / IL-27 is a heterodimeric cytokine produced by macrophages and dendritic cells known to induce IL-10-producing Tr1 cells and to regulate Th1, Th2, and Th17 lymphocytes, depending on the underlying disease. Because the infection caused by Trypanosoma cruzi normally induces myocarditis mirrored by an outstanding migration of Th1 cells to the heart tissue, we analyzed the regulatory role of IL-27 in this inflammatory condition. We firstly verified that IL-27 was promptly induced by in vitro T. cruzi-infected spleen cells. To generate a robust myocarditis coordinated by Th1 lymphocytes, we polarized lymphocytes to a Th1 pattern by infecting mice in the absence of Th17-related molecules (IL-17R-/-, IL-23-/-, and IL-6-/- mice). As expected, an impressive cardiac inflammation and damage was observed in the absence of Th17-related molecules, leading IL-17R-/-, IL-23-/-, and IL-6-/- mice to the premature death, precisely and notably by inducing an exuberant Th1 migration to the heart tissue via CXCL9 and CXCL10 chemokines. To explore the mechanisms by which IL-27 controls T. cruzi-induced myocarditis, we found a striking recruitment of IL-27-producing macrophages to the heart tissue mediated by increased levels of CCL3 and CCL4 chemokines in the absence of Th17-associated molecules. To gain further insights into the receptors required to IL-27 production, we observed that bone marrow-derived macrophages from TLR4-/-, TLR9-/-, and NLRP3-/- mice completely abolished IL-27 production after in vitro T. cruzi infection, while TLR2 was dispensable. We also verified that IL-27-producing macrophages supressed Th1 lymphocytes by inducing IL-10-producing Tr1 cells after T. cruzi infection. We next assessed whether IL-27 was correlated to cardiac protection during Chagas Disease. We observed augmented serum levels of IL-27 in either patients with indeterminate (asymptomatic) form or mild cardiac form, whereas patients with moderate or severe cardiomyopathy were poor producers of IL-27. Here, we described a novel regulatory mechanism developed by IL-27-producing macrophages in the control of T. cruzi-induced myocarditis. IL-27-producing macrophages can suppress inflammatory processes caused by Th1 lymphocytes, the bona fide culprits of Chagas Disease.

INTRODUÇÃO: A cardiopatia chagásica (CC) é um importante problema de saúde pública na América do Sul e a patogênese desta doença ainda não é totalmente compreendida, mas a inflamação e a fibrose miocárdica participam de forma central no processo crônico e progressivo de dano miocárdico. Trabalho prévio de nosso grupo demonstrou a capacidade da Ressonância Magnética Cardiovascular (RMC) de identificar precisamente a fibrose miocárdica em pacientes com Doença de Chagas. A RMC demonstrou ser eficaz para avaliar edema miocárdico, como marcador de inflamação, e ser altamente sensível para a detecção de trombos intracavitários, especialmente no ventrículo esquerdo, e em outras patologias, como miocardites e infartos. A avaliação de edema miocárdio pela RMC em pacientes com CC não foi ainda avaliada na literatura. Nosso objetivo foi investigar a presença de edema e fibrose miocárdica nas três formas clínicas da CC, o que julgamos ser de potencial valor diagnóstico e prognóstico. MÉTODOS: Cinquenta e quatro pacientes com doença de chagas foram analisados: 16 pacientes com a forma indeterminada (FI), 17 pacientes com CC-SD e 21 pacientes com CC-CD. Todos os pacientes foram submetidos a exame de RMC em equipamento de 1,5 T, utilizando a sequência de realce tardio do miocárdio (RTM), a sequência de edema miocárdico (Spin-eco ponderado em T2) e a sequência de realce global precoce ponderado T1 pós-contraste, para identificar fibrose, edema e hiperemia miocárdicos, respectivamente. RESULTADOS: A fibrose miocárdica foi encontrada em 39 indivíduos, 72,2% de toda a amostra. A fibrose miocárdica foi detectada em 2 pacientes (12,5%) na forma indeterminada, com uma massa de fibrose média de 0,85 ± 2,47g. Os pacientes da forma CC-SD em sua quase totalidade - 16 pacientes (94,1%) - apresentaram fibrose, com uma massa média de 13,0 ± 10,8g. Todos os pacientes com a forma CC-CD apresentaram fibrose miocárdica (21 pacientes) e adicionalmente detinham a maior massa de fibrose média, 25 ± 11,9g. O edema miocárdico foi encontrado em 40 indivíduos, 74,0% de toda a amostra. A extensão do edema miocárdico foi analisada pelo número de segmentos comprometidos. Foram identificados 3 pacientes (18,8%) da forma indeterminada com critérios positivos para edema miocárdio, determinando uma média de 0,31 ± 0,87 segmentos. A forma CC-SD obteve a presença de edema em 16 indivíduos (94,1%) distribuídos em uma média de 3,24 ± 2,3 segmentos. Todos os pacientes da forma CC-CD apresentaram edema miocárdico pela RMC, em uma média 3,67 ± 1,82 segmentos (p < 0,001). Houve correlação significativa entre a quantidade de fibrose miocárdica e edema miocárdico com a gravidade das formas clínicas (p < 0,001), classe funcional (p < 0,001), fração de ejeção do VE (p < 0,001) e volume diastólico do VE(p < 0,001). CONCLUSÃO: Fibrose e inflamação miocárdica foram detectadas pela ressonância magnética cardíaca em pacientes portadores de cardiopatia chagásica em todas as fases crônicas da doença, inclusive naqueles pacientes sem cardiopatia ou com cardiopatia sem disfunção ventricular. A quantidade de fibrose e edema miocárdico apresenta correlação com a gravidade da forma clínica, classe funcional, fração de ejeção do VE e dilatação do VE / BACKGROUND AND PURPOSE: Chagas\' heart disease (CHD) is a major public health problem in South America, and the pathogenesis of this disease is not yet fully understood, but inflammation and myocardial fibrosis seem to play a central role in the process of chronic and progressive myocardial damage. Previous descriptions from our group demonstrated the ability of Cardiovascular Magnetic Resonance (CMR) accurately identify myocardial fibrosis in patients with CHD. CMR shown to be effective for assessing myocardial edema, a marker of inflammation, and is highly sensitive for the detection of thrombi, especially in the left ventricle in other pathologies such as myocarditis and myocardial infarct. The assessment of myocardial edema by CMR in patients with CHD has not been evaluated. We believe to be of potential diagnostic and prognostic value to investigate the presence of myocardial edema and fibrosis in patients in the three clinical forms of this disease. METHODS: Fifty-four patients with Chagas\' disease were analyzed: 16 patients with the indeterminate phase (IF), 17 patients with the cardiac form without left ventricular systolic dysfunction (CFWO), and 21 patients with the cardiac form with left ventricular systolic dysfunctional form (CFSD). All patients underwent 1.5-T cardiac magnetic resonance (CMR) using the myocardial delayed enhancement sequence (MDE), T2-weighted sequence and the T1 weighted global enhancement after contrast sequence, to identify fibrosis, edema and hyperemia, respectively. RESULTS: Myocardial fibrosis was found in 39 subjects, 72.2% of the entire sample. Myocardial fibrosis was detected in 2 patients (12.5%) with the indeterminate form, representing an average mass of fibrosis of 0.85 ± 2.47 g. Patients with the CFWO almost entirely, 16 patients (94.1%) showed fibrosis, representing an average mass of fibrosis of 13.0 ± 10.8 g. All patients with the CFSD had myocardial fibrosis (21 patients) additionally had greater average mass of fibrosis 11.9 ± 25g. The myocardial edema was found in 40 subjects, 74.0% of the entire sample. The extent of myocardial edema was determined by the number of segments affected. We identified three patients (18.8%) from the indeterminate form with myocardial edema, an average of 0.31 ± 0.87. The CFWO presented a high presence of edema in 16 individuals (94.1%) distributed in an average of 3.24 ± 2.3 segments. All patients with the CFSD presented myocardial edema, an average of 3.67 ± 1.82 segments. (p < 0.001). There was significant correlation between the amount of myocardial fibrosis and myocardial edema with the severity of the clinical forms ( p < 0.001 ), functional class ( p < 0.001 ), LV ejection fraction ( p < 0.001 ) and left ventricular diastolic volume ( p < 0.001). CONCLUSION: Myocardial fibrosis and inflammation were detected by cardiac magnetic resonance imaging in patients with Chagas\' disease in all stages of chronic disease, including those patients without heart disease or cardiomyopathy without ventricular dysfunction. The amount of fibrosis and myocardial edema correlates with the severity of the clinical, functional class, LV ejection fraction and LV dilation

Der Großteil MHC Klasse I restringierter Epitope wird bei der Proteindegradation durch das Ubiquitin Proteasom System (UPS) generiert. In der vorliegenden Arbeit wurde die Rolle des UPS in der Antigenpräsenation in einer Coxsackievirus B3 (CVB3) induzierten akuten und chronischen Myokarditis untersucht. Für in vitro Degradationsexperimente mit isolierten 20S Proteasomen wurden CVB3 Polypeptide synthetisiert und die Degradationsprodukte massenspektrometrisch analysiert. Eine erhöhte Substratumsatzrate und eine Verschiebung von Schnittpräferenzen durch Immunoproteasomen oder unter dem Einfluss von PA28 führten zu einer verbesserten Generierung immunrelevanter CVB3 Fragmente. Inflammatorische Kardiomyopathien können in Mäusen durch eine CVB3 Infektion ausgelöst werden. Resistente Stämme (C57BL/6) eliminieren das Virus vollständig, in anfälligen Mäusen (A.BY/SnJ) erfolgt keine vollständige Elimination. In Herzen gesunder Mäuse werden vorwiegend konstitutive 20S Proteasomen exprimiert. Eine myokardiale Entzündung, ausgelöst durch eine CVB3 Infektion, führte in den Herzen beider Mausstämme zu der Bildung von Immunoproteasomen, was zu einer gesteigerten Generierung immunrelevanter CVB3 Fragmente führte. Die größte Menge immunrelevanter Fragmente wurden durch Proteasomen gebildet, die am Tag vier aus den Herzen akut erkrankender C57BL/6 Mäuse und am Tag acht aus chronisch erkrankenden A.BY/SnJ Mäusen isoliert wurden. Dies korrelierte mit der Inkorporation von Immunountereinheiten in de novo assemblierende Proteasomen und einer unterschiedlichen Interferon (IFN) Typ I Kinetik. In Geweben lymphatischen Ursprungs hingegen waren Zusammensetzung und proteolytische Aktivität der Proteasomen im Verlauf der Infektion in beiden Mausstämmen unverändert. Die vorliegende Arbeit unterstreicht die Bedeutung einer zeitlich optimalen IFN Sekretion an der Infektionsstelle, die zu der Anpassung des UPS an die inflammatorischen Bedingungen führt. / The recognition of viral antigens bound to major histocompatibility complex (MHC) class I molecules by CD8+ T cells is crucial for virus elimination. Most MHC class I restricted antigenic peptides are produced by the Ubiquitin Proteasome System (UPS). In the present study, the impact of the UPS in antigen presentation during Coxsackievirus B3 (CVB3) induced acute and chronic myocarditis has been investigated. To examine whether the proteasome is involved in the generation of MHC class I ligands derived from the CVB3 polyprotein, polypeptides were synthesized for in vitro processing by 20S proteasomes. Mass spectrometry analysis demonstrated an enhanced generation of immunorelevant CVB3 fragments due to an increased substrate degradation rate and altered cleavage site preferences by immunoproteasomes or in the presence of PA28. Murine models of CVB3 induced myocarditis mimic human disease pattern with diverse outcomes. Permissive mice (A.BY/SnJ) develop chronic myocarditis with cardiac CVB3 persistence whereas resistant mice (C57BL/6) recover and eliminate the virus after acute infection. Constitutive 20S proteasomes are mainly expressed in hearts of healthy mice. Myocardial inflammation, caused by a CVB3 infection, resulted in immunoproteasome formation in hearts of both, resistant C57BL/6 and susceptible A.BY/SnJ mice, and was correlated with enhanced generation of immunorelevant CVB3 peptides. In concurrence with distinctive type I interferon kinetics, immunoproteasome formation and improved epitope generation peaked on day 4 post infection in resistant mice, and was delayed in susceptible mice. No alterations were observed in assembly and proteolytic activity of 20S proteasomes in lymphatic tissues during CVB3 infection, independent from mouse strain. The results emphasise the impact of a rapid adjustment of the UPS to viral infection due to early secretion of type I interferon at site of infection.

Orientador: Rossano César Bonatto / Resumo: INTRODUÇÃO: Cardiomiopatia é uma alteração do miocárdio em que o músculo do coração é estruturalmente e/ou funcionalmente anormal, na ausência de doença de artérias coronárias, hipertensão arterial, doenças valvares e cardiopatias congênitas. A Cardiomiopatia dilatada é o tipo mais frequente na faixa etária pediátrica, caracterizando-se por apresentar dilatação do ventrículo esquerdo com disfunção sistólica na ausência de condições de carga anormais, com incidência de aproximadamente 0,57 casos/100.000 habitantes ao ano e maior prevalência no sexo masculino. Apresenta curso progressivo, elevado custo de tratamento e é a principal causa de transplante cardíaco em pediatria. Em cinco anos de acompanhamento, aproximadamente 2,5% evoluem com morte súbita e 29% tem indicação de transplante cardíaco. A etiologia ao diagnóstico é pouco conhecida, permanecendo a causa idiopática como a mais frequente, incluindo entre elas causas genéticas e familiares não identificadas, seguida das miocardites. O diagnóstico é baseado em sintomas de insuficiência cardíaca congestiva (ICC) ou alterações em exames de imagem na ausência de sinais de ICC. O exame complementar mais importante é o ecocardiograma com doppler colorido que permite a avaliação da dilatação do VE, fração de ejeção do VE (FEVE) <55% e/ou hipocinesia de VE. O tratamento na fase aguda da doença deve ser baseado na classificação hemodinâmica, sendo utilizados inibidores da enzima de conversão da angiotensina (IECA), betabloqueadore... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: INTRODUTION: Cardiomyopathy is a myocardial disorder in which the heart muscle is structurally and/or functionally abnormal, in the absence of coronary artery disease, arterial hypertension, valvular heart disease and congenital heart disease. Dilated Cardiomyopathy is the most common type in the pediatric age group, characterized by a dilation of the left ventricle with systolic dysfunction in the absence of abnormal loading conditions, with an incidence of approximately 0.57 cases/100,000 inhabitants per year and higher prevalence in the male gender. It is a progressive disease, with a high cost of treatment and is the major cause of heart transplantation in pediatrics. In five years of following up, nearly 2.5% evolve with sudden death and 29% have an indication for heart transplantation. The etiology to diagnosis is little known, and the idiopathic cause remains the most frequent one, including among them unidentified genetic and familial causes, followed by myocarditis. The diagnosis is based on symptoms of congestive heart failure (HF), or changes in imaging tests, in the absence of signs of HF. The most important complementary exam is the color Doppler echocardiography, which allows an assessment of the LV dilation, Left Ventricular ejection fraction (LVFE) < 55% and/or LV hypokinesis. Treatment in the acute phase of the disease should be based on hemodynamic classification, using angiotensin-converting enzyme (ACE) inhibitors, beta-blockers, diuretics and positive ino... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Ventricular dysfunction and dilated cardiomyopathy (DCM) develop among untreated HIV-infected people at much higher rates than among HIV-negative individuals, resulting in significant contributions to morbidity and mortality. Mechanisms underlying development of HIV-associated cardiomyopathy (HIVCM) are as yet poorly understood. The well-characterized simian immunodeficiency virus (SIV) model of HIV infection provides a unique context for HIVCM pathogenesis studies in that SIV-infected rhesus monkeys develop myocardial lesions and contractile dysfunction similar to those described in HIV-infected people, suggesting a shared disease mechanism. Lymphocytic myocarditis is a commonly reported finding in AIDS patients at autopsy and constitutes one of several conditions known to predispose to development of DCM, irrespective of HIV-infection status. As lymphocytic myocarditis also occurs with high frequency among SIV-infected rhesus monkeys, a retrospective analysis of rhesus monkey cardiac tissue collected at necropsy was performed to examine viral and cellular correlates of lymphocytic inflammation within myocardial tissue. One subpopulation of macrophages, which has been reported by other groups to be associated with an anti-inflammatory phenotype, was found to correlate inversely with lymphocytic infiltration and positively with numbers of virus infected cells, suggesting effects of an anti-inflammatory cytokine production profile. In contrast, the detrimental effects of inflammatory cytokines on myocardial structure and function are well-recognized and HIV infection in general is characterized by chronic immune activation and inflammatory cytokine dysregulation. To further investigate a role for myocardial cytokine production in development of HIVCM, a prospective study was conducted in which SIV-infected rhesus monkeys and uninfected controls were treated with recurrent administration of inactivated Mycobacterium aviumcomplex bacteria (MAC). SIV-infected, MAC-treated animals rapidly developed significant ventricular systolic dysfunction and chamber dilatation not seen in control groups, suggesting an exaggerated myocardial sensitivity to exogenous antigenic stimulation. Concurrent treatment with the TNFα antagonist etanercept completely abrogated development of these changes, strongly implicating a causative role for TNFα in evolution of the contractile dysfunction and chamber remodeling. Findings reported from the current studies suggest that characteristics of local myocardial macrophage populations and the myocardial tissue cytokine milieu may play more important roles than lymphocytic infiltration, cardiomyocyte damage, or viral proteins in the pathogenesis of HIVCM.

Der Coxsackievirus- und Adenovirusrezeptor (CAR) ist ein Typ I Transmembran-protein, das an der Adsorption von Viren und der Aufrechterhaltung von Zell-Zellkontakten beteiligt ist. Coxsackievirus B3 (CVB3) Infektionen sind eine häufige Ursache für akute Myokarditis, die bei Patienten häufig zu chronischer Kardiomyopathie bis zur Herzinsuffizienz führen können. CAR ist für die Aufnahme von Viren in unterschiedliche Zelltypen verantwortlich und damit ein potentielles Ziel bei der Therapie und Prävention von CVB3-Infektionen. Der komplette Knockout von CAR ist embryonal letal. Die betroffenen Embryonen zeigten Missbildungen des Herzens. Weiterhin konnte eine reduzierte Expression von Connexinen im Knockout beobachtet werden – ein mögliches Zeichen gestörter interzellulärer Kommunikation. In konditionellen CAR Knockout Tieren führte die Infektion mit CVB3 im Gegensatz zu CVB3-infizierten Wildtyp Kontrolltieren zu keinen pathologischen Veränderungen oder eine Erhöhung von Entzündungsmarkern. Die kontraktile Funktion des CVB3-infizierten Knockout Herzen war erhalten. Um mögliche unerwünschte Konsequenzen aus dem Verlust von CAR zu untersuchen, wurde eine umfassende kardiale Phänotypisierung durchgeführt, die AV-block im Knockout-Herzen zeigte. Der zugrunde liegende Mechanismus betrifft die Interaktion von Tight- und Gap-Junctions mit veränderter Expression und Lokalisierung von Connexinen, sowie die interzelluläre Kommunikation zwischen CAR-Knockout Kardiomyzeten. CAR ist essentiell für eine normale Embryonalentwicklung und kardiale Funktion. Das CAR-Knockout-Modell bietet einerseits den ersten genetischen Hinweis für eine Rolle von CAR als Virusrezeptor in vivo und belegt andererseits die Relevanz von direkter Virus-vermittelter Symptomatik gegenüber einer sekundären autoimmun- Komponente in CVB3-induzierten Herzerkrankungen. Damit ist CAR ein potentielles therapeutisches Target in der Prävention und Behandlung von viraler Myokarditis. / The coxsackievirus and adenovirus receptor (CAR) is a type I transmembrane protein involved in virus uptake and the maintenance of cell-cell contacts. Coxsackievirus B3 (CVB3) infections are frequent causes of human acute myocarditis, often resulting in chronic cardiomyopathy that may progress into terminal heart failure. The coxsackievirus and adenovirus receptor (CAR) is involved in virus uptake into various cell types and has therefore been suggested as a therapeutic target to prevent or treat CVB3 induced diseases. The complete CAR-knockout was embryonic lethal at midgestation with cardiac malformation. Connexin expression was decreased in the knockout, suggesting an abnormal cell-cell communication secondary to the loss of CAR. The role of CAR in murine viral myocarditis was investigated using the inducible CAR-knockout infected with CVB3. Unlike control animals exposed to CVB3, the cardiac inducible knockout mice did not exhibit structural changes such following CVB3 infection, or increased production of markers of inflammation, and severe contractile dysfunction. To evaluate possible adverse effects that might result from CAR deficiency, we implemented a detailed cardiac phenotyping protocol and found that CAR deficient animals developed AV nodal block. The underlying mechanism relates to the crosstalk of tight and gap junctions with altered expression and localization of connexins that affect the communication between CAR knockout cardiomyocytes. Thus, CAR is essential for embryonic development and normal cardiac function. The CAR-knockout does not only provide the first genetic evidence to establish CAR as the CVB3 receptor in vivo, but furthermore demonstrates the relevance of direct virus-mediated pathology versus a secondary autoimmune component in CVB3 induced heart disease. Our data suggest that CAR is a suitable target to help prevent and treat viral myocarditis.