La fusion des myoblastes est une étape cruciale pour une bonne formation musculaire pendant l'embryogenèse et après une blessure à l'âge adulte. Le système génétique simpliste des mouches a été largement utilisé dans le passé pour identifier les acteurs essentiels impliqués dans la fusion des myoblastes. Chez la drosophile, la protéine d'échafaudage Antisocial (Ants)/Rols7 joue un rôle essentiel dans la fusion des myoblastes en connectant les protéines de surface d'adhésion cellulaire au cytosquelette. Même si la plupart des voies moléculaires régissant la fusion des myoblastes sont évolutives conservées entre les mammifères et les mouches, les contributions relatives de Tanc1 et Tanc2, les orthologues mammifères de Ants/Rols7, dans la fusion de myoblastes n'ont pas été établies. Le premier objectif de la thèse était d'évaluer les contributions potentielles de Tanc1 et Tanc2 dans la fusion de myoblastes en utilisant la lignée cellulaire de myoblastes murins C2C12 comme modèle de différenciation et de fusion de myoblastes. Nous avons constaté que l'expression de Tanc1 et Tanc2 n'est pas modulée lors de la différenciation C2C12, mais que les deux échafaudages sont enrichis au niveau du cortex lors de la prolifération des myoblastes. De plus, le knockdown de Tanc1 ou Tanc2 a altéré la fusion des myoblastes sans affecter la différenciation des myoblastes. Notamment, l'expression du défaut de fusion humain entièrement restauré Tanc1 ou Tanc2 observé dans les cellules C2C12 épuisées pour Tanc1 ou Tanc2 suggérant qu'un niveau seuil de leur expression est critique pour une fusion efficace des myoblastes. De plus, ni Tanc1 ni Tanc2 n'ont pu se substituer à Ants/Rols7 lors de la fusion des myoblastes chez la drosophile, ce qui suggère que différents acteurs pourraient être impliqués dans la régulation de la fusion des myoblastes chez les mammifères. Le deuxième objectif de la thèse était de caractériser davantage le rôle de Tanc1 et Tanc2 dans la fusion de myoblastes en utilisant des modèles murins de souris. À cette fin, des souris knock-out Tanc1 totales (Tanc1 KO) et des souris knock-out Tanc2 conditionnelles (Tanc2 cKO) ont été générées. Bien que les souris Tanc2 KO aient été précédemment signalées comme étant mortelles sur le plan embryonnaire, nous rapportons ici que ces souris sont viables contrairement à ce qui a été rapporté. L'expression de Tanc1 et Tanc2 a été détectée dans les somites ainsi que dans les fibres musculaires primaires. L'analyse du phénotype musculaire au stade embryonnaire a révélé une différenciation normale des somites et la formation de fibres musculaires chez les souris Tanc1 KO et Tanc2 cKO. De plus, lors de l'analyse au stade adulte, aucune différence dans la section transversale des fibres musculaires entre les souris de type sauvage et les souris mutantes n'a été détectée. Cela pourrait-il impliquer une redondance potentielle entre Tanc1 et Tanc2 dans la régulation de la myogenèse ? Pour répondre à cette question, des souris double knockout Tanc1 et Tanc2 sont actuellement en cours de génération. En conclusion, nous avons identifié dans cette étude un nouveau rôle pour les protéines d'échafaudage Tanc1 et Tanc2 dans la fusion de myoblastes chez les mammifères. L'identification de nouveaux acteurs essentiels dans la fusion des myoblastes nous rapproche de sa compréhension et de son ciblage thérapeutique à long terme. / Myoblast fusion is a crucial step for proper muscle formation during embryogenesis and after in injury during adulthood. The simplistic genetic system of flies has been extensively used in the past to identify essential players involved in myoblast fusion. In Drosophila, the scaffold protein Antisocial (Ants)/Rols7 plays an essential role in myoblast fusion by connecting the cell adhesion surface proteins to the cytoskeleton. Even though most molecular pathways governing myoblast fusion are evolutionary conserved between mammals and flies, the relative contributions of Tanc1 and Tanc2, the mammalian orthologs of Ants/Rols7, in myoblast fusion have not been established. The first aim of the thesis was to assess the potential contributions of Tanc1 and Tanc2 in myoblast fusion by using the murine myoblast C2C12 cell line as a model for myoblasts differentiation and fusion. We found that Tanc1 and Tanc2 expression is not modulated during C2C12 differentiation, but that both scaffolds are enriched at the cortex during myoblast proliferation. Furthermore, the knockdown of either Tanc1 or Tanc2 impaired myoblast fusion without affecting myoblast differentiation. Notably, the expression of human Tanc1 or Tanc2 fully restored fusion defect observed in C2C12 cells depleted for Tanc1 or Tanc2 suggesting that a threshold level of their expression is critical for efficient myoblast fusion. Furthermore, neither Tanc1 nor Tanc2 could substitute for Ants/Rols7 during Drosophila myoblast fusion suggesting that different players might be involved in regulating myoblast fusion in mammals. The second aim of the thesis was to further characterize the role of Tanc1 and Tanc2 in myoblast fusion by using murine mice models. For this purpose, total Tanc1 knockout mice (Tanc1 KO) and conditional Tanc2 knockout mice (Tanc2 cKO) were generated. Although Tanc2 KO mice were previously reported to be embryonically lethal, we report here that those mice are viable contrary to what has been reported. Tanc1 and Tanc2 expression was detected in the somites as well as in the primary muscle fibers. Analysis of the muscle phenotype at the embryonic stage revealed normal somites differentiation and muscle fiber formation in both Tanc1 KO and Tanc2 cKO mice. Furthermore, when analyzed at the adult stage, no difference in the cross-sectional area of the muscle fibers between wild-type mice and mutant mice was detected. Could this imply a potential redundancy between Tanc1 and Tanc2 in regulating myogenesis? To answer this question, Tanc1 and Tanc2 double knockout mice are currently being generated. In conclusion, we identified in this study a novel role for the scaffold proteins Tanc1 and Tanc2 in myoblast fusion in mammals. Identifying new and essential players in myoblast fusion brings us a step closer to understanding it and on the long run target it therapeutically.

Der Skelettmuskel ist ein dynamisches Gewebe, das seine Funktionalität durch Anpassung des Gleichgewichts zwischen Proteinabbau und Proteinsynthese aufrechterhält. Kritisch kranke septische Patienten in der Intensivstation erleiden häufig eine dort erworbene tiefgreifende Muskelschwäche und –atrophie (intensive care unit acquired weakness, ICUAW). Es gibt Hinweise darauf, dass die Regenerationsfähigkeit des Muskels bei kritisch kranken Patienten beeinträchtigt ist. Die Pathogenese der ICUAW ist nur unzureichend verstanden, jedoch werden Sepsis und Entzündungen als führende Risikofaktoren angesehen. In früheren RNA-Sequenzierungsanalysen aus Muskeln septischer Mäuse wurde eine Herunterregulierung des Transforming Growth Factor beta (TGF-β)-Signals und eine erhöhte Genexpression von SPRY domain and SOCS-box containing protein 1 (SPSB1) gefunden. Ich stellte also die Hypothese auf, dass SPSB1 die Proteinhomöostase im Muskel beeinträchtigt, indem es den TGF-β/TβRII-Signalweg beeinflusst und eine entzündungsinduzierte Muskelatrophie verursacht. Die quantitative Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion verifizierte eine erhöhte Spsb1/SPSB1-Expression im Skelettmuskel von septischen Mäusen und ICUAW-Patienten. Die inflammatorischen Zytokine IL-6, IL-1β und Tumor-Nekrose-Faktor induzierten Spsb1 in C2C12-Myozyten in vitro. Die Überexpression von SPSB1 hemmte den TGF-β-Akt-Signalweg durch Destabilisierung von TβRII, was zu einer reduzierten Proteinsynthese in Myozyten führte. Als Konsequenz beeinträchtigte die SPSB1-Überexpression die Myogenese von C2C12-Myoblasten, gemessen an reduzierten Differenzierungs- und Fusionsindizes, sowie einer verminderten Protein- und mRNA-Expression der Differenzierungsfaktoren Mymk, Mymx, Myog, Myh1, 3 und 7. Zusammengenommen hemmt SPSB1 den TβRII-Signalweg im entzündeten Skelettmuskel, was die Myogenese beeinträchtigt. Daher könnte die Hemmung von SPSB1 hilfreich sein, um entzündungsinduziertes Muskelversagen zu verhindern. / Skeletal muscle is a dynamic tissue which maintains its functionality by adapting the balance between protein degradation and protein synthesis. Critically ill septic patients often develop intensive care unit acquired weakness (ICUAW), characterized by profound muscle weakness and atrophy. Emerging evidence suggests that the regenerative ability is impaired in patients with ICUAW. However, the pathogenesis of this disease is poorly understood. Sepsis and inflammation are considered as leading risk factors for ICUAW. In previous RNA sequencing analyses from muscle of septic mice, downregulation of transforming growth factor beta (TGF-β)-signaling and an increased gene expression of SPRY domain and SOCS-box containing protein 1 (SPSB1) have been found. If SPSB1 and TGF-β signaling play a role in inflammation-induced muscle atrophy was unknown. I hypothesized that SPSB1 impairs protein homeostasis in muscle by affecting TGF-β/TβRII signaling and causes inflammation-induced muscle atrophy. Quantitative real-time polymerase chain reaction verified increased Spsb1/SPSB1 expression in skeletal muscle of septic mice and ICUAW patients. The inflammatory cytokines IL-6, IL-1β and tumor necrosis factor induced Spsb1 in C2C12 myocytes in vitro. Overexpression of SPSB1 inhibited the TGF-β-Akt signaling pathway by destabilization of TβRII, leading to reduced protein synthesis in myocytes. These effects on TβRII signaling were mediated by the SPRY- and SOCS-box domains of SPSB1. As a consequence, SPSB1 overexpression impaired myogenesis of C2C12 myoblasts as measured by reduced differentiation and fusion indices, decreased protein and mRNA expression of the differentiation factors Mymk, Mymx, Myog, Myh1, 3 and 7. Taken together, SPSB1 binds and inhibits TβRII signaling in the inflammatory skeletal muscle resulting in impaired myogenesis. Therefore, inhibition of SPSB1 could be useful to prevent inflammation-induced muscle failure.

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Un nouveau facteur de transcription, appartenant à la famille des protéines à domaine bHLH, a récemment été isolé dans notre laboratoire. Initialement appelé « clone bc8 » puis HRT1, ce facteur présentait des similitudes avec les protéines Hairy and Enhancer of split qui interviennent notamment dans le phénomène d’inhibition latérale lors de la formation du tissu neural. Des études d’hybridation in situ réalisées chez l'embryon de xénope ont suggéré un rôle important de XHRT1, la protéine HRT1 de xénope, dans le développement neural. Nous avons recherché les partenaires protéiques de XHRT1 par la technique du double-hybride afin de mieux comprendre son mécanisme d’action moléculaire dans la neurogenèse.<p>Tout d’abord nous avons construit les outils appropriés pour l’élaboration du travail, à savoir, les clones de levures exprimant les appâts spécifiques des domaines de la protéine étudiée et la création d’une banque d’ADNc du xénope au stade de la neurulation. Ensuite, trois criblages ont été réalisés. Dans le premier cas, nous avons recherché les partenaires des domaines bHLH et Orange (bHLH-O). Le domaine bHLH est en effet responsable de la dimérisation de ce type de protéine. Le domaine Orange qui suit le domaine bHLH, pourrait participer dans le choix du partenaire d’hétérodimérisation. Nous avons isolé deux facteurs de type bHLH-Orange apparentés à HRT1, XHairy1 et XHairy2b et confirmé leur interaction avec XHRT1. Les domaines impliqués dans ces interactions sont les bHLH-O pour les trois facteurs. Ce même criblage nous a permis d’isoler un nouvel ADNc qui code une protéine sans domaine apparent connu actuellement. Nous avons montré que cette protéine reconnaissait spécifiquement le domaine Orange de HRT1 mais pas celui des autres facteurs de type bHLH-O. Elle a été baptisée BOIP pour Bc8 Orange Interacting Protein. Le rôle physiologique de cette interaction n’a pu être démontré. Nous avons établi que la protéine BOIP pouvait aussi s’homodimériser. Nous avons aussi déterminé son profil d’expression chez le xénope et la souris. Son transcrit est hautement présent dans les testicules adultes. La protéine pourrait donc jouer un rôle important dans la spermatogenèse. Les deux autres criblages, utilisant les domaines situés dans la partie C-terminale de XHRT1, ont apporté des nouveaux partenaires potentiels, mais ces interactions n’ont pu être confirmées dans un système indépendant. <p>Enfin, en étudiant plus en détail les interactions entre XHRT1 et XHairy1 ou XHairy2b, nous avons mis à jour une possible fonction de spécificité dans le choix du partenaire dans la région C-terminale de HRT1. La formation de ces dimères pourrait jouer un rôle dans la formation du tube neural mais également dans d’autres différenciations tissulaires.<p> / Doctorat en sciences, Spécialisation biologie moléculaire / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Thesis (PhD (Physiology (Human and animal))-- University of Stellenbosch, 2007. / Definition: Stem cells are unspecialised cells with the capacity for long-term self-renewal and the ability to differentiate into multiple cell-lineages. The potential for the application of stem cells in clinical settings has had a profound effect on the future of regenerative medicine. However, to be of greater therapeutic use, selection of the most appropriate cell type, as well as optimisation of stem cell incorporation into the damaged tissue is required. In adult skeletal muscle, satellite cells are the primary stem cell population which mediate postnatal muscle growth. Following injury or in diseased conditions, these cells are activated and recruited for new muscle formation. In contrast, the potential of resident adult stem cell incorporation into the myocardium has been challenged and the response of cardiac tissue, especially to ischaemic injury, is scar formation. Following muscle damage, various growth factors and cytokines are released in the afflicted area which influences the recruitment and incorporation of stem cells into the injured tissue. Transforming Growth Factor-β (TGF-β) is a member of the TGF-β-superfamily of cytokines and has at least three isoforms, TGF-β1, -β2, and -β3, which play essential roles in the regulation of cell growth and regeneration following activation and stimulation of receptor-signalling pathways. By improving the understanding of how TGF-β affects these processes, it is possible to gain insight into how the intercellular environment can be manipulated to improve stem cell-mediated repair following muscle injury. Therefore, the main aims of this thesis were to determine the effect of the three TGF-β isoforms on proliferation, differentiation, migration and fusion of muscle progenitor cells (skeletal and cardiac) and relate this to possible improved mechanisms for muscle repair. The effect of short- and long-term treatment with all three TGF-β isoforms were investigated on muscle progenitor cell proliferation and differentiation using the C2C12 skeletal muscle satellite and P19 multipotent embryonal carcinoma cell-lineages as in vitro model systems. Cells were treated with 5 ng/mℓ TGF-β isoforms unless where stated otherwise. In C2C12 cells, proliferating cell nuclear antigen (PCNA) expression and localisation were analysed, and together with total nuclear counts, used to assess the effect of TGF-β on myoblast proliferation (Chapter 5). The myogenic regulatory factors MyoD and myogenin, and structural protein myosin heavy chain (MHC) were used as protein markers to assess early and terminal differentiation, respectively. To establish possible mechanisms by which TGF-β isoforms regulate differentiation, further analysis included determination of MyoD localisation and the rate of MyoD degradation in C2C12 cells. To assess the effect of TGF-β isoforms on P19 cell differentiation, protein expression levels of connexin-43 and MHC were analysed, together with the determination of embryoid body numbers in differentiating P19 cells (Chapter 6). Furthermore, assays were developed to analyse the effect of TGF-β isoforms on both C2C12 and P19 cell migration (Chapter 7), as well as fusion of C2C12 cells (Chapter 8). Whereas all three isoforms of TGF-β significantly increased proliferation of C2C12 cells, differentiation results, however, indicated that especially following long-term incubation, TGF-β isoforms delayed both early and terminal differentiation of C2C12 cells into myotubes. Similarly, myocyte migration and fusion were also negatively regulated following TGF-β treatment. In the P19 cell-lineage, results demonstrated that isoform-specific treatment with TGF-β1 could potentially enhance differentiation. Further research is however required in this area, especially since migration was greatly reduced in these cells. Taken together, results demonstrated variable effects following TGF-β treatment depending on the cell type and the duration of TGF-β application. Circulating and/or treatment concentrations of this growth factor could therefore be manipulated depending on the area of injury to improve regenerative processes. Alternatively, when selecting appropriate stem or progenitor cells for therapeutic application, the effect of the immediate environment and subsequent interaction between the two should be taken into consideration for optimal beneficial results.

Le muscle squelettique adulte a une importante capacité à se régénérer après une lésion. La régénération musculaire dépend de divers signaux moléculaires tels que l’activation de la signalisation Wnt dans les cellules souches musculaires, appelées cellules satellites. Les protéines R-spondins (Rspo) composent une famille de quatre protéines qui ont un rôle d’activateurs/potentialisateurs sur les voies Wnt dans les cellules souches de différents tissus. Bien qu’il soit connu que ces protéines sont importantes pour la régénération de ces tissus, leur rôle dans la myogenèse régénérative n’a pas été étudié à ce jour. L’expression génique de R-spondin1 étant sur-régulée par Pax7, le marqueur des cellules satellites, nous avons émis l’hypothèse que R-spondin1 participe à la régénération musculaire. Nous avons, tout d’abord, isolé les cellules souches musculaires des modèles murins d’invalidation constitutive pour Rspo1 et avons observé qu’une déficience de R-spondin1 n’altère pas le cycle cellulaire de ces cellules. Cependant, une altération de l’expression de Rspo1 induit un défaut global de la cinétique de différenciation myogénique. Nous montrons que R-spondin1 inhibe la fusion des cellules musculaires puisque les myotubes déficients pour R-spondin1 possèdent un plus grand nombre de noyaux. Nous avons ensuite induit la régénération du muscle squelettique Tibalis Antérieur par une injection de Cardiotoxine et nous avons analysé les muscles à différents temps de régénération. Nos données prouvent qu’en l’absence de R-spondin1, les cellules souches présentent un retard de différenciation alors qu’elles possèdent une plus grande capacité de fusion, ayant pour conséquence une hypertrophie des myofibres dans le muscle. Concordant au rôle de R-spondin dans les cellules souches intestinales ou dans le follicule pileux, la protéine R-spondin1 stimule l’expression des gènes cibles de la voie Wnt canonique dans les cellules souches musculaires. Nous avons mis en évidence que R-spondin1 potentialise la voie Wnt canonique et régule négativement l’activation de la voie non-canonique dans les cellules. Nos résultats démontrent que la protéine R-spondin1 contribue à la régénération du muscle squelettique adulte par la régulation de l’activation des voies Wnt. / Adult mammalian skeletal muscles have the remarkable ability to repair after injury. Muscle regeneration depends on various cellular and molecular responses, such as activation of Wnt signaling pathways in muscle stem cells called satellite cells. R-spondin (Rspo) proteins are able to potentiate Wnt signaling pathways in vivo in many stem cells and play important role for regeneration of several tissues. The role of R-spondin in injury-induced myogenesis has not been studied. Given that R-spondin1 gene expression is up-regulated by Pax7, the satellite cell-specific transcription factor, we explored the hypothesis that R-spondin1 plays a role during skeletal muscle regeneration. We firstly isolated primary myoblasts from Rspo1 constitutive knock-out mice and observed that a depletion of Rspo1 did not alter cell cycle of these cells. However, a lack of R-spondin1 on cells resulted in global alteration of differentiation kinetics. We found that R-spondin1 inhibits muscle cell fusion, as Rspo1 knock-out myotubes contain an higher number of myonuclei. Then, we injured the Tibialis Anterior (TA) muscle of Rspo1-null mice and littermates controls by Cardiotoxin injection and analyzed muscle regeneration at different time points following injury. Our data show that R-spondin1 removal results in a delay of stem cell differenciation. In contrast, a R-spondin1 deficiency leads to better cell capacity to fuse to dommaged myofibers, giving rise to myofiber hypertrophy. As with other tissue-specific stem cells, such as hair follicle or intestinal crypt stem cells, R-spondin1 potentiates canonical Wnt signaling target genes expression in muscle stem cells. We proved that R-spondin1 potentiates canonical Wnt signaling target genes expression and negatively regulates non-canonical signaling in muscle stem cells. Our results demonstrate that R-spondin1 is crucial for adult muscle regeneration through a tighly cross-talk regulation between Wnt signalings.

Ttc39c has been identified as a novel gene in skeletal muscle that is upregulated in response to neurogenic atrophy in mice. Quantitative PCR and Western blot analysis confirmed that Ttc39c is expressed in both proliferating and differentiated muscle cells. Furthermore, comparison of Ttc39c expression in undifferentiated and differentiated C2C12 cells demonstrated that Ttc39c levels peak in early differentiation, but decreases as cells become fully differentiated myotubes. The transcriptional regulation of Ttc39c was examined by cloning promoter fragments of the gene and fusing it with the SEAP reporter gene. The Ttc39c reporter gene constructs were transfected into muscle cells and confirmed to have significant transcriptional activity in cultured muscle cells and were also found to be transcriptionally repressed in response to ectopic expression of myogenic regulatory factors (MRF). Furthermore, conserved E-box elements in the proximal promoter region were identified, mutated, and analyzed for their role in the transcriptional regulation of Ttc39c expression. Mutation of the conserved E-box sequences reduced the activity of the Ttc39c reporter gene, suggesting that these elements are potentially necessary for full Ttc39c expression. To determine the sub-cellular location of Ttc39c in muscle cells, the Ttc39c cDNA was fused with the green fluorescent protein (GFP), expressed in muscle cells, and visualized by confocal microscopy revealing that Tct39c is localized to the cytoplasm of proliferating myoblasts and differentiating myotubes. Furthermore, Ttc39c appears to localize to the microtubule network and differentiating muscle cells developed elongated primary cilia in response to Ttc39c ectopic expression. Additionally, Ttc39c overexpression resulted in impaired muscle cell differentiation, attenuated Hedgehog and MAP Kinase signaling, and increased expression of IFT144, a component of the intraflagellar transport complex A involved in retrograde movement in primary cilia. Interestingly, Ttc39c knockdown also resulted in abrogated muscle cell differentiation and impaired Hedgehog and MAP Kinase signaling, but did not affect IFT144 expression levels. These results suggest that muscle cell differentiation is sensitive to aberrant Ttc39c expression, that Ttc39c is necessary for proper muscle cell differentiation, and that Ttc39c may participate in retrograde transport of the primary cilia of developing muscle cells.

Les cassures double-brin (DSB) sont des dommages dangereux de l’ADN et représentent un facteur de risque pour la stabilité du génome. Le maintien de l'intégrité du génome est essentiel pour les cellules souches adultes, qui sont responsables de la régénération des tissus endommagés et de l'homéostasie tissulaire tout au long de la vie. La régénération musculaire chez l'adulte repose sur les cellules souches musculaires (cellules satellites, SCs) qui possèdent une remarquable capacité de réparation des DSB, mais dont le mécanisme sous-jacent reste inconnu. Ce projet de thèse consistait à étudier comment la différenciation musculaire est affectée lorsque la réparation des DSB est altérée, et quels sont le(s) mécanisme(s) et les conséquences de ce défaut de réparation sur la régénération musculaire. Au cours de cette étude, il est apparu de façon originale que les facteurs de réparation des DSB peuvent affecter la myogenèse, indépendamment de leur fonction dans la réparation de l'ADN. La présente étude a porté sur le rôle de la protéine kinase dépendante de l'ADN (DNA-PK), un facteur crucial pour la réparation non-homologue des DSBs (NHEJ), au cours de la différenciation musculaire chez la souris. L’étude a ciblé l'activation des SCs et la régénération musculaire in vitro et in vivo et a également abordé la régulation de cette kinase. Le rôle "canonique" de la DNA-PK, et donc du NHEJ, dans les SCs a également été étudié en présence de lésions de l'ADN radio-induites. Le rôle d’ATM, une kinase qui orchestre les réponses cellulaires aux DSB, a également été abordé dans le contexte de la régénération musculaire. Ces résultats confirment la notion émergente du rôle multifonctionnel des protéines de réparation de l’ADN dans d’autres processus physiologiques que la réparation elle-même, ce qui m’a également permis de réaliser une étude bibliographique. Ce travail i) identifie de nouveaux régulateurs de la myogenèse et ii) contribue à la compréhension de la résistance des cellules souches musculaires au stress génotoxique. Ces résultats pourraient avoir des implications dans l'amélioration des thérapies cellulaires de la dysfonction musculaire en agissant sur les régulateurs nouvellement découverts. / DNA double-strand breaks (DSBs) are dangerous DNA damages and a risk factor for genome stability. The maintenance of genome integrity is crucial for adult stem cells that are responsible for regeneration of damaged tissues and tissue homeostasis throughout life. Muscle regeneration in the adult relies on muscle stem cells (satellite cells, SCs) that have a remarkable DSB repair activity, but the underlying mechanism is not known. The aims of the present PhD project were to investigate how muscle differentiation is affected when DSB repair is impaired, and which are the mechanism(s) and the consequences on muscle regeneration. During this study, a novel possibility has arisen, namely that DSB repair factors affects myogenesis independently of their DNA repair activity, suggesting a novel function, not previously anticipated, of these factors. The present study has addressed the role of DNA-dependent protein kinase (DNA-PK), a crucial factor in non-homologous end-joining (NHEJ) repair of DSBs, in muscle differentiation in the mouse. Studies have targeted SC activation and muscle regeneration in vitro and in vivo and also addressed the regulation of this kinase. In parallel the more “canonical” role of DNA-PK, and thereby of NHEJ, has been investigated in SCs via radiation-induced DNA damage. The role of ATM, a kinase that orchestrates cellular responses to DSBs in muscle regeneration has also been addressed. These results support the emerging notion of multifunctional repair proteins in a variety of physiological processes beyond the repair process itself, on which I have conducted a bibliographical study. This work i) identifies novel regulators of myogenesis, and ii) helps understanding the resistance of muscle stem cells to genotoxic stress. It has potential implications for improving cellular therapies for muscle dysfunction by acting on the newly discovered regulators.

La poly(ADP-ribosyl)ation est une modification post-traductionnelle de protéines catalysée par les Poly(ADP-ribose) polymérases (PARPs, 17 membres). Depuis 2011, le laboratoire décortique les propriétés biologiques de PARP3 qui est désormais bien décrite pour son rôle dans la réparation des cassures double-brin de l’ADN, la mitose et la transition épithélio-mésenchymateuse. Ces recherches combinées aux données de la littérature semblent indiquer que les fonctions de PARP3 sont très étendues et participent aussi à des processus physiologiques. Ainsi, mes travaux de thèse révèlent une nouvelle fonction clé de PARP3 dans la différenciation des cellules souches neurales et musculaires. Nous avons observé une forte augmentation de l’expression de PARP3 au cours de la neurogénèse, la gliogenèse et la myogénèse. En l’absence de PARP3, la différenciation des cellules souches neurales (NSPC) en astrocytes et neurones est perturbée et les souris PARP3KO présentent une incapacité à régénérer le tissu cérébral au niveau du striatum après ischémie hypoxique. Concernant les cellules musculaires, la disruption de PARP3 (Crispr/Cas9) empêche toute différenciation des myoblastes C2C12 en myotubes et conduit à une désoganisation du cytosquelette, une dégénérescence mitochondriale et une répression de gènes de l’identité. La réexpression de PARP3 catalytiquement active restaure la capacité de différenciation des C2C12. Enfin, nous avons identifié de nouvelles protéines cibles de PARP3 qui permettent de suspecter un rôle dans l’autophagie et le métabolisme énergétique au cours de la différenciation cellulaire. L’ensemble de ces résultats nous ont permis de découvrir que PARP3 a un rôle central dans la différenciation cellulaire et d’ouvrir de solides pistes de recherche afin d’identifier les mécanismes mis en jeu. / Poly (ADP-ribosyl)ation is a post-translational modification of proteins catalysed by Poly (ADP-ribose) polymerases (PARPs, 17 members). Since 2011, the laboratory has been dissecting the biological properties of PARP3 which is now well described for its role in the repair of DNA double-strand breaks, in mitosis and in epithelial-mesenchymal transition. This investigation combined with data from the literature suggests that PARP3 functions are very wide and could participate in physiological processes. Thus, my thesis work reveals a new key function of PARP3 in neural and muscular stem cell differentiation. We observed a strong increase in PARP3 expression during neurogenesis, gliogenesis and myogenesis. In the absence of PARP3, the differentiation of neural stem cells (NSPCs) into astrocytes and neurons is impaired and PARP3KO mice display an inability to regenerate brain tissue in the region of the striatum after hypoxic ischemia. Regarding muscle cells, PARP3 disruption (Crispr/Cas9) prevents C2C12 myoblast differentiation into myotubes and leads to cytoskeleton disorganisation, mitochondrial degeneration, and repression of identity genes. The reexpression of a catalytically active PARP3 restores the C2C12 differentiation capacity. Finally, we have identified new PARP3 target proteins that suggest a role in autophagy and energetic metabolism during cell differentiation.Together, these results reveal that PARP3 has a central role in cell differentiation and opens solid lines of research to identify the mechanisms involved.

Au cours de la myogenèse post-natale, la voie de signalisation de Notch participe au développement et à la régénération du muscle squelettique chez les mammifères. Elle permet le maintien de l'état prolifératif des myoblastes, contrôle la quiescence des cellules satellites in vivo et préserve une sous-population de cellules de réserve indifférenciées in vitro. L' activation de la voie et l'interaction du récepteur Notch avec ses ligands est dépendante de leur entité glucidique, notamment de leurs O-fucosylglycannes. La synthèse de ces derniers est initiée par la protéine O-fucosyltransférase 1 (Pofut1) qui greffe un O-fucose sur des domaines peptidiques particuliers appelés EGF-like. Bien que les acteurs moléculaires de la différenciation myogénique aient été largement étudiés par la communauté scientifique, la contribution de la glycosylation des protéines dans ce processus reste peu documentée. Une approche expérimentale in vitro basée sur l'utilisation de la lignée myoblastique murine C2C12 nous a permis d'identifier une expression importante de Pofut1 dans les cellules de réserve tandis qu' elle est restreinte dans les myotubes durant la différenciation myogénique. Plusieurs lignées de cellules C2C12 ont été générées pour qu' elles expriment de manière stable et différentielle Pofut1. Elles permettent ainsi d' évaluer l' importance du niveau d' expression de Pofut1 sur la différenciation myogénique.La sous-expression de Pofut1 réduit l' activation de la voie de signalisation de Notch conduisant à une entrée précoce des myoblastes dans le programme myogénique. Ceci a pour conséquence la dépletion des cellules de réserve Pax7+/MyoD- au profit d' une augmentation du nombre de myotubes. Des études morphométriques ont révélé un défaut d' accrétion nucléaire dans les myotubes sous-exprimant Pofut1, caractéristique d' une altération de la fusion secondaire. Ces observations sont accompagnées d' une diminution significative de l' expression du récepteur à l' interleukine 4 dans les cellules de reserve sous-exprimant Pofut1. Les lignées cellulaires ré-exprimant Pofut1 présentent une activation de la voie de signalisation de Notch et un processus de fusion myoblastique correctement restaurés.Ces travaux de thèse ont mis en exergue pour la première fois le rôle essentiel de Pofut1 dans le devenir cellulaire et la fusion des myoblastes au cours de la différenciation myogénique. / During post-natal myogenesis, Notch signaling pathway is involved in the development and regeneration of skeletal muscle in mammals. It maintains progenitor cell properties during the development of the myogenic lineage and controls the transition of satellite cells from a quiescent to an active state and preserves a subpopulation of reserve cells, in cell culture, in an undifferentiated state. The interaction between Notch and its ligands and the activation of this signaling is mainly controlled by the activity of protein O-fucosyltranferase 1 (Pofut1) and thus by the O-fucosylation state of the EGF-like repeats.Although the molecular players in myogenic differentiation have been extensively studied by the scientific community, the contribution of glycosylated proteins in this process remains poorly documented. An experimental in vitro study based on the C2C12 mouse myoblast cell line allowed us to identify a high expression of Pofut1 in reserve cells while a low expression was found in myotubes during myogenic differentiation. Several C2C12 cell lines were generated to express Pofut1 at different levels. They were used to evaluate the contribution of Pofut1 expression to the myogenic differentiation.The knockdown of Pofut1 repressed Notch signaling pathway activation leading to an earlier entrance of myoblasts in myogenic program. This resulted in the depletion of reserve cells Pax7+/MyoD- and an increase in the number of myotubes. Morphometric analysis revealed a nuclear accretion defect in Pofut1 knockdown myotubes. A significant decrease in the expression of the interleukin-4 receptor in Pofut1 knockdown reserve cells was also observed. Cell lines re-expressing correctly Pofut1 restored Notch signaling pathway and subsequently myoblast fusion process.This thesis work highlights, for the first time, the crucial role of Pofut1 in the cell fate decision and the fusion of myoblasts during myogenic differentiation.