A criptococose clinica foi observada por volta do primeiro dia da inoculação e a sobrevida dos animais 15 dias após-inoculação (PI). Isolamos C. neoformans no cérebro a partir do 5º dia (PI) e no pulmão a partir 11º dia (PI). No 1º dia (PI) observamos por meio do tecido cerebral que já havia um quadro inicial de infecção, presença de edema, que evoluiu durante todo o período. C. neoformans foi visualizado primeiramente nos vasos capilares, o que nos leva a sugerir que seja esta rota importante para a entrada da levedura no órgão. A meningite aguda aconteceu por volta do 7º dia quando visualizamos o microrganismo na meninge e com um discreto infiltrado inflamatório. A partir do 13º dia a doença evoluiu para crônica permanecendo até o óbito dos animais. A monoterapia com anfotericina B (AMB) reduziu a sobrevida dos animais, enquanto que, o tratamento isolado com fluconazol (FLC) prolongou a mesma. A associação AMB-FLC foi eficaz, quando iniciamos o tratamento 24 horas (PI), enquanto que, o mesmo tratamento iniciado a partir do 7º dia quando já tínhamos um quadro compatível de meningite aguda não foi satisfatório. É importante ressaltar que os resultados descritos foram referentes à inoculação com isolado sensível in vitro ao fluconazol, enquanto que, o tratamento não resultou em êxito quando empregamos isolado resistente in vitro ao fluconazol. / Clinical cryptococcosis was observed on day 1 postinoculation (PI), and the animals survived until day 15 PI. C. neoformans was isolated from brain tissue starting on day 5 PI, and from lung tissue starting on day 11 PI. On day 1 PI, signs of infection were already observed in brain tissue, with presence of edema, which evolved throughout the period. C. neoformans was first seen in the capillaries, suggesting that this is an important route for the entrance of the yeast into this organ. Acute meningitis occurred around day 7 PI, when the microorganism was observed in the meninges, along with a discrete inflammatory infiltrate. From day 13 PI onward the disease became chronic, persisting until the death of the animals. Treatment with amphotericin B (AMB) alone shortened the animals\' survival, while treatment with fluconazole (FLC) alone lengthened it. Treatment with the two drugs in association was effective when treatment was begun at 24 hours PI, however, when treatment was begun at day 7 PI, already with signs of acute meningitis, the effectiveness was unsatisfactory. It is important to emphasize that these results relate to inoculation with an isolate susceptible in vitro to fluconazole, while the treatment was not effective for an isolate resistant in vitro to fluconazole.

O objetivo desta tese foi desenvolver um modelo farmacocinético-farmacodinâmico (PK-PD) aplicável a avaliação de esquemas posológicos de antifúngicos sistêmicos no tratamento de infecções cerebrais associadas ao Cryptococcus neorformans. Inicialmente um modelo de infecção cerebral em ratos Wistar machos imunocompetentes foi estabelecido. Os animais foram inoculados a partir da administração iv de 1.106 UFC/mL na veia lateral caudal, de uma cepa de Cryptococcus neoformans var neoformans (ATCC 28957). A presença da levedura em cérebro, pulmão, fígado, rins e coração foi avaliada após 7, 10 e 14 dias. Paralelamente foram investigados os parâmetros bioquímicos (contagem de leucócitos, TGO, TGP, uréia, creatinina, albumina e CK) e a permeabilidade vascular cerebral com azul de Evans. Após 10 dias de inoculação foi produzida uma infecção com características semelhantes a doença em humanos. C. neoformans esteve presente em todos os tecidos investigados pelas análises histológicas e microbiológicas e diferenças nos níveis de albumina, ureia, TGP e CK, alteração no número de leucócitos (monócitos e neutrófilos) e elevação da permeabilidade cerebral ao azul de Evans foram observadas nos animais infectados. Após estabelecida e caracterizada a infecção, foi avaliada a farmacocinética plasmática e tecidual cerebral através da técnica de microdiálise, do fluconazol (FLU) (20 mg/kg, i.v. bolus) e do voriconazol (VRC) (5 mg/kg, i.v. bolus) em ratos Wistar sadios (n = 13) e infectados (n = 13). De posse dos dados das concentrações plasmáticas e teciduais vs tempo dos grupos sadios e infectados construiu-se um modelo farmacocinético populacional (PopPK) para cada fármaco investigado. A penetração cerebral do VRC demonstrou-se elevada nos animais infectados (fTsadios = 0,85 vs fTinfectados = 1,86). O modelo PopPK de dois compartimentos e eliminação por Michaelis Menten descreveu o perfil de concentrações versus tempo de VRC em plasma e tecido, simultaneamente. A covariável infecção foi incluída em V2 e VM. Observou-se o grande potencial do VRC para tratar meningite associada a C. neoformans, pois os níveis alcançados em tecidos infectados foram superiores aos valores descritos para CIM de VRC contra C. neoformans (0,03 - 0,5 μg/mL). A farmacocinética do FLC foi descrita através de um modelo PopPK de dois compartimentos com eliminação linear incluindo dados de concentrações plasmáticas e livres cerebrais para ambos os grupos investigados. Nesse modelo a covariável infecção foi atribuída ao parâmetro k21 e covariável peso foi atribuída aos parâmetros V1 e V2. De posse desse modelo popPK, foram investigados os desfechos farmacodinâmicos considerando o nível de exposição cerebral nas doses de 125 e 250 mg/kg para ratos e 400-2000 mg para humanos observado em tecido sadio e infectado através da probabilidade de atingir o alvo terapêutico (PTA - fASC/CIM = 389) do FLC usando simulações de Monte Carlo. Essas simulações demonstraram um uso limitado de fluconazol em monoterapia para o tratamento de meningite por C. neoformans. Após a etapa farmacocinética procederam-se os estudos farmacodinâmicos através da metologia de curvas de morte em função do tempo do fluconazol e voriconazol frente a C. neoformans. Os dados da curva de morte foram modelados adequadamente com o modelo PK-PD de Emax modificado incluindo um termo de atraso de crescimento. A CIM foi determinada para ambos os fármacos por microdiluição e os valores foram de 0,03 μg/mL para voriconazol e 0,5 μg/mL para fluconazol, indicando que esta cepa ATCC 28957 é sensível a ambos os fármacos. Os valores de k, EC50 e kmax foram determinados para vários múltiplos das CIM de cada fármaco (0,03×, 0,06×, 0,25×, 0,5×, 1× 4×, 16×, 32× e 64×). O valor médio de k foi de 0,38 h-1, EC50 foi de 1,26 ± 0,18 μg/mL e 0,32 ± 0,06 μg/mL e kmax foi de 0,95 ± 0,21 h-1 e 0,64 ± 0,12 h-1 para FLC e VRC, respectivamente. Por fim, de posse dos parâmetros calculados através do modelo PK-PD foram realizadas simulações dos desfechos de tratamento para meningite criptocócica no cenário clínico para ambos os fármacos após administração das doses 200 e 400 mg de voriconazol e 800 e 2000 mg de fluconazol por dez semanas. Através das simulações conclui-se que para fluconazol há 25% de insucesso na dose de 800 mg e 10% na dose de 2000 mg com um tempo médio de 3 semanas para erradicação da levedura. Para o voriconazol, o EC50 teve pouco impacto sobre a erradicação do fungo e, em todos os cenários foi observada uma erradicação completa do fungo em curto espaço de tempo (1 - 2 semanas). Os resultados incentivam o uso de voriconazol nos pacientes com meningite criptocócica e uma reavaliação do uso de fluconazol. / The aim of this thesis was to develop a pharmacokinetic-pharmacodynamic (PK-PD) model for the evaluation of systemic antifungal dosing regimens for the treatment of brain infections associated with Cryptococcus neorformans. Firstly a model of brain infection in immunocompetent male Wistar rats was established. The animals were inoculated by intravenously administration of 1. 106 CFU/mL of Cryptococcus neoformans var neoformans (ATCC 28957) into the tail lateral vein. The presence of yeasts in the brain, lung, the liver, kidneys and the heart was evaluated after 7, 10 and 14 days. The biochemical parameters (leucocytes counting, GOT, GPT, urea, creatinine, albumin and CK) and cerebral vascular permeability with Evans blue were investigated. After 10 days post inoculation an infection with characteristics similar in humans was produced. C. neoformans was present in all tissues investigated by histological and microbiological analyzes and differences in albumin, urea, GPT and CK levels, alterations in the number of leukocytes (monocytes and neutrophils), and elevation of cerebral permeability to Evans blue were observed in infected animals. After establishing and characterizing the infection, the plasma and cerebral tissue pharmacokinetics were evaluated by microdialysis after administration of fluconazole (FLU) (20 mg/kg, iv bolus) and voriconazole (VRC) (5 mg/kg, iv bolus) in healthy (n = 13) and infected Wistar rats (n = 13). A population pharmacokinetic model (PopPK) was build for each drug, based on data from plasma and tissue concentrations vs. time of healthy and infected groups. The brain penetration of voriconazole was shown to be high in infected animals (fThealthy = 0.85 vs fTinfected = 1.86) than in healthy ones. The two-compartment model with Michaelis Menten elimination best described the concentration of VRC in plasma and tissue. The covariate infection was included in V2 and VM. The great potential of voriconazole to treat meningitis associated with C. neoformans was observed, as the levels reached in infected tissues were higher than the values described for MIC against C. neoformans (0.03 - 0.5 μg/mL). The pharmacokinetics of FLC was described using a two-compartment model with linear elimination including data from plasma and brain free concentrations for both groups investigated. In this model the covariate infection was attributed to parameter k21 and covariate weight was assigned to parameters V1 and V2. With this popPK model, the pharmacodynamic outcomes were investigated considering the level of brain exposure at doses of 125 and 250 mg/kg for rats and 400 - 2000 mg for humans observed in healthy and infected tissue through the probability of attaining the target (PTA - fAUC/MIC = 389) of fluconazole using Monte Carlo simulations. These simulations demonstrated limited use of fluconazole in monotherapy for the treatment of C. neoformans meningitis. After the pharmacokinetics modeling, the pharmacodynamic studies were carried out using the methodology of time-kill curves of fluconazole and voriconazole versus C. neoformans. The kill curves data were suitably modeled with the modified Emax PK-PD model including a growth delay term. MIC was determined for both drugs by microdilution and values were 0.03 μg.mL-1 for voriconazole and 0.5 μg.mL-1 for fluconazole, indicating that this ATCC 28957 strain is sensitive to both drugs. The values of k, EC50 and kmax were determined for several MIC multiples of each drug (0.03 ×, 0.06 ×, 0.25 ×, 0,5×, 1 × 4 ×, 16 ×, 32 × and 64 ×). The mean value of k was 0.38 h-1, EC50 was 1.26 ± 0.18 μg.mL-1 and 0.32 ± 0.06 μg.mL-1 and kmax was 0.95 ± 0.21 h -1 and 0.64 ± 0.12 h-1 for FLC and VRC, respectively. Finally, the parameters obtained using the PK-PD model were used to simulate treatment outcomes for cryptococcal meningitis in the clinical setting for both drugs after administration of 200 and 400 mg of voriconazole and 800 and 2000 mg of fluconazole for 10 weeks. By the simulations it is concluded that for fluconazole there is a 25% rate of failure at the dose of 800 mg and 10% at the dose of 2000 mg with an average time of 3 weeks for eradication of the yeast. For voriconazole, the EC50 had little impact on fungus eradication and, in all scenarios complete eradication of the fungus was observed in a short time (1 - 2 weeks). The results encourage the use of voriconazole in patients with cryptococcal meningitis and a reassessment of fluconazole use.

No período de 1981-2010, foram estudados, retrospectivamente, 54 casos de criptococose em pacientes com transplante de órgão sólido, identificados no Laboratório de Micologia da Santa Casa Complexo Hospitalar, Porto Alegre, RS. A criptococose ocorreu em 31 transplantados de rim, 13 de fígado, 7 de pulmão, 2 de pâncreas e rim, e 1 de coração. A idade média foi de 47,91 ± 13,98 (12-76 anos). Um total de 38 pacientes do sexo masculino (70,4%). As manifestações clínicas mais frequentes (54 pacientes) foram febre, cefaléia, vômito, tosse e estado mental alterado. Os achados radiográficos mais comuns no tórax, em 27 pacientes, foram nódulo, consolidação, cavitação e derrame pleural, sendo 10 com comprometimento pulmonar comprovado. Trinta e quatro apresentavam acometimento do sistema nervoso central, 7 tinham envolvimento cutâneo, e 4 em outros locais. O liquor, sangue e urina, respectivamente, contribuíram para o diagnóstico microbiológico com maior frequência. A maioria das infecções, nesta série de pacientes com criptococose, foi causada por Cryptococcus neoformans (92,7%). Pela primeira vez na literatura, documentamos C. gattii em pacientes com transplante de pulmão. Finalmente, quanto ao regime imunossupressor primário utilizado, houve maior mortalidade entre os pacientes que usaram o regime terapêutico baseado em ciclosporina e menor naqueles que usaram tacrolimus. / In the period of 1981 to 2010, 54 cases of cryptococcosis in patients with solid organ transplantation indetified at Mycology Laboratory in Santa Casa Hospital Complex, Porto Alegre, RS, were retrospectively studied. Cryptococcois occured in 31 kidney, 13 liver, 7 lung, 2 kidney-pancreas, and 1 heart transplant. The mean age was 47.3 years old (range, 12-76; SD 13.98). A total of 38 patients were male (70.4%). The most frequent clinical manifestation (54 patients) was fever, headache, vomiting, cough and altered mental status. The most common chest radiographic fidings, in 27 patients, were nodules, masses, consolidation, cavitation, and pleural effusion, 10 with proved pulmonary involvement. Thirty four patients had central nervous system involvement, 7 with cutaneous involvement, and 4 at other sites. The cerebospinal fluid, blood, and urine had the highest yield for the microbiologic diagnosis, respectivelly. Nearly all infections in this series of patients with cryptococcosis involved Cryptococcus neoformans (92.7%). By the first time in the literature, we documented C. gattii in lung transplant patients. Finally, considering the type of primary immunosupressive agent used, there was a higher mortality rate on patients with cyclosporine based therapy, and lowest in those with tacrolimus.

No período de 1981-2010, foram estudados, retrospectivamente, 54 casos de criptococose em pacientes com transplante de órgão sólido, identificados no Laboratório de Micologia da Santa Casa Complexo Hospitalar, Porto Alegre, RS. A criptococose ocorreu em 31 transplantados de rim, 13 de fígado, 7 de pulmão, 2 de pâncreas e rim, e 1 de coração. A idade média foi de 47,91 ± 13,98 (12-76 anos). Um total de 38 pacientes do sexo masculino (70,4%). As manifestações clínicas mais frequentes (54 pacientes) foram febre, cefaléia, vômito, tosse e estado mental alterado. Os achados radiográficos mais comuns no tórax, em 27 pacientes, foram nódulo, consolidação, cavitação e derrame pleural, sendo 10 com comprometimento pulmonar comprovado. Trinta e quatro apresentavam acometimento do sistema nervoso central, 7 tinham envolvimento cutâneo, e 4 em outros locais. O liquor, sangue e urina, respectivamente, contribuíram para o diagnóstico microbiológico com maior frequência. A maioria das infecções, nesta série de pacientes com criptococose, foi causada por Cryptococcus neoformans (92,7%). Pela primeira vez na literatura, documentamos C. gattii em pacientes com transplante de pulmão. Finalmente, quanto ao regime imunossupressor primário utilizado, houve maior mortalidade entre os pacientes que usaram o regime terapêutico baseado em ciclosporina e menor naqueles que usaram tacrolimus. / In the period of 1981 to 2010, 54 cases of cryptococcosis in patients with solid organ transplantation indetified at Mycology Laboratory in Santa Casa Hospital Complex, Porto Alegre, RS, were retrospectively studied. Cryptococcois occured in 31 kidney, 13 liver, 7 lung, 2 kidney-pancreas, and 1 heart transplant. The mean age was 47.3 years old (range, 12-76; SD 13.98). A total of 38 patients were male (70.4%). The most frequent clinical manifestation (54 patients) was fever, headache, vomiting, cough and altered mental status. The most common chest radiographic fidings, in 27 patients, were nodules, masses, consolidation, cavitation, and pleural effusion, 10 with proved pulmonary involvement. Thirty four patients had central nervous system involvement, 7 with cutaneous involvement, and 4 at other sites. The cerebospinal fluid, blood, and urine had the highest yield for the microbiologic diagnosis, respectivelly. Nearly all infections in this series of patients with cryptococcosis involved Cryptococcus neoformans (92.7%). By the first time in the literature, we documented C. gattii in lung transplant patients. Finally, considering the type of primary immunosupressive agent used, there was a higher mortality rate on patients with cyclosporine based therapy, and lowest in those with tacrolimus.

Submitted by Maike Costa (maiksebas@gmail.com) on 2017-09-11T13:49:03Z No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 4539317 bytes, checksum: 8b0c70f7cf6924075fe039736b510527 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-09-11T13:49:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 4539317 bytes, checksum: 8b0c70f7cf6924075fe039736b510527 (MD5) Previous issue date: 2017-02-13 / Cryptococcosis is an infection caused by fungus of the genus Cryptococcus. This fungus is cosmopolitan and there are two main species, Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gatii. The infection manifests primarily non-lung tissue and central nervous system, being highly lethal when not treated properly. Individuals with HIV or the compromised immune system are more susceptible to the development of cryptococcosis. Therapeutic agents available for the treatment of cryptococcosis are limited and toxic, besides the high incidence of physical resistance to these agents. Therefore, a search for other therapeutic alternatives for the treatment of cryptococcosis is essential. In this scenario, natural products, such as essential oils and their phytochemicals, are very promising for the development of new antifungal drugs. The objective of this study was to evaluate the antifungal activity of O. vulgare L. (oregano) and its major phytochemical, carvacrol, on Cryptococcus neoformans strains. The composition of the essential oil was analyzed by Gas Chromatography coupled to Mass Spectrometry (GC-MS). Minimum Inhibitory Concentration (MIC) and Minimum Fungicidal Concentration (CFM) were determined by broth microdilution technique. The sensitivity profile of the strains was determined by disc diffusion method, as well as the study of association of the products with antifungals. The kinetics of microbial death were also evaluated. The results of CG-MS have indicated a higher concentration of carvacrol (67.97%), p-cymene (11.67%), γ-terpinene (7.92%), thymol (7.84%) and linalool 3.44%). The MIC50, as well as MIC90, of the essential oil were 64 μg/mL. Carvacrol presented MICs of 32 μg/mL and MICs of 64 μg/mL. The CFM50 and CFM90 from the essential oil were 64 μg/mL and 256 μg/mL respectively. Carvacrol has shown CFM50 equal to 32 μg/mL and CFM90 equal to 64 μg/mL. The strains profile has shown 100% of sensitivity to amphotericin B (100 μg), 30% sensitivity to fluconazole (25 μg) and any strain has shown sensitivity to 5-fluorocytosine (10 μg). The association of essential oil and carvacrol with amphotericin B and fluconazole has not shown synergism of action. The microbial death curve has shown that the products have concentration-dependent fungicidal effect. The results of the study demonstrate that the essential oil of oregano and carvacrol have an antifungal activity, showing them as promising agents to the development of drugs capable to treat cryptococcosis. / Criptococose é uma infecção causada por fungos do gênero Cryptococcus. Esse fungo é cosmopolita e tem duas espécies principais patogênicas ao homem: Cryptococcus neoformans e Cryptococcus gatii. A infecção se manifesta principalmente no tecido pulmonar e sistema nervoso central, sendo altamente letal quando não tratada adequadamente. Indivíduos portadores do HIV ou com sistema imunológico comprometido são os mais susceptíveis ao desenvolvimento da criptococose. Os agentes terapêuticos disponíveis atualmente para o tratamento da criptococose são limitados e possuem significativa toxicidade, além da alta incidência de resistência fúngica a esses agentes. Assim sendo, é imprescindível a busca por alternativas terapêuticas para o tratamento da criptococose. Nesse panorama, os produtos naturais, como óleos essenciais e seus fitoconstituintes, se mostram muito promissores para o desenvolvimento de novos medicamentos antifúngicos. Diante disto, o presente estudo teve como objetivo avaliar a atividade antifúngica do óleo essencial de O. vulgare L. (orégano) e seu fitoconstituinte majoritário, o carvacrol, sobre cepas de Cryptococcus neoformans. A composição do óleo essencial foi analisada por Cromatografia Gasosa acoplada a Espectrometria de Massas (CG-EM). A Concentração Inibitória Mínima (CIM) e Concentração Fungicida Mínima (CFM) foram determinadas pela técnica de microdiluição em caldo. O perfil de sensibilidade das cepas frente a antifúngicos licenciados, foi determinado pelo método de disco-difusão, bem como o estudo de associação dos produtos com antifúngicos. A cinética de morte microbiana também foi avaliada. Os resultados da CG-MS indicaram a presença de cinco fitoconstituintes presentes em maior quantidade: carvacrol (67,97%), p-cimeno (11,67%), ý-terpineno (7,92%), timol (7,84%) e linalol (3,44%). A CIM50, assim como a CIM90, do óleo essencial foi de 64 μg/mL. Já o carvacrol apresentou CIM50 de 32 μg/mL e CIM90 de 64 μg/mL. A CFM50 e CFM90 do óleo essencial foram 64 μg/mL e 256 μg/mL respectivamente. O carvacrol teve CFM50 de 32 μg/mL e CFM90 de 64 μg/mL. O perfil de sensibilidade das cepas mostrou que 100% das cepas foram sensíveis a anfotericina B (100 μg), 30% foram sensíveis ao fluconazol (25 μg) e nenhuma cepa apresentou sensibilidade a 5-fluorocitosina (10 μg). A associação do óleo essencial e do carvacrol com anfotericina B e fluconazol não apresentou sinergismo de ação. A curva de morte microbiana demonstrou que os produtos apresentaram efeito fungicida dependente de concentração. Os resultados desse estudo demonstram que o óleo essencial de orégano e o carvacrol possuem atividade antifúngica, se mostrando como agentes promissores para o desenvolvimento de medicamentos para o tratamento da criptococose

O objetivo desta tese foi desenvolver um modelo farmacocinético-farmacodinâmico (PK-PD) aplicável a avaliação de esquemas posológicos de antifúngicos sistêmicos no tratamento de infecções cerebrais associadas ao Cryptococcus neorformans. Inicialmente um modelo de infecção cerebral em ratos Wistar machos imunocompetentes foi estabelecido. Os animais foram inoculados a partir da administração iv de 1.106 UFC/mL na veia lateral caudal, de uma cepa de Cryptococcus neoformans var neoformans (ATCC 28957). A presença da levedura em cérebro, pulmão, fígado, rins e coração foi avaliada após 7, 10 e 14 dias. Paralelamente foram investigados os parâmetros bioquímicos (contagem de leucócitos, TGO, TGP, uréia, creatinina, albumina e CK) e a permeabilidade vascular cerebral com azul de Evans. Após 10 dias de inoculação foi produzida uma infecção com características semelhantes a doença em humanos. C. neoformans esteve presente em todos os tecidos investigados pelas análises histológicas e microbiológicas e diferenças nos níveis de albumina, ureia, TGP e CK, alteração no número de leucócitos (monócitos e neutrófilos) e elevação da permeabilidade cerebral ao azul de Evans foram observadas nos animais infectados. Após estabelecida e caracterizada a infecção, foi avaliada a farmacocinética plasmática e tecidual cerebral através da técnica de microdiálise, do fluconazol (FLU) (20 mg/kg, i.v. bolus) e do voriconazol (VRC) (5 mg/kg, i.v. bolus) em ratos Wistar sadios (n = 13) e infectados (n = 13). De posse dos dados das concentrações plasmáticas e teciduais vs tempo dos grupos sadios e infectados construiu-se um modelo farmacocinético populacional (PopPK) para cada fármaco investigado. A penetração cerebral do VRC demonstrou-se elevada nos animais infectados (fTsadios = 0,85 vs fTinfectados = 1,86). O modelo PopPK de dois compartimentos e eliminação por Michaelis Menten descreveu o perfil de concentrações versus tempo de VRC em plasma e tecido, simultaneamente. A covariável infecção foi incluída em V2 e VM. Observou-se o grande potencial do VRC para tratar meningite associada a C. neoformans, pois os níveis alcançados em tecidos infectados foram superiores aos valores descritos para CIM de VRC contra C. neoformans (0,03 - 0,5 μg/mL). A farmacocinética do FLC foi descrita através de um modelo PopPK de dois compartimentos com eliminação linear incluindo dados de concentrações plasmáticas e livres cerebrais para ambos os grupos investigados. Nesse modelo a covariável infecção foi atribuída ao parâmetro k21 e covariável peso foi atribuída aos parâmetros V1 e V2. De posse desse modelo popPK, foram investigados os desfechos farmacodinâmicos considerando o nível de exposição cerebral nas doses de 125 e 250 mg/kg para ratos e 400-2000 mg para humanos observado em tecido sadio e infectado através da probabilidade de atingir o alvo terapêutico (PTA - fASC/CIM = 389) do FLC usando simulações de Monte Carlo. Essas simulações demonstraram um uso limitado de fluconazol em monoterapia para o tratamento de meningite por C. neoformans. Após a etapa farmacocinética procederam-se os estudos farmacodinâmicos através da metologia de curvas de morte em função do tempo do fluconazol e voriconazol frente a C. neoformans. Os dados da curva de morte foram modelados adequadamente com o modelo PK-PD de Emax modificado incluindo um termo de atraso de crescimento. A CIM foi determinada para ambos os fármacos por microdiluição e os valores foram de 0,03 μg/mL para voriconazol e 0,5 μg/mL para fluconazol, indicando que esta cepa ATCC 28957 é sensível a ambos os fármacos. Os valores de k, EC50 e kmax foram determinados para vários múltiplos das CIM de cada fármaco (0,03×, 0,06×, 0,25×, 0,5×, 1× 4×, 16×, 32× e 64×). O valor médio de k foi de 0,38 h-1, EC50 foi de 1,26 ± 0,18 μg/mL e 0,32 ± 0,06 μg/mL e kmax foi de 0,95 ± 0,21 h-1 e 0,64 ± 0,12 h-1 para FLC e VRC, respectivamente. Por fim, de posse dos parâmetros calculados através do modelo PK-PD foram realizadas simulações dos desfechos de tratamento para meningite criptocócica no cenário clínico para ambos os fármacos após administração das doses 200 e 400 mg de voriconazol e 800 e 2000 mg de fluconazol por dez semanas. Através das simulações conclui-se que para fluconazol há 25% de insucesso na dose de 800 mg e 10% na dose de 2000 mg com um tempo médio de 3 semanas para erradicação da levedura. Para o voriconazol, o EC50 teve pouco impacto sobre a erradicação do fungo e, em todos os cenários foi observada uma erradicação completa do fungo em curto espaço de tempo (1 - 2 semanas). Os resultados incentivam o uso de voriconazol nos pacientes com meningite criptocócica e uma reavaliação do uso de fluconazol. / The aim of this thesis was to develop a pharmacokinetic-pharmacodynamic (PK-PD) model for the evaluation of systemic antifungal dosing regimens for the treatment of brain infections associated with Cryptococcus neorformans. Firstly a model of brain infection in immunocompetent male Wistar rats was established. The animals were inoculated by intravenously administration of 1. 106 CFU/mL of Cryptococcus neoformans var neoformans (ATCC 28957) into the tail lateral vein. The presence of yeasts in the brain, lung, the liver, kidneys and the heart was evaluated after 7, 10 and 14 days. The biochemical parameters (leucocytes counting, GOT, GPT, urea, creatinine, albumin and CK) and cerebral vascular permeability with Evans blue were investigated. After 10 days post inoculation an infection with characteristics similar in humans was produced. C. neoformans was present in all tissues investigated by histological and microbiological analyzes and differences in albumin, urea, GPT and CK levels, alterations in the number of leukocytes (monocytes and neutrophils), and elevation of cerebral permeability to Evans blue were observed in infected animals. After establishing and characterizing the infection, the plasma and cerebral tissue pharmacokinetics were evaluated by microdialysis after administration of fluconazole (FLU) (20 mg/kg, iv bolus) and voriconazole (VRC) (5 mg/kg, iv bolus) in healthy (n = 13) and infected Wistar rats (n = 13). A population pharmacokinetic model (PopPK) was build for each drug, based on data from plasma and tissue concentrations vs. time of healthy and infected groups. The brain penetration of voriconazole was shown to be high in infected animals (fThealthy = 0.85 vs fTinfected = 1.86) than in healthy ones. The two-compartment model with Michaelis Menten elimination best described the concentration of VRC in plasma and tissue. The covariate infection was included in V2 and VM. The great potential of voriconazole to treat meningitis associated with C. neoformans was observed, as the levels reached in infected tissues were higher than the values described for MIC against C. neoformans (0.03 - 0.5 μg/mL). The pharmacokinetics of FLC was described using a two-compartment model with linear elimination including data from plasma and brain free concentrations for both groups investigated. In this model the covariate infection was attributed to parameter k21 and covariate weight was assigned to parameters V1 and V2. With this popPK model, the pharmacodynamic outcomes were investigated considering the level of brain exposure at doses of 125 and 250 mg/kg for rats and 400 - 2000 mg for humans observed in healthy and infected tissue through the probability of attaining the target (PTA - fAUC/MIC = 389) of fluconazole using Monte Carlo simulations. These simulations demonstrated limited use of fluconazole in monotherapy for the treatment of C. neoformans meningitis. After the pharmacokinetics modeling, the pharmacodynamic studies were carried out using the methodology of time-kill curves of fluconazole and voriconazole versus C. neoformans. The kill curves data were suitably modeled with the modified Emax PK-PD model including a growth delay term. MIC was determined for both drugs by microdilution and values were 0.03 μg.mL-1 for voriconazole and 0.5 μg.mL-1 for fluconazole, indicating that this ATCC 28957 strain is sensitive to both drugs. The values of k, EC50 and kmax were determined for several MIC multiples of each drug (0.03 ×, 0.06 ×, 0.25 ×, 0,5×, 1 × 4 ×, 16 ×, 32 × and 64 ×). The mean value of k was 0.38 h-1, EC50 was 1.26 ± 0.18 μg.mL-1 and 0.32 ± 0.06 μg.mL-1 and kmax was 0.95 ± 0.21 h -1 and 0.64 ± 0.12 h-1 for FLC and VRC, respectively. Finally, the parameters obtained using the PK-PD model were used to simulate treatment outcomes for cryptococcal meningitis in the clinical setting for both drugs after administration of 200 and 400 mg of voriconazole and 800 and 2000 mg of fluconazole for 10 weeks. By the simulations it is concluded that for fluconazole there is a 25% rate of failure at the dose of 800 mg and 10% at the dose of 2000 mg with an average time of 3 weeks for eradication of the yeast. For voriconazole, the EC50 had little impact on fungus eradication and, in all scenarios complete eradication of the fungus was observed in a short time (1 - 2 weeks). The results encourage the use of voriconazole in patients with cryptococcal meningitis and a reassessment of fluconazole use.

FundaÃÃo Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Cientifico e TecnolÃgico

A criptococose clinica foi observada por volta do primeiro dia da inoculação e a sobrevida dos animais 15 dias após-inoculação (PI). Isolamos C. neoformans no cérebro a partir do 5º dia (PI) e no pulmão a partir 11º dia (PI). No 1º dia (PI) observamos por meio do tecido cerebral que já havia um quadro inicial de infecção, presença de edema, que evoluiu durante todo o período. C. neoformans foi visualizado primeiramente nos vasos capilares, o que nos leva a sugerir que seja esta rota importante para a entrada da levedura no órgão. A meningite aguda aconteceu por volta do 7º dia quando visualizamos o microrganismo na meninge e com um discreto infiltrado inflamatório. A partir do 13º dia a doença evoluiu para crônica permanecendo até o óbito dos animais. A monoterapia com anfotericina B (AMB) reduziu a sobrevida dos animais, enquanto que, o tratamento isolado com fluconazol (FLC) prolongou a mesma. A associação AMB-FLC foi eficaz, quando iniciamos o tratamento 24 horas (PI), enquanto que, o mesmo tratamento iniciado a partir do 7º dia quando já tínhamos um quadro compatível de meningite aguda não foi satisfatório. É importante ressaltar que os resultados descritos foram referentes à inoculação com isolado sensível in vitro ao fluconazol, enquanto que, o tratamento não resultou em êxito quando empregamos isolado resistente in vitro ao fluconazol. / Clinical cryptococcosis was observed on day 1 postinoculation (PI), and the animals survived until day 15 PI. C. neoformans was isolated from brain tissue starting on day 5 PI, and from lung tissue starting on day 11 PI. On day 1 PI, signs of infection were already observed in brain tissue, with presence of edema, which evolved throughout the period. C. neoformans was first seen in the capillaries, suggesting that this is an important route for the entrance of the yeast into this organ. Acute meningitis occurred around day 7 PI, when the microorganism was observed in the meninges, along with a discrete inflammatory infiltrate. From day 13 PI onward the disease became chronic, persisting until the death of the animals. Treatment with amphotericin B (AMB) alone shortened the animals\' survival, while treatment with fluconazole (FLC) alone lengthened it. Treatment with the two drugs in association was effective when treatment was begun at 24 hours PI, however, when treatment was begun at day 7 PI, already with signs of acute meningitis, the effectiveness was unsatisfactory. It is important to emphasize that these results relate to inoculation with an isolate susceptible in vitro to fluconazole, while the treatment was not effective for an isolate resistant in vitro to fluconazole.

Introdução: A meningite criptocócica causa elevada mortalidade, sobretudo em pacientes acometidos de alguma condição imunossupressora. O objetivo deste estudo foi identificar fenômenos de baixa suscetibilidade a antifúngicos e outros preditores clínicos que possam explicar falha terapêutica e recidiva da neurocriptococose Metodologia: Foram avaliados 96 casos com coleta de dados clínicos epidemiológicos e laboratoriais. Os isolados foram identificados quanto a genótipo molecular, suscetibilidade de anfotericina B (AMB) e fluconazol (FCZ) pela determinação da concentração inibitória mínima (Minimal Inhibitory Concentration, MIC), nível de heteroresistência ao FCZ (NHF) e determinação do tempo de morte frente AMB (Time-Kill, TK). Foram selecionados isolados heterorresistentes para análise quantitativa de DNA por PCR em tempo Real, expressão de bombas de efluxo por citometria de fluxo e isolados tolerantes a AMB para estudo de resistência ao estresse oxidativo. Foi realizada análise univariável e múltipla usando regressão logística para identificar preditores de óbito hospitalar e de um desfecho composto definido pelo óbito, encaminhamento para unidade de terapia intensiva ou recidiva 6 meses após alta hospitalar. Resultados: A maioria dos pacientes eram imunodeprimidos, com CD4 de 2 a 722 cel./mm3 e 96,7% eram portadores do HIV. Foram identificados 93 isolados de C. neoformans, sendo 76 do genótipo VNI e 17 VNII e 3 C. gattii, todos VGII. MIC de AMB variou de 0,012 a 0,94 mg/L e MIC de FCZ estiverem entre 0,12 e 64 mg/L. Resistência a FCZ (MIC>16mg/L) foi maior em VNI do que em VNII (p=0,03). Dentre os isolados VNI, 64,5% sofreu atividade fungicida até as 24h (TK24) de exposição à AMB e 6 cepas VNI não sofreram ação fungicida (TK>72). A maioria dos isolados VNII (64,7%) apresentou TK24. Os 3 isolados VGII sofreram atividade fungicida a partir de TK24. A maioria dos isolados VNI, VNII e todos os isolados VGII apresentaram alto NHF (>32mg/L). Diferença no NHF de acordo com os genótipos foi observada (p=0,005). No modelo múltiplo, as variáveis associadas significativamente ao óbito foram: idade em anos (OR=1,08;IC95%=1,02-1,15), contagem de leveduras no líquido cefalorraquidiano em logaritmo (LCR) (OR=1,66;IC95%=1,21-2,28) e uma variável composta por hipertensão arterial sistêmica ou diagnóstico de edema cerebral ou dilatação ventricular por tomografia (OR=35,68;IC95%=4,97-256,31). Para o desfecho composto, as variáveis associadas foram: contagem de leveduras do 1D em logaritmo (OR=1,50; IC95%=;1,20-1,86; p=<0,001), cultura de sangue positiva para Cryptococcus spp. (OR=3,30; IC95%=0,86-12,59; p=0,08) e descrição de neurotoxoplasmose (OR=18,62; IC95%=1,85-187,5; p=0,01). As associações foram consistentes em modelos de sobrevida. Conclusão: Foi possível descrever genótipos mais frequentes e identificar fatores genéticos, como aumento da expressão de genes e bombas de efluxo, relacionados à resistência aos fármacos. Nenhum dos testes de suscetibilidade esteve associado com os desfechos. Variáveis obtidas nos primeiros dias de internação mostraram utilidade para predizer o prognóstico em pacientes com meningite criptocóccica. Estes preditores podem ajudar a identificar os casos com maior potencial de óbito e que necessitam da otimização dos recursos terapêuticos. / Background: Cryptococcal meningitis causes high mortality in immunocompromised patients. The objective of this study was to identify the phenomena of low susceptibility to antifungal and other clinical predictors that may explain therapeutic failure and relapse of neurocryptococcosis Methodology: It was analyzed 96 cases with clinical and epidemiological data. The respective isolates were identified for genotype, susceptibility profile by Minimal Inhibitory Concentration (MIC), FCZ heteroresistance level (NHF), and time to death determination against 1 mg / L BMA (Time-Kill, TK). We isolated heteroresistant DNA expression analysis by real-time PCR, expression of efflux pumps by flow cytometry and, some isolates tolerant to AMB were selected to study resistance to oxidative stress. Univariable and multiple analyses using logistic regression were performed to identify predictors of in-hospital mortality and a composed outcome defined by death, referral to the intensive care unit and relapse 6 months after hospital discharge. Results: Most of the patients were immunocompromised, with CD4 range from 2 to 722 cells/mm3 and 96.7% patients HIV-positive. It was analyzed 93 strains of Cryptococcus neoformans of which 76 were genotype VNI and 17 were VNII and 3 were C. gattii, all were VGII. AMB MIC ranged from 0.012 to 0.94 mg/L and FCZ MIC were between 0.12 and 64 mg/L. Resistance to FCZ (MIC>16mg/L) was higher to VNI than VNII (p=0.03). Among the VNI strains, 64.5% had fungicidal activity up to 24h (TK24) of exposure to AMB and 6 VNI did not present this activity until 72h (TK> 72). Most VNII strains (64.7%) had TK24. The 3 VGII strains presented fungicidal activity from TK24. According to the MIC, all strains were susceptible to AMB. The majority of VNI strains (93.4%) and VNII (76.5%) and 3 VGII strains showed high NHF (>32mg/L) and it was observed statistical difference according to the genotypes VNI and VNII (p=0.005). At the multiple analysis, the variables significantly associated with the death were the age in years (OR=1.08,95%CI=1.02-1.15), the cerebrospinal fluid (CSF) yeasts count-log (OR=1.66,95%CI=1.21-2.28), and a variable composed of systemic arterial hypertension or diagnosis of cerebral edema or ventricular dilatation by tomography (OR=35.68,95%CI=4.97-256.31). At the composed outcome, the variables associated were: CSF yeasts count-log (OR=1,50; IC95%=;1,20-1,86; p=<0,001), positive blood culture for Cryptococcus spp. (OR=3,30; IC95%=0,86-12,59; p=0,08) and neurotoxoplasmosis (OR=18,62; IC95%=1,85-187,5; p=0,01). The associations were consistent at survival models. Conclusion: It was possible to describe more frequent genotypes and to identify genetic factors, such as increased gene expression and efflux pumps, related to drug resistance. The antifungal susceptibilities were not associated with the outcomes. were not associated with outcomes. Variables available in the first days of hospitalization showed utility to predict the prognosis in patients with cryptococcal meningitis. These predictors can help to identify the cases with higher potential of death and that require the optimization of the therapeutic resources.

O complexo C. neoformans (no qual as espécies C. neoformans e C. gattii estão inseridas) é constituído por leveduras encapsuladas que causam infecção em humanos e animais, com distribuição mundial. Diante do reconhecimento da importância dessas leveduras, seja no meio ambiente ou na área médica, há um crescente interesse no desenvolvimento de pesquisas que possam levar a uma melhor compreensão de sua epidemiologia e estrutura. Cepas clínicas e ambientais pertencentes ao acervo de amostras do Departamento de Microbiologia do HCFMUSP e ao Laboratório de Leveduras Patogênicas do ICB-USP foram reidentificadas, estudadas quanto aos fatores relacionados à virulência (por pesquisa de exoenzimas), quanto ao perfil de suscetibilidade in vitro frente aos antifúngicos: anfotericina B, fluconazol e voriconazol pela utilização da técnica E-test®, e quanto aos aspectos epidemiológicos (estudo de prontuários dos pacientes). As cepas de origem clínica (60) e ambiental (42) foram reidentificadas e condiziam com o estabelecido pela literatura. Nota-se que quanto às cepas clínicas, 90% delas pertenciam à espécie C. neoformans e 10% à espécie C. gattii e das cepas ambientais, 95,2% eram C. neoformans e 4,8% eram C. gattii. Com relação à produção de exoenzimas, cepas de origem clínica (45%) apresentaram índice 2 (positiva) e cepas de origem ambiental (45,2%) apresentaram índice 3 (fortemente positiva) quanto à proteinase; quanto à fosfolipase, 71,7% das cepas de origem clínica apresentaram índice 2 e, 52,4% das cepas ambientais apresentaram índice 3. Todas as cepas foram sensíveis aos antifúngicos testados (com exceção de uma que era sensível de forma dose dependente ao fluconazol). Em estudo epidemiológico, a maioria dos pacientes acometidos de criptococose foi do sexo masculino (70%), com média de acometimento aos 47 anos; 25 pacientes (41,7%) foram ao óbito; a criptococose mais frequente (50%) foi a neurocriptococose; 50% dos pacientes tinham sorologia positiva para o HIV e 26,7% dos pacientes utilizaram anfotericina B associada ao fluconazol como tratamento. Ao final do trabalho chegamos a importantes conclusões: o meio CGB não se apresentou como método capaz de identificar eficazmente cepas C. gattii, sendo útil apenas como uma primeira triagem, devendo ser acoplado à técnica de PCR-RFLP; ensaios de produção da atividade fosfolipásica são extremamente relevantes, podendo-se afirmar que a fosfolipase pode ser a mais importante enzima na patogênese da criptococose (servindo como indicador das espécies do gênero Cryptococcus spp.); homens são mais acometidos de criptococose do que mulheres, sendo estas acometidas mais cedo. A leucemia de células linfoides granulares grandes (LGL), com expressão anômala de CD16+CD56+CD19+, encontrada em 1 paciente HIV negativo, infectado por C. gattii pode sugerir que a substituição de células imunocompetentes por células aberrantes com ineficiência funcional poderia ser a responsável pela imunossupressão do paciente. Esse fato sugere a importância de uma investigação detalhada em pacientes com meningite causada por Cryptococcus spp. com um sistema imune aparentemente competente / C. neoformans complex (the species C. neoformans and C. gattii are inserted) consists of encapsulated yeasts that cause infection in humans and animals, with worldwide distribution. With the recognition of the importance of these yeasts, either in the environment or in the medical field, there is a growing interest in developing research that may lead to a better understanding of its epidemiology and structure. Clinical and environmental strains of the collection of samples from the Department of Microbiology, HC-USP and the Laboratory of Pathogenic Yeasts of ICB- USP were reidentified, studied concerning the factors related to virulence (by exoenzymes research), as the susceptibility profile in vitro front of antifungal: amphotericin B, fluconazole and voriconazole by use of the E-test® technique, and as to the epidemiological (study of medical handbooks of patients). The strains of clinical (60) and environmental origin (42) were reidentified and established in the literature. We notice that as the clinical strains, 90% of them belonged to the species C. neoformans and (10%) to the species C. gattii and of theenvironmental strains, 95,2% were C. neoformans and 4,8 % were C. gattii. With respect to exoenzyme production, strains of clinical origin (4 %) had an index 2 and strains of environmental origin (45,2%) had an index 3, as the phospholipase, 71,7 % of the strains of clinical origin showed index 2 (positive) and 52,4 % of the environmental strains exhibited index 3 (strongly positive). All strains were susceptible to antifungal agents tested (except one that was sensitive dose dependente to fluconazole). In an epidemiological study, the majority of patients with cryptococcosis were male (70%), with age of 47 years, 25 patients (41,7%) died; the cryptococcosis more frequent (50%) was the neurocryptococcosis, 50 % of patients were seropositive for HIV and 26,7 % of patients received amphotericin B associated to fluconazole treatment. At the end of the study we got some important conclusions: the middle CGB is not presented as a method that effectively identify C. gattii strains , being useful only as a first triage, and should be coupled with PCR-RFLP; tests that measuring phospholipase activity are extremely relevant, we can affirm that the phospholipase may be the most important enzyme in the pathogenesis of cryptococcosis (serving as an indicator species of the genus Cryptococcus spp.), men are more affected of cryptococcosis than women, which are affected earlier as men with the age. The NK-cell leukemia found in 1 patient, HIV negative, infected by C. gattii and with a special expression of both their NK cells (CD19+CD16+CD56+ aberrant cells) gave origin to a lymphoid population anomalous CD56+CD19+, and this lymphoid tumor cells lineage may suggest that the substitution of immunocompetent cells by aberrant cells with a functional inefficiency could be responsible for the immunosuppression of the patient, and this suggests the importance of a detailed investigation in patients with meningitis caused by Cryptococcus spp., with an apparently competent immune system