O objetivo deste estudo foi caracterizar as respostas das células mesenquimais indiferenciadas derivadas do ligamento periodontal (PDLSCs) ao extrato proteico total de Porphyromonas gingivalis (PgPE) e avaliar seu impacto nas propriedades biológicas das células leucêmicas promielocíticas humanas HL-60. PDLSCs enriquecidas com CD105 foram semeadas em placas de 6 poços durante 24h. Em seguida, as células foram desafiadas com PgPE (0 e 2 mg/ml) durante 3h (período de exposição). Os sobrenadantes foram então descartados; PDLSCs foram lavadas com PBS e cultivadas por 18h adicionais. Por fim, os sobrenadantes foram coletados. Os níveis de citocinas e quimiocinas nos sobrenadantes foram avaliados por ensaios multiplex. Na sequência, o efeito dos sobrenadantes derivados de PDLSCs (tratadas ou não com PgPE) sobre a ativação, o recrutamento e a resposta inflamatória de HL-60 foi avaliado. PDLSCs responderam ao tratamento com PgPE. RANTES, eotaxina e IP-10 (proteína produzida por IFN-?) foram detectados apenas em sobrenadantes de PDLSCs/PgPE. Além disso, PgPE induziu maior secreção de proteína quimiotática de neutrófilos (MCP)-1, intérferon (IFN)-?, interleucina (IL)-6, IL-8 e IL-1ra (p> 0,05). O recrutamento de HL-60D aumentou 4,7 vezes quando estas células foram expostas a sobrenadantes PDLSCs/PgPE, enquanto que os sobrenadantes de PDLSCs não afetaram a quimiotaxia de HL-60D. Sobrenadantes PDLSCs promoveram uma redução de 16% na produção de espécies de oxigênio reativo (ROS) por HL-60D estimuladas por PMA (p=0,013). Em contraste, sobrenadantes PDLSCs/PgPE promoveram um aumento de 1,78±1,04 vezes (p=0,046) na produção de ROS. Finalmente, tanto sobrenadantes PDLSCs, como sobrenadantes PDLSCs/PgPE, não influenciaram a produção de fator de necrose tumoral (TNF)-? e IL-1? pelas HL-60D em resposta ao lipopolissacarídeo (LPS). Esses achados sugerem um importante papel das PDLSCs no reconhecimento de P. gingivalis, recrutamento de células imunes inatas e ativação de mecanismos antimicrobianos. / The aim of this study was to characterize periodontal ligament-derived mesenchymal stem cells (PDLSCs) responses to Porphyromonas gingivalis total protein extract (PgPE) and its impact on human leucocyte promyelocyte cells HL-60 biological properties. CD105-enriched PDLSCs were seeded in 6-well plates for 24h. Next, cells were challenged with PgPE (0 and 2mg/ml) for 3h (exposure period). Supernatants were then discarded, cells were washed with PBS, and cultured further for 18h before supernatants were collected. Supernatants\' cytokine and chemokine levels were assessed by bead-based multiplex assays. The effect of supernatants collected from untreated and PgPE-treated PDLSCs on HL-60D activation, recruitment and inflammatory responses was determined. PDLSCs were responsive to PgPE treatment. RANTES, eotaxin, and interferon-inducible protein (IP)-10 were detected only in supernatants collected from PgPE treated cells. Moreover, PgPE induced higher monocyte chemoattractant protein (MCP)-1, interferon (IFN)-?, interleukin (IL)-6, IL-8 and IL-1ra secretion (p > 0.05). HL-60D recruitment was increased by 4.7 fold when exposed to PDLSCs/PgPE supernatants, whereas PDLSCs supernatants did not affect HL-60D chemotaxis. PDLSCs supernatants promoted a 16% reduction in radical oxygen species (ROS) production by PMA-stimulated HL-60D (p=0.013). On the contrary, PDLSCs/PgPE supernatants promoted a 1.78 ± 1.04 fold increase (p=0.046) in ROS production. Finally, both PDLSCs and PDLSCs/PgPE supernatants had no effect on HL-60D tumor necrosis factor (TNF)-? and IL-1? responses to lipopolysaccharide (LPS). These findings strongly suggest an important role of PDLSCs in the recognition of P gingivalis, recruitment of innate immune cells and activation of antimicrobial mechanisms.

A malária causa complicações envolvendo diversos órgãos, inclusive o fígado, onde se sabe que ocorrem inflamação e dano hepáticos, os quais contribuem para a severidade da doença. A interleucina (IL)-1 α é uma citocina pró-inflamatória que pertence à família da IL-1 e que pode ser produzida e liberada tanto por células não-hematopoiéticas, como hematopoiéticas em contextos como dano tecidual, infecção e doenças autoimunes em diversos órgãos. O presente estudo tem como objetivo avaliar a produção e o papel da IL-1 na imunopatogênese e na proteção durante a malária experimental. A produção da IL-1 foi investigada durante a inflamação e necrose no fígado em camundongos C57BL/6 infectados com o estágio eritrocítico do Plasmodium chabaudi. A fonte de IL-1 no fígado dos camundongos infectados foi determinada por imunofluorescência e citometria de fluxo. Camundongos IL1A-/- foram utilizados para avaliar o papel da IL-1 neste contexto. Durante a infecção aguda com o P. chabaudi, a inflamação hepática e o desenvolvimento das lesões necróticas são acompanhados pelo aumento nos níveis de IL-1 no fígado, que ocorre de forma independente do inflamassoma NLRP3 (Nod-like receptor protein 3). Os neutrófilos foram identificados como sendo a fonte de IL-1 α no fígado dos camundongos C57BL/6 infectados. De forma sistêmica, a deficiência em IL-1 α resultou numa diminuição da perda de peso e da hipotermia causados pela malária, mas teve um efeito menos significativo no controle da parasitemia. No fígado, a ausência de IL-1 reduziu o número de células TUNEL+, atenuando a necrose induzida pela infecção. A melhora no dano hepático nos camundongos IL1A-/- infectados está associada com uma menor resposta inflamatória em comparação aos camundongos C57BL/6 infectados, incluindo uma menor produção do TNF- α (Tumor necrosis factor alpha), citocina associada à apoptose de hepatócitos e, consequentemente, à necrose do tecido hepático durante a malária causada pelo P. chabaudi. Apesar de exercer um importante papel na imunopatogênese do dano e inflamação do fígado durante a fase eritrocítica da infecção pelo P. chabaudi, a ausência da IL-1 α não impediu a proteção conferida pela presença das formas eritrocíticas contra a reinfecção com esporozoítos. Em conclusão, neutrófilos produzem IL-1 α no fígado durante a fase aguda da malária causada pelo P. chabaudi. Esta citocina amplifica a resposta inflamatória à infecção e promove a necrose hepática, assim como exacerba a perda de peso e a hipotermia. / Malaria causes complications involving several organs, including the liver, where there are inflammation and damage that contribute to the disease severity. Interleukin (IL)-1 is a pro-inflammatory cytokine from the IL-1 family that can be released by non-hematopoietic or hematopoietic cells during tissue damage, infection and autoimmune diseases in different organs. The present study aims to evaluate the production and the role of IL-1 in the immunopathogenesis and in the protection during experimental malaria. IL-1 production was assessed during hepatic inflammation and necrosis in C57BL/6 mice infected with blood stages of Plasmodium chabaudi. The source of IL-1 in the liver of infected mice was determined by immunofluorescence and flow cytometry analyses. IL1A-/- mice were used to assess the role of IL-1 in this context. During acute P. chabaudi infection, hepatic inflammation and development of necrotic lesions were accompanied by an increase in IL-1 levels in the liver, which occurred independently of the Nod-like receptor protein 3 (NLRP3) inflammasome. Neutrophils were identified as the source of IL-1 α in the liver of infected C57BL/6 mice. Systemically, IL-1 deficiency resulted in reduction of weight loss and hypothermia caused by P. chabaudi malaria, but had minor effect on parasitemia control. In the liver, the absence of IL-1 reduced the number of TUNEL+ cells and attenuated the necrotic process induced by infection. The amelioration of liver damage in infected IL1A-/- mice was associated with lower inflammatory response compared to infected C57BL/6 mice, in particular with a decrease in tumor necrosis factor alpha (TNF- α) production, which has been directly implicated in the apoptosis of hepatocytes and, in consequence, the necrosis of the liver tissue during P. chabaudi malaria. Despite the important role in liver damage and inflammation immunopathogenesis during the blood-stage P. chabaudi infection, the absence of IL-1 α did not impair the protection conferred by blood stages against sporozoite reinfection. This study shows that neutrophils produce IL-1 α in the liver during acute P. chabaudi malaria. This cytokine amplifies the inflammatory response to infection and promotes liver necrosis, as well as exacerbates the weight loss and hypothermia.

Uma das principais causas de prejuízos econômicos da pecuária mundial, é a mortalidade de bezerros nos primeiros meses de vida, devido ao desenvolvimento de afecções, pois a defesa contra estas, depende principalmente da imunidade destes animais. Nesta fase, os animais possuem seu sistema imune ainda não completamente funcional, além disso, o número de bezerros acometidos e a gravidade das doenças, pode variar de acordo com a raça dos bovinos. A literatura relata que os bezerros da raça japonesa Wagyu podem ser mais susceptíveis às afecções durante o período neonatal, quando comparados à bezerros da raça Holandesa. Porém, a maior susceptibilidade destes animais ainda não possui as razões totalmente elucidadas. Devido às consequências da menor competência imunológica dos bezerros japoneses, o desenvolvimento de estratégias para a melhoria da imunidade destes animais, vem sendo alvo de pesquisas e a utilização de antioxidantes, como a Vitamina E, é uma das tentativas para melhorar a imunidade desses neonatos. No presente trabalho, foram selecionados 26 bezerros da raça Wagyu, com média de 7,35 (±2,64) dias de vida, os quais foram distribuídos por dois grupos de 13 animais (Grupo Controle e Grupo Vitamina E). O Grupo Vitamina E recebeu uma aplicação de Vitamina E, por via intramuscular (30 UI/kg). O Grupo Controle recebeu uma aplicação intramuscular de solução de NaCl 0,9% no mesmo volume correspondente ao de Vitamina E, de acordo com o peso do animal. Os animais foram avaliados semanalmente, durante os primeiros 60 dias de vida, por meio de exame físico, hemograma, bioquímica sérica e avaliação da função de neutrófilos com uso da citometria de fluxo. Não houve diferença entre os grupos controle e Vitamina E em nenhum dos parâmetros avaliados. Os resultados de exames físicos, hemograma e bioquímica sérica dos bezerros Wagyu, apresentaram comportamento semelhante ao descrito na literatura, bem como, a maioria dos aspectos avaliados na função dos neutrófilos. A aplicação de Vitamina E na dosagem de 30UI/kg não gerou alteração na função dos neutrófilos, a partir da avaliação da produção de espécies reativas de Oxigênio (EROs) pelos granulócitos, estimulados ou não pela fagocitose de Staphylococcus aureus conjugado com Iodeto de propídeo (SaPI). Existe a necessidade do desenvolvimento de novas pesquisas, a respeito de dosagens de Vitamina E capazes de gerar alterações na função de neutrófilos dos bezerros Wagyu, afim de melhorar o perfil imunológico destes animais. / One of the main causes of economic losses of livestock worldwide, is the mortality of calves in the first months of life, on account of diseases, because the immunity of these animals is a very important for their defense. At this stage, the animals have their immune system not yet fully developed, in addition, the number of calves affected and the severity of the diseases, can vary according to the breed of the cattle. The literature reports that Japanese Wagyu calves may be more susceptible to conditions during the neonatal period, in comparison to Holstein calves. However, the higher susceptibility of these animals doesnt fully elucidated. Due to the consequences of the lower immunological competence of Japanese calves, the development of strategies to improve the immunity of these animals, has been the subject of research and the use of antioxidants, such as Vitamin E, is one of the attempts to improve immunity of calves. In the present study, 26 Wagyu calves were selected, with 7.35 (± 2.64) days of life an average, and were subdivided into two groups of 13 animals (Control Group and Vitamin E Group). The Vitamin E Group received a intramuscularly application of Vitamin E (30 IU / kg). The Control Group received an intramuscular application of 0.9% NaCl solution in the same volume corresponding to that of Vitamin E, according to the weight of the animal. The animals were evaluated weekly during the first 60 days of life, by physical examination, blood count, serum biochemistry and evaluation of neutrophil function using flow cytometry. There was no difference between the Control and Vitamin E groups in any of the evaluated parameters. The results of physical exams, hemogram and serum biochemistry of Wagyu calves, presented a behavior similar to that described in the literature, as well as, most aspects evaluated in neutrophyl function. The application of Vitamin E at 30IU/kg did not change the neutrophil function, based on the evaluation of Reative Oxygen Species (ROS) production by granulocytes, stimulated or not by Staphylococcus aureus conjugated with propidium iodide (SaPI) phagocytosis. There is a need for the development of new research on Vitamin E dosages capable of generating alterations in the neutrophil function of Wagyu calves, for improve the immunological profile of these animals.

A ação de espécies reativas de oxigênio e/ou de nitrogênio (ERO/ERN), produzidas por neutrófilos através do complexo NADPH oxidase (Nox2) e óxido nítrico sintase (iNOS), estão diretamente associadas à capacidade microbicida de fagócitos. Entretanto, se a produção destes oxidantes escapa ao controle da homeostase bioquímica, ocorrem danos oxidativos aos tecidos circunvizinhos do foco inflamatório, quando, então, há necessidade de intervenção farmacológica. Neste trabalho foi testado o efeito dos nitróxidos piperídinicos 2,2,6,6-tetrametil-1-piperidina-1-oxil (Tempo) e 4-((9 acridinecarbonil)amino)-2,2,6,6-tetrametil-1-piperidina-1-oxil (Ac-Tempo) sobre a atividade de Nox2 de neutrófilos inflamatórios e suas consequências sobre a capacidade fungicida dos fagócitos. Neutrófilos isolados de cavidade peritoneal de camundongos foram incubados (37°C, 10 min) com Tempo (50-400 μM) ou Ac-Tempo (25-200 μM) e estimulados com Candida albicans (ATCC 10231) opsonizadas (107 C. albicans/105 neutrófilos). A atividade de Nox2 foi determinada polarograficamente, pelo consumo de oxigênio mensurado através de eletrodo de Clark, ou espectrofotometricamente, medindo-se a redução de citocromo c (550nm). A atividade de Nox2 (119,311,6 nmol de O2-•.min-1) foi diminuída pelo tratamento com ambos os nitróxidos, de forma dose-dependente, embora Ac-Tempo tenha sido mais eficaz (ED50 31 M) que Tempo (ED50 160 M). Paralelamente, foi verificada a fluorescência (λexc361, λemi440) emitida pelo grupo acridina após reação de espécies radicalares com Ac-Tempo, corroborando a hipótese de que nitróxidos depletam radicais produzidos por neutrófilos estimulados com C. albicans. O nitróxido Tempo não mostrou nenhuma ação direta sobre culturas de C. albicans, conforme análises de antifugigramas padrões. Entretanto, testes de capacidade microbicida de neutrófilos mostraram que o tratamento prévio das células com Tempo (300 µM) causou decréscimo de 80% na efetividade fungicida sobre C. albicans. Testes in vivo mostraram que Tempo administrado em dose oral única (26,52 mg/kg) foi capaz de diminuir o edema de pata originado em resposta à inoculação do fungo (107 C. albicans) cujo ponto máximo de efeito foi 18 horas após a administração do nitróxido, bem como determinou significativa diminuição de nitração de proteínas em tecido muscular das patas dos animais, conforme resultados de ensaios com anticorpos anti-nitrotirosina. Em conjunto, os resultados corroboram a premissa de que a atividade de Nox2 é essencial para a resposta do hospedeiro a C. albicans e que a administração de nitróxidos para modular a produção de oxidantes nos focos infecciosos pode diminuir a resposta do sistema imune à infecção fúngica. / Production of oxidants species by neutrophils through NADPH oxidase complex (Nox2) is directly associated with the microbicidal activity of phagocytes. In this work we tested the effect of the nitroxides 2,2,6,6-tetramethylpiperidine-1-piperidine-1-oxil (Tempo) and 4-((9 acridinecarbonil)amino)-2,2,6,6-tetramethyl-1-piperidine-1-oxil (Ac-Tempo) on the activity of inflammatory neutrophil Nox2 complex and the consequences on the fungicidal phagocytes capability. Neutrophils were incubated with Tempo (50-400 mM) or Ac-Tempo (25-200 mM) and stimulated with Candida albicans. Nox2 activity was determined polarographically by oxygen consumption measured by Clark electrode. Oxidase activity decreased by treatment with both nitroxides in a dose-dependent manner. However, Ac-Tempo was more effective (ED5044M) that Tempo (ED50160M). In parallel, the fluorescence intensity elicited by acridine after reaction with free radicals was determined. Neutrophils stimulation elicited significant fluorescent response in direct correlation with Ac-Tempo doses (R2=0.997), supporting the hypothesis that nitroxide is consumed by free radicals neutrophils-released. Fungicidal neutrophils activity assay explicited that pretreatment of cells with Tempo caused 80% decrease in the effectiveness on C. albicans death. Oral administration of a Tempo single dose was able to reduce paw edema elicited in response to inoculation of the fungus. Also, a significant decrease in protein nitration in paw tissues was found in this condition. Together, the results support the premise that Nox2 activity is essential for the host response against C. albicans and that nitroxides cause a decrease on the oxidant immune response to fungal infection.

Durante algumas das reações que levam à formação de AGEs, espécies reativas de oxigênio são geradas e concorrem paralelamente com o estresse oxidativo e com os danos estruturais e funcionais às macromoléculas. A formação de AGEs in vivo pode envolver os neutrófilos, que após estímulo inflamatório, induzem importantes enzimas geradoras de ERO, como o sistema NADPH oxidase. Entretanto ainda permanecem questionamentos sobre a relação entre o Sistema NADPH oxidase de neutrófilos e os AGEs. O presente trabalho visa contribuir para o entendimento do papel do sistema NADPH oxidase e da geração de ERO na formação de AGEs e o impacto da formação destes produtos na função renal destes animais. Foi utilizado um modelo experimental de diabetes induzido pela injeção i.p. de aloxano em ratos Wistar que foram divididos em 5 grupos: controle, diabético, diabético tratado com aminoguanidina (AG), diabético tratado com apocinina (AP) e diabético tratado com apocinina e aminoguanidina (AP+AG). A AG é um conhecido inibidor da formação de AGEs, e a AP é inibidor do sistema NADPH oxidase. Os inibidores, ou água foram administrados aos animais por gavagem por 50 dias após a instalação do DM. A formação de ERO reflete a atividade de NADPH oxidase e foi mensurada em neutrófilos peritoneais por quimiluminescência e pelo ensaio de redução do citocromo C. A expressão das subunidades p47phox e a p67phox do sistema NADPH oxidase foi avaliada por imunofluorescência. Os AGEs circulantes foram avaliados por fluorescência e a função renal foi avaliada pela dosagem da uréia e creatinina séricas e análises histológica dos rins. Pelos parâmetros avaliados neste estudo, verificamos que o tratamento com AP, diminuiu a geração de ERO tanto no grupo controle, quanto diabético, mas não afetou a via de formação de AGEs. O que indica que, provavelmente, não há interrelação entre as vias do sistema da NADPH oxidase de neutrófilos e a formação de AGEs, no nosso modelo experimental. O tratamento com a AP atenuou a glomerulonefrite do grupo diabético. A AG, na dose e no tempo administrado, 100mg/Kg por 50 dias, melhorou o perfil glicêmico dos animais diabéticos, preveniu a formação de AGEs e o dano glomerular. Além disso, o tratamento com a AG aumentou a atividade do sistema NADPH oxidase e a expressão das subunidades citosólicas p47phox e a p67phox do sistema. Não podemos afirmar que o aumento da atividade e expressão do sistema NADPH oxidase seja devido à diminuição dos AGEs no nosso sistema ou um efeito isolado da aminoguanidina, ainda não descrito na literatura. A compreensão do papel desta enzima em modelo experimental de diabetes pode ajudar na compreensão do processo inflamatório persistente que ocorre devido ao acúmulo desses produtos nas complicações da doença, permitindo uma melhor adequação da abordagem clínica e tratamento desses pacientes. / Chronic hyperglycemia observed in diabetes disease leads to the advanced glycation end products (AGEs) formation, which are able to damage the patient organs, especially the kidney. Some AGEs formation reactions may also generate reactive oxygen species (ROS) and they are able to compete with oxidative stress and structural and functional macromolecules damages. Neutrophils are immune cells capable of expressing great amount of important ROS generator enzymes such as NADPH oxidase just after inflammatory stimuli. There are still questions about the relationship between the neutrophil NADPH oxidase system and AGEs despite the information that in vivo AGEs formation may involve neutrophils. The present study aims to contribute to the understanding of NADPH oxidase role and its ROS generation in AGEs formation and what is the impact of these products formation in renal function of rat model. Our experimental diabetes model was reached by alloxan i.p. injection in rats. These animals were divided in five groups: control, diabetic, diabetic treated with aminoguanidine (AG), diabetic treated with apocynin (AP) and diabetic treated with apocynin and aminoguanidine (AG + AP). AG is an AGEs formation inhibitor, and AP is a NADPH oxidase inhibitor. The inhibitors compounds or the vehicle (water) were administered by gavage for 50 days after DM confirmation. ROS formation reflects the NADPH oxidase activity and it was measured by chemiluminescence assay and by cytochrome C reduction in peritoneal neutrophils. The expression of NADPH oxidase p47phox and p67phox subunits was assessed by immunofluorescence. Circulating AGEs were analyzed by fluorescence and the renal function was evaluated by serum urea and creatinin concentration and by kidney histological sections. Our results showed that AP treatment decreased ROS generation in both control and diabetic groups, but did not affect the process of AGEs formation. This may indicate that in our experimental model there is no interrelation between the neutrophil NADPH oxidase system and the AGEs formation. It was also observed that the AP attenuated glomerulonephritis in diabetic mice. AG, at the administered dose and time, 100mg/Kg for 50 dias, improved glycemic control, prevented the AGEs formation and prevented glomerular damage. Furthermore, AG treatment increased the NADPH oxidase activity and its p47phox and p67phox cytosolic subunits expression. We are not able to confirm if the increased activity and expression of NADPH oxidase were caused by the AGEs decrease in our system or by an isolated effect of aminoguanidine not yet described. Understanding the NADPH oxidase role in experimental diabetes could improve the knowledge about the persistent inflammatory process that occurs due to these products accumulation during the disease complication, allowing a better clinical approach and treatment of these patients. / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES

Espécies reativas de oxigênio (ERO) produzidas por neutrófilos através do complexo Nox2 estão diretamente associadas às ações deletérias surgidas quando a inflamação escapa do controle da homeostase. A produção exacerbada destas espécies é controlada por ações de antioxidantes endógenos como a glutationa (GSH), um importante tripeptídeo redutor que repara biomoléculas oxidadas envolvidas na sinalização celular e atua como “scavenger” de bioradicais. Os nitróxidos são radicais livres, sintéticos e estáveis que apresentam propriedades antioxidantes e antiinflamatórias. Recentemente foi demonstrado que estes são capazes de modular o “burst” respiratório de macrófagos, reduzindo a produção de ânions superóxido (O2•-) gerados pelo complexo Nox2, em um mecanismo no qual atuariam como “scavengers” de radicais tiila (RS•.), alterando modificações proteicas pós-traducionais. O presente trabalho teve como objetivo avaliar a capacidade dos nitróxidos 4-9((- acridinecarbonil)-amino)-2,2,6,6-tetrametilpiperidina-1-oxil (Ac-Tempo) e 2,2,6,6- tetrametilpiperidina-1-oxil (Tempo) de interagir e indisponibilizar RS•, especialmente glutationila (GS•), modulando a produção de ERO/ERN por neutrófilos inflamatórios isolados da cavidade peritoneal. O “burst” respiratório de neutrófilos estimulados com forbol 12-miristato 13- acetato (PMA) foi monitorado através de técnicas espectrofotométricas e a capacidade de interação entre RS• e nitróxidos foi analisada através de ensaios de Ressonância Paraeletromagnética (EPR) e Espectrometria de Fluorescência. Para confirmar a produção de RS• durante a ativação do complexo Nox2, utilizou-se o agente captador de spin, 5,5- dimetilpirrolina-N-oxido (DMPO) e o sinal de EPR característico do aduto DMPO/GS• foi monitorado. Verificou-se um aumento da resposta de fluorescência, acompanhado pela redução do sinal de EPR do nitróxido em células estimuladas com PMA. Com a finalidade de verificar alterações proteicas pós-traducionais de S-glutationilação os grupos experimentais foram submetidos à técnica de “dot blotting” e o tratamento celular com o nitróxido Tempo 100 μM determinou uma diminuição do processo de S-glutationilação proteica associado à atividade do complexo Nox2. Os resultados apontam os nitróxidos como protótipos de antioxidantes e antiinflamatórios. / Reactive oxygen species (ROS), produced in neutrophils, through the Nox2 complex are directly associated with the deleterious actions that arise when inflammation escapes from the control of organic homeostasis. An exacerbated production of these species is controlled by endogenous antioxidants such as glutathione (GSH), an important tripeptide able to repair oxidized biomolecules involved in cell signaling and to act as a scavenger of bioradicals. The nitroxides are synthetic and stable free radicals which have been frequently reported because of their anti-inflammatory and antioxidant properties. Recently, it was shown that these compounds can modulate neutrophil respiratory burst, reducing the production of superoxide anion generated by the Nox2 complex in a mechanism were they act as scavenger of thiyl radicals (RS•), altering post-translational modification of proteins. The aim of this work was to evaluate the ability of nitroxides 2,2,6,6-tetramethylpiperidine 1-oxyl (TEMPO) and 4-(9- acridinecarbonylamino)-2,2,6,6-tetramethylpiperidine-1-oxyl (Ac-Tempo) to interact with thiyl radicals, especially glutathionyl (GS•), minimizing the production of reactive oxygen and nitrogen species by inflammatory neutrophils isolated from the peritoneal cavity of mice. The respiratory burst in neutrophils stimulated by phorbol 12-myristate 13- acetate (PMA) was monitored spectrophotometrically and the interaction between thiyl radicals and nitroxides was analyzed by Electron Paramagnetic Resonance (EPR) and Fluorescence Spectroscopy. To confirm the production of RS• during the activation of the Nox2 complex, the spin trap for GS•, 5,5-dimethylpyrroline-N-oxide (DMPO) was used and the characteristic DMPO/GS• adduct EPR signal was monitored. An increase in the fluorescence response was observed, accompanied by a reduction of EPR signal of nitroxide in cells stimulated with PMA. Posttranslational events such as S-glutathionylation were analyzed through dot blotting and the experimental groups treated with Tempo (100 μM) showed a decrease in the process of Sglutathionylation associated with the activity of the Nox2 complex. These results suggest that thiyl radicals play a role in the maintenance of the neutrophil respiratory burst and may provide a therapeutic target for inflammation management. / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES

Os neutrófilos são as primeiras células recrutadas em um processo inflamatório, desempenhando um papel importante na defesa do hospedeiro pela ativação do sistema NADPH oxidase e através da ação da enzima mieloperoxidase (MPO). As espécies oxidantes (EO) produzidas durante a ativação dos neutrófilos são altamente reativas e tóxicas para o patógeno, mas podem comprometer a homeostase celular do hospedeiro. A espécie Passiflora edulis Sims (Passifloraceae) é rica em compostos fenólicos, conhecidos por suas atividades antioxidantes. A maior parte dos estudos farmacológicos dessa espécie vegetal é direcionada a suas ações sobre o sistema nervoso central e poucos estudos têm sido realizados na tentativa de avaliar o efeito anti-inflamatório desse gênero. Dessa forma, no presente trabalho, foi avaliada a atividade anti-inflamatória do extrato seco obtido das folhas de P. edulis Sims, assim como sua atividade sobre o metabolismo oxidativo de neutrófilos peritoneais de ratos em um modelo de inflamação aguda induzida pela administração intraperitoneal de carragenina. A análise por espectro de massas sugeriu a presença de isoorientina e isovitexina, principais constituintes relatados na espécie P. edulis. A administração do extrato diminuiu o número de neutrófilos recrutados para o foco inflamatório, entretanto, não alterou a atividade do sistema NADPH oxidase dessas células. Por outro lado, o extrato interferiu na formação de EO geradas a partir da ativação desse complexo, como, por exemplo, o ácido hipocloroso, sugerindo uma diminuição na atividade de MPO. Além disso, o extrato diminuiu a atividade de catalase, aumentou a atividade de glutationa peroxidase e não interferiu na atividade de superóxido dismutase. Dessa forma, nossos resultados sugerem que o potencial anti-inflamatório do extrato seco das folhas de P. edulis Sims poderia estar relacionado não somente à inibição do recrutamento de neutrófilos como também à modulação do metabolismo oxidativo de neutrófilos no foco inflamatório. / Neutrophils are the first cells recruited in an inflammatory process and play an important role in host defense by the NADPH oxidase activation and by the action of the enzyme myeloperoxidase (MPO). The oxidizing species (OS) produced during activation of neutrophils are highly reactive and toxic to the pathogen, but they can compromise the cellular homeostasis of the host. The species Passiflora edulis Sims (Passifloraceae) is rich in phenolic compounds, which are known for their antioxidant activity. Most of the pharmacological studies on this species have been carried out on the Central Nervous System and few studies have been conducted to evaluate the anti-inflammatory effect of this genus. Thus, in this study, we evaluated the anti-inflammatory activity of dry extract obtained from P. edulis Sims leaves, and its activity on oxidative metabolism of rat peritoneal neutrophils in a model of acute inflammation induced by the intraperitoneal administration of carrageenan. The mass spectral analysis suggested the presence of isoorientin and isovitexin, major constituents reported by P. edulis. The extract administration reduced the number of neutrophils recruited to the inflammatory site; however, it did not alter the activity of the NADPH oxidase of these cells. On the other hand, the extract interferes with OS formation generated by the activation of this system, for instance, hypochlorous acid, which suggests a decrease in MPO activity. Furthermore, the extract decreased the catalase activity and enhanced the glutathione peroxidase activity, but it did not affect the superoxide dismutase activity. Thus, our results suggest that the anti-inflammatory potential of the dry extract from P. edulis Sims leaves could be related to the inhibition of neutrophils recruitment and to the modulation of the neutrophils oxidative metabolism at the inflammatory focus. / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES

Mycobacterium tuberculosis (Mtb), o principal causador da tuberculose (TB), continua a representar um grave problema de saúde pública, principalmente em países de baixa e média renda. Estima-se que um terço da população mundial esteja infectada pelo Mtb, com aproximadamente oito milhões de casos novos e quase três milhões de mortes anualmente por TB. Após a infecção pelo Mtb, a resposta imune desempenha papel preponderante para impedir o inicio da doença infecciosa, a TB, bem como de seu curso. Assim, os oxidantes (espécies reativas do oxigênio/nitrogênio [EROs/ERNs]) gerados no burst oxidativo de células fagocíticas como, os neutrófilos, são essenciais para uma efetiva resposta ao patógeno. O uso indiscriminado de suplementação antioxidante, atualmente muito comum entre a população, ou o uso terapêutico durante o tratamento da TB, poderia comprometer a resposta imune frente às micobactérias, portanto, predispondo a uma maior susceptibilidade ao Mtb e/ou TB. Neste contexto, o objetivo deste estudo foi investigar ex vivo a influência do antioxidante sintético da classe dos nitróxidos, o 4-Hidroxi-2,2´,6,6´-tetrametilpiperidina-1-oxil (Tempol), sobre a resposta microbicida de neutrófilos contra M. tuberculosis. Neutrófilos humanos foram isolados por gradiente de densidade a partir de sangue total de voluntários saudáveis. Para avaliar o burst oxidativo na ausência ou presença do Tempol, M. tuberculosis H37Ra (ATCC 35177) foi incubado a 37 ºC com neutrófilos a multiplicidades de infecções (MOI) variando de 1 a 100. A liberação de anions superóxido (O2•-) pelos neutrófilos foi avaliada através do ensaio de redução do citocromo c. O ensaio de quimioluminescência amplificada com o Luminol foi utilizado para avaliar EROs/ERNs total e com Isoluminol para extracelular. Complementarmente, o ensaio de killing foi realizado para verificar a capacidade microbicida total dos neutrófilos tratados ou não com Tempol. Neste teste, foi adotado o protocolo "dois passos", em que, Mtb foi incubado com neutrófilos (por 10, 30 e 90 min a 37 ºC) e, através de uma centrifugação diferencial (100 x g, 5 min) e lise dos neutrófilos com H2O pH 11, as micobactérias intracelular e extracelular foram quantificadas e os resultados reportados em Unidades Formadoras de Colônia (UFC), após uma incubação das micobactérias por 21 dias a 37 ºC. Através deste protocolo, as taxas de fagocitose (Kp) e morte intracelular (Kk) do Mtb foram calculadas. Paralelamente foi avaliada a possível atividade tóxica do Tempol sobre neutrófilos, tendo sido observado que Tempol a uma concentração de 500 µM não foi citotóxico. O burst oxidativo dos neutrófilos contra Mtb foi significativamente diminuído na presença do Tempol (450 µM, p < 0,05) para todos os oxidantes avaliados. Esta concentração também foi capaz de diminuir a capacidade microbicida dos neutrófilos, em que o número de UFC de M. tuberculosis no grupo tratado com Tempol foi significativamente maior que no grupo controle (p < 0,05). Curiosamente, Tempol diminuiu o KK dos neutrófilos, mas não teve nenhum efeito sobre a seu Kp. Este estudo fornece informações sobre a influência de antioxidantes sobre a resposta imune contra o M. tuberculosis, de modo que as implicações clínicas para a prevenção e tratamento da tuberculose deve levar em conta estes achados. / Mycobacterium tuberculosis (Mtb), the main cause of tuberculosis (TB), remains as a serious public health problem, chiefly in low- to middle-income countries. It is estimated that about one-third of the world's population has latent TB, with about eight million new cases and roughly three million deaths each year from TB. The innate immune response following Mtb infection plays a crucial role in preventing the onset of active TB, as well as its course. Thus, phagocytes-derived reactive oxygen/nitrogen species (ROS/RNS) during the oxidative burst (e.g., generated by neutrophils) are essential to an effective response to the pathogen. The indiscriminate use of antioxidant supplements, currently very common among the population, or their use as adjuvant therapy during TB treatment, could compromise the immune response to Mtb accordingly potentially increasing the host's susceptibility to Mtb/TB. In this context, the aim of this study was to investigate the ex vivo effect of the cyclic nitroxide tempol (4-hydroxy-2,2,6,6-tetra-methyl-1-piperidinyloxy), an antioxidant with superoxide dismutase mimetic properties, on the microbicide response of neutrophils against M. tuberculosis. Human neutrophils were isolated from venous blood of healthy volunteers by Ficoll density gradient centrifugation. To assess the oxidative burst in the absence or presence of Tempol, M. tuberculosis H37Ra (ATCC 35177) was incubated at 37 ° C with neutrophils at multiplicity of infection (MOI) ranging from 1 to 100. ROS generation (O2•-) by neutrophils was evaluated by using the cytochrome c reduction assay. The total and extracellular ROS were determined using the luminol- and Isoluminol-amplified chemiluminescence assay. Complementarily, the killing assay was performed to check the total microbicide capacity of neutrophils treated or not with Tempol. In this test, the "two-step" protocol was adopted in which, Mtb was incubated with neutrophils (for 10, 30, and 90 min at 37 °C) and, by differential centrifugation (100 x g 5 min) and lysis of neutrophils with H2O pH 11, the intracellular and extracellular mycobacteria were incubated for 21 days at 37 ° C and, mycobacteria were quantified and results the ensuing reported as number of Colony Forming Units (CFU). Through this protocol, were calculated the phagocytosis (Kp) and intracellular killing (Kk) rates for M. tuberculosis. The possible toxic activity of Tempol was evaluated on neutrophils and, was observed that 500 µM tempol was not cytotoxic. The oxidative burst of neutrophils against Mtb was significantly decreased in the presence of 450 µM Tempol, for all evaluated oxidants (p < 0.05). Treatment of neutrophils with 450 µM Tempol decreased the total microbicidal activity against M. tuberculosis, since colony-forming units of these mycobacteria in the treated group were significantly higher than those for the untreated group (p < 0.05). Strikingly, Tempol (450 µM) decreased the kk of neutrophils, but had no effect on their kp. This study provides insights of the influence of antioxidants on the immune response to M. tuberculosis, so that clinical implications for the prevention and treatment of TB should take into account these findings. / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES

Já foi demonstrado que a aminoguanidina (AG), um conhecido inibidor de AGEs (Produtos Finais de Glicação Avançada), aumenta a atividade de NOX2 (Sistema NADPH oxidase fagocítico) em neutrófilos peritoneais de ratos diabéticos. Experimentos adicionais demonstraram que o mesmo efeito ocorre em neutrófilos de ratos não diabéticos. Visando elucidar o mecanismo e a importância deste aumento de NOX2 pela AG em neutrófilos, utilizou-se um modelo experimental de ratos diabéticos e não diabéticos e um modelo in vitro com neutrófilos humanos isolados de sangue periférico ou HUVEC, uma linhagem de células endoteliais. Para isso, ratos machos Wistar diabéticos e não diabéticos foram tratados ou não por gavagem com AG (100mg/kg/dia) por 50 dias. Os neutrófilos foram recrutados e isolados do peritônio após 4 horas da injeção de caseinato de sódio e foram usados para avaliar a produção de superóxido, ERO e as atividades fagocítica e candicida destas células. No modelo in vitro, neutrófilos isolados de sangue periférico ou HUVEC foram ou não incubados com AG ou Metformina (MET) por 18h em estufa de CO2. O tratamento in vivo com a AG, mostrou aumento na produção de superóxido em comparação com grupos tratados com água, em ambos os grupos, diabéticos e não diabéticos. O aumento de atividade e expressão de NOX2 (p47phox e p67 phox) pela AG aumentou as atividades fagocíticas e candicida de Candida albicans, entretanto este aumento foi menos pronunciado no grupo diabético. Adicionalmente, os resultados demonstram a eficácia do tratamento com a AG na prevenção de glicação de proteínas, reduzindo os níveis de HbA1C e AGEs, além de reduzir os níveis de ureia e manter os níveis de creatinina no soro dos animais. O tratamento com AG reduziu a pressão arterial e a produção de nitratos no soro dos animais, mas a atividade das enzimas antioxidantes foi mantida. Verificou-se que as HUVEC tratadas com AG ou MET no estado basal ou estimuladas com LPS, tiveram menor produção de ERO. Neutrófilos humanos incubados com AG aumentaram a produção de ERO e de superóxido, enquanto o tratamento com MET manteve a produção de ambos. Além disso, o tratamento com AG aumentou a fagocitose e a atividade candicida de neutrófilos humanos nos tempos avaliados. O tratamento de neutrófilos humanos com MET manteve a expressão das subunidades avaliadas e o tratamento com AG aumentou a expressão de gp91phox. A liberação de IL-8 foi diminuída nos neutrófilos humanos tratados com a MET, e a AG aumentou a liberação de IFN-y . Em HUVEC a liberação de IL-8 e INF-y foram mantidas com ambos os tratamentos. Pode-se sugerir que a AG aumentou a atividade e a expressão de NOX2 em neutrófilos humanos e de ratos e que isso contribuiu diretamente para o aumento da atividade microbicida dos neutrófilos. Além disso, nos neutrófilos humanos, o aumento da liberação de IFN-y pode ter contribuído para o aumento da expressão de gp91phox. Adicionalmente, a influência da AG em células em processo de diferenciação para um estado mais maduro pode ser diferente dos seus efeitos in vitro, em células já maduras. / It has been showed that aminoguanidine (AG), a known inhibitor of AGE (Advanced Glycation End Products) increases the activity of NOX2 (phagocyte system NADPH Oxidase) peritoneal neutrophils of diabetic rats. Additional experiments demonstrated that the same effect occurs in non-diabetic rat neutrophils. To elucidate the mechanism and significance of NOX2 increase in neutrophils by AG, it was used an experimental model of diabetic and non-diabetic rats and an in vitro model in which human neutrophils isolated from peripheral blood or HUVEC endothelial cell lineage. For this, Wistar rats diabetic and non-diabetic were treated or not with AG by gavage (100 mg / kg / day) for 50 days. Neutrophils were recruited and isolated from the peritoneum 4h after injection of sodium caseinate and were used to evaluate superoxide generation, ROS and phagocytic and candicida activity of these cells. In vitro model, neutrophils isolated from peripheral blood or HUVEC were incubated or not with AG or Metformin (MET) for 18h in CO2 incubator. In vivo treatment with AG showed an increase in superoxide production compared with groups treated with water, in both groups diabetics and non-diabetics. The increased activity and expression of NOX2 (p47phox and p67phox) by AG increased phagocytic and candicida activity of Candida albicans, however this increase was less pronounced in the diabetic group. Additionally, the results demonstrate the effectiveness of treatment with AG on preventing glycation of proteins, reducing HbA1c and AGEs, in addition to reducing levels of urea and maintain the creatinine levels in serum of animals. The treatment with AG reduced the blood pressure and the production of nitrates and antioxidant enzymes activity were maintained in animals. It was found that HUVEC treated with AG or MET at baseline, or stimulated with LPS had lower production of ROS. Human neutrophils incubated with AG increase ROS and superoxide while treatment with MET remained the production of both. In addition, treatment with AG increased phagocytosis and candicidal activity of human neutrophils at times evaluated. In addition, treatment with AG increased phagocytosis and candicida activity of human neutrophils at times evaluated. The MET treatment maintained the expression of subunits assessed, and treatment with AG caused increased expression of gp91. The release of IL-8 by human neutrophils was decreased by treatment with MET, and AG increased the release of IFN-y The release of IL-8 was reduced in human neutrophils treated with MET, and AG increased IFN-y . In HUVEC the release of IL-8 and IFN-y were maintained with both treatments. It can be suggested that the AG used to inhibit the formation of AGEs increased activity and NOX2 expression in human and rat neutrophils and that directly contributed to the increased microbicidal activity by neutrophils. In addition, the human neutrophils the increased of IFN-y may have contributed to the increased expression of gp91phox. In addition, the influence of AG in cells in differentiation process to more mature state may be different of in vitro effects on cells already mature.

Os efeitos de EPA e DHA sobre a função de neutrófilos foram comparados. Para isso, foram realizados experimentos em neutrófilos isolados de ratos. Foram analisadas células com a membrana plasmática íntegra e fragmentação de DNA com o intuito de determinar as concentrações não tóxicas de EPA e DHA. Aumento da produção de peróxido de hidrogênio ocorreu a partir de concentrações menores de DHA (50 <font face=\"Symbol\">mM comparado com 100 <font face=\"Symbol\">mM de EPA). Já para a produção de ânion superóxido, EPA estimulou em doses menores (12.5 <font face=\"Symbol\">mM e o DHA em 100 <font face=\"Symbol\">mM). Ambos AGs aumentaram a síntese e liberação das citocinas CINC-2 e TNF-<font face=\"Symbol\">&#945 e não modificaram a produção de IL1-<font face=\"Symbol\">b e óxido nítrico após incubação das células por 18 horas. Somente DHA elevou a capacidade fagocitária e a atividade fungicida dos neutrófilos. EPA e DHA apresentaram efeitos distintos na produção de citocinas, fagocitose e atividade fungicida dos neutrófilos. Já na produção das EROS, EPA e DHA apresentaram efeitos similares, embora em concentrações diferentes. / The effects of eicosapentaenoic (EPA) and docosahexaenoic (DHA) on neutrophil function were compared. For this purpose, experiments were performed in isolated rat neutrophils. Cells with intact plasma membrane and DNA fragmentation were analyzed in order to determine the non-toxic concentrations of EPA and DHA. Production of H2O2 was increased in lower concentrations of DHA (50 <font face=\"Symbol\">mM compared to 100 <font face=\"Symbol\">mM of EPA). For production of O2 -, EPA stimulated at lower doses (12.5 <font face=\"Symbol\">mM compared to 100 <font face=\"Symbol\">mM of DHA). Both FAs increased synthesis and release of cytokines, CINC-2 and TNF-<font face=\"Symbol\">&#945, and did not change the production of IL-1<font face=\"Symbol\">b and nitric oxide after incubation of the cells for 18 hours. Only DHA increased the phagocytic capacity and fungicidal activity of neutrophils. These FAs showed distinct effects on cytokine production, phagocytosis capacity and fungicidal activity by neutrophils. For production of ROS, both EPA and DHA had similar actions, although at different concentrations.