Foram estudados os efeitos de um estresse social, produzido pela introdução de um rato, na condição de \"intruso\", por uma hora, em uma comunidade formada por três elementos (macho dominante, macho submisso e fêmea), com relações sociais pré-estabelecidas, sobre o comportamento, a bioquímica e a atividade imune inata de neutrófilos. Os animais intrusos apresentaram, em relação ao grupo controle, tendência a serem mais ativos e menos ansiosos no Campo Aberto e no Labirinto em Cruz Elevado, níveis significantemente mais elevados de corticosterona sérica, burst oxidativo induzido por SAPI significantemente aumentado e, tanto no córtex frontal como no hipotálamo, sistemas serotonérgicos significantemente mais ativados. Os dados, foram interpretados como decorrentes de uma reação de estresse preparando o organismo dos animais intrusos para novo desafio: um eixo HPA mais ativado, com conseqüências favoráveis para uma ação rápida; uma resposta imune inata mais efetiva, para defesa contra possíveis injúrias e uma neuroquímica denotando um refreamento de comportamentos impulsivos, permitindo escolhas mais adequadas em contexto de confrontação social. Essa reação tornou os organismos mais ativos e eficazes, um exemplo do aspecto positivo do estresse. Demonstrou-se, também, a existência e importância das grandes diferenças individuais e necessidade de se tratar estatisticamente e interpretar com muito cuidado os efeitos de estímulos estressores mais sutis, onde essas diferenças despontam com menor clareza e podendo induzir a erro interpretativo. / The present works shows the effects of social stress, produced by introducing a rat, in the condition of \"intruder\", for one hour, in a community formed for three elements namely a dominant male , submissive male and a female, with preset social relations, concerning their behaviour, the biochemistry and the innate immune activity of neutrophils. The intruder animals displayed, in relationship to the control group, a tendency towards being more active and less anxious in the Open Field and the Plus Maze, as well as of serum corticosterone levels with higher values, as well as its oxidative burst being significantly increased. And, as in the frontal cortex as in hypothalamus is concerned, the author found significant activation of serotonergic systems. The data, had been indicative of the function of the reaction of stress in order to prepare the organism for a challenge: a activated HPA axis was increased, with favorable consequences for a fast action; an innate immune reply more effective and neurochemistry denoting cohibition of impulsive behaviours, allowing more adjusted choices in the context of social confrontation This reaction turned the organisms more active and efficient, in an example of the positive aspect of stress reaction. The data also demonstrated the existence and importance of the great individual differences and the need of keeping in mind the statistic approach and very careful interpretation of subtle stressors, whenever these differences appear clearly and may eventually induce to an interpretative error.

Temos mostrado que os glicocorticóides endógenos (GE) modulam o rolling e a aderência de neutrófilos in vivo, mediando a expressão de moléculas de adesão no leucócito e no endotélio. Adicionalmente, os GE controlam a maturação neutrofílica na medula e a sua mobilização para o sangue periférico. O presente trabalho visou investigar os mecanismos moleculares e celulares envolvidos na modulação exercida pelos GE neste processo. Utilizando ratos Wistar submetidos à adrenalectomia bilateral, tratados com RU 38486 ou controles (falso-operados, tratados com veículo ou não manipulados), foi demonstrado que: 1) os GE controlam, negativamente, a expressão de L-selectina em neutrófilos circulantes e ICAM-1, VCAM-1, PECAM-1, VAP-1 na célula endotelial e, positivamente, a expressão de L-selectina em granulócitos da medula óssea via seu receptor citosólico (GCR); 2) o mecanismo envolvido no controle dos GE sobre a expressão de L-selectina é independente de ação sobre sua expressão gênica ou da atividade de NFkB, mas dependente da expressão de anexina-A1, como verificado em camundongos knockouts (KO) para esta proteína 3) o controle da expressão de moléculas de adesão endotelial é dependente de ações sobre a expressão gênica, via translocação nuclear do NFkB; 4) a neutrofilia detectada em animais adrenalectomizados (ADR) é mediada pelo GCR, e dependente de anexina- A1; 5) a neutrofilia parece ser dependente da ação da anexina-A1 sobre a secreção de SDF-1 na medula óssea e expressão de CXCR-4 em neutrófilos circulantes e da medula; 6) concentrações circulantes elevadas de GE induzidas pela administração de ACTH confirmaram o controle dos GE, via anexina A-1, sobre o tráfego de neutrófilos da medula óssea para o sangue, mas sugerem um controle diferencial dos GE e anexina A-1 sobre a expressão de L-selectina em células da medula e do sangue circulante. Estes dados mostram mecanismos inéditos do controle dos GE sobre o tráfego de neutrófilos, que diferem em cada microambiente e tipo celular envolvido neste complexo fenômeno. / We have shown that endogenous glucocorticoids (GE) modulate the rolling and adhesion of neutrophils in vivo, mediating the expression of adhesion molecules on leukocytes and the endothelium. Additionally, the GE control neutrophil maturation in bone marrow and mobilization to peripheral blood. This work aimed to investigate the molecular and cellular mechanisms involved in the modulation exerted by GE in this process. Using male Wistar rats, submitted to bilateral adrenalectomy, treatment with RU 38 486 or controls (sham operated, vehicle or non manipulated), it was shown that: 1) GE control, negatively, L-selectin expression on circulating neutrophils and ICAM-1, VCAM-1, PECAM-1, VAP-1 on endothelial cell and, positively, L-selectin expression on bone marrow granulocytes via their cytosolic receptor (GCR); 2) the mechanism involved in the control of GE on the L-selectin expression is independent of its action on gene expression or NFkB activity, but dependent on the expression of anexina-A1, as observed in mice knockouts for this protein; 3) the control of endothelial adhesion molecules is dependent on gene expression, via NFkB translocation; 4) the neutrophilia detected in adrenalectomized animals (ADR) is mediated by GCR, and dependent on anexina-A1; 5) the neutrophilia seems to be dependent on the action of annexin A-1 on SDF-1α secretion in bone marrow and expression of CXCR-4 in peripheral blood and bone marrow; 6) high circulating concentrations of GE induced by administration of ACTH confirmed the control of GE, via the annexin-1, on the traffic of neutrophils from the bone marrow to the blood, but suggest a differential control of GE and annexin A-1 on the L-selectin expression in the bone marrow and circulating blood. These data indicate unpublished mechanisms of control of GE on the traffic of neutrophils, which differ in each microenvironment and cell type involved in this complex phenomenon.

Microcistinas (MCs) são heptapeptídeos cíclicos produzidos por cianobactérias e possuem potente hepatotoxicidade e atividade promotora de tumor. Em intoxicações agudas induzidas por MCs ocorre infiltração leucocitária no foco inflamatório. Embora os mecanismos de hepatotoxicidade não são claros, o recrutamento de neutrófilos no fígado pode contribuir ao dano tecidual e desenvolvimento tumoral causados por xenobióticos. O objetivo dessa tese foi investigar os efeitos de três estruturalmente distintas MCs (MC-LA, MC-YR e MC-LR) nas seguintes funções de neutrófilos: síntese e expressão de moléculas de adesão, rolamento, adesão, migração e liberação de citocinas e de ROS. Nos ensaios de migração em bolsa de ar, as três MCs induziram similarmente a migração de leucócitos in vivo em tecido subcutâneo de ratos e diferencialmente a secreção de citocinas pró-inflamatórias (CINC, IL-1β, TNF-α, VEGF-α e MIP) no exsudato. Concentrações elevadas de CINC-2αβ foram encontradas nos exsudatos inflamatórios de animais após injeção de MC-LA, MC-LR ou MC-YR. MIP-2 elevou-se apenas em exsudatos de animais expostos a MC-LR. Não foram observadas alterações em secreção de IL-1β, TNF-α e VEGF-α. Estudos de microscopia intravital mostraram que apenas a aplicação tópica de MC-LR reforçou o rolamento e a adesão de leucócitos no endotélio de vênulas mesentéricas pós-capilares. Esses últimos resultados podem ser dependentes de aumento e expressão da síntese da L-selectina e β2-integrina nos neutrófilos, tal como avaliado por FACS e PCR-RT, respectivamente. Adicionalmente, em ensaios em câmara de Boyden in vitro, as três MCs promoveram locomoção direta de neutrófilos e aumentaram a migração dessas células em resposta ao fMLP, além do aumento de cálcio intracelular observado por microscopia confocal. Os efeitos das MC-LA, MC-YR e MC-LR em neutrófilos humanos e de ratos tiveram o mesmo padrão de resposta. A análise de viabilidade celular, fragmentação de DNA, despolarização de membrana mitocondrial e liberação de ROS intracelulares foram avaliadas pela técnica de FACS. A concentração de ROS extracelular foi medida por quimiluminescência amplificada por lucigenina. A produção de citocinas em células tratadas foram determinadas por ELISA. Observamos aumento da liberação de IL-8, CINC-2α β e da concentração de ROS extracelular por neutrófilos humanos e de ratos pela exposição dessas células com as MCs. Os resultados aqui obtidos mostram o efeito pró-inflamatório direto das MC-LA, MC-YR e MC-LR. A possibilidade de os neutrófilos migrarem e responderem localmente a MCs contribui para a toxicidade destas toxinas. / Microcystins (MCs) are a family of heptapeptide toxins produced by some genera of Cyanobacteria. MCs have potent hepatotoxicity and tumor-promoting activity. Leukocyte infiltration in the liver was observed in MC-induced acute intoxication. Although the mechanisms of hepatotoxicity induced by MCs are still unclear, neutrophil infiltration in the liver may play an important role in triggering toxic injury and tumor development. The purpose of this thesis was to investigate the effects of three structurally distinct MCs (MC-LA, MC-YR and MC-LR) in the neutrophil functions: synthesis and expression of adhesion molecules, rolling, adhesion, migration and release of cytokines and ROS. In migration assays of the air pouch, the three MCs similarly induced the migration of leukocytes in vivo in subcutaneous tissue of rats and differentially the secretion of pro-inflammatory cytokines (CINC-2αβ, IL-1-β, TNF--α, VEGF- α and MIP-2) in exudates. Elevated concentrations of CINC-2αβ were found in the inflamed exudates from animals injected with MC-LA, MC-LR or MC-YR, although MIP-2 was only detected in the exudates from animals injected with MC-LR. There were no changes in the secretion of IL-1-β, TNF-α and VEGF--α. Intravital microscopic studies showed that topical application of MC-LR enhanced the numbers of rolling and adhered leukocytes in the endothelium of postcapillary mesenteric venules. The latter effects may be dependent upon induction of the synthesis and expression of L-selectin and -α2-integrin in neutrophils, as assessed by flow cytometry and RT-PCR, respectively. Conversely, the three toxins promoted direct locomotion of neutrophils and enhanced their migration in response to fMLP, as measured by Boyden chamber assays, and increased intracellular calcium, a messenger in the chemotaxic process. The effects of MC-LA, MC-YR and MC-LR in human neutrophils and mice had the same pattern of response. The analyses of cell viability, DNA fragmentation, mitochondrial membrane depolarization of and release of intracellular ROS were evaluated by the technique of FACS. Extracellular ROS content was measured by lucigenin-amplified chemiluminescence, and cytokines were determined by ELISA. We found that these MCs increased interleukin-8 (IL-8), cytokine-induced neutrophil chemoattractant-2αβ (CINC-2αβ) and extracellular ROS levels in human and rat neutrophils. In conclusion, our results showed that MCs act on specific pathways of neutrophil recruitment, indicating their potential effect on neutrophils activation. This process can significantly contribute to the pathogenesis of hepatic damage due to generation of ROS by neutrophils as well as act on hepatocytes under such conditions and potentially increase injury processes induced by MCs.

A leishmaniose visceral (LV) é uma doença crônica e potencialmente fatal causada, no Brasil, pelo protozoário Leishmania infantum. A resistência à LV é relacionada ao desenvolvimento de uma resposta imune celular eficiente. Para isso, células dendríticas (DCs) reconhecem produtos antigênicos do parasito, através dos Toll-like Receptors (TLRs), e, após ativação, produzem fatores, que irão orquestrar o recrutamento celular e desenvolvimento da resposta imune protetora. Dentre os vários TLRs, tem sido demonstrado que o TLR9 está relacionado com a resistência à infecção em modelo de leishmaniose cutânea. No presente estudo, nosso objetivo foi determinar o papel do TLR9 durante a infecção por L. infantum. Nossos resultados demonstram que a expressão de TLR9 é modulada positivamente durante a infecção in vivo e in vitro pela L. infantum. O TLR9 é essencial para o controle da infecção contra L. infantum, uma vez que camundongos TLR9-/- são mais susceptíveis à infecção, apresentando maior número de parasitos no baço e fígado na 4ª e 6ª semana pós-infecção. A fenotipagem de leucócitos presente no baço demonstrou que camundongos TLR9-/- possuem menor número de neutrófilos. De maneira semelhante, a análise imuno-histoquímica mostrou uma reduzida marcação de células 7/4+ (específica para neutrófilos) no fígado de animais TLR9-/-. A falha na migração de neutrófilos observada em animais TLR9-/- não está associada a uma incapacidade de ativação dos polimorfonucleares, mas sim a deficiências na produção de fatores quimiotáticos, como CXCL1 (KC) e CXCL2 (MIP-2) nos órgãos-alvo. Investigando o mecanismo de ação, as células dendríticas oriundas de animais TLR9-/- falham em seu processo de ativação frente à infecção in vitro e in vivo com L. infantum, apresentando um fenótipo semi-maduro, com redução de expressão de MHC-II e moléculas coestimuladoras. Interessante que essas células apresentaram deficiência na produção de mediadores quimiotáticos de neutrófilos como KC e MIP-2, e consequentemente, induzindo o menor recrutamento de neutrófilos in vitro. Em conjunto, nossos resultados demonstram que o TLR9 é essencial para o controle da infecção por L. infantum, através de um mecanismo dependente do recrutamento de neutrófilos para o sítio inflamatório mediado pela ativação apropriada de fatores quimiotáticos de neutrófilos pelas DCs. / Visceral leishmaniasis (VL) is a chronic and potentially fatal disease caused by protozoan Leishmania infantum, in Brazil. The resistance against VL is related to the development of cellular immune response. During infection, the dendritic cells (DCs) recognize antigenic products through Toll-like Receptors (TLRs) and then orchestrate the cellular recruitment and immune response development. Among several TLRs, it has been showed that TLR9 is related to resistance to cutaneous leishmaniasis. In the present study, our aim was to determinate the role of TLR9 during L. infantum infection. Our results demonstrated that TLR9 is up regulated during in vitro and in vivo L. infantum infection. TLR9 is critical for protective immunity against L. infantum, since TLR9-/- mice infected were more susceptible to infection, displaying high amounts of parasites in spleen and liver, at 4th and 6th weeks post-infection. Phenotyping the leukocytes into the spleen, TLR9-/- mice presented reduced neutrophils when compared to WT. Likewise, imunohistochemistry analyses showed the reduced of 7/4+ cells (specific to neutrophils) staining into the TLR-9-/- liver. The failure of neutrophil migration is not associated to their stage of activation impaired, but due the reduced levels of CXCL1 (KC) and CXCL2 (MIP-2) (neutrophil chemoatracttant) produced into into the spleen cells culture from infected TLR9-/-. Furthermore, DCs from TLR9-/- presented a semi-mature stage during in vitro and in vivo L. infantum infection, showing reduced expression of MHC-II and co-stimulatory molecule. Interestingly, the ability of DC to produce the neutrophil chemotact mediators (KC and MIP-2) was completely reduced by that derived from TLR9-/- mice, affecting neutrophil migration into Boyden chamber. Altogether, we demonstrated that TLR9 presents a critical role in the protective response against L.infantu through the mechanism dependent of crosstalk between neutrophil recruitment and DC activation.

Submitted by Márcio Ropke (ropke13marcio@gmail.com) on 2017-06-14T11:39:35Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Avaliação imunoistoquímica de neutrófilos e linfócitos no fronte invasivo do.pdf: 669377 bytes, checksum: 4b3ab148e2d476d517ef09b5f5eebc1a (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-14T11:39:35Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Avaliação imunoistoquímica de neutrófilos e linfócitos no fronte invasivo do.pdf: 669377 bytes, checksum: 4b3ab148e2d476d517ef09b5f5eebc1a (MD5) Previous issue date: 2015-12-10 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio Grande do Sul - FAPERGS / Pacientes com carcinoma espinocelular (CEC) de lábio apresentam prognóstico favorável em comparação aos pacientes com a lesão intraoral. O estadiamento clínico da lesão é a principal forma de avaliação do prognóstico do CEC oral, além dos sistemas de gradação histológica dos tumores. A análise do budding tumoral (BT) e do infiltrado inflamatório na região do fronte invasivo tumoral (FIT) podem configurar-se como fatores prognósticos complementares, já que para alguns tipos de câncer, entre eles o CEC intraoral, BT positivo, contagem elevada de neutrófilos no tumor, sangue ou ambos e razão neutrófilos/linfócitos (RNL) aumentada representam um pior prognóstico para os pacientes. O objetivo deste estudo foi avaliar a presença e a RNL no FIT, bem como a associação desses achados com o grau histológico de malignidade (GHM) dos tumores e o BT em uma amostra de CEC de lábio. Revisou-se os arquivos do Centro de Diagnóstico das Doenças da Boca da Faculdade de Odontologia da Universidade Federal de Pelotas, buscando-se lesões submetidas a biópsias excisionais de CEC em lábio inferior e classificando-as segundo um sistema de classificação do GHM. Realizou-se técnica imunoistoquímica com os anticorpos CD66b e CD3 para avaliação de neutrófilos e linfócitos, respectivamente. O anticorpo AE1/AE3 foi empregado para a classificação do BT. Neutrófilos CD66b+ e linfócitos CD3+ foram analisados semi-quantitativamente no FIT. De um total de 43 casos, 36 (83,7%) eram tumores bem diferenciados e 32 (74.4%) não apresentavam BT. Observou-se baixa infiltração de neutrófilos e alta de linfócitos (índices 0,8 e 2,0, respectivamente) na região do FIT, acarretando baixa RNL na mesma região. Portanto, a alta diferenciação tumoral, os poucos casos exibindo BT positivo e a baixa RNL no FIT podem estar associadas ao melhor prognóstico do CEC labial. / Patients with lip squamous cell carcinoma (LSCC) present favorable prognosis compared to those with intraoral lesion. Clinical staging of lesion is the main way of assessing the prognosis of oral squamous cell carcinoma (OSCC), followed by the histological grading systems. Analysis of tumor budding (TB) and the inflammatory infiltrate in the tumoral invasive front (TIF) can be configured as additional prognostic factors, since for some types of cancers, including intraoral SCC, findings as TB positive, high counting of neutrophils in tumor, blood or both and increased neutrophils/lymphocytes ratio (NLR) represent a worse prognosis for the patients. The aim of this study was to evaluate the presence and the NLR in the TIF, and the association of these findings with the histological malignancy grading (HMG) of tumors and the TB in a LSCC sample. The files from the Center of Diagnosis of Oral Diseases, Dental School, Federal University of Pelotas were reviewed searching specimens from excisional biopsies of lower LSCC (LLSCC) and classifying them according to a HMG system. Immunohistochemistry was performed with CD3 and CD66b antibodies for evaluation of neutrophils and lymphocytes, respectively. The antibody AE1/AE3 was used for the identification of TB. CD66b+ neutrophils and CD3+ lymphocytes were analyzed semi-quantitatively in the TIF. From a total of 43 cases, 36 (83.7%) represented well differentiated tumors, 32 (74.4%) showed none TB. There were low neutrophil and high lymphocyte infiltrations (indexes 0.8 and 2.0, respectively) in the TIF, leading to a low NLR in the same region. Therefore, the high differentiation grading, the few BT positive cases and the low NLR in the TIF may be associated with better prognosis in LSCC.

Lesão pulmonar aguda é caracterizada por infiltrado de neutrófilos no pulmão, edema, lesão alveolar difusa e alteração da reatividade das vias aéreas. Evidências clínicas e experimentais sugerem que os hormônios sexuais femininos (HSF) modulam a inflamação. Nesse estudo camundongos fêmeas C57BL/6 foram ovariectomizados (OVx) ou falsamente operados, com ovários mantidos (Sham). Após 7 dias foi realizada instilação nasal de LPS (ou salina como controle). Após 4 ou 24 h os experimentos foram conduzidos. Os resultados obtidos 24 h após o LPS mostram aumento de neutrófilos, IL-1b e de óxido nítrico (NO) e redução de IL-10 no pulmão dos animais OVx em relação aos Sham. Também foi observada redução da reatividade traqueal e da resistência e elastância pulmonar dos animais OVx. O tratamento dos animais OVx com 17b-estradiol ou progesterona antes do LPS reverteram esses efeitos. Os dados mostram que 4 h após o LPS a OVx não altera a inflamação e a reatividade das vias aéreas. Pode-se concluir nesse modelo experimental que os HSF exerçam papel de proteção ao organismo. / Acute lung injury is characterized by lung neutrophil infiltration, edema, diffuse alveolar damage and changes in airway reactivity. Clinical and experimental evidences suggest that the female sex hormones (FSH) modulate the inflammation. In this study, female mice C57BL/6 were ovariectomized (OVx) or not (Sham). After 7 days, LPS or saline (as control) were intranasally instillated. After 4 or 24 h the experiments were carried. We observed, 24 h after LPS, increase in neutrophil, IL-1b and nitric oxide (NO) and reduction of IL-10 in the lungs of OVx compared to Sham. We also noted reduced tracheal reactivity and lung resistance and elastance in OVx animals. Treatment of OVx with 17b-estradiol or progesterone before LPS reversed these effects. The data show that 4 h after LPS, the OVx does not promote inflammation and airway reactivity. We can conclude that in our experimental model, FSH exert protective role.

Plantas medicinais são usadas por 80% da população mundial. O Brasil, devido a sua grande diversidade de clima, possui uma forte medicina tradicional. Muitas espécies vegetais são usadas pela população como anti-inflamatórias e cicatrizantes. Neste cenário está Solidago chilensis. Sucedânea da Arnica montana, está presente na lista de plantas de interesse da ANVISA (RENISUS), e possui uma investigação científica defasada. Para apoiar o uso popular e resolver as questões sobre o seu mecanismo de ação foram desenvolvidos testes demonstrando a ação cicatrizante desta espécie. Experimentos de ferida aberta e bolsa de ar foram realizados em ratos, para determinar sua participação como um pró ou anti-inflamatório. Estes testes incluem contagem de migração celular e dosagem de citocina, frente ao estimulo de seu extrato e frações. Ensaios in vitro foram realizados para indicar o tipo celular predominante envolvido e a dose toxica (indicada pela fragmentação de ADN e viabilidade celular). Todos os experimentos foram executados com o extrato hidroetanólico a 70%, liofilizado e com as frações clorofórmio, acetato de etila, e aquosa. Paralelamente, uma triagem química por CLAE e CCD foi realizada para determinar, por RMN, alguns marcadores. Foi observado uma redução significativa da área da ferida no dia 5º dia de tratamento com LHEE em gel de carbopol, justamente na passagem da fase de inflamação para a fase de granulação, indicando uma aceleração da fase inflamatória. Também foi observado um aumento da liberação de L-selectina, IL-1, IL-6 no ensaio de bolsa de ar, mas em oposição, percebe-se um efeito oposto quando administrado concomitantemente com um estímulo pró-inflamatório. Diversos compostos devem estar atuando para culminar com essa atividade, entre eles endotoxinas, contaminantes inerentes ao ambiente não estéril, diterpenos tóxicos e flavonóides, como a quercitrina. O supracitado fenômeno indica um efeito modulador da resposta imune. / Medicinal plants are used by 80% of the world population. Brazil due its vast climatically diversity possess a strong traditional medicine. Many vegetal species are used by the population as anti-inflammatory and wound healer. In this picture there is Solidago chilensis. Ersatz of the Arnica Montana, and present in the ANVISA`s plants of interest list (RENISUS), posses a lagged scientific investigation. To support the popular use and elucidate questions about its mechanism of action were developed tests demonstrating the healing action of this specie. Open wound and air pouch experiments are developed with rats to determinate the activities as a pro or anti-inflammatory. These tests include a cellular migration count and cytosine dosage. In vitro essay were performed to indicate the predominant cellular type response and the toxic dosage (indicated by DNA fragmentation and the cellular viability). All the experiments were executed with the lyophilized 70% hydroethanolic extract, and the fractions chloroform, ethyl acetate, and aqueous. An alongside chemical screening by THL and HPLC were carried on to determine by NMR some key compounds. It was verified a significant reduction of the wound in the 5th day in the open wound experiment, which is the passage of the inflammation phase to the granulation phase. Also it was noted ad increase of the L-selectin, IL-1, and IL-6 liberation by neutrophils but a decrease when administrated concomitant with a pro- inflammatory stimulus. Several compounds must be acting to culminate this activity, including endotoxin, inherent contaminants in the non-sterile environment, toxic diterpenes and flavonoids such as quercitrin. The aforementioned phenomenon points to a modulatory effect of the immune response. The obtained result indicates a potential use in wound healing processes with has immune deficiency and also hiperresponsivite. Further studies will be performed to verify the most active fraction, and its main compounds.

Um material obturador deve apresentar boas propriedades biológicas e físico-químicas, uma vez que ficará em íntimo contato com os tecidos periapicais. Sendo assim, não deve ser irritante aos tecidos adjacentes, possibilitando, ou mesmo favorecendo, o reparo da região periapical, para isso não devem alterar o processo inflamatório. O presente estudo avaliou a citotoxicidade dos cimentos AH Plus, Sealapex, MTA Fillapex e Sealepox em neutrófilos humanos. Neutrófilos humanos cultivados na presença ou ausência de LPS foram tratados com os cimentos em diferentes diluições (1:1, 1:4, 1:8, 1:16 e 1:32) e tempo de presa (24 e 48 horas) durante 24 horas. A viabilidade celular foi analisada por citometria de fluxo, a dosagem de CXCL8 pelo método de ELISA, e Óxido Nítrico na absorvância de 540nm. Os dados foram analisados com o auxílio do programa GraphPad Prism5 por ANOVA a 1 critério seguido pelo teste de Tukey, e os valores considerados significantes quando p<0,05. O cimento AH Plus interferiu apenas na síntese de NO, estimulando-a, tendo a diluição 1:16 melhor comportamento biológico, em ambos períodos experimentais. O Sealapex diminuiu a produção de NO, sendo significante para 1:32 em 48 horas. O MTA Fillapex induziu apoptose, a produção de CXCL8 (1:4 e 1:8 em 48 horas) e diminuiu a síntese de NO (1:32 em 48 horas). Sealepox diminuiu a apoptose (1:16 e 1:32 em 24 horas) e interferiu na produção de CXCL8, diminuindo-a (1:8 em 48 horas, e 1:16 em ambos os períodos). A citotoxicidade em ordem crescente dos cimentos foram: AH Plus, Sealapex, MTA Fillapex e Sealepox. Nosso estudo concluiu que os cimentos AH Plus e Sealapex foram os menos citotóxicos, que menos interferiram na viabilidade celular e na sua função (não indução de CXCL8 e na produção de NO), tanto em 24 horas como em 48 horas. MTA Fillapex e o Sealepox, apesar de causarem mais morte celular e interferirem na produção de NO e CXCL8, seus efeitos podem ser aceitáveis, uma vez que os níveis dessas alterações são, de tal maneira discretos, não agressivos. / A filling material must have good biological and physicochemical, since you\'ll be in close contact with the periapical tissues. Thus it should not be irritating to the surrounding tissues, allowing, or even encouraging, the repair of the periapical region, for it must not alter the inflammatory process. The present study evaluated the cytotoxicity of AH Plus, Sealapex, MTA and Fillapex Sealepox in human neutrophils. Human neutrophils cultured in the presence or absence of LPS cements were treated with different dilutions (1:1, 1:4, 1:8 , 1:16, 1:32) and setting time (24 and 48 hours) for 24 hours. Cell viability was analyzed by flow cytometry, the dosage of CXCL8 by ELISA and nitric oxide in absorbance at 540 nm. Data were analyzed with the aid of GraphPad Prism5 ANOVA for the first criterion followed by Tukey test, and values considered significant when p < 0.05. The AH Plus sealer interfered only in NO synthesis , stimulating it , having a 1:16 dilution better biological behavior , in both experimental periods . The Sealapex decreased production of NO, with 1:32 significant to within 48 hours. The MTA Fillapex induced apoptosis, production of CXCL8 (1:4 to 1:8 within 48 hours) and reduced NO synthesis (1:32 in 48 hours). Sealepox decreased apoptosis (1:16 and 1:32 in 24 hours) and interfere with the production of CXCL8, reducing it (1:8 in 48 hours, and 1:16 in both periods). The cytotoxicity of the cements in ascending order were: AH Plus, Sealapex, MTA and Fillapex Sealepox. We conclude that AH Plus and Sealapex cements were less cytotoxic than less interfered with cell viability and function ( CXCL8 and noninduced NO production ) both in 24 hours and in 48 hours. MTA and Fillapex Sealepox, although most causing cell death and interferes the production of NO and CXCL8, their effects may be acceptable, since the levels of these changes are so mild, non-aggressive.

Através do presente trabalho investigou-se a expressão do comportamento doentio e a atividade de neutrófilos sanguíneos de camundongos adultos, de meia idade e idosos, após o tratamento com lipopolissacarídeo de bactéria gram negativa (Escherichia coli). O comportamento doentio foi avaliado através da ingestão de alimentos e do peso corpóreo. Nos aparatos comportamentais Campo Aberto e Labirinto em cruz elevado, o comportamento doentio foi avaliado através da atividade geral, da exploração e dos níveis de ansiedade. A atividade de neutrófilos sanguíneos foi estudada através de citometria de fluxo, analisando-se a intensidade e porcentagem de neutrófilos que realizaram fagocitose e da intensidade e porcentagem de neutrófilos que realizaram burst oxidativo, ambos induzidos pelo estímulo in vitro da bactéria Staphylococcus aureus. Os animais foram tratados com solução salina ou LPS (na dose de 200 &micro;g/kg) avaliações foram realizadas 2 horas após o tratamento. No caso da ingestão de alimentos e do peso corpóreo, as avaliações foram realizadas durante 3 dias anteriores ao experimento, e durante 7 dias posteriores ao experimento. Os resultados demonstraram que animais idosos apresentaram diferenças na expressão do comportamento doentio, sendo que houve uma maior motivação em explorar os aparatos comportamentais. Apesar da manutenção da exploração no Campo Aberto e Labirinto em Cruz elevado, a redução da ingestão de alimentos e do peso corpóreo apresentou-se mais acentuada nos camundongos de meia idade e idosos, após tratamento com LPS. A atividade de neutrófilos sanguíneos, avaliadas pela fagocitose e burst oxidativo, apresentou-se aumentada em camundongos idosos após tratamento com LPS. A menor migração de neutrófilos sanguíneos à cavidade peritoneal parece ser responsável por esse aumento de atividade dos neutrófilos de camundongos idosos. Esses resultados sugerem que a expressão do comportamento doentio de camundongos idosos é diferente, com manutenção do comportamento de exploração, e que esses camundongos seriam mais susceptíveis aos efeitos do choque endotóxico, devido à presença de maior quantidade de neutrófilos ativados no sangue. / Through the present work, it has been investigated the expression of sickness behavior and blood neutrophils activity in adult, middle-aged and aged mice, after gram negative (Escherichia coli) lipopolysaccharide treatment. Sickness behavior was evaluated through food ingestion and body weight. On the behavioral apparatus Open Field and Elevated Plus Maze, sickness behavior was evaluated through general activity, exploration and anxiety levels. Blood neutrophils activity was studied through flow cytometric analysis, assessing neutrophil\'s intensity and percentage of phagocytosis and neutrophil\'s intensity and percentage of oxidative burst, both induced by in vitroM stimulus of Staphylococcus aureus bacteria. Animals were treated either with saline solution or LPS (in the 200 &micro;g/kg dose) and analysis were done 2 hours after treatment. In the case of food ingestioin and body weight, analysis were done through 3 days before experiment, and during 7 days after experiment. Results demonstrated that aged animals showed differences in sickness behavior expression, with a greater motivation to explore behavioral apparatus. Despite maintenance of Open Field and Elevated Plus Maze exploration, reduction in food ingestion and body weight were more pronounced in middle-aged and aged mice, after LPS treatment. Blood neutrophils activity, analysed through phagocytosis and oxidative burst, were higher in aged mice after LPS treatment. Lesser blood neutrophils migration to peritoneal cavity seems to be responsible for this enhancement in neutrophil activity. These results suggest that the expression of sickness behavior in aged mice is different, with maintenance of exploratory behavior, and that these mice would be more susceptible to endotoxic effects, due to the presence of higher quantity of activated neutrophils in blood.

Benzodiazepínicos (BDZ) são fármacos ansiolíticos que se caracterizam por atuar em receptores GABAa presentes no sistema nervoso central. Além dos receptores centrais os BDZ também possuem afinidade por sítios ligantes periféricos presentes em vários tecidos, dentre eles nas glândulas adrenais e em células polimorfonucleares. O presente experimento analisou os efeitos de BDZ sobre a atividade de neutrófilos e sobre os níveis séricos de corticosterona de ratos. Especificamente, o burst e a fagocitose de neutrófilos foram estudados após o tratamento ex vivo e in vitro com diazepam, RO 5-4864, clonazepam e/ou PK 11195. Os efeitos do diazepam sobre a atividade de neutrófilos também foram avaliados após o uso prolongado deste fármaco. Finalmente, os efeitos in vitro dos BDZ foram estudados após a incubação com um bloqueador do canal de cálcio (Ca2+) o L-verapamil. Os resultados mostraram que (1) o tratamento agudo ex vivo com diazepam (10 mg/kg) produziu um aumento do burst oxidativo e da fagocitose induzida por PMA, LPS e Staphylococcus aureus; (2) o tratamento prolongado (21 dias) com diazepam (10 mg/kg) produziu um aumento do burst oxidativo induzido pelos mesmos estímulos e reduziu a fagocitose dos neutrófilos (porcentagem e intensidade); (3) o tratamento agudo ex vivo com diazepam, mas não o prolongado, aumentou os níveis séricos de corticosterona; (4) os efeitos da adição in vitro de diazepam (100 nM) foram na mesma direção daqueles observados após o tratamento agudo; (5) o RO 5-4864 (100 nM) induziu in vitro efeitos similares aos obtidos ex vivo (10 mg/kg) e in vitro (100 nM) com diazepam; (6) o tratamento ex vivo com clonazepam (10 mg/kg) diminuiu o burst oxidativo de neutrófilos induzido por PMA, LPS e Staphylococcus aureus enquanto que o tratamento com este fármaco na dose de 1 mg/kg aumentou o burst oxidativo destas células frente a todos os estímulos; (7) o tratamento ex vivo (1 e 10 mg/kg) e in vitro (100 nM) com clonazepam não alterou a fagocitose de neutrófilos; (8) os efeitos da adição in vitro de clonazepam sobre a atividade de neutrófilos vão na mesma direção daqueles observados após o tratamento ex vivo na dose de 1 mg/kg; (9) o clonazepam (1 e 10 mg/kg) aumentou os níveis séricos de corticosterona; (10) a adição in vitro do PK 11195 (100 nM) per se ou associado com diazepam (100 nM) ou RO 5-4864 (100 nM) aumentou o burst oxidativo e diminuiu a fagocitose realizada pelos neutrófilos; (11) a adição in vitro do PK 11195 (100 nM) associado com o clonazepam (100 nM) diminuiu o burst oxidativo induzido por PMA e diminuiu a fagocitose realizada por estas células; finalmente, (12) a pré incubação por 2 minutos com L-verapamil (100 nM) bloqueou todos os efeitos do diazepam sobre a atividade de neutrófilos estimulada por PMA, LPS e Staphylococcus aureus e reverteu os efeitos do RO 5-4864 no burst oxidativo induzido por PMA. Esses resultados sugeriram que os efeitos dos BDZ não estão relacionados com a ativação de PBR nas células da glândula adrenal e também que eles não estão relacionados a um aumento dos níveis séricos de corticosterona. Indicaram que os BDZ tenham produzido mudanças na concentração do Ca2+ intracelular dos neutrófilos através da ativação de PBR seguida de um aumento da permeabilidade da membrana plasmática ao Ca2+ através da abertura de canais sensíveis ao L-verapamil, permitindo a entrada do Ca2+. Os diferentes efeitos dos BDZ sobre o burst oxidativo e a fagocitose de neutrófilos foram atribuídos a ações específicas deste fármaco em subtipos de PBR presentes nos neutrófilos e nas membranas mitocondriais. Finalmente, os resultados sugeriram o desenvolvimento de tolerância aos efeitos do diazepam sobre os níveis séricos de corticosterona mas não sobre a atividade de neutrófilos. / Benzodiazepines (BDZ) exert their anxiolytic effects via specific binding sites coupled to neuronal GABAa receptors. They also affect a second, pharmacologically different type of receptor, which has been found in many sites such as blood polimorphonuclear cells and adrenals. The present experiment was designed to analyze the effects of BDZ on neutrophil activity and corticosterone serum levels in rats. Specifically, neutrophil oxidative burst and phagocytosis were studied after ex vivo and in vitro treatments with diazepam, Ro 5-4864, clonazepam and/or PK 11195. Diazepam effects on neutrophil activity were also taken after long-term treatment. Finally, in vitro effects of BDZ were studied after incubation with L-verapamil, a Ca2+ channel blocking agent. Results showed that (1) acute and ex vivo diazepam (10.0 mg/kg) treatment induced an increment on PMA, LPS and Staphylococcus aureus induced oxidative burst and phagocytosis (2) long-term (21 days, 10 mg/kg/day) diazepam treatment increased the oxidative burst induced by the same stimuli and reduced both intensity of phagocytosis and the percentage of neutrophil performing phagocytosis; (3) acute and ex vivo diazepam treatment, but not long-term diazepam treatment increased corticosterone serum levels; (4) the effects induced by in vitro addition of diazepam (100 nM) were in the same direction of those observed after acute treatment; (5) Ro 5-4864 (100 nM) induced similar effects to those of diazepam after ex vivo (10.0 mg/kg) and in vitro (100 nM) treatments; (6) ex vivo (10.0 mg/kg) clonazepam treatment decreased the neutrophil oxidative burst induced by PMA and S. aureus after a 1.0 mg/kg dose and decreased these parameters after a higher (10 mg/kg) dose; (7) ex vivo (1.0 and 10.0 mg/kg) and in vitro (100 nM) clonazepam treatments did not change neutrophil phagocytosis; (8) in vitro clonazepam (100 nM) induced effects on neutrophil activity that were in the same direction of those observed after the 1.0 mg/kg dose (9) clonazepam (1.0 and 10.0 mg/kg) increased corticosterone serum levels; (10) in vitro PK 11195 (100 nM) per se or associated with diazepam (100 nM) or Ro 5-4864 (100 nM) increased PMA, LPS and S. aureus induced neutrophil oxidative burst and decreased cell phagocytosis; (11) in vitro PK 11195 (100 nM) together with clonazepam (100 nM) decreased PMA-induced oxidative burst and decreased S. aureus phagocytosis; finally, (12) in vitro L-verapamil (100 nM) incubation for 2 minutes prevented all effects induced by diazepam on PMA, LPS and S. aureus -induced neutrophil activity and reverted the effects induced by Ro 5-4864 (100 nM) on PMA-induced oxidative burst. These results suggest that BDZ effects on neutrophil activity were not related to PBR activation within the adrenal gland cells, leading to increments on corticosterone serum levels. They suggest instead that BDZ induced [Ca2+]i changes in neutrophils through PBR activation followed by an increase in plasma membrane permeability due to L-verapamil sensitive Ca2+ channels and subsequent extracelular Ca2+ entry. The differences of BDZ effects on neutrophil oxidative burst and phagocytosis were attributed to specific actions on different PBR subtypes present on neutrophil and mitochondrial membranes. Finally, results suggest the development of tolerance to diazepam effects on corticosterone serum levels but not on neutrophil activity.