Identificamos em 12 pacientes deficientes de CD40L uma incidência de infecções fúngicas de 83%, incluindo os primeiros casos de paracoccidioidomicose (PCM) e aspergilose. As células dendríticas imaturas (DCs) dos pacientes apresentaram expressão reduzida das moléculas HLA-DR, CD80 e CD86 e as DCs maduras (mDCs) pulsadas com os fungos P. brasiliensis ou C albicans apresentaram baixa expressão das moléculas HLA-DR e CD80. As mDCs dos pacientes secretaram baixa concentração de IL-12 e alta de IL-10. Nas co-culturas das mDCs com os linfócitos autólogos, observamos que a produção de IFN-<font face=\"Symbol\">g foi reduzida e a produção de IL-4 e IL-5 foi aumentada. Após tratamento com CD40L solúvel os defeitos observados foram revertidos. Os neutrófilos dos pacientes falharam na atividade fungicida em resposta ao P. brasiliensis, reduzida produção de H2O2 e sinalização via TLR1/TLR2 e TLR2/TLR6 foram observadas. Falhas na resposta de DCs e neutrófilos sugerem que esses são mecanismos imunopatológicos subjacentes à suscetibilidade às infecções fúngicas em pacientes deficientes de CD40L. / We identified 12 CD40L-deficient patients with an incidence of fungal infections of 83%, including the first case of paracoccidioidomycosis and aspergillosis. The immature DCs (iDCs) from the patients present reduced protein expression of HLA-DR, CD80 and CD86 and mature DCs (mDCs) pulsed with P. brasiliensis (mDCs) presented low expression of HLA-DR and CD80 molecules The mDCs from the patients secreted low levels of IL-12 and high of IL-10. In co-cultures of mDCs and autologous T lymphocytes we found low production of IFN-<font face=\"Symbol\">g and high production of IL-4 and IL-5. After treatment with soluble CD40L, the defects were reversed. The neutrophils from these patients showed impaired fungicidal activity in response P. brasiliensis and low production of H2O2. Additionally defective TLR1/TLR2 and TLR2/TLR6 signaling were observed. Failure in DCs and neutrophils responses are imunophatological mechanisms underlying the suscetibility to fungal infections in CD40L-deficient patients.

Normalmente, após a cobertura ou a inseminação artificial de éguas, ocorre uma endometrite aguda transitória em resposta ao sêmen e bactérias no útero. O objetivo deste estudo foi verificar se o transporte espermático e a intensidade da reação inflamatória uterina, 2h, 4h ou 24h após a inseminação com sêmen resfriado, são influenciados pela concentração espermática na dose inseminante. Para tal, foram utilizadas 192 éguas em cio, com folículo dominante ≥35 mm, sem crescimento bacteriano e livres de PMNs aos exames uterinos complementares. As éguas foram distribuídas aleatoriamente em grupos e inseminadas com 20 ml contendo 100x106 (n=30), 500x106 (n=27) ou 1000x106 (n=31) espermatozóides diluídos em solução de 3 ml de plasma seminal e 17 ml de leite desnatado, refrigerado e armazenado por 18 a 22 horas, ou infundidas com 20 ml de plasma seminal (n=33), ou com 20 ml de leite desnatado (n=38). As éguas foram abatidas duas, quatro ou 24h após as inseminações ou infusões. O grupo controle (n=33) não recebeu nenhum tratamento. Os ovidutos foram separados do útero, sendo útero e ovidutos lavados separadamente com PBS. Uma amostra do lavado de cada oviduto foi examinada para contagem de espermatozóides e uma amostra de cada lavado uterino foi utilizada para contagem de leucócitos. Após as lavagens, foi retirada uma amostra de endométrio para exame histopatológico. As éguas inseminadas e infundidas apresentaram reação inflamatória significativamente maior que as éguas do grupo controle, no decorrer das 24 horas. A reação inflamatória foi significativamente maior nas éguas inseminadas que nas infundidas. A reação inflamatória apresentou correlação com a concentração espermática (r=0,389). O número de éguas apresentando espermatozóides nos ovidutos não foi diferente nos grupos inseminados. Concluiu-se que componentes da dose inseminante provocam uma resposta inflamatória, sendo esta tanto mais severa e de resolução mais rápida, quanto maior for a concentração espermática. Por outro lado, até as quatro horas pós-inseminação, o transporte espermático independe da concentração espermática utilizada.

Orientador: Nicola Amanda Conran Zorzetto / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-15T08:53:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Miguel_LedianaIagalo_M.pdf: 1386194 bytes, checksum: b81f5aa45e96b255588df48747c1397c (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: A adesão anormal das células brancas e vermelhas ao endotélio, que desencadeia numa diminuição do fluxo de sangue na microcirculação, é um dos principais fatores envolvidos na iniciação da vaso-oclusão em pacientes falciformes (AF). O estado inflamatório crônico, característico nos pacientes com AF, eleva a circulação de citocinas, as quais podem contribuir significativamente para a ativação e adesão das células vermelhas e brancas ao endotélio. O óxido nítrico (NO) e a via de sinalização dependente em NO têm importante efeito inibidor nas propriedades adesivas de leucócitos. Drogas que aumentem a biodisponibilidade de NO ou que atuem na via de sinalização NO-GMPc podem ser benéficas no tratamento de alguns aspectos da AF. Já é de conhecimento que pacientes com AF apresentam níveis elevados de algumas citocinas presentes no plasma, assim sendo, este estudo teve como objetivo avaliar os efeitos in vitro das citocinas nas propriedades adesivas de neutrófilos e células vermelhas de indivíduos controles e pacientes com AF. Adicionalmente, foram determinados os efeitos de BAY 73-6691, um inibidor da enzima hidrolizante de GMPc, fosfodiesterase 9A (PDE9A) e BAY 41-2272, um ativador de guanilato ciclase, na ausência ou presença da estimulação pelas citocinas na adesão dessas células. Os neutrófilos e as células vermelhas de indivíduos controles e pacientes com AF foram isolados de sangue periférico. A adesão das células à fibronectina foi determinada utilizando o ensaio de adesão estático na presença ou ausência das citocinas IL-8 (10-500ng/ml), TNF-alpha (10-100ng/ml) e GM-CSF (0,1-10ng/ml) e/ou na presença/ausência de BAY 73-6691 (60µM), BAY 41-2272 (60nM) ou DMSO como veículo (0.2%v/v). Como previamente demonstrado, os neutrófilos de pacientes com AF (neutrófilos AF) possuem uma maior capacidade de aderir à FN do que os neutrófilos de indivíduos controle (neutrófilos CON). A estimulação das células in vitro com as três citocinas aumentaram significativamente as adesões à FN dos neutrófilos CON e aumentou ainda mais a adesão dos neutrófilos AF. A incubação de ambos os neutrófilos, CON e AF, com BAY 73-6691, mas não BAY 41-2272, reduziu significativamente as propriedades adesivas à FN; esse evento foi acompanhado por uma diminuição da expressão das moléculas de adesão, L-selectina e CD11b (subunidade Mac-1) na superfície de neutrófilos AF. Além do mais, nas concentrações utilizadas, BAY 73-6691, mas não o BAY 41-2272, diminui significativamente a adesão de neutrófilos CON e AF após estimulação com IL-8, TNF-a e GM-CSF. No entanto, esse evento não foi acompanhado por alterações na expressão da moléculas de adesão na superfície de neutrófilos AF quando estimulados com IL-8. As células vermelhas de indivíduos AF também apresentaram uma maior capacidade de se aderir à FN quando comparadas às células de indivíduos controles. No entanto, ao contrário dos neutrófilos, na presença de IL-8 (10-500ng/ml) e TNF-a (0.1-1µg/ml), não houve alteração das propriedades adesivas dessas células tanto de indivíduos controles quanto das células de pacientes com AF. Além disso, BAY 73-6691 e BAY 41-2272, não alteraram a adesão basal tanto das células vermelhas de controles quanto pacientes com AF. Os principais mediadores inflamatórios, utilizados em concentrações fisiologicamente relevantes, foram capazes de aumentar as propriedades adesivas de neutrófilos, mas não das células vermelhas, de indivíduos controles e AF. Portanto, sugerimos que as citocinas inflamatórias circulantes podem desempenhar um papel na indução das propriedades adesivas dos neutrófilos em pacientes falciformes; em contrapartida, outros fatores além do estímulo inflamatório, podem ser mais importante para induzir a adesão das células vermelhas de pacientes AF. Dados sugerem que agentes que aumentam os níveis de GMPc intracelular podem ser úteis para reduzir as propriedades adesivas de neutrófilos AF, mesmo na presença de um estado inflamatório. PDE9A é altamente expressa pelas células hematopoiéticas e a inibição desta enzima, com conseqüente elevação de GMPc, pode representar um alvo terapêutico para drogas que são tecido/célula específicas, necessitando de mais estudos in vivo e in vitro para a terapêutica de AF / Abstract: The adhesion of both red and white cells to the vessel walls of the microcirculation initiates vaso-occlusion in sickle cell disease (SCD). The chronic inflammatory nature of SCD leads to elevation of circulating cytokines in patients, which may contribute significantly to the activation of red and white cells and their consequent adhesion. Nitric oxide (NO) and the NO-dependent signaling pathway have important inhibitory effects on cellular adhesive properties. Drugs that enhance NO bioavailability or NO-cGMP-dependent signaling may hold potential for treatment of various aspects of SCD. It is known that levels of certain cytokines are augmented in the plasma of SCD individuals; therefore, this study aimed to observe the effect of cytokines, on the in vitro adhesive properties of neutrophils (neu) and red blood cells (RBC) from healthy control (CON) and steady-state SCD (SCD) individuals. Furthermore, the effects of BAY 73-6691, an inhibitor of the cGMP-hydrolyzing enzyme, phosphodiesterase 9A (PDE9A) and BAY 41-2272, a guanylate cylase activator, on non-stimulated and cytokine-stimulated cell adhesion were determined. Neutrophils and red blood cells (RBC) were isolated from the peripheral blood of CON and SCD individuals. Cell adhesion to immobilized fibronectin was assessed using static adhesion assays in the presence or absence of the cytokines, IL-8 (10-500ng/ml), TNF-alpha (10-100ng/ml) and GM-CSF (0,1-10ng/ml) and/or in the presence/absence of BAY 73-6691 (10-60µM), BAY 41-2272 (60nM) or DMSO vehicle (0.2%v/v). As previously demonstrated, SCDneu have a greater capacity to adhere to FN than CONneu. Stimulation of cells in vitro with all three cytokines significantly augmented both CONneu adhesion to FN and further increased SCDneu adhesion. The incubation of both CONneu and SCDneu with BAY 73-6691, but not BAY 41-2272, significantly reduced their adhesions to FN; this was accompanied by a decrease in the expressions of the L-selectin and CD11b (Mac-1-subunit) adhesion molecules on the SCAneu surface. Furthermore, BAY 73-6691, but essentially not BAY 41-2272, significantly inhibited CONneu and SCDneu adhesion stimulated by IL-8, TNF-alpha and GM-CSF. However, this was not accompanied by alterations in adhesion molecule presentation on IL-8-stimulated SCAneu. As previously reported, SCD RBC have a greater capacity to adhere to FN, in vitro, compared to CON RBC. However, in contrast to neutrophils, cytokines IL-8 (10-500ng/ml) and TNF-alpha (0.1-1µg/ml) did not alter the capacities of neither CON RBC nor SCD RBC to adhere to FN. Furthermore, BAY 73-6691 and BAY 41-2272 did not affect either basal CON RBC or SCD RBC adhesion. Key SCD inflammatory mediators were found, at physiologically relevant concentrations, to augment the adhesive properties of neutrophils from control and SCD individuals. Circulating inflammatory cytokines may play a role in the induction of leukocyte adhesive properties in SCD; in contrast factors other than inflammatory stimuli may be more important for induction of SCD RBC adhesion. Data suggest that elevation of intracellular cGMP may be an important approach for reducing SCD leukocyte adhesive properties, even in an inflammatory environment. PDE9A is highly expressed in hematopoietic cells and inhibition of this enzyme, with consequent augmentation of cGMP, may represent a tissue/cell-specific therapeutic drug target worthy of further in vitro and in vivo studies as a therapy for SCD / Mestrado / Ciencias Biomedicas / Mestre em Ciências Médicas

Orientador: Claudia Herrera Tambeli / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-08-10T16:43:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Oliveira_MariaClaudiaGoncalvesde_D.pdf: 939911 bytes, checksum: b56bfd43b641acd5fc9d086b0faf0aa0 (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: Recentes estudos demonstram que a ativado de receptores P2X3,2/3 pelo ATP endógeno contribui para a hiperalgesia inflamatória. Portanto, os objetivos desse trabalho foram: (1) Estudar o mecanismo pelo qual a ativa o dos receptores P2X3,2/3 pelo ATP endogeno contribui para a hiperalgesia mecânica induzida no modelo da inflamacça causada pela carragenina, (2) Verificar se o ATP end?eno e a ativado dos receptores P2X3,2/3 contribui para a hiperalgesia induzida pelos mediadores inflamatórios Bradicinina, TNF-a, IL-1ß, IL-6, CINC-1, PGE2 e dopamina e, verificar o mecanismo pelo qual essa contribuido ocorre, e (3) studar o mecanismo pelo qual a ativado dos receptores P2X1,3,2/3 induz hiperalgesia mecânica. De acordo com o objetivo (1): A co-administrado do antagonista seletivo de receptor P2X3,2/3, A-317491, ou do antagonista de receptor P2X1,3,2/3,1/5, TNP-ATP, com carragenina bloqueou a hiperalgesia mecânica...Observação: O resumo, na íntegra, poderá ser visualizado no texto completo da tese digital / Abstract: Activation of P2X3,2/3 receptors by endogenous ATP contributes to the evelopment of inflammatory hyperalgesia. Therefore, the aims of this study were: (1) To study the mechanism underlying activation of P2X3,2/3 receptors by endogenous ATP contributes to mechanical hyperalgesia induced by the carrageenan model of inflammation, (2) To verify whether endogenous ATP and P2X3,2/3 receptors activation contributes to the hyperalgesia induced by inflammatory mediators bradykinin, TNF-a, IL-1ß, IL-6, CINC-1, PGE2 and dopamine and, to verify the mechanism underlying this contribution occurs, (3) To study the mechanism underlying activation of P2X1,3,2/3 receptors induces mechanical hyperalgesia...Note: The complete abstract is available with the full electronic digital thesis or dissertations / Doutorado / Fisiologia Oral / Doutor em Odontologia

Os neutrófilos ou leucócitos polimorfonucleares (PMNs) são células fagocíticas com funções bactericida e fungicida altamente potentes. A destruição dos microrganismos invasores é realizada através da liberação de substâncias tóxicas presentes em seus grânulos e das espécies reativas de oxigênio (EROs) produzidas durante o metabolismo oxidativo dessas células. Apesar dos benefícios da atividade antimicrobiana, em situações de intensa ativação celular, a grande produção e liberação de compostos citotóxicos podem causar efeitos deletérios sobre os tecidos do hospedeiro, como parece ocorrer em doenças por imunocomplexos. O grande potencial dos antioxidantes para o tratamento e prevenção dessas doenças tem levado à pesquisa de novos compostos que atuam no processo inflamatório em que estão envolvidos os neutrófilos ativados. Dentre estes, destacam-se os naturais, em que se encontra a planta Baccharis dracunculifolia (Asteraceae), principal fonte botânica da própolis verde, sendo que a própolis possui diversas atividades biológicas conhecidas. Entretanto, a produção de metabólitos secundários pelas plantas pode ser modificada de acordo com fatores sazonais o que dificulta os estudos e pode acarretar em alterações de atividade biológica. Desta forma, este trabalho avaliou o efeito da sazonalidade no perfil químico de B. dracunculifolia e na atividade desta planta sobre o metabolismo oxidativo de PMNs. Para isso, extratos etanólicos brutos das folhas de B. dracunculifolia (EEBBd), colhidas mensalmente durante 14 meses foram submetidos à ensaios de cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), e avaliados quanto à capacidade de inibir a quimioluminescência dependente de luminol (QLlum) e de lucigenina (QLluc) produzida por PMNs estimulados. Além disso, para desvendar o(s) possível(is) mecanismo(s) de ação responsável(is) pela atividade antioxidante, foram realizados, com a amostra mais ativa em inibir a QL, ensaios para avaliar a citotoxicidade, a atividade scavenger de radicais livres (DPPH) e a ação sobre a atividade da enzima NADPH oxidase. Os resultados mostraram que todos os EEBBd inibiram tanto a QLlum quanto a QLluc de forma dependente da concentração e que para ambos os ensaios houve variação na eficiência deste efeito biológico ao longo do período de tempo estudado, demonstrando que a sazonalidade desempenhou um papel importante na intensidade da atividade antioxidante dos extratos. O ensaio de CLAE permitiu análise dos seguintes compostos: ácido caféico, ácido p-cumárico, aromadendrina-4-metil éter, isosakuranetina e artepilin C, e revelaram que apesar de não haver notória variação qualitativa entre os componentes, foi observada grande diferença quantitativa. As análises com a amostra do mês de maior atividade antioxidante (Maio/07) revelou que esta foi colhida durante um período de baixo índice pluviométrico, temperaturas amenas e apresentou a menor concentração da maioria dos compostos fenólicos estudados, evidenciando que tais compostos não foram os maiores responsáveis pela atividade biológica da amostra e que alguns desses compostos podem ter atuado como pró-oxidantes. Além disso, foi verificado que esta amostra atuou de forma não tóxica sobre as células, através da captação de parte das EROs geradas no meio reacional e de inibição parcial da atividade da NADPH oxidase. / Neutrophils or polymorphonuclear (PMN) are phagocytic cells with potent bactericidal and fungicidal functions. The destruction of invading microorganisms is made by the release of toxic substances contained within their granules and by the reactive oxygen species (ROS) produced during the oxidative metabolism of these cells. Despite the benefits of antimicrobial activity, in situations of intense cellular activation, large production and release of toxic compounds may cause deleterious effects on host tissue, as it seems to occur in immune complex diseases. The great potential of the antioxidants for the treatment and prevention of these diseases has led to the search of new compounds that act in the inflammatory process where are involved the activated neutrophils. Within this context, natural products are highlighted, mainly plants, among which is the Baccharis dracunculifolia (Asteraceae), the main botanical source of green propolis, which has several activities already known. However, secondary metabolites of plants can be modified according to seasonal factors, what can difficult the studies and alter the biological activity results. Thus, this study evaluated the effect of seasonality in the chemical profile of B. dracunculifolia and in the activity of this plant on the oxidative metabolism of PMNs. For this, crude ethanolic extracts of B. dracunculifolia leaves (CEEBd), harvested monthly for 14 months were analyzed in high performance liquid chromatography (HPLC) and evaluated for their ability to inhibit the luminol- and lucigenin-dependent chemiluminescence (CLlum and CLluc, respectively) produced by stimulated PMNs. In addiction, to understand the possible mechanisms of action responsible for antioxidant effect, the most active sample in the CL test was evaluated for the following proprieties: cytotoxic, scavenger of free radicals (DPPH) and action on the NADPH oxidase activity. The results showed that all CEEBd inhibited both CLlum and CLluc in a concentration-dependent manner and that in both trials it was found variation in the biological effect over the study period, indicating that the seasonality played an important role on the intensity of the antioxidant activity of the extracts. The HPLC assay allowed the analysis of the following compounds: caffeic acid, p-coumaric acid, aromadendrin-4\'-methyl ether, isosakuranetin and artepillin C, and showed that although there was no evident variation in qualitative profile, it was observed large quantitative differences. The analysis of the sample of greatest antioxidant activity (May/07) revealed that it was harvested during a period of low rainfall, mild temperatures and had lower concentrations of most compounds studied, indicating that these compounds were not the most responsible for the biological activity of the sample and that some of these substances may have acted as pro-oxidants molecules. Furthermore, it was found that this sample works in a non-toxic manner on cells, by capturing some of the ROS generated in the reaction medium and by partial inhibition of NADPH oxidase activity.

O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito da competição de triathlon na função e morte de neutrófilos de atletas de elite e investigar o possível envolvimento dos ácidos graxos livres (AGs) neste processo. Os neutrófilos foram obtidos do sangue coletado de 11 sedentários e de 12 triatletas em repouso e após competição de triathlon (Half Ironman, 2 Km de natação, 80 Km de ciclismo e 20 Km de corrida). A competição de triathlon aumentou a capacidade dos neutrófilos de migrar e de realizar burst oxidativo, porém inibiu a fagociose realizada por estas células. Além disso, induziu aumento da fragmentação de DNA e externalização de fosfatidilserina. A competição de triathlon aumentou a concentração de AGs no plasma dos triatletas e esta foi correlacionada positivamente com a proporção de neutrófilos com DNA fragmentado e fosfatidilserina externalizada. A elevação da concentração plasmática dos ácidos oléico, linoléico e esteárico induzida pela competição parece estar envolvida nas alterações funcionais e na apoptose verificadas após a competição de triathlon. / The objective of this study was to evaluate the effect of triathlon competition on function and death of neutrophils from elite athletes and to investigate the involvement of fatty acids in this process. Neutrophils were obtained from blood collected from eleven sedentary volunteers and twelve triathletes under rest and after a Half Ironman triathlon competition (2 Km swimming, 80 Km cycling and 20 Km running). The triathlon competition increased the migration and reactive oxygen species production in neutrophils, however it reduced the phagocytosis activity. Moreover, it induced neutrophils death possibly by apoptosis as indicated by DNA fragmentation and phosphatidylserine externalization. The increase in plasma levels of oleic, linoleic and stearic acids induced by the competition may be involved in modulation on neutrophil function and death.

Orientador: Nicola Amanda Conran Zorzetto / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-21T11:46:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DiasJunior_PedroPaulo_M.pdf: 932681 bytes, checksum: a8ceae0940e26759a4abe344de43b8f4 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: A resposta vascular inflamatória envolve a interação complexa entre células. A adesão dos neutrófilos aos sítios inflamatórios é constituído de várias etapas que envolvem a interação das moléculas de adesão com os neutrófilos, intermediado pela L-selectina (CD62L) e pelas integrinas ?2, LFA-1 e Mac-1 (CD11a/CD18 e CD11b/CD18) com ligantes sobre o endotélio. Os eritrócitos podem aderir ao endotélio vascular usando as moléculas de adesão CD 36 e integrina VLA-4 entre outras moléculas de adesão. O mecanismo de adesão das plaquetas envolve o sequestro celular no local da lesão tecidual através da interação de quatro receptores sinérgicos: a glicoproteína GPIb/IX (CD42b/CD42a), a integrina ?2?1 (GPIa/IIa; CD49b/CD41a), a integrina ?IIb?3 (GPIIb/IIIa; CD41a/CD61), e a integrina ?5?1 (GPIc/IIIa; CD51/CD61). Em doenças associadas com a inflamação vascular, tais como a doença falciforme e aterosclerose, alterações na adesão de leucócitos à parede vascular desempenham um papel central na fisiopatologia da doença. O CD40L e o LIGHT são proteínas citocinas pertencente ao fator de necrose tumoral (TNF), tendo como receptores o CD40L, LTBR e o HVEM, respectivamente. Diante disso, este estudo objetivou avaliar os efeitos das proteínas inflamatórias CD40L e LIGHT nas propriedades adesivas dos neutrófilos, hemácias e plaquetas. Os neutrófilos, hemácias e plaquetas foram separados do sangue periférico e foram realizados ensaios de adesão estática e citometria de fluxo após estimulo destas células com as proteínas recombinantes, CD40L e LIGHT. Após incubação com CD40L ou LIGHT, os neutrófilos e hemácias da circulação periférica apresentaram alterações quanto às propriedades adesivas em relação aos neutrófilos e hemácias não estimulados. As plaquetas estimuladas com as citocinas não demonstraram alteração nas propriedades adesivas. Neutrófilos incubados com anticorpos bloqueadores das integrinas Mac-1 e LFA-1 apresentaram uma reversão no aumento das propriedades adesivas após estimulo com CD40L ou LIGHT. Os neutrófilos estimulados com as citocinas apresentaram uma diminuição na expressão proteíca de CD62L, característica de ativação celular. Nao foi observado nenhuma diferença quanto a expressão das integrinas Mac-1 e LFA-1 nos neutrófilos após estímulo com as citocinas. Esses resultados sugerem que essas proteínas inflamatórias podem aumentar as propriedades adesivas de neutrofilos (intermediado por um aumento na afinidade das integrinas) e hemácias. A presença de altas concentrações destas citocinas na circulação, como encontrados em algumas patologias caracterizadas por inflamação vascular, pode resultar em conseqüências importantes, como a indução da adesão dos leucócitos e hemácias à parede vascular / Abstract: The vascular inflammatory response involves a complex interaction between cells. The adhesion of neutrophils to inflammatory sites is composed of several stages involving the interaction of adhesion molecules on neutrophils and on the endothelium. These interactions are mediated by Lselectin (CD62L) and the ?2 integrins, LFA-1 and Mac-1 (CD11a/CD18 and CD11b / CD18, respectively) with ligands on the endothelium. The red cells may adhere to vascular endothelial adhesion molecules using CD 36 and the VLA-4 integrin and other adhesion molecules. The mechanism of adhesion of platelets involves the adhesion of these cells at the site of tissue injury through the interaction of four synergistic receptors: glycoprotein GPIb/IX (CD42b/CD42a), integrin ?2?1 (GPIa/IIa; CD49b/CD41a), integrin ?IIb?3 (GPIIb / IIIa, CD41a/CD61), and integrin ?5?1 (GPIC/ IIIa; CD51/CD61). In diseases associated with vascular inflammation, such as sickle cell disease and atherosclerosis, changes in leukocyte adhesion to the vascular wall plays a central role in the pathophysiology of the disease. The CD40L and LIGHT cytokines are proteins belonging to the tumor necrosis factor (TNF) family, and interact with the receptors, CD40L, LTBR and HVEM, respectively. Thus, this study aimed to evaluate the effects of the inflammatory proteins, CD40L and LIGHT, on the adhesive properties of neutrophils, erythrocytes and platelets. Neutrophils, erythrocytes and platelets were separated from peripheral blood and static adhesion assays and flow cytometry were performed after stimulation of these cells with the recombinant proteins, CD40L and LIGHT. After incubation with CD40L or LIGHT, neutrophils and red blood cells from the peripheral circulation showed alterations in adhesive properties compared to unstimulated neutrophils and erythrocytes. Platelets stimulated with cytokines showed no changes in adhesive properties. Neutrophils incubated with antibodies that block the functions of integrins Mac-1 and LFA-1 reversed the increase in adhesive properties after stimulation with CD40L or LIGHT. Neutrophils stimulated with cytokines showed a decrease in the protein expression of CD62L, a characteristic of cellular activation. No difference was observed in the expression of the integrins Mac-1 and LFA-1 on neutrophils after stimulation with cytokines. These results suggest that these inflammatory proteins can increase the adhesive properties of neutrophils (mediated by an increase in the affinity of the integrin) and erythrocytes. The presence of high concentrations of these cytokines in the circulation, as found in certain vascular diseases characterized by inflammation, can result in important consequences, such as the induction of the adhesion of leukocytes and red blood cells to the vascular wall / Mestrado / Ciencias Biomedicas / Mestre em Ciências Médicas

Orientador: Carlos Amilcar Parada / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-27T14:12:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Rocha_LilianWunsch_D.pdf: 2264409 bytes, checksum: 95c935aebbbef2ad5593f1d56eb53bed (MD5) Previous issue date: 2015 / Resumo: Vimang® é um medicamento fitoterápico constituído pelo extrato aquoso da planta Mangifera indica L. Este medicamento é utilizado em Cuba para o tratamento de estresse e de doenças imunopatológicas, pois possui propriedade antioxidante reconhecida. O componente majoritário deste extrato é a mangiferina (cerca de 7%) e dados da literatura apontam que ambos, extrato e mangiferina, possuem atividade antinociceptiva. O objetivo deste trabalho foi verificar o potencial anti-hiperalgésico da mangiferina no tecido periférico e investigar seu possível mecanismo de ação em ratos. Para isso foram utilizados modelos de hiperalgesia inflamatória, tais como: hiperalgesia induzida pela carragenina (100 ?g/pata), epinefrina (1 ?g/pata) e pelos mediadores inflamatórios PGE2 (100 ng/pata), IL-1? (0,5 pg/pata) e CINC-1 (1 pg/pata). A hiperalgesia também foi induzida por ?,?-meATP (agonista de receptor P2X3)(50 ?g/pata) e 8-Br-cAMP (ativador de PKA) (0,01 ?g/pata). A avaliação da hiperalgesia mecânica foi realizada através de Von Frey eletrônico. O modelo de nocicepção aguda induzido pela capsaicina (0,5 ?g/pata) também foi realizado. Para complementar os experimentos comportamentais, foi realizada a dosagem de citocinas pró-inflamatórias IL-1?, TNF-? e CINC-1, a avaliação da migração de neutrófilos através da dosagem de mieloperoxidase, Western Blotting para COX-1 e COX-2 e ainda o teste de calcium imaging para verificar a possível interferência da mangiferina em receptores purinérgicos. Em todos os testes moleculares, a inflamação foi induzida pela carragenina e o tecido plantar da pata traseira dos ratos foi coletado 3 horas após a injeção intraplantar. Em todos os experimentos em que houve pré-tratamento com mangiferina, o mesmo foi realizado através de administração local, intraplantar. Para verificar a participação dos receptores purinérgicos no mecanismo de ação da mangiferina, no teste de calcium imaging, o influxo de cálcio in vitro foi induzido por ?,?-meATP. Os resultados demonstram que a mangiferina nas doses de 300, 600 e 1200 ?g/pata reduziu a hiperalgesia induzida pela carragenina de forma dose-dependente e sem apresentar efeito sistêmico, o qual foi avaliado através do limiar na pata contralateral. Para os demais experimentos foi utilizada a dose submáxima de 600 ?g/pata. A hiperalgesia mecânica induzida por epinefrina, IL-1? e CINC-1, mas não por PGE2, foi prevenida pela administração local de mangiferina. Também foi observado efeito da mangiferina reduzindo a nocicepção induzida pela capsaicina. No teste de ELISA, o pré-tratamento com mangiferina foi capaz de reduzir a concentração local da citocina TNF-? e da quimiocina CINC-1 induzida pela carragenina; porém, os níveis de IL-1? mantiveram-se inalterados. A migração de neutrófilos também foi avaliada e o tratamento local com mangiferina reduziu a migração de neutrófilos induzida pela carragenina para o tecido plantar. Os resultados obtidos através da dosagem das proteínas COX-1 e COX-2 por Western Blotting demonstraram que o tratamento local com mangiferina não altera a expressão destas proteínas. Na avaliação in vitro da atividade da mangiferina em inibir o influxo de cálcio induzido pelo ?,?-meATP não houveram resultados positivos, ou seja, a mangiferina não causou dessensibilização nos neurônios. Tomados em conjunto, os resultados demonstram que a mangiferina possui atividade anti-hiperalgésica e possivelmente esta ação esteja relacionada com a sua habilidade em reduzir citocinas que são essenciais para o desenvolvimento da hiperalgesia inflamatória / Abstract: Vimang® is an herbal medicine constituted by the aqueous extract of Mangifera indica L plant. It is used in Cuba for the treatment of stress and immunopathological diseases because it has recognized antioxidant properties. The major component of this extract is mangiferin (about 7%) and literature data indicates that both, extract and mangiferin, have antinociceptive activity. The aim of this study was to evaluate the antihyperalgesic potential of mangiferin in peripheral tissue and investigate its possible mechanism of action in rats. Were used inflammatory hyperalgesia models such as carrageenan-induced hyperalgesia (100 ?g/paw), epinephrine (1 ?g/paw) and the inflammatory mediators PGE2 (100 ng/paw), IL-1? (0.5 pg/ paw) and CINC-1 (1 pg/paw). Hyperalgesia was also induced by ?,?-meATP (P2X3 receptor agonist) (50 ?g/paw) and 8-Br-cAMP (PKA activator) (0.01 ?g/paw). The evaluation of mechanical hyperalgesia was performed using Electronic Von Frey. The acute model of nociception induced by capsaicin (0.5 ?g/paw) was also performed. In addition to the behavioral experiments, the dosage of pro-inflammatory cytokines IL-1?, TNF-? and CINC-1 was performed, evaluation of the migration of neutrophils through the myeloperoxidase dosage, Western Blotting for COX-1 and COX-2, and the calcium imaging test to check possible interference of mangiferin in purinergic receptors. In all molecular tests, inflammation was induced by carrageenan and the plantar tissue of the hind paw of the rats was collected 3 hours after intraplantar injection. In all experiments in which there was pretreatment with mangiferin, it was conducted by local administration, intraplantar. To verify the involvement of the purinergic receptors in the mangiferin mechanism of action, using calcium imaging test, in vitro calcium influx was induced by ?, ?-meATP. The results demonstrate that mangiferin at doses of 300, 600 and 1200 ?g/paw reduced carrageenan-induced hyperalgesia in a dose-dependent manner and without providing systemic effect, which was evaluated through the threshold of the contralateral paw. For other experiments the submaximal dose of 600 ?g/paw was used. Mechanical hyperalgesia induced by epinephrine, IL-1? and CINC-1, but not by PGE2, was prevented by local administration of mangiferin. It was also observed mangiferin effect of reducing the capsaicin-induced nociception. In the ELISA test, the mangiferin pretreatment reduced the local concentration of the cytokine TNF-? and chemokine CINC-1, however, IL-1? levels were unchanged. The neutrophil migration was also assessed and local treatment with mangiferin reduced neutrophil migration induced by carrageenan into the plantar tissue. The results obtained with the COX-1 and COX-2 proteins dosage by Western Blotting demonstrated that local treatment with mangiferin did not alter the expression of these proteins. In vitro evaluation of the activity of mangiferin in inhibiting calcium influx induced by ?, ?-meATP there were no positive results, mangiferin did not cause desensitization in neurons. Taken together, the results show that mangiferin has anti-hyperalgesic activity and possibly this action is related to its ability to reduce cytokines that are essential to the development of inflammatory hyperalgesia / Doutorado / Fisiologia / Doutora em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Marco Antônio Alvarenga / Resumo: A endometrite persistente pós cobertura (EPPC) é uma das principais causas de infertilidade na égua devido uma inflamação exacerbada uterina pós cobertura/Inseminação Artificial (IA) diminuindo os índices de fertilidade. O uso do meio condicionado por células tronco mesenquimais demonstra grande efetividade na modulação inflamatória, podendo ser uma alternativa no tratamento e EPPC. O objetivo desse trabalho foi avaliar pela primeira vez diferentes concentrações de meio condicionado (MC) por células tronco mesenquimais equinas sobre a cinética espermática equina e capacidade imunomodulatória do MC na inflamação uterina pós IA em éguas resistentes e susceptíveis assim como sua fertilidade. Foram realizados 2 experimentos. No experimento 1 foi avaliado o efeito da adição de diferentes concentrações de MC sobre a cinética e integridade espermática equina. No Experimento 2 foi avaliado in vivo a capacidade moduladora do MC sobre o processo inflamatório endometrial de éguas resistentes e susceptíveis após inseminação artificial. O MC alterou o VCL (P<0,05) porém não alterou o restante dos parâmetros da cinética espermática (P>0,05). A integridade de membrana plasmática do sêmen equino não foi alterada (P<0,05). O MC reduziu a porcentagem de células polimorfonucleares (PMN) em éguas resistentes 6 horas após a inseminação artificial (P<0,05). Nas éguas susceptíveis o MC diminuiu as porcentagens de PMN e fluido intrauterino 6 e 24 horas após IA (p<0,05), com incremento na fertilidade... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Persistent mating-induce endometritis (PMIE) is a major cause of subfertility in the mare due to exacerbated uterine inflammation post breeding, so therapies have been studied to immunomodulate the inflammatory response. The objective of this work was to evaluate different concentrations of conditioned medium (MC) by equine mesenchymal stem cells on equine sperm kinetics and MC immunomodulatory capacity in uterine inflammation after breeding in resistant and susceptible mares as well as their fertility. Two experiments were performed. In experiment 1 the effect of the addition of different MC concentrations on the equine sperm kinetics and integrity was evaluated. In Experiment 2, the modulatory capacity of MC on the endometrial inflammatory process of resistant and susceptible mares after artificial insemination was evaluated, as well as its effect on conception rates. The MC did not significantly alter sperm kinetics and plasma membrane integrity of equine semen. Even in resistant mares MC reduced the percentage of neutrophils 6 hours after artificial insemination (p <0.05), not negatively interfering with fertility. In susceptible mares, MC decreased the percentages of neutrophils and intrauterine fluid 6 and 24 hours after AI (p <0.05). It was concluded that equine MC does not negatively affect the quality of equine semen or its fertility, modulating the inflammatory response after coverage in resistant and susceptible mares. / Mestre

Os neutrófilos desempenham um papel fundamental na defesa do organismo contra microrganismos invasores, através da fagocitose, da degranulação e da produção de espécies reativas de oxigênio (EROs), sendo que esta última é decorrente da ativação do metabolismo oxidativo dos neutrófilos. As EROs produzidas, tais como O2&#8729;-, H2O2, HO&#8729;, HOCl, 1O2 e NO, que são essenciais para matar os microrganismos fagocitados, podem também ser liberadas para o meio extracelular e causar lesões oxidativas aos tecidos do hospedeiro. Essas lesões têm sido implicadas na patogênese de doenças como aterosclerose, câncer, artrite reumatóide, pneumonia e enfisema pulmonar. Com o intuito de prevenir essas lesões oxidativas, tem-se investigado a atividade antioxidante de diversos compostos, especialmente os derivados de plantas. Neste trabalho foram avaliadas as atividades de oito cumarinas simples (compostos 1 a 8) sobre o metabolismo oxidativo de neutrófilos de coelho estimulados com Zimosan opsonizado, empregando-se os ensaios de quimioluminescência (QL) dependente de lucigenina (QLluc) e de QL dependente de luminol (QLlum). A QLluc reflete a produção apenas de O2&#8729;- , enquanto que a QLlum é resultante da oxidação do luminol pelas diversas EROs produzidas pelos neutrófilos estimulados. Assim, a inibição da QLluc e da QLlum será decorrente da redução da concentração das EROs responsáveis pela oxidação da lucigenina e do luminol no meio de reação, respectivamente. Foram avaliadas também a atividade dos antioxidantes a-tocoferol, butil-hidroxitolueno (BHT) e quercetina sobre a QLlum e a QLluc, e a toxicidade das cumarinas 1 a 8 e dos três antioxidantes citados sobre os neutrófilos de coelho. Determinou-se o coeficiente de partição e o volume molecular das cumarinas 1 a 8. Dentre os três antioxidantes, observou-se que a quercetina inibiu tanto a QLlum quanto a QLluc, e não foi tóxica para os neutrófilos, na concentração de 50 mmol/L. O a-tocoferol não inibiu a QLlum nem a QLluc, enquanto o BHT foi tóxico para os neutrófilos de coelho. Para as cumarinas simples, observou-se que: (1) a cumarina 1 não apresentou atividade inibitória sobre a QLluc e sobre a QLlum; (2) as cumarinas 3, 4, 5 e 6 tiveram atividades inibitórias sobre a QLluc semelhantes à da quecetina, que foram maiores que as das cumarinas 2, 7 e 8; (3) as atividades inibitórias das cumarinas 2 a 8 sobre a QLluc não estão relacionadas à lipofilicidade e ao volume molecular desses compostos, nem à toxicidade dos mesmos sobre os neutrófilos de coelho; (4) as cumarinas 3 e 4 provocaram aumento da QLlum medida, enquanto as demais não tiveram atividade neste sistema. / Neutrophils play a crucial role in the defense of the organism against invading microorganisms, thorough phagocytosis, degranulation and generation of reactive oxygen species (EROS). The last one is a consequence of activation of neutrophils\' oxidative metabolism. The produced EROs, such as O2&#8729;-, H2O2, HOCl, HO&#8729;, 1O2 and NO, which are essential for killing phagocyted microorganisms, may also be released to the extracellular milieu and inflict oxidative damage to host tissues. This damage has been implicated in the pathogenesis of diseases, such as arteriosclerosis, cancer, rheumatoid arthritis, pneumonia and lung emphysema. The antioxidant activity of many compounds, especially those obtained from plants, has been investigated with the aim of avoid such oxidative damage. In this work, we studied the activity of eight simple coumarins (compounds 1 to 8) on the oxidative metabolism of rabbit neutrophils upon stimulation by opsonized zymosan, using luminol- (QLlum) and lucigenin (QLluc)-enhanced chemiluminescence (QL) assays. QLluc reflects generation of O2&#8729;- only, whereas QLlum is a result of luminol oxidation by the various EROs produced by the stimulated neutrophils. Inhibition of QLluc and of QLlum will be a consequence of the decrease of the concentration of that EROs which are involved in the oxidation of lucigenin and luminol, respectively, in the reaction medium. We also evaluated the activity of the antioxidants a-tocopherol, butyl-hydroxytoluene (BHT) and quercetin on QLlum and QLluc, and the toxicity of coumarins 1 to 8 and the three antioxidants on rabbit neutrophils. Partition coefficient and molecular volume values of coumarins 1 to 8 were determined. We observed that, among the three antioxidants, quercetin inhibited QLlum and QLluc, and was not toxic to the neutrophils at concentration of 50 mmol/L. BHT was toxic to the rabbit neutrophils whereas a&#61485;-tocopherol did not inhibit QLlum nor QLluc. For the simple coumarins we observed that: (1) coumarin 1 did not inhibit QLlum nor QLluc; (2) coumarins 3, 4, 5 and 6 had inhibitory effects, which were similar to the quercetin and higher than coumarins 2, 7 and 8; (3) the inhibitory activities of coumarins 2 to 8 on QLluc were not related to the lipophilicity and to the molecular volume of these compounds, nor to their toxicity upon the rabbit neutrophils; (4) coumarins 3 and 4 increased the QLlum, whereas the others had no effect on this system.