O tabaco é uma das principais drogas consumidas mundialmente e seu uso por mulheres em idade reprodutiva, em particular, têm representado uma grande preocupação por parte de especialistas e da sociedade em geral. Apesar dos efeitos adversos associados ao ato de fumar durante a gestação serem bastante documentados e conhecidos, sabe-se que uma parcela de mulheres grávidas tem dificuldades em abandonar o hábito. A exposição fetal aos constituintes do tabaco tem sido associada com aumento do risco de aborto espontâneo e nascimentos prematuros, incidência de recém-nascidos com baixo peso, síndrome de morte súbita infantil e desordens cognitivas e neurocomportamentais. Entretanto, devido ao sentimento de culpa e medo de ações punitivas, mulheres raramente admitem terem utilizado tabaco durante a gestação. Como resultado, uma série de marcadores biológicos tem sido estudada para se diagnosticar a exposição fetal aos constituintes do tabaco. Dentre os marcadores utilizados estão a nicotina e o seu principal produto de biotransformação, a cotinina, que podem ser detectados em amostras de mecônio de recém-nascidos. No presente estudo, um método analítico foi desenvolvido visando à detecção desses marcadores em amostras de mecônio. Foi considerada neste projeto a técnica de extração acelerada por solvente (ASE) por ser uma técnica promissora para o preparo de amostras sólidas e/ou semi-sólidas. Os analitos foram identificados por cromatografia em fase-gasosa com detector de nitrogênio e fósforo (GC/NPD). Os limites de detecção foram de 3 ng/g e 30 ng/g e os de quantificação foram de 5 ng/g e 40 ng/g, para cotinina e nicotina respectivamente, e apresentaram boa linearidade na faixa de concentração estudada (5-500 ng/g), com coeficiente de correlação (r2) maior que 0,98. A precisão intra-ensaio, determinada pelo coeficiente de variação do método (CV%) foi menor que 15% e a precisão interensaio foram menor ou igual a 20% para nicotina e cotinina. A recuperação média foi de 77%. O método desenvolvido demonstrou ser rápido, preciso, prático e sensível e com uso de menores volumes de solventes orgânicos do que outros métodos descritos na literatura. O método desenvolvido e validado foi aplicado em amostras de mecônio de neonatos com suspeita ou não de exposição fetal aos constituintes do tabaco. / Tobacco is one of the main drugs consumed worldwide and its use by women of reproductive age in particular has played a major concern among experts and society in general. Despite the adverse effects associated with smoking during pregnancy are well documented, it is known that a significant proportion of pregnant women have difficulties to quit the habit. Fetal exposure to tobacco constituents has been associated with increased risk of spontaneous abortion (miscarriage) and premature births, incidence of newborns with low birth weight, sudden infant death syndrome and neurobehavioral and cognitive disorders. However, due to guilt and fear of punitive actions, women rarely admit to have used tobacco during pregnancy. As a result, a series of biological markers have been studied to diagnose fetal exposure to tobacco constituents. Nicotine and cotinine are some of these biomarkers which can be detected in meconium samples from newborns. In this study, an analytical method was developed to detect these biomarkers in meconium samples. Accelerated solvent extraction (ASE), a promising technique for solid or semi-solid sample preparation, was considered in this work the that is considered a. The analytes were identified by gas-chromatography with nitrogen phosphorus detector (GC / NPD). The limits of detection (LOD) were 3 ng/g and 30 ng/g and the limits of quantification (LOQ) were 5 ng/g and 40 ng/g for cotinine and nicotine, respectively. The method showed good linearity in the concentration range studied (5-500 ng/g), with a coefficient of correlation (r2) greater than 0.98. The intraday precision, determined by the coefficient of variation (CV %) was less than 15% and the interday precision was less or equal than 20% for nicotine and cotinine. The average recovery was 77%. The method proved to be fast, accurate, practical and sensitive and smaller volumes of organic solvents are necessary, compared to other methods published in the scientific literature. The developed and validated method was applied to meconium samples of suspected and nonsuspected neonates of having been exposed to tobacco constituents during gestation.

A nicotina é um alcalóide extraído da planta do tabaco e age como agonista em neurônios e outras células que expressam receptores nicotínicos. Essa substância é capaz de atravessar a barreira hematoencefálica e mimetizar os efeitos da acetilcolina endógena ao interagir com os diferentes subtipos de receptores. O hipocampo e o cerebelo são regiões encefálicas ricas em receptores nicotínicos como o alfa7 e o alfa42 que estão também envolvidos na progressão de doenças neurodegenerativas, como a doença de Alzheimer, e neuropsiquiátricas, como a esquizofrenia, ambas apresentando um contexto inflamatório. O lipopolissacarídeo (LPS) é um indutor inflamatório que age via receptor toll-4 (TLR-4) ativando, dentre outros, o fator de transcrição NF-capaB. Vários estudos têm demonstrado tanto in vitro quanto in vivo que a exposição crônica à nicotina inibe a resposta imune. Uma vez que o fator de transcrição NF-capaB regula a expressão gênica de diversos fatores que medeiam a plasticidade e o desenvolvimento neuronal e inflamação, nosso objetivo foi avaliar os efeitos da nicotina crônica sobre a via de sinalização induzida pelo LPS. Sendo assim, avaliou-se a translocação nuclear do NF-capaB, a expressão de indutores inflamatórios (TNF, IL-1 e iNOS) e também do receptor TLR-4 tanto no hipocampo quanto no cerebelo. Além disso, foram determinados os níveis plasmáticos das citocinas TNF, IL-1, MIP-1alfa, CINC2alfa/. Nossos resultados mostram que, perifericamente, o LPS induziu a produção das citocinas plasmáticas, mas a nicotina não foi capaz de reverter seus efeitos. Já no cerebelo e no hipocampo, a nicotina crônica (0,1 e 1,0 mg/kg) interferiu significativamente na translocação do NF-capaB induzida pelo LPS, levando inclusive a um bloqueio importante da expressão do mRNA de TNF, IL-1, iNOS no hipocampo, e de IL-1 no cerebelo. Ademais, no hipocampo, a nicotina também interferiu na expressão do receptor TLR-4. A mecamilamina, antagonista heteromérico não-seletivo não foi capaz de reverter os efeitos da nicotina sobre o NF-capaB no hipocampo, mas o fez no cerebelo. Já o antagonista seletivo de receptor alfa 7, metililaconitina, bloqueou a ação da nicotina no hipocampo. / Nicotine is an alkaloid extracted from Tobacco plants, and it acts as an agonist in neurons and other cells that express nicotinic receptors. This substance crosses the blood brain barrier and mimics endogenous acetylcholine in interacting with various receptor subtypes. The hippocampus and cerebellum are brain regions rich in nicotinic receptors including 7, 42 and other subtypes, involved in neurodegenerative and neuropsychiatric disorders, including Alzheimer disease and schizophrenia, respectively, in a neuroinflammatory context. The lipopolysaccharide (LPS) is a known inflammatory inducer that exerts its effects through the Toll-like receptor 4 (TLR-4) and activates the transcription factor NF-capaB. In the present work, we evaluate the effects of chronic nicotine on the nuclear translocation of NF-capaB, on the expression of NF-capaB regulated inflammatory inducers (TNF, IL-1 and iNOS) and on the LPS-induced TLR4 mRNA expression in response to chronic nicotine treatment in hippocampus and cerebellum. In addition, we accessed the production of peripheral cytokines (TNF, IL-1, MIP-1, CINC 2/). Our results demonstrate that LPS induced the production of peripheral cytokines but nicotine treatment did not interfere in their plasma levels. However, in cerebellum and hippocampus, chronic nicotine 1.0 and 0.1 mg/kg interfered in the LPS-induced NF-capaB leading to a deficient mRNA expression of its related genes TNF, IL-1 and iNOS in hippocampus and of IL-1, in cerebellum. Chronic nicotine (0.1 mg/kg, s.c.) significantly interfered in the TLR4 mRNA expression in LPS-challenged animal group in hippocampus. The non-selective heteromeric antagonist mecamylamine (1.0 mg/kg s.c.) reverted the nicotine effects over NF-capaB nuclear translocation in cerebellum, but not in hippocampus. On the other hand, the 7 antagonist methyllycaconitine (MLA) (5.0 mg/kg i.p.) reverted the nicotine effects over NF-capaB in hippocampus but not in cerebellum. Nicotine prevents LPS effects, both in cerebellum and hippocampus, once it reduced significantly the nuclear translocation of NF-capaB and the expression of related pro-inflammatory cytokines. Besides, the nicotinic effects seem to be mainly mediated by heteromeric receptors in cerebellum and through 7 receptors in hippocampus.

The CHRNA5/A3/B4 genomic cluster encodes for the alpha5, alpha3 and beta4 subunits of the nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs). Human genetic studies have revealed a significant association of variants in this genomic region with nicotine dependence. However, the mechanisms through which overexpression of these three subunits may influence smoking-related behaviours is not understood. To gain insight in the possible mechanisms, we used a BAC transgenic mouse model overexpressing this cluster containing the three genes together with their transcriptional regulatory elements. We found that overexpression of the cluster: i) increases sensitivity to the pharmacological effects of nicotine; ii) modifies particular cognitive domains associated to drug addiction and hippocampal neuronal complexity and synaptic plasticity; and iii) shifts the rewarding and aversive properties of nicotine and the manifestation of nicotine-withdrawal syndrome. Our study suggests that the genomic cluster CHRNA5/A3/B4 contributes to genetic vulnerability to nicotine addiction and promotes smoking-related behaviours possibly through hippocampal plasticity changes. / El cluster genòmic CHRNA5/A3/B4 codifica per les subunitats alfa5, alfa3 i beta4 dels receptors d’acetilcolina (nAChRs). Estudis de genètica humana han revelat que variants en aquesta regió genòmica estan significativament associats a la dependencia a nicotina. Malauradament, els mecanismes pels quals la sobreexpressió d’aquestes tres subunitats influencia comportaments relacionats amb el consum de tabac no són del tot coneguts. Per tal d’entendre els possibles mecanismes, hem utilitzat un model de ratolí transgènic que sobreexpressa aquest cluster amb els tres gens i les seus elements de regulació transcripcional. Hem trobat que la sobreexpressió del cluster: i) incrementa la sensibilitat als efectes farmacològics de la nicotina; ii) modifica determinats dominis cognitius associats a l’addicció a droges i la complexitat neuronal i plasticitat sinàpica de l’hipocamp; a més a més iii) canvia les propietats de recompensa i aversió de la nicotina i la manifestació del síndrome d’abstinència. El nostre estudi suggereix que el cluster genòmic CHRNA5/A3/B4 contribueix a la vulnerabilitat genètica a l’adicció a la nicotina i promou comportaments relacionats amb el consum de tabac possiblement a través de canvis de plasticitiat a l’hipocamp.

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro / Adolescentes humanos frequentemente associam o fumo do tabaco ao consumo de bebidas alcoólicas. A despeito desta associação, pouco se sabe sobre a neurobiologia básica da coexposição no cérebro adolescente. No presente estudo, avaliamos os efeitos da exposição, que ocorreu do 30 ao 45 dia de vida pós natal (PN30 a PN45), à nicotina e/ou ao etanol durante a adolescência (PN38-45) e da retirada (PN50-57) na memória visuoespacial através do Labirinto Aquático de Morris (LAM: 6 sessões + 1 prova, 3 tentativas/sessão, latência = 2 min), em 4 grupos de camundongos Suíços machos e fêmeas: (1) exposição concomitante à NIC [solução de nicotina free base (50 μg/ml) em sacarina a 2% para beber] e ETOH [solução de etanol (25%, 2 g/kg) injetada i.p. em dias alternados]; (2) exposição à NIC; (3) exposição ao ETOH; (4) veículo (VEH). Uma vez que os resultados comportamentais podem sofrer a interferência de alterações motoras, avaliamos (a) a atividade locomotora no Teste de Campo Aberto (sessão única, 5 min) e (b) a coordenação e o equilíbrio no Teste de Locomoção Forçada sobre Cilindro Giratório (5 tentativas, latência = 2 min). Para os efeitos da exposição à NIC e/ou ao ETOH na eficiência do transporte de aminoácidos excitatórios, avaliamos a captação de [3H] D-aspartato no hipocampo. A expressão do transportador glial GLAST/EAAT1 foi avaliada por Western-blot. Durante a exposição, animais ETOH e NIC+ETOH apresentaram déficits de memória nas sessões de teste e de prova no LAM enquanto, na retirada, os grupos NIC e NIC+ETOH apresentaram prejuízos na retenção. Não houve diferenças significativas entre os grupos de tratamento em nenhum dos parâmetros testados em ambos os testes motores, tanto na exposição quanto na abstinência. Os grupos NIC, ETOH e NIC+ETOH tiveram uma diminuição significativa na captação de [3H] D-aspartato ao final do período de exposição, com uma normalização da atividade dos EAATs na retirada das drogas. O tratamento com NIC e ETOH reduziu ainda a expressão de GLAST/EAAT1 no hipocampo em ambas as idades testadas. O uso de etanol na adolescência causa prejuízos à memória de camundongos, com um efeito negativo mais acentuado quando associado à nicotina. Contudo, a retirada da nicotina apresentou um efeito mandatório nos danos encontrados. Ambas as drogas, isoladamente ou na coexposição, alteram os níveis de atividade e expressão dos EAATs, sugerindo que os resultados bioquímicos estejam implicados nas alterações comportamentais encontradas. / Human adolescents frequently associate tobacco smoke and alcoholic drinks. Despite this association, little is known about the basic neurobiology of co-exposure in the adolescent brain. In the present study, we assessed the effects of nicotine and/or ethanol exposure (postnatal days 30 to 45: PN30-45) during adolescence (PN38-45) and withdrawal (PN50-57) on visuospacial memory through the Morris Water Maze (MWM: 6 sessions + 1 probe, 3 trials/session, latency = 2 min), in four groups of male and female Swiss mice: (1) Concomitant NIC [nicotine free base solution (50g/ml) in 2% saccharin to drink] and ETOH [ethanol solution (25%, 2g/kg) i.p. injected every other day] exposure; (2) NIC exposure; (3) ETOH exposure; (4) Vehicle (VEH). Once behavioral results can be affected by motor disorders, we assessed (a) locomotor activity through the Open field Test (one session, 5 min) and (b) coordination and balance through the ROTAROD Test (5 trials, latency = 2 min). To investigate the effects of NIC and/or ETOH exposure on the efficiency on excitatory amino acid transport, we assessed the [3H] D-aspartate uptake in mice hippocampus. The GLAST/EAAT1, a glial transporter, was assessed by Western-blot technique. During exposure, ETOH and NIC+ETOH animals showed deficits on memory through the session and probe trial in WMW while, during withdrawal, NIC and NIC+ETOH groups showed impairments on retention. There were no significant differences between the experimental groups in any parameters assessed in both motor tests, either during exposure and withdrawal. There was a significant decrease in the [3H] D-aspartate for NIC, ETOH and NIC+ETOH groups in the end of exposure, turning to the normal levels of EAATs activity during withdrawal. The NIC and ETOH treatment decreased the GLAST/EAAT1 expression on hippocampus in all ages tested. Ethanol use leads to memory impairments in adolescent mice, with more preeminent effects when associated to nicotine. However, the nicotine withdrawal showed a mandatory effect on memory impairments. Both drugs, singly or in co-exposure, alter activity and expression of EAATs, which suggests that biochemical results may be associated to the behavioral alterations.

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:13Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-07-30 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Introdução: Diversos fatores podem diminuir a viabilidade do retalho TRAM, dentre eles a nicotina que tem sido responsabilizada pela perda parcial ou total destes retalhos. Objetivo: Avaliar a ação do Fator de Crescimento do Endotélio Vascular na viabilidade do Retalho Musculofasciocutâneo Transverso do Reto do Abdome, em ratos submetidos à nicotina. Métodos: Foram utilizados 60 Ratos Wistar EPM-1, machos adultos, pesando de 230 a 300g, aleatorizados em 4 grupos de 15 animais cada: Grupo Controle composto por animais que foram submetidos ao retalho TRAM; Grupo Nicotina composto por animais que foram submetidos á nicotina e ao retalho TRAM; Grupo VEGF composto por animais submetidos à administração de VEGF plasmidial antes do retalho TRAM; e Grupo Nicotina+VEGF composto por animais que foram submetidos à nicotina, tratados com administração de VEGF e submetidos ao retalho TRAM. Para análise dos resultados foi realizado método de análise da área de necrose e de densidade vascular. Resultados: Houve diferença estatisticamente significativa na comparação entre todos os grupos, com relação às variáveis área de necrose e densidade vascular (p<0,05). Os animais do Grupo VEGF apresentaram a menor área de necrose (4.10%) e a maior densidade vascular (39%) em relação aos outros grupos do estudo. Conclusão: O Fator de Crescimento do Endotélio Vascular aumentou a viabilidade do retalho musculofasciocutâneo transverso do reto do abdome, em ratos submetidos à nicotina. / Introduction: Several factors can reduce the viability of the TRAM flap, among them the nicotine has been made responsible by the loss partial or total of these flaps. Objective: To evaluate the action of the Vascular endothelial Growth Factor in the viability of the Transverse Rectus Abdominis Musculocutaneous, in rats submitted to the nicotine. Methods: Sixty Wistar EPM-1 rats were used, adult males, weighing from 230 to 300g, randomized in 4 groups of 15 animals each: Group Control composed by animals that were submitted to the TRAM flap; Group Nicotine composed by animals that were nicotine exposed and submitted of TRAM flap; Group VEGF composed by animals submitted to the administration of VEGF plasmidial before the TRAM flap; and Group Nicotina+VEGF composed by animals that were exposed to the nicotine, trated with administration of VEGF and submitted to the TRAM flap. For analysis of the results they were done necrosis area and vascular density. Results: There was estatistic significant differentiates in the comparison among all of the groups, regarding the variables necrosis area and vascular density (p <0,05). Conclusion: The Vascular Endothelial Growth Factor increased the viability of the Transverse Rectus Abdominis Musculocutaneous, in rats submitted to the nicotine. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro / Adolescentes humanos frequentemente associam o fumo do tabaco ao consumo de bebidas alcoólicas. A despeito desta associação, pouco se sabe sobre a neurobiologia básica da coexposição no cérebro adolescente. No presente estudo, avaliamos os efeitos da exposição, que ocorreu do 30 ao 45 dia de vida pós natal (PN30 a PN45), à nicotina e/ou ao etanol durante a adolescência (PN38-45) e da retirada (PN50-57) na memória visuoespacial através do Labirinto Aquático de Morris (LAM: 6 sessões + 1 prova, 3 tentativas/sessão, latência = 2 min), em 4 grupos de camundongos Suíços machos e fêmeas: (1) exposição concomitante à NIC [solução de nicotina free base (50 &#956;g/ml) em sacarina a 2% para beber] e ETOH [solução de etanol (25%, 2 g/kg) injetada i.p. em dias alternados]; (2) exposição à NIC; (3) exposição ao ETOH; (4) veículo (VEH). Uma vez que os resultados comportamentais podem sofrer a interferência de alterações motoras, avaliamos (a) a atividade locomotora no Teste de Campo Aberto (sessão única, 5 min) e (b) a coordenação e o equilíbrio no Teste de Locomoção Forçada sobre Cilindro Giratório (5 tentativas, latência = 2 min). Para os efeitos da exposição à NIC e/ou ao ETOH na eficiência do transporte de aminoácidos excitatórios, avaliamos a captação de [3H] D-aspartato no hipocampo. A expressão do transportador glial GLAST/EAAT1 foi avaliada por Western-blot. Durante a exposição, animais ETOH e NIC+ETOH apresentaram déficits de memória nas sessões de teste e de prova no LAM enquanto, na retirada, os grupos NIC e NIC+ETOH apresentaram prejuízos na retenção. Não houve diferenças significativas entre os grupos de tratamento em nenhum dos parâmetros testados em ambos os testes motores, tanto na exposição quanto na abstinência. Os grupos NIC, ETOH e NIC+ETOH tiveram uma diminuição significativa na captação de [3H] D-aspartato ao final do período de exposição, com uma normalização da atividade dos EAATs na retirada das drogas. O tratamento com NIC e ETOH reduziu ainda a expressão de GLAST/EAAT1 no hipocampo em ambas as idades testadas. O uso de etanol na adolescência causa prejuízos à memória de camundongos, com um efeito negativo mais acentuado quando associado à nicotina. Contudo, a retirada da nicotina apresentou um efeito mandatório nos danos encontrados. Ambas as drogas, isoladamente ou na coexposição, alteram os níveis de atividade e expressão dos EAATs, sugerindo que os resultados bioquímicos estejam implicados nas alterações comportamentais encontradas. / Human adolescents frequently associate tobacco smoke and alcoholic drinks. Despite this association, little is known about the basic neurobiology of co-exposure in the adolescent brain. In the present study, we assessed the effects of nicotine and/or ethanol exposure (postnatal days 30 to 45: PN30-45) during adolescence (PN38-45) and withdrawal (PN50-57) on visuospacial memory through the Morris Water Maze (MWM: 6 sessions + 1 probe, 3 trials/session, latency = 2 min), in four groups of male and female Swiss mice: (1) Concomitant NIC [nicotine free base solution (50g/ml) in 2% saccharin to drink] and ETOH [ethanol solution (25%, 2g/kg) i.p. injected every other day] exposure; (2) NIC exposure; (3) ETOH exposure; (4) Vehicle (VEH). Once behavioral results can be affected by motor disorders, we assessed (a) locomotor activity through the Open field Test (one session, 5 min) and (b) coordination and balance through the ROTAROD Test (5 trials, latency = 2 min). To investigate the effects of NIC and/or ETOH exposure on the efficiency on excitatory amino acid transport, we assessed the [3H] D-aspartate uptake in mice hippocampus. The GLAST/EAAT1, a glial transporter, was assessed by Western-blot technique. During exposure, ETOH and NIC+ETOH animals showed deficits on memory through the session and probe trial in WMW while, during withdrawal, NIC and NIC+ETOH groups showed impairments on retention. There were no significant differences between the experimental groups in any parameters assessed in both motor tests, either during exposure and withdrawal. There was a significant decrease in the [3H] D-aspartate for NIC, ETOH and NIC+ETOH groups in the end of exposure, turning to the normal levels of EAATs activity during withdrawal. The NIC and ETOH treatment decreased the GLAST/EAAT1 expression on hippocampus in all ages tested. Ethanol use leads to memory impairments in adolescent mice, with more preeminent effects when associated to nicotine. However, the nicotine withdrawal showed a mandatory effect on memory impairments. Both drugs, singly or in co-exposure, alter activity and expression of EAATs, which suggests that biochemical results may be associated to the behavioral alterations.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:22:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 4914.pdf: 6126867 bytes, checksum: 84adde1d63af407ef40d3973b9aaaaeb (MD5) Previous issue date: 2013-03-08 / Financiadora de Estudos e Projetos / Tobacco and ethanol are the most used drugs in the world and often co-abused. An important issue in the field of drug abuse research is the characterization of risk factors related to increased vulnerability to drug addiction. In the present study we investigated in rats: a) the effects of exposure to variable stress on nicotine-induced locomotor activation, CREB and ERK activities in the prefrontal cortex, nucleus accumbens and amygdala and nicotine intravenous self-administration; b) whether previous exposure to cocaine could affect nicotine seeking behaviors, and if this phenomenon could be related to alterations in the BDNF, TrkB, DYN, Mi-Opio, NPY and CRFR1 gene expression in the nucleus accumbens; c) whether repeated nicotine treatment could induce anxiety-like behavior, which in turn increases alcohol intake; d) the effect of simultaneous nicotine treatment during the transition to development of alcohol dependence and whether that is mediated by activation of neuronal ensembles in different parts of the brain. We found: the variable stress exposure caused cross sensitization with nicotine, increased the nicotine selfadministration behavior and decreased CREB activity in mesencephalic areas; the pretreatment with cocaine caused sensitization of cocaine motor response, locomotor cross-sensitization with nicotine, and increased motivation to nicotine intake; the pretreatment with nicotine increased the anxiety-like behavior and the motivation to ethanol intake; the simultaneous administration of nicotine and ethanol vapor exposure speed up the escalation of ethanol self-administration, increased the motivation and the compulsivity to ethanol intake and these behaviors could be related to activation of extended amygdala and mesocorticolimbic systems. Our results suggest that additional factors to the drug use such as stress and preexposure to other drug could increase the vulnerability to addiction. / Tabaco e etanol são as substâncias de abuso mais consumidas no mundo e frequentemente co-abusadas. Apesar do número elevado de pessoas que fazem uso de substâncias de abuso, apenas uma pequena, mas considerável porcentagem se torna dependente. Assim, outros fatores interagem com o efeito da droga influenciando o desenvolvimento da dependência. No presente estudo investigamos em ratos: a) se a exposição prévia ao estresse variado poderia alterar os parâmetros da autoadministração de nicotina, e se este fenômeno poderia estar relacionado à alterações na atividade de CREB e ERK no córtex pré-frontal medial, núcleo acúmbens e amídala; b) se a administração prévia e repetida de cocaína poderia alterar os parâmetros de autoadministração de nicotina, e se este fenômeno poderia estar relacionado a alterações na expressão de BDNF, TrkB, DYN, Mi-Opio, NPY e CRFR1 no núcleo acúmbens; c) se a exposição prévia à nicotina poderia alterar os parâmetros de autoadministração de etanol; d) o efeito da administração simultânea de nicotina no desenvolvimento da dependência ao etanol, e as áreas encefálicas bem como o fenótipo dos neurônios envolvidos nesse comportamento. Nossos resultados demonstram que a exposição ao estresse variável induziu sensibilização cruzada com nicotina e aumentou a motivação e o consumo dessa substância e reduziu a atividade de CREB em regiões mesoencefálicas. O pré-tratamento com cocaína induziu sensibilização cruzada com nicotina e aumentou a motivação e o consumo dessa substância. O pré-tratamento com cocaína aumentou a expressão gênica de BDNF no núcleo acúmbens desses animais. O pré-tratamento com nicotina aumentou os comportamentos relacionados à ansiedade e a motivação para o consumo de etanol. A administração simultânea de nicotina acelerou a escalada da autoadministração, aumentou o ponto de ruptura e a compulsividade para o consumo de etanol e esses comportamentos podem estar relacionados a ativação da amídala estendida e do sistema mesocorticolímbico. Desta forma, nossos resultados sugerem que fatores adicionais ao uso de uma substância de abuso como estresse e a pré-exposição a outra substância podem aumentar a vulnerabilidade ao desenvolvimento da dependência.

A hidroxipropil-metil-celulose (HPMC) é um éter de celulose que possui estrutura variável dependendo da quantidade de grupos metila, apolares, e hidroxipropoxila, polares, inseridos na cadeia polimérica celulósica. A polaridade do polímero é controlada através da quantidade de grupos metila (DS) e de hidroxipropoxila (MS) e afeta as propriedades de filmes poliméricos finos e espessos, além de alterar as características de liberação controlada de princípios ativos (neste caso nicotina) incorporados em filmes de HPMC, reticulados através de uma reação de esterificação com ácido cítrico. Com exceção do polímero com baixo DS e alto MS (e por consequência mais polar), filmes finos apresentam valores de energia superficial próximos aos de poliestireno ou poli(metacrilato de metila) (~41 mJ/m/2), indicando forte orientação molecular dos grupos metila ao ar, de acordo com um modelo apresentado. Esta orientação favoreceu as interações com o ar, que se organizou na superfície, formando pequenas cavidades superficiais, de acordo com imagens de microscopia de força atômica (AFM). Apesar de seguirem a mesma ordem de acordo com a polaridade dos polímeros, os valores de energia superficial observados para filmes espessos foram mais elevados, devido a uma menor quantidade de grupos metila orientados ao ar, acarretados por uma maior interação intermolecular no \"bulk\" do filme polimérico e uma consequente diminuição nos graus de liberdade da molécula polimérica. Um modelo para a estrutura de filmes espessos é proposto, no qual a variação nos valores de DS e MS explica as diferentes estruturas superficiais observadas em imagens de AFM. A incorporação de nicotina em filmes espessos também sofre influência dos valores de DS e MS; uma maior incorporação do princípio ativo foi observada em maiores DS e menores MS. A liberação controlada do princípio ativo também é influenciada por esses fatores estruturais, porém o pH do meio externo também é um fator a ser considerado: somente em pHs maiores que 8,8, onde a nicotina se encontra majoritariamente na sua forma neutra/desprotonada, pode-se observar uma cinética mais lenta e controlada para o polímero de maior MS e menor DS. A força iônica também influencia a cinética de liberação, porém em uma extensão muito menor que uma variação no pH. Os resultados obtidos também foram analisados segundo o modelo de liberação de Korsmeyer-Peppas, que quantifica a interação princípio ativo-matriz polimérica e descreve o mecanismo de liberação através do parâmetro difusional n. Ao final, baseado nos resultados obtidos, pode-se recomendar para uso tópico o polímero J, com menor DS e maior MS, como sendo o mais indicado para Terapia de Reposição de Nicotina (TRN), devido à sua liberação quantitativa e em velocidades mais lentas, possuindo a menor retenção de nicotina ao final do processo dentre os polímeros estudados; em casos de peles fortemente oleosas, mais alcalinas, a indicação do polímero E, com maior DS e menor MS, é recomendada pela sua capacidade de liberar uma maior quantidade de princípio ativo quando em pHs mais elevados. / Hydroxypropyl-methyl-cellulose (HPMC) is a cellulose ether with variable structure, depending on the amount of methyl groups, with apolar characteristics, and hydroxypropyl groups, with polar characteristics, inserted on the polymer backbone chain. The polymer polarity is controlled through the amount of methyl (DS) and hydroxypropyl (MS) groups, and affects the properties of thin and thick polymer films, as well as impacts the active principle release rate (in this case, nicotine) from HPMC polymer films, crosslinked through a esterification reaction with citric acid. With exception of the polymer with low DS and high MS (and consequently, more polar), thin films present surface energy values close to those determined for polystyrene or poly(methyl-methacrylate) (~41 mJ/m2), indicating strong orientation of the methyl groups to the air, according to a proposed model. This orientation favored the interactions with the air, which has been organized at the surface, forming small superficial cavities, according to Atomic Force Microscopy (AFM) images. Despite following the same pattern according to the polymer\'s polarities, values of surface energy observed for thick films were higher, due to a lower amount of methyl groups oriented to the air, driven by a higher interchain interaction in the bulk polymer film and consequent lowering in the polymer molecule degrees of freedom. A model to the thick films structure has been proposed, where the variation in the values of DS and MS explains the differences observed in the AFM images. Nicotine incorporation in thick films is also influenced by the values of DS and MS; a higher incorporation of the active principle has been observed in higher DS and lower MS. The active principle\'s controlled release is influenced by these structural parameters as well, although the medium\'s pH should also be considered: only at pHs higher than 8,8, where nicotine can be found mostly at its neutral/non-protonated form, a slower and controlled release can be observed for the polymer with higher MS and lower DS. The ionic strength influences the release kinetics too, but in a much minor extension than the medium pH does. The results obtained were analyzed using the Korsmeyer-Peppas model, which quantifies the active principle-polymer matrix interaction and describes the release mechanism through the diffusional parameter n. At the end, based on the results obtained, the polymer J, with higher MS and lower DS, can be the most indicated for Nicotine Replacement Therapy (NRT), due to its quantitative release and at lower rates and constant amounts over time, allowing the lowest nicotine retention at the end of the process amongst all evaluated polymers; at highly oily skin, more alkaline, the polymer E, with higher DS and lower MS, can be recommended by its characteristics of more quantitative release under higher pHs.

Liberação transdérmica de fármacos apresenta várias vantagens na terapêutica quando comparada com administração oral ou parenteral. Não existe até o momento nenhum método previsto na Farmacopéia Brasileira para realizar testes de liberação de fármacos em adesivos transdérmicos, outros compêndios oficiais como Farmacopéia Americana, Britânica e Européia, descrevem o aparato de pás sobre disco, o cilindro rotatório e o suporte recíproco. Atualmente a literatura descreve diversos tipos de células de difusão para liberação transdérmica das quais a célula de difusão de Franz tem sido a mais empregada tanto para adesivos transdérmicos como formas semi-sólidas, utilizada no desenvolvimento farmacotécnico, caracterização biofarmacêutica e controle de qualidade. A proposta deste estudo tem por objetivo estipular critérios para a escolha mais adequada do equipamento e metodologias in vitro na avaliação da liberação transdérmicas de fármacos, utilizando a nicotina como fármaco modelo. Para tal, foram empregados ensaios in vitro de liberação e retenção cutânea utilizando métodos de pás sobre disco e método de célula de difusão de Franz modificada em sistema estático e fluxo contínuo. A validação dos fatores que influenciam a taxa de liberação in vitro da nicotina foram fundamentais para escolha do meio receptor, escolha da velocidade de agitação que promoveu mais semelhança no perfil de liberação em diferentes equipamentos assim como a escolha da membrana biológica mais adequada para o método proposto. Os resultados mais promissores foram selecionados para os ensaios in vitro de liberação, permeação e retenção cutânea. Os dados de liberação, tanto em quantidades de nicotina liberada como seu fluxo, demonstraram semelhança no uso de diferentes equipamentos, indicando possíveis intercambialidades entre os métodos propostos para liberação de nicotina transdérmica. Ensaios in vitro de permeação cutânea em célula de difusão vertical de Franz não demonstraram diferenças significativas em diferentes modelos de membranas biológicas utilizadas, as quais foram pele de orelha de porco, pele de camundongo sem pelo e pele de cobra cascavel hidratada por 24 horas. A quantidade de nicotina permeada em até 8 horas, assim como o fluxo de permeação foram significativamente menor para o método de pás sobre disco (FDA) quando comparado com os resultados obtidos utilizando célula de difusão vertical de Franz tanto em sistema estático com em fluxo contínuo. Estes resultados podem estar relacionados com a estrutura física do equipamento de célula de difusão vertical de Franz, uma vez que oferece um sistema oclusivo, dificultando o contato do adesivo com o meio receptor. Desta forma, os resultados deste projeto podem indicar o uso da célula de difusão vertical de Franz para ensaios in vitro de liberação e permeação cutânea da nicotina em formas farmacêuticas transdérmicas, podendo ser aplicado em pesquisas de desenvolvimento de formulações, controle da qualidade e testes de Equivalência Farmacêutica para produtos genéricos. Os resultados desta pesquisa apresentam-se podem ter importante influência nas discussões em torno dos medicamentos genéricos no Brasil, bem como na elaboração de diretrizes para testes de Equivalência Farmacêutica e Controle de Qualidade de medicamentos transdérmicos. Poderão ainda fornecer dados para indicações de protocolos para Farmacopéia Brasileira e pesquisa científica em torno dos sistemas de liberação transdérmicas de fármacos. / The aim of this work was to compare in vitro release and permeation of nicotine from transdermal patch (TDS) using three different methods such as, FDA paddle method and both Vertical Diffusion Cell (VCD) static and continuous flux. We evaluated different kinds of membrane (hairless mouse, porcine ear skin and snake skin), different composition and pH of acceptor phases (0.01N isotonic phosphate buffer pH 7.4 (± 0.2), water, and HCL 0.025N), agitation of acceptor phase and batches of the transdermal patches. Profiles of release and permeation from all methods evaluated were linked statistically using linear regression and one-way ANOVA nonparametric assay. The 0.01N isotonic phosphate buffer pH 7.4 (± 0.2) improved greater release rate of nicotine than those obtained using HCL and water as acceptor phase. Cumulative released and permeated amounts of nicotine were almost equal for all methods evaluated and there is not significantly different (one-way ANOVA p 0.05) were observed after 8 h. However nicotine permeated fluxes (J) after 8 h were significantly higher using VDC than those obtained using FDA paddle method. Cumulative permeated amounts (reported to the effective surface area of the cells) were overestimated when skin permeation experiments were prolonged to 12 h, indicating that the actual diffusion surface area of NiQuitinTM exceeded the effective diffusion surface area of the cells. Reducing the trimmed TDS surface area led not only to a reduction of the cumulative permeated amounts, but also to a reduction of the flux at 12 h. In order to evaluate the edge effect on drug release flux studies were performed using static VDC. In vitro penetration studies using different membranes showed not significantly difference for ear pig skin, hairless mouse and snake skin at 8 h. However data obtained without membrane were about 1.25 times smaller than those obtained with biological membranes. These results demonstrated that NiQuitinTM TDS had dependent release of membrane at 8 h of permeation. In conclusion there is not significantly different for in vitro release and permeation amounts of nicotine from NiQuitinTM using VDC and FDA method. In term of release efficiency all methods released up to 80% of nicotine after 8 h. The results suggested the use of VDC as potential method to evaluate both in vitro release and skin permeation of nicotine in transdermal patches.

A nicotina é o principal componente do tabaco e dos cigarros eletrônicos. A exposição crônica a nicotina, em quantidades semelhantes às atingidas pelo tabagismo humano, é responsável por piora da lesão renal aguda e da doença renal crônica. O gene klotho, predominantemente expresso no rim, foi descoberto após uma mutação insercional, com o surgimento de um fenótipo semelhante ao envelhecimento humano nos camundongos homozigotos para esse transgene. A proteína Klotho transmembrana tem ação de co-receptor do fator de crescimento fibroblástico 23 (FGF-23) e sua forma secretada atua em diversas vias intracelulares e em órgãos a distância. A deficiência de Klotho ocorre no envelhecimento, em situações que levam a lesão renal aguda e na doença renal crônica. A expressão reduzida de Klotho também agrava lesão renal aguda e participa da progressão da doença renal crônica, enquanto o seu aumento, ou a sua reposição, protegem dos processos inflamatórios e do estresse oxidativo. Neste estudo, objetivamos avaliar os efeitos renais, hemodinâmicos e sobre a expressão de Klotho da exposição crônica a nicotina e quais os efeitos dessa exposição nos animais haploinsuficientes para o transgene klotho (Kl+/-). Utilizamos para estas avaliações camundongos Kl+/- e seus controles wild type (Kl+/+), que foram expostos a nicotina (200 mcg/mL) ou veículo (sacarina 2%) diluídos em água por 28 dias. Ao final do estudo foram avaliados diurese, eletrólitos plasmáticos e urinários, ureia, aldosterona, ADH, FGF-23 e PTH intactos plasmáticos, expressão protéica renal de Klotho, alfa7-nAchR, NHE3, ENaC, NKCC2, AQP2, e-NOS, VEGF, MnSOD e renina, expressão genica renal de klotho, interleucinas, TBARS e GSH em tecido renal, taxa de filtração glomerular por FITC-inulina, pressão arterial e frequência cardíaca invasivas, sensibilidade baroreflexa e modulação autonômica cardíaca e periférica por análise espectral. Após a exposição a nicotina, os animais Kl+/+ apresentaram redução da expressão renal da proteína e do RNAm de Klotho e uma tendência a aumento dos níveis plasmáticos de FGF-23, associados a uma queda da diurese e da taxa de filtração glomerular, sem alteração dos níveis de ADH. Esses animais Kl+/+ também apresentaram aumento da sensibilidade barorreflexa em resposta ao nitroprussiato e um predomínio da modulação simpática cardíaca, com redução da expressão renal dos alfa7-nAchR. Os animais Kl+/- tiveram níveis renais ainda menores de Klotho após a exposição a nicotina, com aumento de TBARS, IL-6, uréia e aldosterona em relação aos Kl+/- não expostos. A diurese, a taxa de filtração glomerular e a expressão dos alfa7-nAchR não se reduziram e não houve aumento da sensibilidade barorreflexa após exposição a nicotina, com um predomínio da modulação parassimpática cardíaca, nesses animais Kl+/-. A ingesta hídrica, a pressão arterial e a frequência cardíaca foram semelhantes entre os 4 grupos. A proteinúria foi maior nos animais Kl+/- do que nos animais Kl+/+ após a exposição a nicotina. Podemos concluir que a exposição crônica à nicotina reduz a expressão renal de Klotho, estimula vias de inflamação, fibrose e estresse oxidativo renais e tem efeitos renais e sistêmicos diferentes de acordo com os níveis basais de Klotho / Nicotine is a major compound of tobacco and electronic cigarettes. Chronic exposure to nicotine concentrations that are similar to human smoke worsens acute kidney injury and chronic kidney disease. The klotho (Kl) gene is expressed predominantly by the kidney and was discovered after an unintentional insertional mutation that resulted, in transgenic homozygous mice, in a phenotype similar to human aging. Klotho transmembrane protein acts as a co-receptor to fibroblastic growth factor 23 (FGF-23) and the secreted form interacts in multiple intracellular pathways, with effects in distant organs. Klotho deficiency occurs in aging and in multiple acute kidney injury and chronic kidney disease etiologies, whereas klotho upregulation and replacement protect from inflammation and oxidative stress. Here, we investigated renal and hemodynamic effects of chronic nicotine exposure, its effects over renal expression of Kl, and compared wild type (Kl+/+) and Kl haploinsufficient mice (Kl+/-) in terms of the effects of that exposure. Kl+/- and Kl+/+ mice received nicotine (200 ?g/ml) or vehicle (saccharine 2%) in drinking water for 28 days. We evaluated diuresis, ions in serum and urine, urea, plasma and urinary levels of cotinine, aldosterone, plasma antidiuretic and parathyroid hormone, plasma FGF-23, protein expression of (immunoblotting for) Klotho and ?7 nicotinic acetylcholine receptor, NHE3, NKCC2, ENaC, aquaporin-2, e-NOS, VEGF and renin, klotho mRNA, kidney interleukines, TBARS and GSH, glomerular filtration rate by fluorescein isothiocyanate-inulin clearance, mean arterial pressure, heart rate, baroreflex sensitivity and autonomic cardiac and peripheral modulation by spectral analysis. After nicotine exposure, Kl+/+ mice showed decreased Klotho protein and mRNA and a tendency towards an elevation in plasma FGF-23, which were associated with both diuresis and glomerular filtration rate reductions, without modifications in ADH levels. Besides that, Kl+/+ animals increased baroreflex sensitivity after nitroprusside, a predominant sympathetic cardiac modulation and lower alfa7-nAchR kidney expression. Kl+/- mice reduced even more Klotho renal expression, with higher levels of TBARS, IL-6, urea and aldosterone. Diuresis, glomerular filtration rate, alfa7-nAchR expression and baroreflex sensitivity were the same of their controls. Cardiac parasympathetic modulation predominated in Kl+/- mice. Fluid intake, mean arterial pressure and heart rate were similar across the 4 groups. Renal protein excretion was higher in Kl+/- than in their controls after nicotine exposure. We can conclude that chronic nicotine exposure downregulates Klotho kidney expression induces inflammation and oxidative stress and stimulates fibrosis, with different renal and systemic responses according to basal Klotho levels