Einleitung: Die Wundheilung kornealer Endothelzellen erfolgt hauptsächlich durch Migration benachbarter Zellen. Die Endothelzellen sind in vivo ständig in Kontakt mit Kammerwasser (KW). TGF-ß2 und Ascorbin- säure (AS) sind in hoher Konzentration im KW enthalten. Der Einfluß von humanem KW, TGF-ß2 und AS auf Proliferation und Migration boviner kornealer Endothelzellen (BCEC) in Kultur wurde untersucht. Methoden: Proliferation: BCEC der 1.Passage wurden zu 1,5x104 Zellen/Well ausgesät. Mit frischem Medium und Zusatz von humanem KW (10% und 100%), TGF-ß2 (0,1; 1 und 10 ng/ml) und AS (50, 100 und 200 µg/ml) wurden die Kulturen für 72 oder 96 h inkubiert und anschließend gezählt. Migration: Konfluente Zellkulturen der 1.Passage wurden verwendet. Mit einem modifizierten Trepan (Durchmesser 5,5 mm) wurde eine zentrale, zirkuläre "Wunde" gesetzt. Die Kulturen wurden mit frischem Medium, das humanes KW, TGF-ß2 und AS in den o. g. Konzentrationen enthielt, für 72 oder 96 h inkubiert. Zur Auswertung wurden die in den Wundbereich migrierten Zellen an 5 verschiedenen Stellen, ausgehend vom Wundrand, gezählt. Ergebnisse: Die Proliferation der BCEC wurde durch humanes KW (unverdünntes KW: nahezu 100%; 10%iges KW: 30%) und Ascorbinsäure (ca. 90% bei AS 200 µg/ml) gehemmt. TGF-ß2 stimulierte die Proliferation bis zu einem 3fachen Wert der Kontrollen. Die Migration wurde durch humanes KW (unverdünntes KW: nahezu 100%; 10%iges KW: 30%) und TGF-ß2 (ca. 50% bei allen Konzentrationen) gehemmt. AS hatte einen stimulierenden Einfluß (20-50%) auf die Migration. Schlußfolgerung: Noch ist unklar, welche Substanzen im KW für den proliferationshemmenden Einfluß auf korneale Endothelzellen verantwortlich sind. Sowohl AS als auch TGF-ß2 zeigten einen gegensätzlichen Effekt auf Proliferation und Migration kultivierter BCEC. Die Bedeutung dieser Beobachtungen für die Wundheilung humaner kornealer Endothelzellen in vivo ist Gegenstand weiterer Untersuchungen. / Purpose: Corneal endothelial cells are non-proliferating, wound healing primarily occurs by migration of adjacent cells. Endothelial cells in vivo are constantly exposed to aqueous humor (AH). Elevated concentrations of TGF-ß2 and ascorbic acid (AA) are present in aqueous humor. The influence of human AH, TGF- ß2 and AA on proliferation and migration of bovine corneal endothelial cells in vitro was investigated. Methods: Proliferation assays: BCEC at first passage were seeded at 1.5x104 cells/well. Fresh medium containing human AH (10% and 100%), TGF-ß2 (0,1;1 and 10 ng/ml) and AA (50, 100 and 200 µg/ml) was added to the cells. 72 or 96 hours later the cells were counted. Migration assays: BCEC at first passage were grown to confluency. A central, circular "wound" was made with an especially designed trephine (diameter 5.5 mm). The cultures were incubated with fresh medium containing human AH, TGF-ß2 and AA in the same concentrations for 72 or 96 hours. The cells were then counted in five randomly chosen sections from the wound edge. Results: Proliferation of BCE cells was inhibited by human AH (pure AH: nearly 100%, 10% AH: 30%) and AA (about 90% at 200 µg/ml). TGF-ß2 stimulated the proliferation up to 3 fold compared to the controls. Migration was inhibited by human AH (pure AH: nearly 100%, 10% AH: 30%) and TGF-ß2 (about 50% at all concentrations). AA had a stimulatory effect (20-50%) on migration. Conclusion: Presently, it remains unknown which substances in AH are responsible for the inhibiting effect on corneal endothelial proliferation. Both TGF-ß2 and AA showed to have a differential effect on proliferation and migration of cultured BCE cells. The significance of these observations for wound healing of human corneal endothelial cells in vivo has to be investigated.

A presente Tese tem por objetivo estudar alguns aspectos das interações água-detergente que são importantes para o entendimento das propriedades fisico-químicas da própria micela. além das interações que ocorrem na pseudo-fase micelar. Estas interações foram estudadas utilizando-se duas técnicas: RMN de 1H, para avaliar o efeito de micelas aquosas iônicas, zwitteriônicas e não-iônicas sobre a estrutura da água; e o estudo cinético da hidrólise espontânea de um éster do ácido carbônico, para determinar a reatividade cinética desta água além de, possivelmente, esclarecer alguns aspectos da questão da penetração da água na micela. Foi determinado o efeito da concentração do detergente e a presença de deutério no solvente sobre os deslocamentos químicos dos prótons da água. Foi usada a seguinte série de detergentes: dodecilsulfato de sódio (SOS, aniônico), dodecilbenzenossulfonato de sódio (SDBS, aniônico), perfluoroctanoato de sódio (SPFO, aniônico), cloreto de cetiltrimetilamônio (CTACl, catiônico), éter octilfenil(9,5)polioxietilênico (TX-100) e dodecildimetilamônio-3-propanossulfonato (DDAPS, zwitteriônico). O deslocamento químico dos prótons da água. depende linearmente da concentração de detergente e os coeficientes angulares das retas são sinsíveis à concentração de deutério no solvente. A partir destas correlações foram calculados os fatores de fracionamneto deutério/prótio,φ cujas magnitudes dão uma idéia quantitativa do efeito do detergente sobre a estrutura da água. Para averiguar a origem micelar do fracionamento observado, foram determinados também os fatores de fracionamento para compostos modelos. Estes são constituídos de cadeias carbônicas curtas que não formam agregados mas que possuem os mesmos grupos hidrofílicos dos detergentes. Foram usados os seguintes compostos como modelos: butilsulfato de sódio (modelo para SDS), p-tolouenossulfonato de sódio (modelo para SDBS), perfluorobutirato de sódio (modelo para SPFO) e brometo de butiltrimetilamônio (modelo para CTACl). Os resultados obtidos mostram que estes compostos perturbam pouco a estrutura água e são diminuidores da sua estrutura. Os detergentes, com a excessão de DDAPS e TX-100, claramente aumentam a estrutura da água devido a efeitos eletrorrestritivos. Interações inter e intramoleculares entre os íons do DDAPS resultam numa neutralização interna das cargas e explicam o seu pequeno efeito (aumento) sobre a estrutura do solvente. Nao é fácil oferecer uma explicação simples para a diminuição da estrutura da água na presença de TX-100, pois existe a interferência de fatores cujos efeitos sobre o fracionamento não podem ainda ser avaliados. Entre estes destacamos o enrolamento das cadeias oxietilênicas do detergente. a presença de água fisicamente presa entre estas cadeias e o fato de que a distruibição das moléculas de água entre as unidades de oxietileno não é homogênea. Foram determinadas as constantes de velocidade, os parâmetros de ativação e o efeito isotópico cinético do solvente para a hidrólise independente do pH de carbonato de bis(2,4-dinitrofenila) , na presença de SDS, CTABr, CTACl, TX-100 de cetildimetilamônio-3-propanossulfonato (HDAPS) . O efeito micelar foi analisado em termos da transferência do éster do seio aquoso para água micelar, e do efeito salino acoplado a fatores eletrostáticos das micelas iônicas. Como modelo para o efeito da transferência do meio, a reação foi estudada em misturas de água e acetonitrila. O efeito salino foi avaliado estudando a reação em presença de alguns dos compostos-modelo acima mencionados. Houve mudanças marcantes na entropia e na entalpia de ativação da reação somente em presença de grandes quantidades de acetonitrila no solvente (fração molar de 0,55 a 0,90). O efeito salino foi pequeno. Todos os detergentes, especialmente o SDS, diminuiram velocidade da reação devido a fatores entálpicos desfavoráveis. Para ter uma idéia do sítio da solubilização do éster nas micelas usadas, estudamos o efeito de acetato e decanoato de p-nitrofenila (compostos usados como modelo para CDNF), sobre os deslocamentos químicos dos grupos de cada detergente. Os resultados mostram que o sítio de solubilização destes ésteres não está predominantemente na região da superfície da micela. Os ésteres movimentam-se rapidamente (em relação à escala do tempo da RMN), em todo volume da micela. Efetuamos um cálculo simples mostrando que a penetração da água até os primeiros dois grupos metilênicos pode dar origem a um volume hidratado da micela de mais de 50%. Uma consideração dos parâmetros de ativação, dos resultados de RMN de 1H e do significado do cálculo do volume micelar efetuado, nos levou a concluir que nossos dados cinéticos podem ser explicados sem a necessidade de assumir uma micela extensivamente hidratada, como por exemplo aquela proposta pelo modelo de aglomeração poros (porous cluster model). / Study of micelle-water interactions is relevant to the physical chemistry of the micelle itself, and for a better understanding of the interactions occuring therein. In the present thesis two aspects of these interactions were studied: the effect of the organized assembly on the structure of water at the micellar interface, and on the kinetic reactivity of water as probed by examining the pH-independent (spontaneous) hydrolysis of a carbonate ester. The effect of the following surfactants on the structure of water was studied: sodium dodecylsulphate (SDS, anionic) sodium dodecylbenzene sulphonate (SDBS, anionic), sodium perfluorooctanoate (SPFO, anionic), cetyltrimethylammonium chloride (CTACl, cationic), polyoxyethylene (9.5) octylphenyl ether (TX-100, nonionic), dodecyldimethylammonio-3-propane sulphonate (DDAPS, zwitterionic). The dependence of the chemical shift of the water protons on the surfactant concentration, and on the deuterium content of the solvent was used to calculate the deuterium/protium fractionation factor, φ. The magnitude of the latter (relative to unity, the fractionation factor for bulk water) gives a quantitative idea of the solvent structure perturbation by the micellar pseudophase. In order to ascertain that the observed D/H fractionation is micelle-induced, the fractionation factors for model compounds were also determined. These were short-chain, i.e., non-aggregating compounds bearing the same head-groups as the surfactants. The following model compounds were used: sodium butylsulphate (model for SDS), sodium p-toluenesulphonate (model for SDBS), sodium perfluorobutyrate (model for SPFO) and butyltrimethylammonium bromide (model for CTACl). The following conclusions were drawn from the determined fractionation factors: whereas the short-chain compounds perturb the structure of water only slightly, and are usually water structure breakers, the presence of the micelles clearly enhances the structure of the solvent. Exceptions are zwitterionic DDAPS (marginal structure enhancement) and nonionic TX-100 (water structure decrease). The behavior of the zwitterionic surfactant was explained based on the negligible electrostrictive effect of the micelle due to inter and intramolecular interactions between the head-ions. A simple rationale for the case of TX-100 is not easy because of can complicate such interpretation: the followino factors that coiling of the oxyethylene chains, physical trapping of water between the chains, noneven distribution of the water molecules along the oxyethylene chains. Rate constants, activation parameters, solvent kinetic isotope effect were determined for the pH-independent hydrolysis of 2,4-dintrophenyl carbonate in the presence of SDS, CTABr, CTACl. TX-100 and cetyldimethylammonio-3-propane sulphonate (HDAPS). The micellar effect was analyzed in terms of a transfer Effect, a salt and an electrostatic effect. The first refers to the transfer of the ester form bulk water to \"micellar\" water, and was mimicked by studying the reaction in water-acetonitrile mixtures. Salt effect was evaluated by conducting the hydrolysis in the presence some of the above mentioned short-chain compounds. For the reaction in aqueous acetonitrile the entropy and enthalpy of activation showed sizable changes only at high mole fraction (0.55 to 0.90) of the organic solvent. Salt effect was negligible. The tested detergents, specially SDS, slow the reaction rate due to unfavorable enthalpy. The solubilization site of the ester in the micelles was assesed by 1H NMR. using p-nitrophenyl acetate and decanoate as models. This study showed that the ester in the micelles is not localized at, or very near, to the micelle/water interface, but is rapidly moving (on the NMR time-scale) all over the micellar volume. Analysis of the obtained activation parameters, coupled with the 1H NMR data, and with the result of simple geometric calculation led us to conclude that deep water penetration in the micelle (e.g ., according to the porous cluster model) is not essential to rationalize our data.

Nenhuma / A corrosão-fadiga é provavelmente um dos mais complexos de todos os fenômenos, sendo influenciada por fatores ambientais, mecânicos, metalúrgicos, somados a uma componente cíclica de tensões. A corrosão-fadiga pode ser definida como a ação combinada de um ambiente agressivo e uma tensão cíclica que conduzem à falha prematura dos metais por trincamento. A maior parte da vida em fadiga está relacionada a uma sucessão de processos durante os quais planos de escorregamento, deformações localizadas, danos e micro trincas se iniciam e desenvolvem até a nucleação de trinca macroscópica. Neste estudo, a influência da solução de NaCl 3,5% nas propriedades de fadiga do aço foi avaliada. Foram analisadas as curvas de S-N-P obtidas sob ambiente corrosivo e comparadas com as curvas de S-N-P obtidas em água destilada. Em geral, a corrosão-fadiga em soluções aquosas é um processo eletroquímico. O mecanismo de iniciação de trincas por corrosão-fadiga proposto para explicar a redução da vida em fadiga de metais em ambientes corrosivos, foi analisado neste trabalho

As lipases (EC 3.1.1.3) hidrolisam ligações éster de triacilgriceróis numa interface água-óleo. Por possuírem diversas aplicações industriais, são as enzimas mais utilizadas em sínteses orgânicas e mais de 20% de biotransformações são realizadas com lipases. Os objetivos deste trabalho foram avaliar as condições nutricionais de meios de cultivo (fontes de óleos vegetais e animais, nitrogênio e carbono) para melhorar a produção de lipase por Candida viswanathii além de purificar a enzima em sistema aquoso bifásico e realizar a caracterização parcial da lipase. Entre os meios de cultivos analisados o meio de Vogel proporcionou a maior produção de lipase após 36 horas de cultivo (11,73 U/mL). Após analisar as fontes de carbono lipídicas e não-lipídicas e fontes de nitrogênio, um planejamento experimental de misturas foi aplicado para analisar o efeito de glicerol, lactose e sorbitol sobre a produção de lipase. Os resultados obtidos mostraram que a maior produção de lipase (20,41 U/mL) foi observada com 0,5% de lactose (p/v) e 0,5% (p/v) de sorbitol, sendo observado um aumento de 74% da produção de enzima. Nesse estudo observou-se que a lactose e sorbitol foram utilizados como adjuntos para a produção de lipase. A lipase produzida nas condições anteriores foi purificada em sistema aquoso bifásico (SAB) formado por polietilenoglicol (PEG) e fosfato de potássio. O maior coeficiente de partição (1,34) foi encontrado no ensaio com PEG 4000/fosfato a Temperatura de 40 °C e pH 7,0, bem como o maior balanço de atividade (50,73%). Na caracterização parcial, a lipase não sofreu influência da temperaturana faixa de 20 – 60 °C e obteve atividade máxima em pH 8,1. A enzima apresentou também elevada estabilidade em solventes orgânicos como metanol e etanol, sendo estas propriedades consideradas importantes para aplicações em processos biotecnológicos. / Lipases (EC 3.1.1.3) hydrolyze ester bonds of triacylglycerols at a water-oil interface. By they have several industrial applications, they are the enzymes most used in organic synthesis and more than 20% of biotransformations are performed with lipases. The objectives of this work were to evaluate the nutritional conditions of culture media (plant and animal oils, nitrogen and carbon) to improve the production of lipase by Candida viswanathii in addition to purifying the enzyme in a biphasic aqueous system and to realize the partial characterization of lipase. Among the culture media analyzed, the Vogel medium provided the highest lipase production after 36 hours of culture (11,73 U/mL). After analyzing the lipid and non-lipid carbon sources and nitrogen sources, an experimental design of blends was applied to analyze the effect of glycerol, lactose and sorbitol on lipase production. The results showed that the highest production of lipase (20,41 U/mL) was observed with 0.5% lactose (w/v) and 0.5% (w/v) sorbitol, with an increase of 74% of enzyme production. In this study it was observed that lactose and sorbitol were used as adjuncts for the production of lipase. The lipase produced under the above conditions was purified in a aqueous two-phase systems (ATPS) consisting of polyethylene glycol (PEG) and potassium phosphate. The highest partition coefficient (1,34) was found in the PEG 4000/phosphate assay at temperature of 40 °C and pH 7,0, as well as the highest activity balance (50,73%). In the partial characterization, the lipase was not influenced by the temperature range of 20 - 60 °C and obtained maximum activity at pH 8,1. The enzyme also showed high stability in organic solvents such as methanol and ethanol, and these properties are considered important for applications in biotechnological processes.

O ácido clavulânico (AC) é um potente inibidor de β-lactamases utilizado na área médica. Métodos alternativos, econômicos e simples para sua purificação são de grande interesse. Este trabalho objetivou produzir e extrair AC de Streptomyces spp. por fermentação extrativa utilizando sistema de duas fases aquosas (SDFA) - polietileno glicol (PEG)/sais fosfato. Foi selecionado o melhor produtor de AC entre sete linhagens de Streptomyces spp. Avaliou-se a influência de cinco fatores no cultivo do melhor produtor em frascos agitados (pH, temperatura, velocidade de agitação, concentrações das fontes de nitrogênio e de carbono), utilizando planejamento experimental estatístico. Definidas as melhores condições de cultivo, foram estudadas a produção e a extração do AC em fermentação extrativa utilizando SDFA em frascos agitados e em sistema descontínuo utilizando biorreator. Em biorreator também foram realizados o estudo termodinâmico do processo de fermentação nas condições ótimas obtidas nas etapas anteriores e a determinação do coeficiente volumétrico de transferência de massa (kLa), comparando os sistemas de fermentação no meio de cultivo simples (SF) e fermentação extrativa utilizando sistema SDFA PEG/sais fosfato (SFE) sem e com crescimento microbiano. A linhagem de Streptomyces selecionada como a melhor produtora de AC foi a DAUFPE 3060, a qual apresentou a maior produção desse inibidor, 494 mg/L em 48h, em frascos agitados nas condições: pH 6,0, 32°C, 150 rpm, 5 g/L de glicerol e 20 g/L de farinha de soja. Após a etapa de otimização realizada para o estudo da temperatura e da concentração de farinha de soja, variáveis mais significativas no estudo de seleção, a temperatura e a concentração de farinha de soja ótimas, foram 32°C e 40 g/L, respectivamente, com produção de 629 mg/L de AC em 48h. O estudo termodinâmico confirmou que a temperatura de 32°C é a máxima de produção do AC; após esse valor, inicia-se, gradualmente, a degradação do AC. No estudo da determinação do coeficiente de transferência de massa, kLa, sem crescimento microbiano, observaram-se valores maiores de kLa para o SF, devido à viscosidade do PEG utilizado no SFE. A massa molar do PEG e a velocidade de agitação foram as variáveis que mais influenciaram na extração de AC no SFE em frascos agitados, apresentando comportamento semelhante em biorreator. E, finalmente, o estudo da transferência de oxigênio do SFE utilizando SDFA com crescimento microbiano foi avaliado para otimizar a produção e a extração de AC. Os resultados obtidos demonstraram que existe uma faixa ideal de velocidade de agitação e de aeração para evitar o rompimento celular e aumentar a recuperação de AC. / Clavulanic acid (CA) is a potent inhibitor of β-lactamases used in the medical field. Alternative methods, economic and simple purification are of great interest. This PhD project aims to produce and extract clavulanic acid of Streptomyces spp. By extractive fermentation using aqueous two-phase system (ATPS) - Polyethylene glycol (PEG)/phosphate salts. The best producer of clavulanic acid among seven strains of Streptomyces spp was selected. The influence of five factors in the cultivation of the best producer in flasks (pH, temperature, agitation velocity, concentrations of nitrogen and carbon sources) using statistical experimental design was evaluated. Defined the best cultivation conditions, the production and extraction of clavulanic acid by extractive fermentation using ATPS in flasks and in a batch system using a bioreactor was analyzed. In batch system using a bioreactor were also carried out the thermodynamic study of the fermentation process in optimum conditions determined in previous steps and also determined the volumetric mass transfer coefficient (kLa) comparing the fermentation systems in simple culture medium (SF) and in a extractive fermentation using aqueous two-phase system (ATPS) PEG/phosphate salts (SEF) medium with and without microbial growth. A strain of Streptomyces spp. selected as the best producer of AC was DAUFPE 3060, which showed the highest production of this inhibitor, 494 mg/L at 48h, in flasks under the conditions of pH 6.0, 32 °C, 150 rpm, 5 g/L of glycerol and 20 g/L of soybean flour. After the optimization step, the most significant variables in the study selection, temperature and concentration of soybean flour, were studied. The optimal values were 32 °C and 40 g/L of temperature and soybean flour concentration, respectively, with production of 629 mg/L of CA after 48h of cultivation. The thermodynamic study confirmed that 32 °C is the maximum temperature production of CA, after this value, starts gradually, the degradation of CA. In the study of volumetric mass transfer coefficient, kLa, without microbial growth, showed higher values of kLa for the SF, because the high viscosity of the PEG used in the SFE. The PEG molar mas and agitation velocity were the variables that most influenced the extraction of CA in flasks using a SFE, with similar behavior in a bioreactor. Finally, the study of oxygen transfer rate in SFE using ATPS with microbial growth was evaluated to optimize the production and extraction of CA. The results showed that there is an ideal range of agitation and aeration to prevent cell disruption and increase the CA recovery.

Este trabalho tem como finalidade obter condições de recuperar e purificar a pró-toxina épsilon e uma protease produzida pelo Clostridium perfringens através do uso da técnica de extração líquido-líquido em sistema de duas fases aquosas (SDFA) para utilização na produção de vacinas. A aplicação do sistema de duas fases aquosas é proposta como alternativa para a purificação, pois permite a separação e análise de partículas biológicas. Esta técnica é aconselhável para purificação em larga escala pela possibilidade de partição seletiva com altos rendimentos, além de apresentar uma boa relação custo-benefício. Foram construídas as curvas binodais que foram utilizadas para análise da composição dos sistemas de duas fases aquosas formados por polietileno glicol e citrato de sódio, como também a extração e recuperação da pró-toxina épsilon e da protease produzidas por Clostridium perfringens. As curvas binodais foram construídas utilizando PEG 400, 550, 1000, 1500, 3350 e 8000 em diferentes valores de pH (6,0; 6,5; 7,0; 7,5 e 8,0) e água para formação do sistema. Também foram construídas curvas na presença de caldo clarificado em substituição à água. Foi avaliada ainda a estabilidade da pró-toxina épsilon, antes da extração, e da protease antes e após a extração, frente às variações de pH e temperatura. Um planejamento experimental ('2pot.8-3') foi usado para avaliar a influência das variáveis concentração e massa molar do PEG, concentração de citrato, pH, concentração de NaCl, fator de diluição do extrato, temperatura e massa total do sistema na extração da pró-toxina épsilon. A partição de uma protease presente no meio fermentado de C. perfringens foi estudada através do uso de três planejamentos experimentais completos (dois do tipo '2pot.4' e um do tipo '2pot.3') que avaliaram a influência das variáveis concentração e massa molar do PEG, concentração de citrato e pH. Três variáveis-resposta foram obtidas (aumento de pureza, coeficiente de partição e recuperação da enzima). Os resultados atingidos foram: coeficiente de partição de 0,57, aumento de pureza de 4,2 com uma recuperação de 131% da atividade enzimática na fase superior do sistema. O sistema de extração que proporcionou as melhores condições de extração foi constituído por: PEG 10000 (g/mol) e concentração de 22% (m/m), concentração de citrato de 8% (m/m) e pH 8,5. A protease permaneceu estável (durante 48 h), mesmo após a extração, nas temperaturas de 5°C e 25°C e nos valores de pH de 6,0 a 9,0. / The purpose of this work is to obtain best conditions of recovery and purification of proteins (epsilon prototoxin and a protease) produced by Clostridium perfringens through the use of the liquid-liquid extraction by aqueous two-phases systems (ATPS). The application of these systems is proposed as alternative for protein purification, because it allows the separation and analysis of biological particles. This technique is advisable process purification applied to large scale since it provides a selective partition with high yields, and good cost-benefit ratio. The binodal curves were constructed and used to determine the system composition based on polyethylene glicol and citrate concentrations. The binodal curves were built by using PEG 400, 550, 1000, 1500, 3350 and 8000 g/mol at different pH values (6.0; 6.5; 7.0; 7.5 and 8.0). The curves were, initially, built in the presence of water and, later, with clarified fermented broth. The differences in the curve profiles (water versus broth) helped to explain the phase separation behaviour. The stability, as a function of pH and temperature, of the epsilon prototoxin was evaluated before the extraction, while the stability of the protease was evaluated before and after the extraction. An experimental design ('2pot.8-3') was used to evaluate the influence of the following variables on epsilon prototoxin extraction: concentration and molar mass of PEG, citrate concentration and NaCl concentrations, pH, dilution factor of the extract, temperature and total mass of the system. However, the partition of the protease was studied through the use of the three full different experimental designs (two of the type '2pot.4', and one of the type '2pot.3') that evaluated the influence of the following variables: concentration and molar mass of PEG, citrate concentration and pH. Three parameter responses were obtained: purification factor; coefficient partition; and recovery yield of the enzyme. The results were satisfactory: partition coefficient = 0.57, purification factor = 4.2; yield = 131%. The extraction conditions which provided the best results were: molar mass of PEG 10000 (g/mol); concentration of PEG of 22% (w/w); concentration of citrate of 8% (w/w); and pH 8.5. The protease was stable (during 48h), even after the extraction, in the temperatures of 5°C and 25°C, and at pH values of from 6.0 to 9.0.

Neste trabalho, foi investigado o efeito do tamanho do abrasivo e do pH do meio na resistência ao desgaste abrasivo do aço H-13 com matriz martensítica e do aço Hadfield com matriz austenítica. Ensaios de abrasão foram realizados utilizando o equipamento roda de borracha a úmido, variando o tamanho do abrasivo entre 0,15 e 2,40 mm e o pH do meio entre 5,5 e 12,8. As microestruturas dos materiais estudados foram analisadas utilizando microscopia óptica, as superfícies de desgaste e as partículas de desgaste foram analisadas em microscópio eletrônico de varredura. A macrodureza e a microdureza, antes e após os ensaios, foram obtidas utilizando durômetro Vickers. A topografia da região central da superfície de desgaste foi obtida utilizando Perfilometria 3D, visando obter valores de profundidade de penetração do abrasivo. Os resultados mostraram que o aço Hadfield é mais resistente do que o aço H-13 em todos os valores de pH e tamanhos de abrasivo utilizados. Para os dois materiais, a perda de massa aumenta linearmente até um tamanho crítico de abrasivo (TCA) e, após este, a mesma continua a aumentar, mas com uma intensidade menor. Para os dois materiais e para todos os tamanhos de abrasivo, o aumento do pH do meio resultou em menores perdas de massa, sendo este efeito maior para os dois menores tamanhos de abrasivo. Para maiores valores de pH, foram observadas menores profundidades de penetração do abrasivo. A microdureza da superfície de desgaste do aço H-13 sofreu um pequeno aumento com o aumento do tamanho do abrasivo enquanto que para o aço Hadfield esse aumento foi mais intenso. A análise das partículas de desgaste mostraram que, para todas as condições ensaiadas, os debris do aço H-13 tinham duas morfologias, contínuas e descontínuas enquanto que os cavacos do aço Hadfield foram sempre descontínuos. Para os dois materiais, foram observados dois micromecanismos de desgaste, sendo eles microcorte e microsulcamento. Por fim, os resultados apresentados neste trabalho sugerem que a análise de desempenho do aço Hadfield em serviço deve considerar o pH do meio bem como a granulometria do abrasivo em contato. / In this work, the effects of abrasive particle size and pH value of the aqueous solution on abrasive wear resistance of the H-13 steel with martensitic matrix and the Hadfield steel with austenitic matrix were investigated. Abrasive wear tests, using a wet rubber wheel abrasion tester, were carried out using abrasive sizes between 0.15 and 2.40 mm and pH values of the aqueous solution between 5.5 and 12.8. The microstructures of the materials studied were analyzed by optical microscopy and the wear surfaces and wear particles were analyzed by scanning electron microscopy. The hardness and microhardness before and after the tests were measured using a Vickers hardness tester. The topography of the middle of wear scars, were obtained by a noncontact 3D profiler in order to measure the depth of abrasive penetrations.The results show that the Hadfield steel is more wear resistant than the H-13 steel at all pH values and abrasive sizes conditions tested. For both materials, mass loss increases linearly up to a critical abrasive size, and after this the mass loss continues to increase, but with a lower intensity. Moreover, for both materials and all the abrasive sizes, increases in the pH values of the aqueous solution resulted in lower mass losses, and this effect is greater for the two smaller grain sizes. For higher pH values, lower depths of penetration of abrasive were observed. The microhardness in the wear scar surface of the H-13 steel presented a slight increase with the abrasive size, while for the Hadfield steel, this microhardness increases in a more intense form with the abrasive size. The analysis of the wear particles showed that, for all test conditions, the chips of H-13 steel has two types of morphologies, continuous or discontinuous, and for Hadfield steel only discontinuous. For both materials, two abrasive wear micromechanisms were observed, microcutting and microploughing. Finally, the results presented in this work suggest that the wear performance analysis of the Hadfield steel, to be used in an abrasive environment, must consider the effects of pH of the aqueous solution and particle size.

Ce travail de thèse a consisté en la synthèse et en la valorisation d’une nouvelle famille de cyclodextrines amphiphiles en catalyse aqueuse : les OléoSodioSuccinyl-Cyclodextrines (OSS-CDs). Ces OSS-CDs ont été obtenues en trois étapes principales. La première étape a consisté en la maléinisation thermique ou rhodiocatalysée de l’acide oléique ou de son ester méthylique. Les anhydrides succiniques substitués obtenus peuvent ensuite optionnellement subir une réaction d’hydrogénation de leur double liaison carbone-carbone par catalyse au rhodium sur charbon. Mis en réaction avec diverses cyclodextrines natives ou modifiées, ces anhydrides ont conduit à des esters de cyclodextrines présentant des fonctions acides carboxyliques. Les OSS-CDs, obtenues par neutralisation à la soude de ces fonctions, possèdent une solubilité aqueuse élevée (50-500 g.L-1 à 20°C), sont tensioactives (concentration d’agrégation critique : 4-360 g.L-1 à 20°C) et forment des agrégats en phase aqueuse. Les chaines grasses de ces OSS-CDs possèdent une forte tendance à s’inclure dans la cavité de la cyclodextrine sur laquelle elles sont greffées. Les OSS-CDs ont montré une très bonne capacité à promouvoir le transfert de matière en hydroformylation biphasique aqueuse et rhodiocatalysée d’alpha-oléfines grasses, avec des vitesses de réaction plus importantes obtenues lors de l’utilisation d’OSS-CDs issues de l’oléate de méthyle. Certaines OSS-CDs issues de l’acide oléique se sont avérées quant à elles de très bons stabilisants de nanoparticules de ruthénium. Les suspensions colloïdales auxquelles elles ont conduit présentent une forte stabilité, sont actives dans l’hydrogénation de nombreux substrats et peuvent être recyclées sans perte d’activité. / This thesis work consisted of the synthesis and valorisation of a new family of amphiphilic cyclodextrins in aqueous catalysis: OleoSodioSuccinyl-Cyclodextrins (OSS-CDs). These OSS-CDs were obtained in three main steps. The first step consisted of the thermal or rhodiocatalysed maleinisation of oleic acid or its methyl ester. The carbon-carbon double bond of the obtained substituted succinic anhydrides can then possibly be hydrogenated by rhodium on carbon catalysis. By reacting with native or modified cyclodextrins, these anhydrides led to cyclodextrin esters having carboxylic groups. The OSS-CDs, obtained by neutralisation with sodium hydroxide of these functions, have high aqueous solubilities ( 50-500 g.L-1 at 20° C), are surfactant (aggregation concentration: 4-360 g.L-1 at 20°C) and form aggregates in water. The fatty chains of these OSS-CDs have a strong tendency to include in the cavity of the cyclodextrin on which they are grafted. The OSS-CDs showed a very good mass transfer capacity in aqueous biphasic rhodiocatalysed hydroformylation of alpha-olefins, with higher reaction rates when using the OSS-CDs obtained from methyl oleate. Some OSS-CDs coming from oleic acid have been found to be very good stabilizers for ruthenium nanoparticles. The colloidal suspensions obtained with them were very stable, active in the hydrogenation of many substrates and can be recycled without loss of activity.

Atopic eczema is an incurable disorder of the skin. Sufferers are afflicted with hypersensitivity to environmental agents such as soaps (detergents), animal dander, pollen, specific foods and sometimes even water. Genetic mutations in atopic eczema compromise the development of the stratum corneum resulting in xerotic skin that is prone to cracking and increased permeability which leads to irritation due to the influx of exogenous material through the skin. The causes of atopic eczema are due to a combination of genetic and environmental factors and it is, therefore, a difficult disease to manage. Emollients and topical corticosteroids are the mainstay treatments for eczema. However, they do not treat the underlying cause of the flare-ups frequently seen in the condition; the damaged skin barrier. Defects in the skin barrier arise from premature desquamation of the stratum corneum. The main contributors to barrier breakdown are the up-regulation of skin proteases that are located in the skin. Since zinc is a known protease inhibitor, it would thus follow that a topical treatment for skin barrier repair should be developed. Therefore, the main objectives of this thesis are to successfully incorporate zinc into a formulation to develop a novel class of treatment for eczema and to assess the delivery of the element into the skin. In this thesis, methods to assess and characterise changes to skin barrier function and to extract and quantify zinc in the stratum corneum have been established. The development of two novel topically applied formulations containing zinc lactate as the active ingredient (1% w/w zinc lactate cream and a 2% w/v zinc lactate formulation) has been achieved and the uptake of zinc from the preparations in vitro determined. Further, the in vitro percutaneous penetration of zinc from three commercially available preparations has been investigated and compared to that recovered from the stratum corneum after passive diffusion with the novel zinc formulations. Additionally, in vivo uptake of zinc into human stratum corneum from Sudocremis ® reported. Scanning electron microscopy has revealed the distribution of zinc on the surface of skin treated with various formulations and has also allowed the efficiency of two cleaning procedures to be ascertained. The delivery of zinc from the novel topical formulation; 1% w/w zinc lactate cream, was more efficient than that the three commercial formulations and shows promise as a new approach to treat atopic eczema.

Orientador: Marineide Rosa Vieira / Resumo: O ácaro rajado, Tetranychus urticae Koch, é uma praga que ataca várias culturas em todo o mundo. Seu controle é feito basicamente por acaricidas químicos sintéticos. O uso inadequado de defensivos agrícolas, além de acarretar problemas ao meio ambiente, ao trabalhador e ao consumidor, pode levar ao desenvolvimento de populações de pragas resistentes aos seus princípios ativos. Extratos vegetais têm sido estudados na busca de novos princípios ativos que causem menos problemas ambientais, ocupacionais e de saúde humana, e que possam fazer parte de programa de manejo integrado de pragas e doenças. As florestas brasileiras são constituídas por uma grande diversidade de plantas que podem apresentar metabólitos secundários interessantes com propriedades biocidas. O objetivo deste estudo foi avaliar extratos aquosos e hidroetanólicos de folhas e cascas de doze espécies vegetais nativas do Cerrado brasileiro quanto à atividade acaricida e ao efeito sobre a fecundidade de fêmeas do ácaro-rajado, T. urticae. De cada espécie vegetal foram avaliados dois órgãos (folhas e cascas), duas épocas de coletas (primavera/verão e outono/inverno) além de dois tipos de solventes (água e etanol 70%). Os extratos foram aplicados por pulverização em torre de Potter, avaliando-se mortalidade, repelência e oviposição após 120 horas. Todas as doze espécies apresentaram atividade acaricida significativa sobre T. urticae, dependendo da época de coleta, do material vegetal e do solvente utilizado. Em nove e... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The two-spotted spider mite, Tetranychus urticae Koch, is a pest that attacks various crops throughout the world. The mites control is basically made by synthetic chemical acaricides. The inappropriate use of pesticides, besides causing problems to the environment, to the workers and the consumers, can lead to the development of populations of pests resistant to its active ingredient. Some pesticides such as neonicotinoids and pyrethroids have their origin in secondary plant metabolites such as tobacco and chrysanthemum, respectively. Plant extracts have been studied in the search for new active ingredients that cause less environmental, occupacional and human health problems, and that can be part of an integrated pest and disease management program. The Brazilian forests are constituted by a great plant diversity that can have interesting secondary metabolites with biocide properties. The objective of this study was to evaluate the mitecide activity of the aqueous and hydroethanolic extracts of leaves and bark of twelve native species from the Brazilian Cerrado and their effect on the fecundity of T. urticae mite females. Two plant organs (leaves and barks), two collection seasons (spring/summer and autumn/winter) were evaluated from each plant species, besides two types of solvents (70% ethanol and water). The extracts were applied by Potter tower spray, evaluating mortality, repellency and oviposition after 120 hours. All twelve species showed significant miticide activity... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre