In dieser Arbeit wurde eine neue Templat-gesteuerte fluorogene Peptidverknüpfung vorgestellt. Speziell modifizierte Peptidfragmente wurden durch die Bindung an ein Templatmolekül zu einer chemischen Reaktion befähigt, wodurch ein Fluoreszenzsignal erzeugt werden konnte. Das erlaubte eine Reaktionskontrolle in Echtzeit. Die fluorogene Peptidverknüpfung konnte erfolgreich mit einem Coiled-coil Peptid-Model etabliert werden. Dabei wurden Peptidthioester derart modifiziert, dass in räumlicher Nähe zur Thioestergruppe ein Fluorophor platziert wurde und die acetylierte Mercaptogruppe als Fluoreszenzlöscher agierte. Die modifizierten Thioester können nach dem Reaktionsmechanismus der nativen chemischen Peptidverknüpfung (NCL) unter der Bildung einer Amidbindung mit N-terminalen Cysteinylpeptiden reagieren. Die fluoreszenzlöschende Mercaptogruppe verlässt dabei den Peptidthioester als Nukleofug, wodurch ein fluoreszierendes Reaktionsprodukt entsteht. Die Templat-gesteuerte Durchführung dieser fluorogenen nativen chemischen Peptidverknüpfung (fNCL) erlaubte die Reaktionsdurchführung bei sehr geringen Peptidkonzentrationen. Die Synthese der benötigten fluorogenen Thioester gelang zum einem durch die Anwendung der selbstreinigenden Thioestersynthese mit einer Tandem-Entschützungs-Kupplungs-Strategie und zum Anderen mit Hilfe eines synthetisierten fluorogenen Azid-Thioesterbausteins, welches mit einem Alkin-modifizierten Peptid zur Reaktion gebracht wurde. Neben Coiled-coil Peptiden, wurden auch doppelsträngige DNA und Antikörper als Template für die fNCL eingesetzt. Die fNCL konnte zur Durchführung eines Abstandsscreenings angewendet werden. Es wurde eine Abhängigkeit zwischen der Reaktionsgeschwindigkeit und dem Abstand der Bindungsstellen im Templat für zwei reaktive Peptidbindungspartner gezeigt. Durch diese Untersuchung konnte die räumliche Abstandsgrenze zwischen zwei Bindungsstellen in einem Templatmolekül bestimmt werden, die keinen Templat-Effekt mehr beobachten lässt. / In this thesis a new template-controlled fluorogenic peptide linkage was presented. Specially modified peptide fragments were enabled to undergo a chemical reaction by binding to a template molecule, which resulted in a fluorescent signal. This allowed a reaction control in real time. The fluorogenic peptide linkage was successfully established using a coiled coil peptide model. Peptide thioesters were modified in such a way that a fluorophore was placed in close proximity to the thioester group and the acetylated mercapto group acted as fluorescence quencher. These modified thioesters can react with N-terminal cysteinyl peptides according to the reaction mechanism of the native chemical ligation (NCL) under the formation of an petide bond. The fluorescence-quenching mercapto group leaves the peptide thioester as a leaving group, resulting in a fluorescent reaction product. Template-controlled execution of this fluorogenic native chemical ligation (fNCL) allowed the reaction to be performed at very low peptide concentrations. The synthesis of the required fluorogenic thioesters was achieved on the one hand by applying a self-purifying thioester synthesis with a tandem-protective coupling strategy and on the other hand by using a synthesized fluorogenic azide thioester building block which was reacted with an alkine-modified peptide. In addition to the coiled coil peptides, double-stranded DNA and antibodies were used as templates for fNCL. Finally, the fNCL could be used to perform a distance screening. A dependence between the reaction rate and the distance between the binding sites in the template for two reactive peptide binding partners was shown. By this investigation a distance between two binding sites in a template molecule could be determined, which does not show a template effect anymore.

Nukleinsäuretemplatkontrollierte Reaktionen, die häufig auf Ligations- oder Transferreaktionen basieren, unterliegen dem Effekt der Produktinhibierung. Dadurch können besonders niedrige Templatmengen nur schwer detektiert werden. Im Rahmen dieser Arbeit konnte erstmalig eine grundlegend neue Kategorie templatkontrollierter Reaktionen etabliert werden: templatkontrollierte Spaltungsreaktionen. Dazu wurde ein spaltbarer Linker auf N-Alkylpicoliniumbasis (NAP) entwickelt, der mit einfachen, orthogonalen Konjugationsmethoden (SPAAC, Maleimid-Thiol-Konjugation oder via Amidbinungsknüpfung) sowohl in PNA- als auch in DNA-Strukturen inkludiert werden kann. Die Templat-vermittelte Photoreduktion induziert eine C-O-Bindungsspaltung des Linkers. Daraus resultieren Produkte, die eine geringere Templataffinität besitzen als das Edukt, sodass die Reaktion keiner Produktinhibierung unterliegt. Dies konnte zum Beispiel mittels Triplex-bildender, spaltbarer PNA-Sonden realisiert werden, die eine rasche Spaltungsgeschwindigkeit aufweisen. Hierzu bindet die spaltbare PNA-Sonde auf dem Templat benachbart zu einer mit einem Ruthenium(II)-Komplex modifizierten Assistenzsonde, die die Photoreduktion lichtkontrolliert induzieren kann. In einem alternativen Ansatz wurde die Fluorophor-induzierte Photolyse von NAP-Derivaten näher untersucht und führte letztlich zur Entwicklung eines selbst-spaltenden Molecular Beacons (iMB). Dieser verhält sich wie ein konventioneller iMB, wodurch eine neue Klasse an Molecular Beacons vorgestellt werden konnte. Die templatkontrollierte Photolyse konnte nicht nur in wässrigem Milieu, sondern auch in komplexen Umgebungen wie Zellkulturmedium, Zelllysat und RNA-Extrakt durchgeführt werden. / Nucleic acid templated reactions, which are often based on ligation or transfer reactions, are limited by the phenomenon of product inhibition. As a result, the usage of catalytical amounts of target are up to date only applicable to a limited extend. In this work, a fundamentally new category of nucleic acid templated reactions could be established: nucleic acid templated cleavage reactions. For this purpose, a cleavable linker based on N-alkylpicolinium (NAP) was developed, which can be included in both PNA and DNA structures using simple, orthogonal conjugation methods (SPAAC, maleimide-thiol conjugation or via amide bond formation). A template-mediated photoreduction induces the C-O bond cleavage of the linker. The target affinity of the cleavage products is lower than the parental oligonucleotide prior to cleavage, hence providing a thermodynamical driving force for amplified nucleic acid detection. This could be realized, for example, using triplex-forming, cleavable PNA probes which have a fast cleavage rate. In a first approach various triplex-forming PNA probes were developed that would undergo a photo-reductive C-O-bond cleavage upon irradiation when placed on a template adjacent to an assistant probe equipped with a sensitizer (Ruthenium(II)-complex). In an alternative approach, the fluorophore-induced photolysis of NAP derivatives was investigated and ultimately led to the development of a self-immolative Molecular Beacon (iMB). The iMB behaves like a conventional MB, therefore a new class of Molecular Beacons was introduced. The template-controlled photolysis can be performed not only in aqueous environments, but also in various complex environments such as cell culture medium, cell lysate or RNA extract.

Fluoreszenzmarkierungstechniken für lebende Zellen ermöglichen es Biologen, einen Blick in eine komplexe biologische Umgebung zu werfen und Informationen über ein bestimmtes Ziel in einer nahezu natürlichen Umgebung zu erhalten. Dank der konzertierten Bemühungen der wissenschaftlichen Gemeinschaft gibt es eine Fülle von kommerziell erhältlichen, genetisch kodierbaren Markern und Reportern für die Fluoreszenzmikroskopie. Allerdings gibt es nur wenige Lebendzellmethoden, die eine direkte Konjugation von Nukleinsäuren mit Proteinen erlauben, obwohl es robuste DNA-Technologien gibt, die mit Oligo-Antikörper-Konjugaten auf Zelloberflächen durchgeführt werden. Ein weiterer, oft einschränkender Aspekt der Markierung ist die Fähigkeit, Ziele selektiv zu multiplexen. In dieser Studie wurde eine Methode der Tag-Probe-Markierung entwickelt, die eine selektive, gleichzeitige Markierung von zwei verschiedenen Zielen mit zwei Peptid-Nukleinsäure-Strängen (PNA) ermöglicht. Diese Methode verwendet ein Paar von Coiled-Coil-Peptiden, um die Konjugation einer PNA-Gruppe an ein Zielprotein zu steuern, das ein Peptid-Tag exprimiert. Die Verwendung orthogonaler Coiled-Coils ermöglicht Multiplexing. Die Markierung von synthetischen Tag-Peptiden, die mittels Flüssigchromatographie analysiert wurden, hat gezeigt, dass der orthogonale duale Transfer von PNA selektiv, quantitativ und schnell ist. Die PNA-Konjugation von exemplarischen Membranrezeptoren, gefolgt von der Hybridisierung mit komplementären Fluorophor-DNAs, ermöglichte eine unkomplizierte Visualisierung von dualen Rezeptoren in lebenden Zellen. Durch den Einsatz einfacher molekularer Hilfsmittel, die die Grundlage der DNA-Nanotechnologie bilden, konnte durch die Rekrutierung mehrerer DNAs eine zunehmend hellere Markierung erreicht werden und die löschbare Oberflächenmarkierung ermöglichte eine quantitative Untersuchung der Rezeptorinternalisierung. / Live-cell fluorescent labelling techniques allow biologists to glimpse into a complex biological environment and derive information about a specific target in a near-native environment. Thanks to a concerted effort from the scientific community, a plethora of commercially available, genetically encodable tags and reporters for fluorescence microscopy exist. However, few live-cell methods allow direct conjugation of nucleic acids with proteins despite the robust DNA technologies carried out on cell surfaces using oligo-antibody conjugates. Another aspect of labelling which is often limiting is the ability to selectively multiplex targets. In this study, a method of tag–probe labelling was developed that accomplishes selective, simultaneous labelling of two distinct targets with two peptide nucleic acid (PNA) strands. The technique uses a pair of coiled-coil peptides to guide conjugation of a PNA group to a target protein expressing a peptide tag and using orthogonal coiled-coil enables multiplexing. Initially, the labelling of synthetic tag-peptides analysed by liquid chromatography revealed the orthogonal dual transfer of PNA to be selective, quantitative, and rapid. PNA conjugation of exemplar membrane receptors followed by hybridization with complementary fluorophore-DNAs achieved straightforward live-cell dual receptor visualization. Finally, using simple molecular tools that form the basis of DNA nanotechnology, recruitment of multiple DNAs facilitated progressively brighter labelling, and erasable surface labelling allowed quantitative study of receptor internalisation.

Die Verwendung von nukleinsäuretemplatgesteuerten Reaktionen stellt einen innovativen Ansatz zur Therapie von Krankheiten dar, deren Ursprung in einer genetischen Veränderung von Zellen liegt. Im Rahmen der hier vorliegenden Arbeit erfolgte eine Weiterentwicklung der RNA-templatgesteuerten Acyltransferreaktion nach Seitz et al. hinsichtlich des Aufbaus von aromatischen Amidbindungen, wie sie in vielen niedermolekularen Wirkstoffen vorkommen. Als Modellverbindungen dienten die Bcr-Abl-Tyrosinkinaseinhibitoren Nilotinib, Ponatinib und GZD824, die durch zentrale Benzanilidmotive charakterisiert sind und zur Therapie der chronischen myeloischen Leukämie eingesetzt werden. Das konzipierte Reaktionssystem beruht auf dem Mechanismus der nativen chemischen Ligation, weswegen die Bcr-Abl-Inhibitoren durch die Einführung einer Thiolgruppe modifiziert werden mussten. Es wurde gezeigt, dass diese Modifikation in den meisten Fällen nur zu einer geringen Beeinträchtigung der biologischen Aktivität führt. Der RNA-templatgesteuerte Aufbau der Benzanilidstrukturen konnte sowohl mit PNA- als auch mit DNA-verknüpften Inhibitorfragmenten basierend auf Ponatinib und GZD824 erzielt werden. In Gegenwart eines komplementären RNA-Templats erfolgte die benachbarte Hybridisierung der reaktiven Konjugate, infolgedessen ein Benzoyltransfer von einem thioestermodifizierten Donor auf ein ortho-Mercaptoanilinderivat als Akzeptor stattfand. Mit PNA/PNA-Reaktionssystemen wurde auch in Abwesenheit des RNA-Templats eine signifikante Produktbildung beobachtet, was auf hydrophobe Wechselwirkungen der Konjugate zurückgeführt wurde. Unter Verwendung von DNA/DNA- bzw. PNA/DNA-Konjugatpaaren blieb die templatunabhängige Produktbildung hingegen ausreichend gering. Die entsprechenden Reaktionssysteme wurden hinsichtlich der erzielten Produktausbeuten optimiert, wobei sowohl die Linkerlänge bzw. -struktur der reaktiven Konjugate als auch die Templatarchitektur variiert wurde. / The use of nucleic acid-templated reactions represents an innovative approach to the therapy of diseases that originate in genetic alterations of cells. In this work, the RNA-templated acyl transfer reaction invented by Seitz et al. was extended towards the formation of aromatic amide bonds which occur in a variety of small molecule drugs. The Bcr-Abl tyrosine kinase inhibitors nilotinib, ponatinib, and GZD824 were used as model compounds, as they are characterized by central benzanilide motifs and find application in the treatment of chronic myeloid leukemia. The designed reaction system is based on the mechanism of native chemical ligation which required the modification of the Bcr-Abl inhibitors by introducing a thiol group. It was shown that thiolation affected the biological activity only moderately. The RNA-templated formation of the benzanilide structures was achieved with both PNA- and DNA-linked inhibitor fragments of ponatinib and GZD824. The presence of a complementary RNA template enabled adjacent binding of the reactive conjugates, triggering a rapid benzoyl transfer from a thioester-linked donor to an ortho-mercaptoaniline derivative as an acceptor. With PNA/PNA reaction systems, significant product formation was observed in absence of the RNA template, which was attributed to hydrophobic interactions between the conjugates. However, the template-independent product formation remained low when DNA/DNA or PNA/DNA conjugate pairs were used. The product yields of the corresponding reaction systems were optimized by varying the linker length and structure of the conjugates as well as the template architecture.

Ziel der vorliegenden Arbeit war die Durchführung sowie die Untersuchung ausgewählter Verfahrenswege zur chemischen und thermischen Vernetzung von Polysacchariden und Proteinen aus nachwachsenden Rohstoffen. Darüber hinaus wurden Hypothesen zu den Anwendungsmöglichkeiten der untersuchten vernetzten Polymere erstellt. Hierfür wurden mit analytischen Methoden die physiko-chemischen sowie die technofunktionellen Eigenschaften der Rohstoffe und der vernetzten Biopolymeren untersucht. Verglichen wurden z.B. die IR-Spektren der Ausgangsmaterialien mit denen des vernetzten Biopolymers. Mittels Reaktivextrusion wurden Formkörper hergestellt, deren Eigenschaften durch den Einsatz von geeigneten Weichmachern beeinflusst werden können. Die Temperatur des Extruders sollte möglichst niedrig gehalten werden, d.h. geringer als 90 °C, um unerwünschte Bräunungsreaktionen zu vermeiden. Bei den chemischen Vernetzungen wurden fünf verschiedene Vernetzungsmittel eingesetzt: Glutaraldehyd, Maleinsäureanhydrid, Maleinsäurediethylester, Bernsteinsäureanhydrid und Methylendiphenyldiisocyanat. Die Proben aus der Vernetzung mit Glutaraldehyd weisen einen wasserbindenden Charakter auf und können beispielsweise Einsatz als Hydrogele finden. Die mit Diisocyanaten vernetzten Proben härten im Wasser und können als Füllmaterial Einsatz in der Bauindustrie finden. Aufgrund der starken Vernetzung sind die Proben unlöslich und für die meisten erfolgt der Zersetzungsprozess ab 200 °C. Im Sinne einer Werkstoffbeschreibung wurden alle Proben als Duroplaste eingestuft, da sie keine thermoplastische Eigenschaft aufweisen. Mit dieser Arbeit werden Grundlagen für die Erforschung von Verfahrenswegen für die chemische sowie für die thermische Vernetzung von Polysacchariden und Proteinen gelegt. Die gewonnenen Erkenntnisse können für weitere Arbeiten genutzt werden. / In the present work, the possibilities of conjugation or interactions between polysaccharides, especially hemicelluloses and proteins from different sources of renewable raw materials have been investigated. Sources of polysaccharides are oat spelts xylan and maize spindles. Proteins like acid casein from cow milk and cruciferin, a rapeseed protein isolate, from the canola plant have been used. For the chemical crosslinking, homo-bifunctional reagents (crosslinkers) like glutaraldehyde, maleic anhydride, maleic acid diethyl ester, succinic anhydride, and methylene diphenyl diisocyanate were used. These reagents can react with functional groups of the biopolymers- the hydroxyl groups in the hemicelluloses and amino groups in the proteins. For a thermolinked conjugation of the biopolymers, the reactive extrusion was used as mechanical technique. Both types of biopolymers were successfully blended in a mini-Extruder to form sticks. The plastics characteristics of the sticks could be influenced by the addition of suitable softeners. The extrusion temperature must be kept as low as possible, to avoid the appearance of unwanted brown reactions. To investigate the conjugation of the polysaccharides with casein or cruciferin, the IR spectra of the raw materials with those of the crosslinked biopolymers were compared. Application possibilities of the resulted crosslinked biopolymers have been proposed. Most of the samples are insoluble due to the strong networking after the crosslinking reactions. Their thermal decomposition starts at temperatures around 200 °C. All the samples have been classified as duroplasts since they do not exhibit a thermoplastic characteristic. The work complements basic research about chemical and thermal conjugation between polysaccharides and proteins from renewable raw materials.

Inspiriert durch natürliche Grenzflächenproteine in Knochen wurden bifunktionale Biokonjugate für verschiedene Grenzflächenstabilisierungen genutzt. In einem kombinatorischen Ansatz wurden materialspezifische Peptid-block-Polyethylenglycol-Konjugate eingesetzt, um die Grenzflächen von Nanopartikeln in Lösung sowie in Polymerkompositen zu stabilisieren. Dazu wurden biokombinatorisch ausgewählte Peptid-Sequenzen mit einer Affinität für MgF2-Oberflächen in Form eines MgF2-bindenden Konjugats (MBC) synthetisiert, welches die materialaffine Bindung der monodispersen Peptid-Domäne mit der zusätzlichen Funktion des synthetischen Polymer-Blocks verbindet. Aus detaillierten Untersuchungen der Bindungseigenschaften von MBC und davon abgeleiteten Konjugaten mit variierten Peptidarchitekturen bzw. Polymer-Blocklängen bei verschiedenen Inkubationsbedingungen ging hervor, dass das sequenzspezifisch bindende MBC das Potenzial zur Stabilisierung von MgF2-Nanopartikeln hat. Das Konjugat verhinderte die Agglomeration der Partikel und ermöglichte im Gegensatz zu etablierten Stabilisatoren die vollständige Redispergierbarkeit sogar nach Eintrocknung. Die Stabilisierung in Lösung wurde auf die Kompatibilisierung von Partikeln in Polycaprolacton (PCL)-Kompositen übertragen, in denen das grenzflächenaktive MBC die Materialeigenschaften von bioabbaubaren PCL/MgF2-Kompositen optimierte. Die Grenzflächenstabilisierung führte zur gleichzeitigen Erhöhung der Steifigkeit und der Zähigkeit der Materialien bis in den Bereich natürlicher Knochen. Durch die gemeinsame Zugabe von MBC-kompatibilisiertem MgF2 und Hyxdroxylapatit zu PCL wurde ein bioaktives Material geschaffen, das nachweislich die osteogene Differenzierung von mesenchymalen Stammzellen und die Mineralisierung von neuem Knochengewebe unterstützte. Damit stellt es ein vielversprechendes Komposit für die Regeneration von Knochengewebe und weitere Anwendungen dar. / Inspired by natural interface proteins in bone, bifunctional bioconjugates were exploited for different interface stabilization applications. The interfaces of nanoparticles both in solution and in polymeric composites were stabilized by combinatorially selected, material specific peptide-polymer conjugates. Peptide sequences showing affinity to MgF2 particle surfaces were selected from a phage display library and translated into a MgF2-binding peptide-block-poly(ethylene glycol) conjugate (MBC). The MBC combined the material-affine binding of the monodisperse peptide domain with an additional function of a synthetic polymer block. Detailed studies of the binding properties of MBC and congeneric conjugates with other peptide architectures or different polymer block lengths, as well as varied incubation conditions revealed the potential of the sequence-specific MBC to stabilize MgF2 nanoparticles in solution. The conjugate inhibited the agglomeration of the particles. In contrast to established stabilizers, it enabled fully redispersable nanoparticles even after complete drying. The stabilization approach in solution was expanded to the compatibilization of the particles in polycaprolactone (PCL) composites. Inspired by the structure of highly specific interface proteins, MBC optimized the material properties of biodegradable PCL/MgF2 composites. Additionally, the interface stabilization simultaneously increased both the stiffness and the toughness of the composites up to the range of natural bone. The addition of hydroxyapatite alongside MBC-compatibilized MgF2 to PCL created a bioactive material that showed enhanced osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells and the mineralization of new bone tissue. Therefore, a mechanically reinforced, osteoinductive material was prepared showing high potential in extensive in vitro studies for biomedical applications such as guided bone regeneration, yet not limited to that.

Chemoselektive Peptidfragmentverknüpfungsmethoden sind ein zentrales Element der chemischen Peptid- und Proteinsynthese. Auf der Suche nach einem „universellen Werkzeug für die Peptidligation“ wurde in den vergangenen zwei Jahrzenten eine Vielzahl unterschiedlicher Hilfsmolekülen (Auxiliare) entwickelt. Trotz des enormen Forschungaufwandes blieben bisher verfügbare Nα-Auxiliare jedoch in ihrer Anwendung auf glycinhaltige Ligationsstellen beschränkt. Im Fall der häufig verwendeten säurelabilen Nα-Auxiliare müssen zudem starke Säuren oder Supersäuren eingesetzt werden, um das Hilfsmolekül nach der Peptidligation zu entfernen. Dabei wurde häufig die Spaltung der zuvor aufgebauten Amidbindung als unerwünschte Nebenreaktion beobachtet. In der vorliegenden Arbeit wurde die Synthese von acht Nα-Auxiliaren erarbeitet und deren Anwendung in der erweiterten nativen chemischen Ligation untersucht. Dabei konnten sechs Hilfsmoleküle identifiziert werden, welche die Auxiliar-Abspaltung unter mild-basischen Bedingungen ermöglichten. Von besonderer Bedeutung war das 2-Mercapto-2-phenethyl-Grundgerüst, welches im Gegensatz zu bisher beschriebenen Nα-Auxiliaren erstmals den Zugang zu sterisch anspruchsvollen Verknüpfungstellen, jenseits von Glycin, gestattete. Der Nutzen des Auxiliars wurde in die chemische Totalsynthese zweier antimikrobieller Peptide demonstriert. Durch die Verwendung eines 13C-markierten Hilfsmoleküls konnte der Mechanismus der radikalischen Auxiliar-Abspaltungsreaktion in NMR-Experimenten detailliert untersucht werden. Zusätzlich wurde das 2-Mercapto-2-phenethyl-Auxiliar in einer neuen Methode der chemischen Proteinsynthese eingesetzt, welche die gewünschten Proteine ohne eine einzige HPLC-Reinigung in reiner Form lieferte. Im letzen Teil der Arbeit wurde mit dem 2-Selenol-2-phenethyl-Grundgerüst erstmals die Anwendung eines Selenol-funktionalisierten Nα-Auxiliars beschrieben. Das Hilfsmolekül ermöglichte besonders schnelle Verknüpfungsreaktionen und konnte zudem rasch mit hoher Selektivität entfernt werden. / Chemoselective ligation methods are an essential element of chemical peptide and protein synthesis. The search of a „universal tool for peptide ligation“ led to a range of different ligation auxiliaries over the last two decades. Despite the intense research in this field established Nα-auxiliaries remained limited to glycine-containing ligation sites. Furthermore, the application of frequently used acid-labile Nα-auxiliaries requires strong acids or superacids to remove the auxiliary after the ligation reaction. Under these harsh acidic conditions the cleavage of the established amide bond has been observed as an undesired side-reaction. This work describes the synthesis of eight Nα-auxiliaries and their application in extended native chemical ligation. Six helping molecules were identified enabling auxiliary cleavage under mild-basic conditions. Perhaps most important and in contrast to previously reported Nα-auxiliaries, the 2-mercapto-2-phenethyl group facilitated access to sterically demanding ligation sites, beyond glycine. The synthetic utility of the auxiliary was demonstrated by the chemical total synthesis of two antimicrobial peptides. The application of a 13C-labelled scaffold allowed a detailled study oft the radical auxiliary cleavage reaction by NMR-spectroscopy. Additionally, the 2-mercapto-2-phenethyl auxiliary was utilised for a novel method of chemical protein synthesis, which delivered the desired proteins without a single HPLC-purification in high purity. Finally, a selenol-functionalized Nα-auxiliary is described for the first time by introducing the 2-selenol-2-phenethyl mojety. This scaffold enabled execptionally rapid peptide ligations and is readily removed with high selectivity.

Im Rahmen dieser Arbeit wurden fluoreszierende Sphingomyelin-Analoga zu Studium der sauren Sphingomyelinase (ASM) synthetisiert. Ausgehend von L-Serin wurde ein Sphingosin-Derivat mit natürlicher Stereochemie dargestellt. Anschließend wurde mittels Phosphorodichloridat-Chemie eine Aminoethylphosphat-Gruppe installiert. Zweifache Fluoreszenzmarkierung ergab Sonden mit der Fähigkeit zu Förster-Resonanzenergietransfer (FRET). Diese wurden als Substrate der ASM akzeptiert und erlaubten die Verfolgung der Enzymaktivität in vitro. Durch die Analyse der photophysikalischen Eigenschaften der Fluorophore wurde das allgemeine Konzept der Phasentrennungs-gestützten Signalverstärkung (PS) abgeleitet. Dieses Konzept wurde erfolgreich bestätigt durch die Synthese einer 30-mal leistungsfähigeren zweiten Generation der FRET-Sonde. Ein homogener Assay wurde entwickelt, der die Quantifizierung der ASM-Aktivität erlaubte. Unter Verwendung von gereinigter rekombinanter humaner ASM, HeLa-Zelllysaten oder Lysaten von murinen embryonalen Fibroblasten (MEFs) als Enzymquelle wurde ausschließlich unter den von der ASM bevorzugten Bedingungen eine vollständige und spezifische Hydrolyse der Sonde beobachtet. Des Weiteren erlaubte die Sonde die Detektion relativer Unterschiede der Aktivität der ASM in kultivierten MEFs mittels Fluoreszenzmikroskopie mit Zweiphotonenanregung (2PE). / Fluorescent sphingomyelin analogues have been synthesized to probe the acid sphingomyelinase (ASM). Starting from L-serine, a sphingosine with natural stereochemistry was synthesized. Subsequently, phosphorodichloridate chemistry was used to install an aminoethyl phosphate moiety. Dual fluorescent labeling afforded probes capable of Förster resonance energy transfer (FRET). They were recognized as substrates of ASM and allowed for monitoring of the enzyme’s activity in vitro. Through analysis of the fluorophores’ photophysical properties, the general concept of partition aided amplification of a FRET probe’s signal (PS) was developed. This concept was successfully confirmed by the synthesis of a second-generation probe with 30-fold improved response. A homogenous assay was developed, which allowed for a quantitation of ASM activity. Using either purified recombinant human ASM, or lysates of HeLa cells or mouse embryonic fibroblasts (MEFs) as an enzyme source, complete and specific cleavage was observed exclusively under conditions preferred by ASM. Furthermore, the probe enabled the detection of relative levels of ASM activity in cultivated MEFs using fluorescence microscopy with two-photon excitation (2PE).

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