Aufgrund der Fähigkeit von Langerhans Zellen, welche den C-Typ Lektin (CTL) Rezeptor Langerin exprimieren, Antigene zu internalisieren und T-Zellen zu präsentieren, wurde Langerin als attraktives Ziel für neue Immunotherapien erkannt. Langerin kann Pathogene wie z.B. Viren erkennen, die zur Erhöhung der Avidität Kohlenhydratliganden multivalent präsentieren, da die monovalenten Kohlenhydratliganden nur niedrige Affinitäten für Langerin aufweisen. Die natürlichen monovalenten Kohlenhydratliganden besitzen nur niedrige Affinitäten für Langerin. Inspiriert durch die Natur stellt Multivalenz eine Strategie zur Überwindung der schwachen CTL-Kohlenhydrat-Wechselwirkung dar. Im Gegensatz zur hochmultivalenten Präsentation von Liganden mit undefinierter Anordnung hat sich diese Arbeit zum Ziel gesetzt auch die Ökonomie der Liganden zu optimieren, indem Liganden auf einer DNA Gerüststruktur so präsentiert wurden, dass sie die Distanz zwischen den Bindungstaschen des Homotrimers Langerin wiederspiegeln. Eine Untersuchung der relevanten multivalenten Bindungsmechanismen führte zu einer Anordnung der Liganden, die sowohl statistisches Rebinding als auch den Chelate Effekt einbezog. Der Rebinding Effekt wurde als Mittel erkannt, dass nicht nur die Avidität des Liganden an einer Bindungstasche erhöht, sondern auch ausgenutzt werden kann, um den Chelate Effekt zu amplifizieren. Diese Methode stellt eine Möglichkeit dar niedrige oder nicht vorhandene Multivalenzeffekte bei der bivalenten Präsentation von Liganden zu überwinden, wenn hochaffine Liganden nicht zur Verfügung stehen. Eine Kombination dieser Strategie mit der Entwicklung eines neuen selektiven Liganden für Langerin führte zu dem stärksten bekannten Langerinbinder (IC50 = 300 nM). Die Ligand-PNA-DNA Konstrukte wurden selektiv von Langerin exprimierenden Zellen bei nanomolaren Konzentrationen internalisiert und stellen ein System dar, welches in Zukunft für den Transport von Beladungen Anwendung finden könnte. / Targeting the C-type lectin (CTL) langerin has received increasing attention as a novel immunotherapy strategy due to the capacity of Langerhans cells, which express langerin, to endocytose and cross-present antigens to T-cells. Langerin recognizes pathogens such as viruses, which present carbohydrates in a multivalent fashion to increase avidity as the monovalent carbohydrate ligands only display low affinity for langerin. Inspired by nature, multivalency has therefore been a key tool for overcoming the low affinities of CTL-carbohydrate interactions. In contrast to highly multivalent ligand presentation with undefined arrangements this work strove to optimize ligand economy by designing bivalent ligands that take the distance between the binding sites of the homotrimeric langerin into consideration by precise arrangement of ligands on DNA-based scaffolds. Studying the multivalent mechanisms at work led us to the design of ligands that take both statistical rebinding and the chelate effect into account. The rebinding effect was recognized as a tool that not only increases ligand avidity at a single binding site but in addition can be exploited to amplify the chelate effect. This method provides a solution for overcoming the low or non-existing multivalency effects when bivalently presenting low affinity ligands on a rigid scaffold if high affinity ligands are unavailable. A combination of this arrangement strategy with the development of a first langerin selective glycomimetic ligand led to the most potent molecularly defined langerin binder to date (IC50 = 300 nM). The ligand-PNA-DNA constructs were selectively internalized by langerin expressing cells at nanomolar concentrations and constitute a delivery platform for the future transport of cargo to Langerhans cells.

Smac-Mimetika (SMCs) sind eine Klasse von Tetrapeptid-abgeleiteten Medikamenten, die dem homodimeren, pro-apoptotischen Protein Smac nachempfunden sind. Sie binden und hemmen die Apoptose-Inhibitoren (IAPs), eine Klasse von anti-apoptotischen Proteinen, die von vielen medikamentenresistenten Krebszellen überexprimiert werden. In dieser Arbeit wurden Strategien zur Steigerung und Kontrolle der Aktivität von SMCs durch Konjugation an Oligonukleotide (ON) untersucht. ONs wie Desoxyribonukleinsäure (DNA) oder das peptidbasierte Analogon Peptidnukleinsäure (PNA) bieten einzigartige Erkennungseigenschaften, die zur Detektion und/oder zur Modulation der Expression krebsspezifischer Genprodukte genutzt werden können. Letzteres kann z. B. mit Antisense-Oligonukleotiden (ASOs) erreicht werden, kurzen einzelsträngigen DNA- oder RNA-Molekülen, die die Translation einer komplementären Zielsequenz blockieren. Im ersten Teil der Arbeit wurden Konjugate aus SMCs und ASOs auf Synergie-Effekte getestet. Viele menschliche Krebszelllinien sind gegen SMCs resistent, weil andere anti-apoptotische Proteine wie das zelluläre FLICE-ähnliche Protein (c-FLIP) als Ausfallsicherung wirken. Es konnte gezeigt werden, dass diese Resistenz durch Kupplung eines SMC an ein anti-c-FLIP ASO überwunden werden kann. Im zweiten Teil wurden kurze ON-Sonden verwendet, um ein templiertes Reaktionssystem zur gezielten Aktivierung eines SMCs in Gegenwart von X-linked Apoptose-Inhibitor (XIAP) mRNA zu erzeugen. Es wurden zwei verschiedene Ansätze untersucht: Ein templierter Acyl-Transfer, bei dem hochaffine, bivalente SMCs aus niedrig affinen, monovalenten Vorläufern erzeugt werden und eine Demaskierung der für die Bindungsaffinität von SMCs entscheidenden, N-terminalen Aminogruppe durch templierte Reduktion eines Azids. Für die zweite Strategie wurden zwei verschiedene Reaktionen verglichen, die Staudinger-Reduktion mit Phosphinen und eine katalytische Photoreduktion mit einem Ruthenium-Komplex. / Smac mimetic compounds (SMCs) are a class of tetrapeptide-derived drugs, modelled after the homodimeric, pro-apoptotic protein Smac. They bind and antagonize Inhibitor of Apoptosis Proteins (IAPs), a class of anti-apoptotic proteins overexpressed by many drug-resistant cancer cells. In this work, strategies to enhance and control the activity of SMCs by conjugating them to oligo-nucleotides (ON) were investigated. ONs like deoxyribonucleic acid (DNA) or the peptide-based analog peptide nucleic acid (PNA) offer unique recognition properties that can be used to detect and/or modulate the expression of cancer-specific gene products. The latter can be achieved with antisense oligonucleotides (ASOs), short single-stranded DNA or RNA molecules that block the translation of a complementary sequence of interest. In the first part of this work, conjugates between SMCs and ASOs were tested for synergy. Many human cancer cell lines are resistant to SMCs because other anti-apoptotic proteins like the cellular FLICE-like protein (c-FLIP) act as a failsafe. It could be demonstrated that by joining an SMC with an anti-c-FLIP ASO this resistance can be overcome. In the second part, short ON probes were used to create a templated reaction system to conditionally activate an SMC in the presence of x-linked inhibitor of apoptosis (XIAP) mRNA. Two different approaches were explored: A templated acyl transfer that yields high affinity bivalent SMCs from low affinity, monovalent precursors and unmasking of the N-terminal amino group, which is crucial for the binding affinity of SMCs, by templated reduction of an azide. For the second strategy, two different chemistries were compared, Staudinger reduction with phosphines and a catalytic photoreduction using a ruthenium complex.

In der vorliegenden Arbeit werden drei neue Klassen von modular zugänglichen Elektrophilen für die Biokonjugation von Cystein vorgestellt. Diethynyl-phosphinate (DPs) wurden als bisreaktive Elektrophile für die cysteinselektive Markierung von Peptiden, Proteinen und Antikörpern entwickelt. In diesen Molekülen können beide elektronenarmen Dreifachbindungen unter physiologischen Bedingungen mit Thiol-Nukleophilen reagieren und die erhaltenen Konjugate sind in menschlichem Plasma und in Gegenwart großer Mengen an reduziertem Glutathion stabil. Darüber hinaus wurden DPs in der selektiven Herstellung verschiedener Protein-(Doppel)-Konjugate angewandt. Neben der klassischen Proteinmodifikation können DPs auch zur kovalenten Verbrückung der Disulfidbrücken von Antikörpern eingesetzt werden. Weiters wurde mit Hilfe von Dichtefunktionaltheorie-Berechnungen werden Ethinyl-triazolyl-phosphinate (ETP) als eine neue Klasse hochreaktiver Elektrophile für die Cystein-Biokonjugation entdeckt. Die Berechnungen zeigen, dass sowohl die elektronenziehenden als auch die π-Elektronen donierenden Eigenschaften des Triazolrings die Reaktivität erhöhen. Vor allem aber wird gezeigt, dass ETP-Elektrophile über die chemoselektive Cu(I)-katalysierte Azid-Alkin-Cycloaddition in ein azidhaltiges Molekül eingebaut werden können. Da diese Reaktion problemlos in wässrigen Puffersystemen abläuft, konnte eine Vielzahl funktioneller Elektrophile, einschließlich elektrophiler Peptide und Proteine, aus DPs erzeugt werden. Schließlich wurden Diethinylphosphinoxide als chemoselektive Reagenzien zur Disulfidvererbrückung untersucht. Insbesondere Diethinyl-Triazolyl-Phosphinoxide (DTP) sind vielversprechende Kandidaten, da sie die modulare Synthese von ETP-Elektrophilen mit den beiden reaktiven Gruppen in DPs kombinieren. Die Fähigkeit der DTP-Reagenzien, Disulfide zu verbrücken, wurde durch die Bildung mehrerer funktioneller Antikörperkonjugate gezeigt. / The present work introduces three new classes of modular accessible electrophiles for cysteine bioconjugation. Diethynyl-phosphinates (DPs) were developed as bisreactive electrophiles for the cysteine-selective modification of peptides, proteins and antibodies. Both electrophilic alkynes can react with thiol-nucleophiles under physiological conditions. The corresponding double-conjugates are stable in human plasma and in the presence of a large excess reduced glutathione. Furthermore, the general applicability of diethynyl phosphinates for cysteine selective bioconjugation was established by the generation of various protein-(double)-conjugates and their application in cell experiments. Additionally, DPs can be employed to covalently rebridge the interchain disulfides of therapeutically relevant IgG1 antibodies. Furthermore, with the help of density functional theory based calculations, ethynyl-triazolyl-phosphinates (ETP) were discovered as a new class of highly reactive electrophilic warheads for cysteine bioconjugation. According to the calculations, both the electron withdrawing as well as the π-electron donating properties of the triazole-ring enhance the reactivity of the electrophile. Most importantly, it was demonstrated that ETP electrophiles can be incorporated into a given azide containing molecule via the chemoselective CuI-catalyzed azide alkyne cycloaddition. ETP-reagents were used to obtain functional peptide-, protein- and antibody-conjugates, as well as site-specifically linked diubiquitins. Finally, diethynyl phosphine oxides were explored as chemoselective reagents for disulfide rebridging. Especially diethynyl-triazolyl-phosphine oxides (DTP) are promising candidates since they combine the modular synthesis of ETP-electrophiles with the two reactive groups present in diethynyl phosphinates. The capability of DTP-reagents to rebridged disulfides was proven by the formation several functional antibody conjugates.

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In der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, dass enzymresponsive Peptid-Poly(ethylenglycol)-Konjugate (Peptid-PEG-Konjugate) effizient biotransformiert und proteinresistente Beschichtungen ausbilden können. Die oberflächenspezifische Haftung eines linearen Biokonjugates auf Basis einer literaturbekannten Adhäsionsdomäne für Titandioxid-Oberflächen wurde durch Verlängerung mit einer proteolytisch spaltbaren Erkennungssequenz und einer Suppressionsdomäne temporär unterbunden. Aus einer Serie unterschiedlich modifizierter Biokonjugate wurde eine anionische Suppressionsdomäne als besonders leistungsfähige haftungsunterdrückende Einheit identifiziert. Die Prozessierung des nicht-bindenden Vorläufers mit einer spezifischen Cysteinprotease hervorgehend aus dem Tabakätzvirus (TEV Protease) bewirkte die Abtrennung der eingeführten Modifikation. Durch die Biotransformation wurden die Haftungseigenschaften der polymergebundenen Adhäsionsdomäne zurückgebildet. Das aktivierte Biokonjugat ermöglichte die nicht-kovalente PEGylierung der Metalloxid-Oberfläche. Das Konzept wurde auf divalente Peptid-PEG-Konjugate unter Verwendung verzweigter Adhäsionsdomänen und verlängerter Suppressionsdomänen übertragen. Die proteolytisch aktivierte Dimer-Beschichtung zeigte eine erhöhte Stabilität im Vergleich zum linearen Biokonjugat und demonstrierte vielversprechende Antifouling-Eigenschaften gegenüber der unspezifischen Adsorption eines Modellproteins für Serumproteine des menschlichen Blutes auf Titandioxid-Oberflächen. / The present thesis has shown that enzyme-responsive peptide-poly(ethylene glycol) (peptide-PEG) conjugates can be efficiently biotransformed to create protein-resistant coatings. The surface-specific adsorption of a linear bioconjugate is temporarily suppressed by extending a titanium dioxide adhesion domain known from literature with a proteolytically cleavable recognition site and a suitable interfering domain. From a series of differently modified bioconjugates, an anionic interfering domain was identified as particularly effective to suppress adhesive functions. The enzymatic processing of the non-binding precursor with a specific cysteine protease derived from tobacco etch virus (TEV protease) resulted in the separation of the introduced modification. The adhesive properties of the polymer-bound binding sequence were reproduced by the biotransformation process. The activated bioconjugate allowed the non-covalent PEGylation of the metal oxide surface. The concept was applied to divalent peptide-PEG conjugates using branched adhesion domains and extended interfering domains. The proteolytically activated dimer coating showed increased stability against dilution compared to the linear bioconjugate and demonstrated promising antifouling properties against the non-specific adsorption of a model protein for human blood serum proteins to titanium dioxide surfaces.

Native chemische Ligation ist heutzutage die Methode der Wahl für die chemische Synthese von Proteinen. Die Voraussetzung der Methode: ein Cystein Rest am N-Terminus, gilt als größter Nachteil der Methode. N-alpha-Auxiliare werden seit mehreren Jahren als Cystein-Surrogat verwendet, um diese Einschränkungen zu überwinden. Aufgrund zahlreicher Einschränkungen haben sich die Auxiliare als Standard Methode nicht durchgesetzt. Im ersten Teil der Arbeit wurde eine neue Klase N-alpah-Auxiliare entwickelt. Die Auxiliare sind einfach zu synthesieren, können direkt auf den Festphasen in das Peptid eingeführt und unter milden basischen Bedingungen wieder abgespalten werden. Modelversuche wurden durchgeführt um ihr Eigenschaften hinsichtlich der native chemische Ligation und Abspaltung zu evaluieren. Daraufhin wurden die Auxiliare für die Synthese der antimikrobiellen Domäne des Dermicidin Proteins verwendet. Die chemische Ligation an der festen Phase hat in den letzten Jahren erheblich an Popularität gewonnen. Die Methode profitiert von der einfachen Reinigungseigenschaften der Festphasensynthese und erlaubt die sequenzielle Verknüpfung von mehreren Peptidfragmenten zu den gewünschten Zielproteinen mit hohen Reinheiten. Im zweiten Teil der Dissertation wurde das Konzept der chemische Festphasen Ligation mit der Hilfe eines „Second Generation“ Auxiliar über die Cysteinchemie hinaus erweitert. Durch Auxiliar-unterstüzte Festphase Ligation“ wurde die variable tandem repeats Domäne des MUC1 Proteins hergestellt. / Native chemical ligation continues to lead as the method of choice for the total chemical synthesis of proteins. Despite the methods broad use the method requirement for a terminal cysteine residue remains its biggest disadvantage. N-alpah-auxiliaries have long been used to overcome this inherent hindrance by acting as cysteine mimics. The method however has still not achieved broad use due to several key issues. In the first part of the thesis a new class of N-alpha-auxiliaries is presented. The auxiliaries are straightforwardly synthesized, readily introduced onto the peptide building blocks and cleaved under mild basic conditions. Model tests were carried out to evaluate the auxiliaries’ characteristics and their removal chemistry was developed. Finally, the auxiliary was utilized for the synthesis of the antimicrobial C-terminal domain of Dermicidine. Solid phase chemical ligation has grown in popularity in the recent years. Benefitting from the solid-phase inherent purification characteristic it allows for multiple peptide fragments to be ligated in a sequential fashion to yield the full length protein target in high purity. In the second part of the dissertation the concept of solid phase chemical ligation is expanded beyond the cysteine junction using a “second generation” auxiliary. MUC1 protein variable tandem repeats domain was synthesized using auxiliary-assisted solid phase chemical ligation.

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