The oviduct plays an important role in the complex process of fertilization and in the early phase of embryo development. Isolation and characterization of some components of bovine oviduct participating in the formation of oviductal sperm reservoir was a subject of the present study. Two affinity sorbents containing immobilized components of bull seminal plasma (non-separated proteins of bull seminal plasma and their phosphorylcholine binding fraction) were prepared and used for the study of interaction of immobilized ligands with components of oviductal epithelium. Two types of preparation of oviductal membrane proteins of the isthmus region were isolated: complete membrane proteins and the apical fraction of membrane proteins. These preparations were separated using prepared affinity matrices. in both cases only an insignificant amount of proteins was found in the adsorbed fractions. Further attention has been paid to the identification of four protein zones detected after electrophoretic separation in the presence of SDS (rel. mol. wt. 15 500 - 18 500) in the fraction of apical membrane proteins. These proteins were identified after the electrophoretic separation and tryptic digestion using MS analysis as bovine histones H4, H2A typ 2-C, H2B typ 1-K a H3.3. Proteins identified as bovine...

En el presente trabajo investigamos las variaciones a lo largo del ciclo estral de la actividad enzimática de 7 exoglicosidasas (alfa-L-fucosidasa, beta-N-acetil-glucosaminidasa, beta-D-galactosidasa, alfa-D-galactosidasa, alfa-D-manosidasa, beta-N-acetil-galactosaminidasa y N-acetil-neuraminidasa), de la cantidad de proteínas y del volumen de fluido oviductal bovino y porcino. El fluido oviductal se obtuvo de hembras prepúbres y adultas sacrificadas en matadero y se clasificó de acuerdo a la morfología ovárica en fluido oviductal en fase folicular (temprana y tardía) y fase luteal (temprana y tardía). Se observaron diferencias significativas a lo largo del ciclo estral en la actividad enzimática de algunas glicosidasas, la cantidad de proteínas y el volumen de fluido obtenido. / In the present work we studied the variations along the estral cycle of 7 different glycosidases (alfa-L-fucosidase, beta-N-acetil-glucosaminidase, beta-D-galactosidase, alfa-D-galactosidase, alfa-D-manosidase, beta-N-acetyl-galactosaminidase and N-acetyl-neuraminidase), of total amount of proteins and volume of bovine and porcine oviductal fluid. Oviductal fluid was obtained from females slaughtered at the abattoir and fluid classified according the ovary morphology into follicular phase (early and late) and luteal phase (early and late). Differences among enzymatic activity, total amount of proteins and volume of oviductal fluid were observed in both species along the estral cycle.

La capacitación es un proceso fisiológico que el espermatozoide debe experimentar para que la fecundación del ovocito tenga lugar. Este proceso se encuentra regulado en el espermatozoide por diferentes vías moleculares, varias de las cuales, a día de hoy, se desconocen o no están totalmente dilucidadas. Estos eventos moleculares que acontecen en el espermatozoide durante el proceso de capacitación están condicionados por distintos factores que rodean su entorno, entre los cuales podemos destacar el ambiente epididimario, el plasma seminal o las secreciones del aparato reproductor femenino como el fluido oviductal. El objetivo principal de este trabajo fue analizar el comportamiento de espermatozoides epididimarios-EP (en contacto con el fluido epididimario y no con el plasma seminal) y eyaculados-EY (en contacto con el plasma seminal) sometidos a 3 tratamientos diferentes: 1) Espermatozoides no tratados (grupo control-C); 2) Lavados a través de gradientes de Percoll e incubados en medio de capacitación TALP (grupo lavados-L); 3) Espermatozoides lavados e incubados en Fluido Oviductal Porcino (grupo FOP).

As novas biotécnicas são ferramentas inovadoras no estudo da fisiologia da reprodução de cães, bem como na preservação do material genético de espécies ameaçadas de extinção. Tendo em vista, pois, a relevância de tais ferramentas, emprestou-se a este estudo o objetivo maior de avaliar os efeitos do 17-ß estradiol, progesterona e do co-cultivo em células da tuba uterina na maturação in vitro de oócitos de cães. Ovários de cadelas em anestro foram fatiados em PBS com 10% SFB. Os oócitos foram selecionados e divididos em 8 grupos: grupo 1 (sem suplementação hormonal), grupo 2 (20 µg/ml de 17-ß estradiol), grupo 3 (20 µg/ml de progesterona), grupo 4 (20 µg/ml de 17-ß estradiol e 20 µg/ml de progesterona), grupo 5 (co-cultivo em células da tuba uterina sem suplementação hormonal), grupo 6 (co-cultivo em células da tuba uterina + 20 mg/ml de 17-ß estradiol), grupo 7 (co-cultivo em células da tuba uterina + 20 µg/ml de progesterona) e grupo 8 (co-cultivo em células da tuba uterina + 20 µg/ml de 17-ß estradiol + 20 µg/ml de progesterona). O cultivo das células da tuba uterina foi realizado por no mínimo 48 horas previamente à adição dos oócitos. Para a maturação, utilizou-se TCM 199 suplementado com 2,5 µg/ml de FSH e 5 µg/ml de LH. Decorridas 48, 72 e 96 horas em estufa a 39&ordm;C, 5% de CO2 em ar e alta umidade, os oócitos foram fixados em paraformaldeído a 4% com Triton 10X e corados com Hoescht 33342 (10 µg/ml) em glicerol. O estágio de maturação nuclear (vesícula germinativa - VG, quebra da vesícula germinativa – QVG, metáfase I – MI, metáfase II – MII, degenerados ou não passíveis de determinação) foi avaliado em microscópio invertido equipado com luz ultravioleta e filtro de 365-420 de excitação/emissão. Os dados foram analisados mediante o PROC NPAR1WAY de análise de variância não paramétrica, sendo o efeito dos tratamentos verificado por meio do teste de Kruskal-Wallis, e as comparações múltiplas do teste de Wilcoxon com os tratamentos comparados dois a dois, considerando as diferenças significativas quando p<0,05. Verificou-se influência positiva da suplementação hormonal no desenvolvimento oocitário in vitro, particularmente com referência à adição de progesterona, associada ou não ao estrógeno. Não houve influência significativa do co-cultivo de células da tuba uterina na maturação oocitária em comparação aos meios de cultivo, sem presença de células epiteliais da tuba uterina, suplementados com hormônios esteróides. Conquanto sem significância estatística, verificou-se tendência de os oócitos, obtidos de cadelas em anestro, desenvolverem-se ao estágio de metáfase II após o período de maturação de 96 horas. Demonstrou-se, portanto, ser plenamente exeqüível o estudo da maturação de oócitos de cães em sistemas de cultivo in vitro a partir de ovários obtidos por ovário-histerectomia, tal estudo propicia, ademais, a pesquisa de características reprodutivas fisiológicas da espécie. / Recent biotechniques are innovative tools for the canine reproductive physiology research, as well as for assisted reproduction of endangered species. The aim of this study was to evaluate the effects of estradiol-17ß, progesterone and the co-culture with oviductal ephitelial cells on in vitro maturation. Ovaries from anestrous bitches were sliced in PBS with 10% FCS. Oocytes were selected and distributed in 8 groups: group 1 (no hormonal suplementation), group 2 (estradiol-17ß at 20 µg/ml), group 3 (progesterone at 20 µg/ml), group 4 (estradiol-17ß at 20 µg/ml + progesterone at 20 µg/ml), group 5 (co-culture in oviductal ephitelial cells without hormonal suplementation), group 6 (co-culture in oviductal ephitelial cells + estradiol-17ß at 20 µg/ml), group 7 (co-culture with oviductal ephitelial cells + progesterone at 20 µg/ml) and group 8 (co-culture with oviductal ephitelial cells + estradiol-17ß at 20 µg/ml + progesterone at 20 µg/ml). Oviductal ephitelial cells culture was performed at least 48 hours prior to oocyte co-culture. For in vitro maturation, TCM 199 supplemented with FSH (2.5 &micro;g/ml) and LH (5 &micro;g/ml) was utilized. After periods of 48, 72 and 96 hour at 39ºC in humidified atmosphere of 5% CO2 in air, oocytes were fixed with Triton-X10 in paraformaldehyde at 4% and and stained with Hoescht 33342 (10 µg/ml) in glycerol. Oocytes were examined through an inverted fluorescence microscope equipped with a 365-420 nm wavelength excitation/emisson filter. Nuclear maturation was classified according to chromatin configuration as: germinal vesicle stage (GV), germinal vesicle break down (GVBD), metaphase I (MI), metaphase II (MII) and degenerated and unidentifiable oocytes. Data was evaluated through PROC NPAR1WAY of non parametrical variance analysis and treatment was verified by the Kruskal-Wallis test and the Wilcoxon test for multiple comparisions. Differences were considered significant at p<0.05. Positive influence of hormonal supplementation for oocyte development rates was verified, particularly with respec to progesterone. No significant influence of oviductal cells co-culture was however verified. In addition, a tendency of the oocytes reaching metaphase II in the 96 hour period was observed. Therefore, the study of canine in vitro oocyte maturation is feasible and provides an important tool for reproductive physiology research.

As novas biotécnicas são ferramentas inovadoras no estudo da fisiologia da reprodução de cães, bem como na preservação do material genético de espécies ameaçadas de extinção. Tendo em vista, pois, a relevância de tais ferramentas, emprestou-se a este estudo o objetivo maior de avaliar os efeitos do 17-ß estradiol, progesterona e do co-cultivo em células da tuba uterina na maturação in vitro de oócitos de cães. Ovários de cadelas em anestro foram fatiados em PBS com 10% SFB. Os oócitos foram selecionados e divididos em 8 grupos: grupo 1 (sem suplementação hormonal), grupo 2 (20 µg/ml de 17-ß estradiol), grupo 3 (20 µg/ml de progesterona), grupo 4 (20 µg/ml de 17-ß estradiol e 20 µg/ml de progesterona), grupo 5 (co-cultivo em células da tuba uterina sem suplementação hormonal), grupo 6 (co-cultivo em células da tuba uterina + 20 mg/ml de 17-ß estradiol), grupo 7 (co-cultivo em células da tuba uterina + 20 µg/ml de progesterona) e grupo 8 (co-cultivo em células da tuba uterina + 20 µg/ml de 17-ß estradiol + 20 µg/ml de progesterona). O cultivo das células da tuba uterina foi realizado por no mínimo 48 horas previamente à adição dos oócitos. Para a maturação, utilizou-se TCM 199 suplementado com 2,5 µg/ml de FSH e 5 µg/ml de LH. Decorridas 48, 72 e 96 horas em estufa a 39&ordm;C, 5% de CO2 em ar e alta umidade, os oócitos foram fixados em paraformaldeído a 4% com Triton 10X e corados com Hoescht 33342 (10 µg/ml) em glicerol. O estágio de maturação nuclear (vesícula germinativa - VG, quebra da vesícula germinativa – QVG, metáfase I – MI, metáfase II – MII, degenerados ou não passíveis de determinação) foi avaliado em microscópio invertido equipado com luz ultravioleta e filtro de 365-420 de excitação/emissão. Os dados foram analisados mediante o PROC NPAR1WAY de análise de variância não paramétrica, sendo o efeito dos tratamentos verificado por meio do teste de Kruskal-Wallis, e as comparações múltiplas do teste de Wilcoxon com os tratamentos comparados dois a dois, considerando as diferenças significativas quando p<0,05. Verificou-se influência positiva da suplementação hormonal no desenvolvimento oocitário in vitro, particularmente com referência à adição de progesterona, associada ou não ao estrógeno. Não houve influência significativa do co-cultivo de células da tuba uterina na maturação oocitária em comparação aos meios de cultivo, sem presença de células epiteliais da tuba uterina, suplementados com hormônios esteróides. Conquanto sem significância estatística, verificou-se tendência de os oócitos, obtidos de cadelas em anestro, desenvolverem-se ao estágio de metáfase II após o período de maturação de 96 horas. Demonstrou-se, portanto, ser plenamente exeqüível o estudo da maturação de oócitos de cães em sistemas de cultivo in vitro a partir de ovários obtidos por ovário-histerectomia, tal estudo propicia, ademais, a pesquisa de características reprodutivas fisiológicas da espécie. / Recent biotechniques are innovative tools for the canine reproductive physiology research, as well as for assisted reproduction of endangered species. The aim of this study was to evaluate the effects of estradiol-17ß, progesterone and the co-culture with oviductal ephitelial cells on in vitro maturation. Ovaries from anestrous bitches were sliced in PBS with 10% FCS. Oocytes were selected and distributed in 8 groups: group 1 (no hormonal suplementation), group 2 (estradiol-17ß at 20 µg/ml), group 3 (progesterone at 20 µg/ml), group 4 (estradiol-17ß at 20 µg/ml + progesterone at 20 µg/ml), group 5 (co-culture in oviductal ephitelial cells without hormonal suplementation), group 6 (co-culture in oviductal ephitelial cells + estradiol-17ß at 20 µg/ml), group 7 (co-culture with oviductal ephitelial cells + progesterone at 20 µg/ml) and group 8 (co-culture with oviductal ephitelial cells + estradiol-17ß at 20 µg/ml + progesterone at 20 µg/ml). Oviductal ephitelial cells culture was performed at least 48 hours prior to oocyte co-culture. For in vitro maturation, TCM 199 supplemented with FSH (2.5 &micro;g/ml) and LH (5 &micro;g/ml) was utilized. After periods of 48, 72 and 96 hour at 39ºC in humidified atmosphere of 5% CO2 in air, oocytes were fixed with Triton-X10 in paraformaldehyde at 4% and and stained with Hoescht 33342 (10 µg/ml) in glycerol. Oocytes were examined through an inverted fluorescence microscope equipped with a 365-420 nm wavelength excitation/emisson filter. Nuclear maturation was classified according to chromatin configuration as: germinal vesicle stage (GV), germinal vesicle break down (GVBD), metaphase I (MI), metaphase II (MII) and degenerated and unidentifiable oocytes. Data was evaluated through PROC NPAR1WAY of non parametrical variance analysis and treatment was verified by the Kruskal-Wallis test and the Wilcoxon test for multiple comparisions. Differences were considered significant at p<0.05. Positive influence of hormonal supplementation for oocyte development rates was verified, particularly with respec to progesterone. No significant influence of oviductal cells co-culture was however verified. In addition, a tendency of the oocytes reaching metaphase II in the 96 hour period was observed. Therefore, the study of canine in vitro oocyte maturation is feasible and provides an important tool for reproductive physiology research.

Os padrões de estocagem de esperma e as variações morfológicas cíclicas do trato reprodutivo feminino constituem táticas reprodutivas muito pouco estudadas em serpentes neotropicais, se comparadas às serpentes de regiões temperadas. Assim, o presente estudo teve por objetivo caracterizar e compreender as estratégias reprodutivas empregadas por fêmeas de quatro espécies de serpentes brasileiras da subfamília Xenodontinae. Amostras de gônadas e vias genitais foram coletadas em diferentes estações do ano e relacionadas aos estágios reprodutivos da fêmea. Os resultados indicaram que as serpentes estudadas possuem dois locais de estocagem de esperma distribuídos no infundíbulo posterior e na junção útero-vaginal. Liophis miliaris, Oxyrhopus guibei e Philodryas patagoniensis apresentaram estocagem por meio de glândulas túbulo-alveolares ramificadas e glândulas tubulares ciliadas no infundíbulo posterior. Das quatro espécies estudadas, apenas Tomodon dorsatus e P. patagoniensis apresentaram grupos de espermatozóides armazenados nos sulcos da junção útero-vaginal. No entanto, unicamente P. patagoniensis parece ter a capacidade de produzir várias ninhadas com esperma estocado proveniente dessa região. Em ambos os locais de estocagem as células secretoras aumentaram a produção de carboidratos neutros na presença de esperma, o que sugere um processo de nutrição. Em fêmeas vitelogênicas o aumento da atividade secretora do epitélio ovidutal com produção de vacúolos eletrodensos parece estar sobre controle hormonal. Durante o ciclo reprodutivo as glândulas uterinas de espécies ovíparas e vivíparas também mostraram um aumento da secreção em fêmeas vitelogênicas. No entanto, as glândulas uterinas das espécies ovíparas apresentaram uma maior atividade do retículo endoplasmático rugoso, o que indicou produção de proteínas para formação da membrana da casca. O ciclo reprodutivo e a época de acasalamento variaram entre as populações das diferentes espécies. Em L. miliaris, O. guibei e P. patagoniensis essas variações estiveram ligadas a mudanças na temperatura e pluviosidade, já T. dorsatus não apresentou variações no ciclo reprodutivo, provavelmente influenciada pela inércia filogenética. / Sperm storage patterns and cyclic morphological variations in the female reproductive tract are poorly studied reproductive tactics in Neotropical snakes if a comparison to snakes from temperate regions is established. Therefore, the aim of this study is to characterize and understand the female reproductive strategies of four species of Xenodontinae snakes from Brazil. Samples of the gonads and genital ducts were collected during the different seasons of the year and a correlation with female reproductive stages was established. Results show that these snakes have two sperm storage sites in the posterior infundibulum and uterovaginal junction. Liophis miliaris, Oxyrhopus guibei and Philodryas patagoniensis store sperm by means of branched tubuloalveolar glands and tubular ciliated glands in the posterior infundibulum. Only Tomodon dorsatus and P. patagoniensis showed sperm stored in the furrows of the uterovaginal junction. Anyway, only P. patagoniensis seems to be capable of producing multiple clutches using sperm stored in this portion. Secretory cells increased the production of neutral carbohydrates in the presence of sperm in both sperm storage sites, which suggests the existence of a nutrition process. In vitellogenic females, the increase of the secretory activity in the oviductal epithelium with production of eletrodense vacuoles seems to be under hormonal control. During the reproductive cycle, uterine glands of oviparous and viviparous species also showed an increase in secretion in vitellogenic females. However, uterine glands of oviparous species showed more intense activity of the rough endoplasmic reticulum, which indicates the production of proteins for the formation of the egg shell. Reproductive cycles and timing of mating varied between different populations. In L. miliaris, O. guibei and P. patagoniensis, these variations were linked to the changes in temperature and rainfall patterns, but T. dorsatus did not show any variation in the reproductive cycles between populations, probably influenced by phylogenetic inertia.

Os padrões de estocagem de esperma e as variações morfológicas cíclicas do trato reprodutivo feminino constituem táticas reprodutivas muito pouco estudadas em serpentes neotropicais, se comparadas às serpentes de regiões temperadas. Assim, o presente estudo teve por objetivo caracterizar e compreender as estratégias reprodutivas empregadas por fêmeas de quatro espécies de serpentes brasileiras da subfamília Xenodontinae. Amostras de gônadas e vias genitais foram coletadas em diferentes estações do ano e relacionadas aos estágios reprodutivos da fêmea. Os resultados indicaram que as serpentes estudadas possuem dois locais de estocagem de esperma distribuídos no infundíbulo posterior e na junção útero-vaginal. Liophis miliaris, Oxyrhopus guibei e Philodryas patagoniensis apresentaram estocagem por meio de glândulas túbulo-alveolares ramificadas e glândulas tubulares ciliadas no infundíbulo posterior. Das quatro espécies estudadas, apenas Tomodon dorsatus e P. patagoniensis apresentaram grupos de espermatozóides armazenados nos sulcos da junção útero-vaginal. No entanto, unicamente P. patagoniensis parece ter a capacidade de produzir várias ninhadas com esperma estocado proveniente dessa região. Em ambos os locais de estocagem as células secretoras aumentaram a produção de carboidratos neutros na presença de esperma, o que sugere um processo de nutrição. Em fêmeas vitelogênicas o aumento da atividade secretora do epitélio ovidutal com produção de vacúolos eletrodensos parece estar sobre controle hormonal. Durante o ciclo reprodutivo as glândulas uterinas de espécies ovíparas e vivíparas também mostraram um aumento da secreção em fêmeas vitelogênicas. No entanto, as glândulas uterinas das espécies ovíparas apresentaram uma maior atividade do retículo endoplasmático rugoso, o que indicou produção de proteínas para formação da membrana da casca. O ciclo reprodutivo e a época de acasalamento variaram entre as populações das diferentes espécies. Em L. miliaris, O. guibei e P. patagoniensis essas variações estiveram ligadas a mudanças na temperatura e pluviosidade, já T. dorsatus não apresentou variações no ciclo reprodutivo, provavelmente influenciada pela inércia filogenética. / Sperm storage patterns and cyclic morphological variations in the female reproductive tract are poorly studied reproductive tactics in Neotropical snakes if a comparison to snakes from temperate regions is established. Therefore, the aim of this study is to characterize and understand the female reproductive strategies of four species of Xenodontinae snakes from Brazil. Samples of the gonads and genital ducts were collected during the different seasons of the year and a correlation with female reproductive stages was established. Results show that these snakes have two sperm storage sites in the posterior infundibulum and uterovaginal junction. Liophis miliaris, Oxyrhopus guibei and Philodryas patagoniensis store sperm by means of branched tubuloalveolar glands and tubular ciliated glands in the posterior infundibulum. Only Tomodon dorsatus and P. patagoniensis showed sperm stored in the furrows of the uterovaginal junction. Anyway, only P. patagoniensis seems to be capable of producing multiple clutches using sperm stored in this portion. Secretory cells increased the production of neutral carbohydrates in the presence of sperm in both sperm storage sites, which suggests the existence of a nutrition process. In vitellogenic females, the increase of the secretory activity in the oviductal epithelium with production of eletrodense vacuoles seems to be under hormonal control. During the reproductive cycle, uterine glands of oviparous and viviparous species also showed an increase in secretion in vitellogenic females. However, uterine glands of oviparous species showed more intense activity of the rough endoplasmic reticulum, which indicates the production of proteins for the formation of the egg shell. Reproductive cycles and timing of mating varied between different populations. In L. miliaris, O. guibei and P. patagoniensis, these variations were linked to the changes in temperature and rainfall patterns, but T. dorsatus did not show any variation in the reproductive cycles between populations, probably influenced by phylogenetic inertia.

La fecundación en mamíferos consiste básicamente en la fusión de los gametos masculino y femenino para formar un zigoto capaz de dar lugar a un nuevo individuo. Hasta ahora, la mayoría de las investigaciones encaminadas al esclarecimiento de este proceso se han centrado en el estudio de la biología de ambos gametos como células aisladas, o bien en el estudio de los diversos mecanismos que tienen lugar durante la interacción de ambos. Sin embargo, se ha dejado un poco de lado a otro elemento fundamental y sin el cual el resto de estudios pueden resultar incompletos: el microambiente en el que tiene lugar el encuentro entre los gametos, es decir, el fluido y las células oviductales que secretan ciertos componentes de dicho fluido. La fase folicular tardía o etapa inmediatamente preovulatoria, es el momento en el que el oviducto se encuentra preparado para el encuentro de los gametos y para que se produzca la fecundación. Debido a la importancia de los factor es implicados en la unión de gametos que han de estar presentes en este momento preciso del ciclo estral y a la escasez de información acerca de los mismos, centramos nuestro estudio en esta fase. Para ello, se abordó el análisis de los componentes oviductales y sus características fundamentalmente desde cuatro perspectivas: (1) efecto del fluido oviductal (FO) sobre la resistencia a la digestión enzimática de la zona pelúcida en 9 especies, (2) fraccionamiento del FO bovino en base a su capacidad de unión a heparina, (3) análisis proteómico del FO y (4) análisis de la expresión génica del oviducto porcino. / Fertilization in mammals is basically the merging of male and female gametes to form a zygote that can give rise to a new individual. So far, most research aimed at clarifying this process have focused either on the study of the biology of the spermatozoon and the oocyte as isolated cells or in the study of the various mechanisms that occur during the interaction of both. However, it has been partially left to one side to another key element without which the other studies may be incomplete: the microenvironment in which the meeting takes place between the gametes, ie the fluid and the oviductal cells that secrete some components of such a fluid. The late follicular phase or immediately pre-ovulatory phase is the time when the oviduct is prepared for the meeting of gametes and fertilization occurs. Due to the importance of the factors involved in the gametes interaction which must be present at this precise moment of the estrous cycle and the scarcity of information about them, we focused our study on this phase. To do so, it was addressed the analysis of oviductal components and features mainly from four perspectives: (1) effect of oviductal fluid (OF) on the resistance to enzymatic digestion of the zona pellucida in 9 species, (2) fractionation of the bovine oviductal fluid based on their ability to bind to heparin, (3) proteomic analysis of OF and (4) gene expression analysis of pig oviduct.

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