ARAÚJO, Rayza Lima. Quantificação de bactérias entéricas em sítios anatômicos e líquido intervalvar de ostras (Crassostrea rhizophorae) e caracterização de isolados de Escherichia coli. 2013. 72 f. : Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Ceará, Centro de Ciências Agrárias, Departamento de Engenharia de Pesca, Fortaleza-CE, 2013 / Submitted by Nádja Goes (nmoraissoares@gmail.com) on 2016-07-21T12:44:56Z No. of bitstreams: 1 2013_dis_rlaraújo.pdf: 1057950 bytes, checksum: 1d6c5772a5e213e790c01a58e0b1adca (MD5) / Approved for entry into archive by Nádja Goes (nmoraissoares@gmail.com) on 2016-07-21T12:45:12Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_dis_rlaraújo.pdf: 1057950 bytes, checksum: 1d6c5772a5e213e790c01a58e0b1adca (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-21T12:45:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_dis_rlaraújo.pdf: 1057950 bytes, checksum: 1d6c5772a5e213e790c01a58e0b1adca (MD5) Previous issue date: 2013 / Fecal coliforms have been described as one of the best indicators of pollution in the aquatic environments by human wastes, and it is widely used as a parameter for classifying areas where oysters are farmed or extracted. Among Enterobacteriaceae members, E. coli stands out as potential pathogenic specie, representing risk for public healthy when associated with consumption of raw or undercooked bivalves. However, little is known about this colonization in the bivalve tissues and/or distribution of these enteric bacteria. The objective of the present study was to: (i) quantify fecal coliforms from body fluid and anatomical sites, separately; (ii) isolate and identify E. coli in oysters commercialized in natura in Praia do Futuro beach, Fortaleza-Ceará; (iii) evaluate the virulence profile and resistance to antimicrobial agents of E. coli isolates. The study covered ten samples, from February to April 2012, by analyzing twelve oysters for sample, divided into a body fluid (intervalvar liquor) and two anatomical sites (mantle and gastrointestinal tract). Fecal coliforms concentration was higher than allowed by legislation nº 12/2001 of ANVISA in three samples, and intervalvar liquor presented higher MPN in six samples. Out of 137 E. coli strains isolated, 19% was resistant to both tetracycline and oxytetracycline, and MAR ranged from 0,250 to 0,625. It is further noted producing expended spectrum beta lactamases strains, however none showed biofilm production. The major frequency resistance to oxytetracycline suggests a selective pressure to mangrove ecosystem microbiota that could be directly affected by farming shrimp activity, practiced in a region next to Parnaíba city, located in Piauí state, where oysters are extracted. In addition, the presence of multiple resistance can be a risk for in natura oyster consumers. / Os coliformes termotolerantes têm sido descritos como um dos melhores indicadores de contaminação de ambientes aquáticos por resíduos humanos, sendo amplamente utilizado como parâmetro para classificação de áreas onde se cultiva ou extrai ostras. Dentre os membros deste grupo, a Escherichia coli se destaca como uma espécie potencialmente patogênica, representando risco para a saúde pública quando associada ao consumo de moluscos bivalves crus ou parcialmente cozidos. Entretanto, pouco é sabido sobre a colonização nos tecidos desses moluscos e/ou distribuição dessas bactérias entéricas. O presente estudo teve como objetivos:(i) quantificar coliformes termotolerantes do fluido corporal e dos sítios anatômicos, separadamente;(ii) isolar e identificar E. coli de amostras de ostras comercializadas in natura na Praia do Futuro, Fortaleza-Ceará;(iii) avaliar o perfil de virulência e resistência a antimicrobianos dos isolados de E. coli. Foram realizadas dez coletas no período de fevereiro a abril de 2012, sendo analisadas dez ostras por coleta, divididas em um fluido corporal (líquido intervalvar) e dois sítios anatômicos (músculo e trato gastrointestinal). Os resultados apontaram três amostras com contagens de coliformes acima do limite estabelecido pela legislação nº 12 de 2001 da ANVISA, tendo o líquido intervalvar apresentado o NMP mais elevado em seis amostras. Das 137 cepas de E. coli isoladas, verificou-se maior incidência de resistência à tetraciclina e oxitetraciclina (19%), com variação do Índice de Múltipla Resistência (MAR) entre 0,250 e 0,625. Observou-se ainda a presença de cepas produtoras de enzimas beta-lactamases de espectro estendido, porém nenhuma das cepas testadas apresentou produção de biofilme. A elevada frequência de resistência à oxitetraciclina sugere uma pressão seletiva sobre a microbiota do ecossistema manguezal, que pode ser afetada diretamente pela atividade de carcinicultura, praticada na região próxima à cidade de Parnaíba, localizada no Estado do Piauí, de onde as ostras são extraídas. Além disso, a presença de múltipla resistência aos antimicrobianos observada pode ser indicativa de risco para os consumidores de ostra in natura.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Crassostrea (Sacco, 1897) é o gênero mais importante do mundo de ostras de cultivo e consiste de 34 espécies distribuídas pelas regiões tropicais e temperadas do globo. C. gasar e C. rhizophorae são as duas espécies nativas que estão distribuídas ao longo de toda a costa do Brasil até o Caribe. C. gasar também ocorre na costa da Africa. Ainda que sua distribuição seja extensa e com disponibilidade abundante, o cultivo de ostras nativas no Brasil ainda é incipiente e a delimitação correta dos estoques mantém-se incerta. O sucesso do desenvolvimento da malacocultura, que é recomendada internacionalmente como forma sustentável de aquicultura, depende da resolução desses problemas. Assim, com o objetivo de determinar geneticamente seus estoques no Atlântico como também estimar sua história demográfica, dois diferentes marcadores moleculares foram empregados: sequências de DNA da região controle mitocondrial e loci de microssatélites espécie-especifícos, desenvolvidos no presente estudo. Foram sequenciados fragmentos da região controle de um total de 930 indivíduos de C. gasar e C. rhizophorae coletados em 32 localidades que incluíram o Caribe, a Guiana Francesa, a costa brasileira e a África. Também foram realizadas genotipagens de 1178 indivíduos, e ambas as espécies, com 9 e 11 loci de microssatélites para C. gasar e C. rhizophorae, respectivamente. Os dados genéticos foram analisados através de diferentes abordagens (índices de estruturação (FST) e de (Jost D), análise molecular de variância (AMOVA), análise espacial molecular de variância (SAMOVA), Bayesian Skyline Plots (BSP), análise fatorial de correspondência (AFC) e análise de atribuição Bayesiana (STRUCTURE)). Os resultados indicaram um padrão geral de estruturação, onde dois diferentes estoques foram detectados para ambas as espécies: grupos do norte e do sul, onde o Rio de Janeiro seria a região limitante entre os dois estoques. Os maiores valores dos índices de estruturação foram encontrados para C. gasar, indicando que esta espécie estaria mais estruturada do que C. rhizophorae. As análises demográficas indicaram uma provável expansão das populações durante o ultimo período glacial e uma possível origem americana das populações africanas. Todos os resultados sugeriram a existência de uma barreira geográfica próxima ao Rio de Janeiro, que poderia ser a cadeia de Vitória-Trindade e o fenômeno de ressurgência que ocorre em Cabo Frio (RJ). Esses resultados serão de grande utilidade para estabelecer critérios para seleção de sementes para cultivo ao longo da costa do Brasil que permitirá o manejo adequado dos estoques ostreícolas, prevenindo seu desaparecimento como já ocorrido em outros recifes no mundo. / Crassostrea (Sacco, 1897) is the most important genus of cultivated oysters in the world and consisting of 34 species distributed by tropical and temperate regions of the globe. C. gasar and C. rhizophorae are the two native species which have wide distribution along the entire Brazilian coast up to the Caribbean. C. gasar also occurs on coast of Africa. Despite its extensive distribution and abundant availability, cultivation of those oysters in Brazil is incipient, and the correct delimitation of the existing stocks is still uncertain. The successful development of malacoculture which is recommended internationally as an environmentally sustainable form of aquaculture depends on the resolution of these issues. Thus, in order to genetically determinate their stocks in the Atlantic and to estimate their demographic history, two different molecular markers were employed: sequences of the mitochondrial DNA control region and species-specific microsatellite loci, developed in the present study. We have sequenced a fragment of the mitochondrial control region from a total of 930 individuals of C. gasar and C. rhizophorae collected in 32 localities including the Caribbean, French Guyana, Brazilian coast and Africa. We have also genotyped 1178 individuals of both species with 9 and 11 loci of microsatellites for C. gasar and C. rhizophorae, respectively. Genetic data were analyzed with different approaches (fixation (FST) and differentiation (Jost D) indices, analysis of molecular variance (AMOVA), spatial analysis of molecular variance (SAMOVA), Bayesian Skyline Plots (BSP), factorial correspondence analysis (AFC) and Bayesian attribution analysis (STRUCTURE)). The results indicated a general structure pattern, where two different stocks were detected for both species: north and south groups, where Rio de Janeiro would be the limited region between them. Higher values of fixation indices were found for C. gasar, indicating that this species would be more structured than C. rhizophorae. Demographic analyses showed a probable expansion of populations during the last glacial period and a probable American origin of African populations. All results suggested the existence of a barrier next to Rio de Janeiro, which could be Vitoria-Trindade chain and the upwelling in the region of Cabo Frio (RJ). These results will be useful to establish criteria for the selection of seeds for cultivation along the Brazilian coast which will allow proper management of stocks of oysters preventing its disappearance as in other reefs around the world.

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / ClassificaÃÃes taxonÃmicas de ostras sÃo problemÃticas, pois estes organismos possuem caracterÃsticas morfolÃgicas pouco informativas. A variabilidade da regiÃo ITS do cluster ibossÃmico tem sido bastante utilizada em estudos filogenÃticos e taxonÃmicos, visto que esta regiÃo apresenta uma variabilidade relativamente elevada e fÃcil amplificaÃÃo por termociclagem. A ostra Crassostrea brasiliana foi, por dÃcadas, confundida com C. rhizophorae, entretanto, estudos recentes indicam que sÃo duas espÃcies biologicamente distintas. Esta pesquisa objetivou analisar a variabilidade da regiÃo ITS-1 de populaÃÃes de ostras C. rhizophorae em trÃs estuÃrios da costa do Estado do Cearà e investigar a presenÃa de uma segunda espÃcie de ostra pertencente ao gÃnero Crassostrea. Exemplares da ostra nativa C. cf. rhizophorae foram coletados nos estuÃrios da costa cearense para anÃlise de variabilidade populacional. Foram coletados tambÃm espÃcimes de C. cf. brasiliana para estudo de filogenia e comparaÃÃo com o primeiro grupo de ostras. ApÃs extraÃÃo de DNA e amplificaÃÃo por PCR da regiÃo ITS-1, seqÃÃncias desta regiÃo foram obtidas para anÃlise filogenÃtica realizada atravÃs dos mÃtodos de neighbour-joining e mÃxima parcimÃnia. SequÃncias de ITS-1 descritas no GenBank para 35 indivÃduos, representando 12 espÃcies de ostras do gÃnero Crassostrea, e mais duas seqÃÃncias de Saccostrea glomerata (grupo externo), foram utilizadas para os alinhamentos com as sequÃncias obtidas na presente pesquisa. A variabilidade intraespecÃfica de C.cf.rhizophorae foi estudada pelo mÃtodo da mÃxima parcimÃnia. SeqÃÃncias inÃditas de ITS-1 completo foram obtidas para C.brasiliana e C.rhizophorae, com 427 e 439 pb, respectivamente. A Ãrvore de neighbour-joining evidenciou a clara separaÃÃo de C.cf.brasiliana e C.cf.rhizophorae em ramos distintos (100%), confirmando a ocorrÃncia de, pelo menos, duas espÃcies de Crassostrea no local de estudo. O estudo sugere a ocorrÃncia de C.brasiliana no Estado do CearÃ. Embora alguns autores tenham considerado C.brasiliana sinÃnimo de C.virginica, em nosso estudo, C.virginica mostrou-se muito mais prÃxima de C.rhizophorae, com forte agrupamento (100%). A Ãrvore de mÃxima parcimÃnia mostrou que as seqÃÃncias de C.cf.brasiliana e C.cf.rhizophorae formaram um grupo monofilÃtico com as demais espÃcies de Crassostrea em 100% das repetiÃÃes. C.cf.brasiliana apresentou-se na base do ramo monofilÃtico de Crassostrea e, portanto, foi o grupo mais prÃximo de S.glomerata. Esta Ãrvore tambÃm mostrou a separaÃÃo dos exemplares de C.cf.brasiliana e C.cf.rhizophorae em ramos distintos (100%), evidenciando o forte sinal filogenÃtico observado na anÃlise. Novamente, C.cf.rhizophorae mostrou-se prÃxima de C.virginica. A anÃlise de mÃxima parcimÃnia para variabilidade intraespecÃfica de C.cf.rhizophorae nos trÃs estuÃrios estudados mostrou a formaÃÃo de 7 diferentes sequÃncias para C.cf.rhizophorae. A ligaÃÃo entre as sequÃncias encontradas sugere a presenÃa de fluxo gÃnico entre as populaÃÃes estudadas e a ocorrÃncia de sequÃncias exclusivas pode indicar a formaÃÃo de populaÃÃes residentes em cada um dos estuÃrios analisados. A regiÃo ITS-1 mostrou-se ideal para estudos de filogenia de ostras e estudos de variabilidade gÃnica populacional. A confirmaÃÃo de uma segunda espÃcie de ostra pertencente ao gÃnero Crassostrea na costa cearense à relevante para uma melhor gestÃo destes recursos, que possuem grande importÃncia ecolÃgica, econÃmica e social para nosso Estado. / Taxonomic classifications of oysters are problematic, because these bodies have little morphological information. The variability of the ITS region of the cluster ibossÃmico has been used in phylogenetic and taxonomic studies, since this region presents a relatively high variability and easy amplification by thermocycling. The oyster Crassostrea brasiliana was, by decades, confused with C. rhizophorae However, recent studies indicate that two biologically distinct species. This study aimed to analyze the variability of ITS-1 region of oyster populations of C. rhizophorae in three estuaries on the coast of Cearà State and investigate the presence of a second species of oysters belonging to the genus Crassostrea. Copies of the native oyster C. cf. rhizophorae were collected in the estuaries of the coast of Cearà for the analysis population ariability. Were also collected specimens of C. cf. brasiliana for study of phylogeny and compared with the first group of oysters. After extraction of DNA and amplification by PCR of the ITS-1 region, this region sequences were obtained for phylogenetic analysis performed by the methods of neighbor-joining and maximum parsimony. ITS-1 sequences described in GenBank for 35 individuals representing 12 species of oysters of the genus Crassostrea and two sequences of Saccostrea glomerata (external group) were used for the alignments with the sequences obtained in this study. The intraspecific variability of C.cf.rhizophorae was studied by the method of maximum parsimony. Unpublished sequences of ITS-1 were obtained for full C.brasiliana and C.rhizophorae with 427 and 439 bp, respectively. The neighbor-joining tree, showed the clear separation of C.cf.brasiliana and C.cf.rhizophorae in separate branches (100%), confirming the occurrence of at least two species of Crassostrea place of study. The study suggests the occurrence of C.brasiliana in the state of CearÃ. Although some authors have considered C.brasiliana synonymous with C.virginica in our study, C.virginica was very close to C.rhizophorae, with a strong group (100%). The tree of maximum parsimony showed that the sequences of C.cf.brasiliana and C.cf.rhizophorae formed a monophyletic group with other species of Crassostrea in 100% of replicates. C.cf.brasiliana presented on the basis of branch of Crassostrea monophyletic and, therefore, was the group nearest S.glomerata. This tree also showed the separation of the copies of C.cf.brasiliana and C.cf.rhizophorae in different branches (100%), showing the strong signal observed in the phylogenetic analysis. Again, C.cf.rhizophorae showed up near C.virginica. The maximum parsimony analysis of intraspecific variability of C.cf.rhizophorae for the three estuaries studied showed the formation of 7 different sequences for C.cf.rhizophorae. The connection between the sequences found suggests the presence of gene flow between populations and the occurrence of unique sequences may indicate the formation of resident populations in each of the estuaries examined. The region ITS-1 proved to be ideal for studies of phylogeny of oysters and studies of population genetic variability. Confirmation of a second species of oysters belonging to the genus Crassostrea in Cearà coast is important for better management of these resources, which have important ecological, economic and social to our state.

Foram aplicadas técnicas de análise e comparação de anatomia detalhada, através de dissecções e por análises moleculares em um grupo altamente variável como os Ostreidae com objetivo de comprovar o monofiletismo de Crassostreinae. Por ser economicamente importante em todo o mundo, a diferenciação entre as espécies é fundamental, com aplicações até na produção. Através de um estudo comparativo de morfologia detalhada, representantes de quase todos os gêneros de Ostreoidea foram analisados. Inicialmente, os representantes da subfamília Crassostreinae foram estudados isoladamente. Em cada uma foi realizada uma análise filogenética na procura de sua monofilia e de sua identidade básica. Os representantes de Ostreinae e Gryphaeidae foram utilizados como grupo-externo. Em seguida, alguns representantes de Pteriomorphia foram incorporados ao grupo-externo (Limidae, Spondylidae, Plicatulidae, Isognomonidae, Anomiidae) com enraizamento em Arcidae. Foram estudados 73 caracteres, presentemente comentados e discutidos. Uma única árvore mais parcimoniosa foi obtida: (((((((Cryptostrea permolis (Teskeyostrea weberi ((Hyotissa hyotis (Parahyotissa mcgintyi - P. numisma)) ((Eostrea puelchana - E. lurida) (Ostrea edulis (Ostreola equestris (\"Dendostrea\" sp1 ((Lopha cristagalli - Alectryonella plicatula) ((Dendostrea folium - D. sp 2) (\"Dendostrea\" frons (\"Saccostrea\" echinata (\"Saccostrea\" palmula (((Saccostrea mordax - \"Striostrea\" prismatica) (Saccostrea cucullata - S. glomerata)) ((Crassostrea virginica (C. gigas - C. bilineata)) (C. mangle (C. brasiliana - C. rhizophorae)))))))))))))))) Plicatulostrea onca) Plicatula gibbosa) Spondylus americanus) Lima sp.) (Anomia simplex - Isognomon alatus)) Barbatia cândida) tendo como índices: passos = 372, IC = 27 e IR = 58. Nota-se que a monofilia de Crassostreinae foi comprovada e é suportada por 6 sinapomorfias, Crassostrea também é monofilético, suportado por 4 sinapomorfias. Saccostrea, considerando a espécie tipo S. cucullata, é monofilético junto com S. glomerata. Dados obtidos por análises moleculares, realizadas neste e dados do GenBank®, corrobora, em parte, com os dados anatômicos; Crassostrea é considerado monofilético em ambas análises. As diferenças e semelhanças morfo-anatômicas encontradas em quase todas as estruturas foram suficientes para a separação e agrupamento entre os gêneros e respectivas espécies / Techniques of analysis and comparison of detailed anatomy through dissections and molecular analysis were applied in a highly variable group as Ostreidae in order to prove the monophyly of Crassostreinae. Being economically important worldwide, differentiation between species is essential in applications to production. Through a detailed comparative study of morphology, representatives of almost all genres of Ostreoidea were analyzed. Initially, the representatives of the subfamily Crassostreinae were studied in isolation. A phylogenetic analysis was performed in the search for your monophyly and their basic identity in each one. Representatives of Ostreinae Gryphaeidae and were used as-external. Then, some representatives of Pteriomorphia were incorporated into the group-external (Limidae, Spondylidae, Plicatulidae, Isognomonidae, Anomiidae) with rooting Arcidae. 73 characters presently commented and discussed were studied. A single most parsimonious tree was obtained: (((((((Cryptostrea permolis (Teskeyostrea weberi ((Hyotissa hyotis (Parahyotissa mcgintyi - P. numisma)) ((Eostrea puelchana - E. lurida) (Ostrea edulis (Ostreola equestris (\"Dendostrea\" sp.1 ((Lopha cristagalli - Alectryonella plicatula) ((Dendostrea folium - D. sp.2) (\"Dendostrea\" frons (\"Saccostrea\" echinata (\"Saccostrea\" palmula (((Saccostrea mordax - \"Striostrea\" prismatica) (Saccostrea cucullata - S. glomerata)) ((Crassostrea virginica (C. gigas - C. bilineata)) (C. mangle (C. brasiliana - C. rhizophorae)))))))))))))))) Plicatulostrea onca) Plicatula gibbosa) Spondylus americanus) Lima sp.) (Anomia simplex - Isognomon alatus)) Barbatia candida) while indices: = 372 steps, CI = 27 and IR = 58. We note that the monophyly of Crassostreinae been established and is supported by six synapomorphies, Crassostrea is also monophyletic, supported by four synapomorphies. Saccostrea, considering the type species S. cucullata, is monophyletic with S. glomerata. Data obtained by molecular analyzes, performed and this data GenBank® corroborates, in part, with the anatomical data; Crassostrea is considered to be monophyletic in both analyzes. Differences and morphological, anatomical similarities found in almost all structures were sufficient for separating and grouping among genera and their species

As bactérias patogênicas em moluscos bivalves podem ser agentes causadores de doenças como a gastroenterite e responsáveis por vários surtos de origem alimentar, representado um risco para os consumidores. Os vírus entéricos são a causa mais comum de surtos de gastroenterites não bacteriana em humanos no mundo e podem ser encontrados nas águas utilizadas no cultivo de moluscos bivalves. Este estudo teve como objetivo avaliar a contaminação de mexilhões (Mytella falcata) e ostras (Crassostrea brasiliana) provenientes do Complexo Estuarino Lagunar de Cananéia-Iguape, Estado de São Paulo, por bactérias (coliformes totais, coliformes termotolerantes, patotipos de Escherichia coli), por astrovírus e norovírus humanos. Um total de 150 amostras de moluscos bivalves (75 ostras e 75 mexilhões) foram coletadas de junho de 2016 a fevereiro de 2017. A estimativa de coliformes totais nos tecidos das ostras variou de 14,1 a 154,5 número mais provável (NMP)/g e de coliformes termotolerantes de 3,0 a 48,6 NMP/g, enquanto que para as amostras de mexilhões, os coliformes totais variaram de 97,4 a 1300 NMP/g e coliformes termotolerantes de 3,6 a 927 NMP/g. E. coli foi detectada em 24 amostras (16%), em concentrações variando entre <3 e >927 NMP/g. Quatro amostras (17%) foram identificadas com Escherichia coli enteropatogênica (EPEC), apresentando o gene eae por PCR (Reação em Cadeia da Polimerase) e RFLP (Polimorfismo no Comprimento de Fragmentos de Restrição), e os amplicons positivos foram sequenciados. As porcentagens de similaridade relativas ao gene phoA de E. coli, para as cinco amostragens realizadas no estudo, apresentaram valores iguais ou superiores a 88,6%. As sequências de EPEC agruparam-se em diferentes clados com outras sequências do Brasil, Suíça e Uruguai, exibindo similaridade de 57,7 e 97,1% quando comparadas umas as outras. Quando comparadas a outras sequências de referência depositadas no GenBank, a similaridade variou entre 56,2 e 95,4%. Estes resultados são os primeiros a indicar a presença de EPEC em moluscos bivalves no Brasil. Astrovírus não foram identificados nas amostras de moluscos analisadas neste estudo. Norovírus (NoV) foi identificado em 21 (14%) das amostras, sendo 38% de mexilhões e 62% de ostras. As amostras de NoV genogrupo II (GII) foram agrupadas num clado único, juntamente com outras sequências de NoV GII, sendo mais próximas filogeneticamente de sequências originárias do Brasil, Japão e México, com similaridade de 93,8 a 96,6% do que com as outras sequências homólogas. A triagem de moluscos bivalves para coliformes, E. coli e presença de vírus entéricos significativos para a saúde pode ajudar na prevenção de surtos entre os consumidores e contribuir para a melhoria do ambiente estuarino. / The pathogenic bacteria in bivalve molluscs are causative agents of diseases such as gastroenteritis and responsible for several food-borne outbreaks, representing a risk to consumers. Enteric viruses are the most common cause of outbreaks of non-bacterial gastroenteritis in humans in the world and can be found in waters used in the cultivation of bivalve molluscs. The objective of this study was to evaluate the contamination of mussels (Mytella falcate) and oysters (Crassostrea brasiliana) from the estuarine complex Lagunar of Cananéia-Iguape, State of São Paulo, by bacteria (total coliforms, thermotolerant coliforms, Escherichia coli) and by human astroviruses and noroviruses. A total of 150 samples of bivalve molluscs (75 oysters and 75 mussels) were collected from June 2016 to February 2017. The total coliform estimate in oyster tissues varied from 14.1 to 154.5 most probable number (MPN)/g and thermotolerant coliforms from 3.0 to 48.6 MPN/g, whereas for mussel samples, total coliforms ranged from 97.4 to 1300 MPN/g and thermotolerant coliforms from 3.6 to 927 MPN/g. E. coli was detected in 24 samples (16%) at concentrations ranging from <3 to >927 NMP/g. Four (17%) were identified with enteropathogenic Escherichia coli (EPEC), presenting the gene eae by PCR (Polymerase Chain Reaction) and RFLP (Restriction fragment length polymorphism), and the positive amplicons were sequenced. The percentages of similarity relative to the phoA gene of E. coli, for the five samplings carried out in the study, presented values equal or superior to 88.6%. The EPEC sequences were grouped in different clades with other sequences from Brazil, Switzerland and Uruguay, exhibiting similarity of 57.7 and 97.1% when compared to each other. When compared to other reference sequences deposited in GenBank, the similarity ranged from 56.2 to 95.4%. These results are the first to indicate the presence of EPEC in bivalve molluscs in Brazil. Astroviruses were not identified in the mollusk samples analyzed in this study. Norovirus (NoV) was identified in 21 (14%) of the samples, representing 38% of mussels and 62% of oysters. NoV genogroup II (GII) samples were clustered in a single clade, along with other NoV GII sequences, keeping phylogenetically closest to sequences originating in Brazil, Japan and Mexico, with similarity of 93.8 to 96.6% than with the other homologous sequences. The screening of bivalve molluscs for coliforms, E. coli and the presence of enteric viruses significant to health can help preventing outbreaks among consumers and contribute to the improvement of the estuarine environment.

A toxoplasmose é uma zoonose de distribuição mundial. O Toxoplasma gondii infecta o Homem e a maioria dos animais homeotérmicos. A ingestão de oocistos esporulados é uma das formas de transmissão desse protozoário. Oocistos de T. gondii podem esporular na água do mar e manter a infectividade por até seis meses. Moluscos bivalves podem filtrar e reter oocistos de T. gondii da água do mar em condições experimentais. O objetivo deste trabalho foi investigar a presença de T. gondii em ostras (Crassostrea rhizophorae) e mariscos (Mytella guayanensis) em condições naturais. Um total de 300 ostras e 300 mariscos foram adquiridos no Mercado de Peixes do município de Santos no estado de São Paulo no período de 05/03/2008 a 29/08/08 e divididos em 60 grupos de cinco ostras e 20 grupos de 15 mariscos. Para o isolamento do parasita, cinco camundongos foram inoculados oralmente com homogenados dos tecidos de cada grupo de ostras ou mariscos. Para a detecção molecular, o DNA dos tecidos dos mariscos foi extraído pelo método de fenol-clorofórmio e o das ostras, pelo método de isotiocianato de guanidina, Em seguida, foi realizada a nested-PCR (Reação em Cadeia pela Polimerase) baseada na amplificação de um fragmento de 155pb do gene B1 de T. gondii. A genotipagem das amostras de T. gondii detectadas foi feita usando a PCR-RFLP (Polimorfismo de Comprimento de Fragmentos de DNA gerados por Enzimas de Restrição) usando os marcadores SAG1, SAG2, SAG3, BTUB, GRA6, c22-8, c29-2, L358, PK1, CS3 e Apico. Não houve isolamento do parasita pelo bioensaio em camundongos. Nos grupos de mariscos, o T. gondii não foi detectado pela n-PCR e, nos grupos de ostras, houve detecção do T. gondii em dois grupos (3,3%). Não foi possível a genotipagem das amostras de T. gondii detectadas. O presente estudo permitiu concluir que ostras da espécie Crassostrea rhizophorae podem filtrar e reter oocistos de T. gondii e que o ambiente marinho do litoral do estado de São Paulo encontra-se contaminado com oocistos desse parasita. Assim, o consumo de ostras cruas pode representar uma potencial via de transmissão de T. gondii para o Homem e para os animais marinhos. / Toxoplasmosis is a worldwide zoonosis. Toxoplasma gondii is widely prevalent in humans and other mammals. This protozoan parasite can be transmitted by ingestion of sporulated oocysts. T. gondiioocysts can sporulate in seawater and retain their infectivity for at least six months. Experimentally, bivalve mollusks can filter and retain T. gondii oocysts from the seawater. The aim of this study was to investigate the presence of T. gondii in oysters (Crassostrea rhizophorae) and mussels (Mytella guayanensis) in natural conditions. A total of 300 oysters and 300 mussels were acquired from the Fish Market in Santos city, São Paulo state, from March 2008 to August 2008, and divided in 60 groups of five oysters and 20 groups of 15 mussels. To isolate the parasite, five mice were orally inoculated with tissue homogenates from each group of oysters or mussels. For molecular detection of T. gondii, DNA from mussels was extracted using a standard phenol-chloroform method and DNA from oysters was extracted using the guanidine isothiocianate method. A nested-PCR (Polymerase Chain Reaction) based on the amplification of a 155bp fragment from B1 gene of T. gondii was then performed. Eleven PCR-RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) markers including SAG1, SAG2, SAG3, BTUB, GRA6, c22-8, c29-2, L358, PK1, CS3 e Apico were used to genotype positive samples. There was no isolation of the parasite by bioassay in mice. T. gondii was not detected in the groups of mussels by n-PCR. There was detection of T. gondii by n-PCR in two groups of oysters (3.3%). Genotyping of these two positive samples was not successful. The results indicate that oysters of the species Crassostrea rhizophorae, the commonest species from the coast of São Paulo, can filter and retain T. gondii oocysts and that the marine environment of the coast of São Paulo state is contaminated with oocysts of this parasite. The ingestion of raw oysters can represent a potential transmission source of T. gondii to humans and marine mammals.

Les efflorescences de la micro-algue toxique Alexandrium minutum sont en constante augmentation au niveau mondial, accentuées par les apports anthropiques et le réchauffement global, et posent des problèmes écologiques, économiques et sanitaires. Lors d’une exposition à A. minutum, l’accumulation des phycotoxines paralysantes (PSP) dans les tissus semble être différente entre les huîtres diploïdes et triploïdes. Par ailleurs, de nombreuses fonctions physiologiques de l’huître C. gigas sont impactées. L’ensemble des fonctions physiologiques d’un organisme est régulé par des rythmes biologiques. Propriété fondamentale de la vie, les rythmes biologiques permettent aux organismes de se synchroniser et d’anticiper les variations cycliques de l’environnement. Dans mes travaux, je me suis intéressée aux rythmes biologiques des huîtres diploïdes et triploïdes C. gigas et à leurs interactions avec la contamination par les PSP. Une analyse in situ sur un an a mis en évidence une relation jusque-là inconnue entre le comportement valvaire de C. gigas et le cycle d’éclairement de la lune, ainsi qu’une relation fine et subtile des cycles comportementaux nycthéméraux et tidaux avec l’évolution annuelle de la photopériode. Cette relation est modulée par la ploïdie. Par ailleurs, la mise au point d’une approche non-invasive d’interférence par ARN a permis de mettre en évidence l’implication de l’horloge circadienne dans les processus de bioaccumulation des PSP chez C. gigas. Enfin, l’analyse du transcriptome cyclique dans les branchies de C. gigas a mis en évidence qu’au moins 42 % du transcriptome peut être exprimé de façon oscillante. Contre intuitivement, en condition d’alternance jour / nuit, une majorité de transcrits sont ultradiens, trois fois plus nombreux que les transcrits circadiens. Exposées à A. minutum, les huîtres ont montré un remodelage profond de leur transcriptome cyclique, pouvant entraîner la perte de synchronisation de l’huître avec son environnement. / Harmful algal blooms of Alexandrium minutum are constantly increasing at the global level, accentuated by anthropogenic contributions and global warming, causing ecological, economical and sanitary problems. During exposition to A. minutum, paralytic phycotoxins (PSP) accumulation differs between diploid and triploid oysters. Moreover, many physiological functions of the oyster C. gigas are impacted. All physiological functions of an organism are regulated by biological rhythms. As a fundamental property of life, biological rhythms allow organisms to synchronize and anticipate cyclic variations of the environment. In my work, I was interested in the biological rhythms of diploid and triploid oysters C. gigas, and their interactions with PSP contamination. A one-year in situ analysis revealed a previously unknown relationship between valve behavior of C. gigas and the lunar illumination cycle, as well as a fine and subtle relationship of the nycthemeral and tidal behavioral cycles with the annual evolution of the photoperiod. This relationship was modulated by the ploidy. Moreover, the development of a non-invasive approach of RNA interference revealed the involvement of the circadian clock in bioaccumulation processes of PSPs in C. gigas. Finally, analysis of the cyclic transcriptome in the gills of C. gigas showed that at least 42 % of the transcriptome can oscillate. Surprisingly, in day / night entrainment, most of transcripts were ultradians, three times more abundant than circadian transcripts. Exposed to A. minutum, results showed a profound remodeling of the cyclic transcriptome of C. gigas, which could lead to loss of synchronization of the oyster with its environment.

Studies were undertaken to determine the effect of Kraft mill effluent (KME) on a representative species of the aquatic environment. By transplanting a population of Pacific oysters (Crassostrea gigas) to the Port Mellon area (the site of a Kraft mill), the effect of varying concentrations (on a distance from the mill basis) of the pulp mill waste was monitored in terms of changes in shell dimension, body mass (meat) weight, visual observation of the oysters' physiological state and oyster mortality. A seasonal hydrographic survey was conducted at three regions within the study area to monitor changes in water quality imposed by the effluent. In the areas of effluent imposition (oyster stations 1, 2 and 3) the oysters decreased or showed little gain in shell dimension. The body mass of those oysters nearest the mill outfall began to decline (on a weight basis) shortly after placement. At Station 2 and 3 the deterioration in body mass due to changes in water quality began a short time after the decline at Station 1. Changes in the physiological state of the oyster expressed as a darkening of the gills and mantle edge and variations in body mass texture, can be correlated to an oyster's distance from the mill for each collection timei A mortality rate was calculated at each station for all collection times. The mortality rates at Station 1 (100% in 12 months), Station 2 (50% in 20 months), and Station 3 (20% in 24 months) were extensive and proportional to effluent levels. Several of the changes in water quality (increased temperature, reduced salinities, low oxygen contents, variable pH, dissolved and particulated organic matter and chemical additions) imposed by the effluent were individually tested as the major cause of oyster deterioration. Firstly, the critical oxygen tension (the P02 where V02 declines below the routine rate) was determined as 40 mmHg. Correlating this to the range of 02 levels at each station during a tidal cycle, the oxygen demand of the effluent was not considered as a major cause of oyster mortality. A range of filtered, neutralized (pH 7.0 at 22°C) and aerated percentage KME/volume (0-50%) test solutions were monitored in terms of their effect on the percentage time of shell closure. In these experiments percentages above 20 greatly increased the time of shell closure. The effect of shell closure on oysters was tested by continual (up to 28 days) periods of air exposure. In these experiments the P02, zC02 and pH of the pallial fluid was monitored (from time 0 to 28 days) to determine if anaerobic metabolism was undertaken and if it was, the time span of anaerobic life in juvenile oysters. Anaerobic metabolism was concluded to maintain life in juvenile oysters for 22 days. These results were consistent with the hypothesis that KME is deleterious to oyster populations. At high concentrations of effluent the duration of shell closure is extensive such that an anaerobic death results. At lower concentrations the effluent imposed changes in water quality are responsible for the gradual decline in oyster well-being. / Science, Faculty of / Zoology, Department of / Graduate

Orientador: Regina Maura Bueno Franco / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-22T02:37:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Leal_DiegoAveraldoGuiguet_D.pdf: 4157800 bytes, checksum: 6b17942eb61d5ff1784bbd719d71b15b (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: Surtos de doenças gastrointestinais associados com a ingestão de moluscos bivalves crus ou mal cozidos têm sido reportados em todo o mundo. O procedimento mais utilizado para purificar os tecidos dos bivalves, consiste na utilização de água desinfetada com radiação UV aplicada em tanques de depuração, previamente à introdução dos animais no mercado. Os riscos de aquisição de infecções mediante o consumo de bivalves são maximizados quando estes são cultivados em áreas inapropriadas, ou quando são comercializados sem serem submetidos ao procedimento de depuração. Os objetivos deste estudo foram: avaliar a contaminação por cistos de Giardia duodenalis e oocistos de Cryptosporidium em ostras destinadas ao consumo humano, antes e após o procedimento de depuração com luz UV, e em águas salobras, nas etapas relacionadas com a cadeia produtiva de ostras no estuário de Cananéia, litoral sul de São Paulo; realizar a caracterização molecular de cistos de Giardia em diferentes etapas da produção de ostras para verificar os genótipos circulantes e aqueles relacionados com a infecção em humanos; enumerar a concentração de indicadores bacteriológicos de contaminação fecal, da área de cultivo até a etapa de depuração para verificar se atende à regulamentação do Conselho Nacional do Meio Ambiente (CONAMA). Quatro pontos foram selecionados para coleta de água e ostras e pesquisa de protozoários: ponto 1: região de cultivo e engorda das ostras; ponto 2: captação de água; ponto 3: etapa de filtração de água e ponto 4: tanque de depuração. As amostras de água foram analisadas por filtração em membranas seguida de separação imunomagnética (IMS) e reação de imunofluorescência direta (RID). A contaminação das ostras foi verificada mediante análise de conteúdo líquido interno e lavado branquial por IMS e RID. A reação em cadeia da polimerase e o sequenciamento foram realizados para pesquisa de Giardia duodenalis e caracterização de seus genótipos. Giardia foi o patógeno mais prevalente em todos os pontos de água, sendo detectada em: 50,0%, 25,0%, 33,3% e 50,0% das amostras dos pontos 1, 2, 3 e 4, respectivamente. O subgenótipo AII foi detectado em algumas amostras hídricas dos pontos 1, 2 e 4 e o genótipo C em duas amostras (pontos 3 e 4). Oocistos de Cryptosporidium foram detectados em 16,6% das amostras de água após a depuração. As ostras da região de cultivo continham cistos de Giardia duodenalis em 41,6% das amostras; o subgenótipo AII foi evidenciado em uma amostra. As ostras depuradas apresentaram a maior contaminação: 58,3% das amostras albergavam cistos de Giardia e 3 delas pertenciam ao subgenótipo AII. As análises bacteriológicas revelaram que o ponto de engorda (P1) estava adequado para o cultivo das ostras. Estes resultados refletem a ineficiência do procedimento de depuração com UV aplicado nesta planta de tratamento e a contaminação do produto - na etapa final que precede sua comercialização - por Giardia duodenalis pertencente ao subgenótipo AII, potencialmente infectante para seres humanos. Os resultados evidenciam a necessidade de monitoramento contínuo de patógenos e adequação da legislação do cultivo de moluscos bivalves no Brasil, a fim de garantir a segurança alimentar / Abstract: Many shellfish-borne associated outbreaks have been reported worldwide especially related to its ingestion raw or lightly cooked. In the shellfish industry, the most commonly utilized procedure to purify shellfish tissues consists in the utilization of UV disinfected water employed at depuration tanks, before they are placed on the market. The risks of acquiring gastroenteric diseases, through its consumption, are maximized when they are cultured on inappropriate growing areas or whenever they are sold without depuration procedure. The purposes of this study were: evaluate the contamination by Giardia duodenalis cysts and Cryptosporidium oocysts in oysters destined to human consumption, before and after UV depuration procedure, and in brackish waters at stages related to the food chain of edible oysters, from Cananéia estuary located on the south coast of São Paulo; perform molecular characterization of Giardia cysts at different stages of the production of oysters to verify the main circulating genotypes and those associated with human infection; enumerate bacteriological indicators of fecal contamination from growing site up to depuration site, to check if it complies with the National Environmental Council (CONAMA). Four sampling sites were selected for water and oysters harvesting and protozoa search: site 1- oysters growing area; site 2: catchment water; site 3: filtration stage of water treatment and site 4: oyster's depuration tank. Water samples were analyzed through membrane filtration technique followed by immunomagnetic separation (IMS) and direct immunofluorescence assay (IFA). Oysters' contamination was verified through the analysis of innerwater and gill wash using IMS and IFA. The polymerase chain reaction and sequencing reactions were performed to search for Giardia duodenalis and characterization of its genotypes. Giardia was the most prevalent pathogens in all water sites, where it was detected: 50.0%, 25.0%, 33.3% and 50.0% of water from sites 1, 2, 3 and 4 respectively. The subgenotype AII was detected in several water samples from sites 1, 2 and 4 and the genotype C in two samples (sites 3 and 4). Cryptosporidium oocysts were found in 16.6% of depuration water tank. Oysters from growing area harbored Giardia duodenalis cysts in 41.6% of the samples and subgenotype AII was evidenced once. Depurated oysters were the most contaminated: 58.3% were harboring Giardia duodenalis cysts and 3 belonged to subgenotype AII. Bacteriological analysis demonstrated that site 1 was adequate to growing oysters. These results indicate the ineffectiveness of the UV depuration applied in this shellfish treatment plant, and the contamination of the product - in the final stage which precedes its commercialization - by Giardia duodenalis belonging to subgenotype AII, potentially infectious to humans. The results highlight the need for continued monitoring of pathogens and suit the legislation on the cultivation of bivalve molluscs in Brazil in order to ensure food safety / Doutorado / Parasitologia / Doutor em Parasitologia

Vibrio parahaemolyticus (Vp) é uma bactéria naturalmente presente em regiões estuarinas, sendo a principal causa de gastrenterite de origem bacteriana associada a pescados, principalmente ostras cruas. Nesta pesquisa, foi desenvolvida uma avaliação quantitativa de risco para avaliar a probabilidade de Vp causar doença após o consumo de ostra crua, produzida e comercializada no Estado de São Paulo. O estudo incluiu a identificação e caracterização do perigo, a avaliação da exposição e a caracterização do risco. Um modelo matemático foi desenvolvido. Este modelo leva em consideração o comportamento de Vp em ostras na cadeia produtiva, em cada estação do ano, além da relação entre a dose de Vp ingerida e a probabilidade de desenvolver a doença. A avaliação da exposição foi desenvolvida em três etapas: cultivo, pós-coleta e consumo. Na etapa de cultivo foram considerados os fatores que influenciam a prevalência e o número de Vp em ostras no momento da coleta. Na etapa pós-coleta, foram descritas as práticas da indústria e foram considerados os fatores associados ao processamento, transporte e manipulação. Já na etapa de consumo foram considerados os fatores como a quantidade de ostras consumidas por porção, o peso médio por ostra consumida e a população de Vp patogênico no momento do consumo. O resultado do modelo quantitativo da avaliação da exposição foi, então, integrado ao modelo dose-resposta, Beta-Poisson, para se obter uma estimativa do risco. Esta estimativa expressa o impacto da exposição humana a Vp, sobre a saúde pública, associada ao consumo de ostras. A simulação de Monte Carlo foi utilizada para avaliar o efeito da variabilidade e incerteza das variáveis do modelo sobre a estimativa do risco. O modelo prediz uma probabilidade de ocorrência de doença de 4,6x10-4, por porção de ostra, consumida ao longo do ano. As variáveis que possuem maior influência sobre o risco de ocorrência de doença são a população de Vp em ostras no cultivo, a temperatura de transporte das ostras até o varejo e a porcentagem de Vp patogênico em ostra, no momento do seu consumo. O modelo evidencia que uma das maneiras de reduzir o risco de ocorrência de doença seria intervir nas condições de transporte de ostras até o varejo por meio da sua refrigeração. Com o modelo é possível identificar fatores e simular cenários para avaliar o comportamento de V. parahaemolytícus como um perigo microbiológico, ao longo da cadeia produtiva de ostra até o momento do seu consumo. Também é possível avaliar o impacto de medidas de intervenção na cadeia produtiva. As suposições adotadas limitam a aplicabilidade do modelo. Portanto, é necessário que o modelo seja validado, particularmente com relação ao número de casos de doença causados por Vp, cujos dados de vigilância epidemiológica inexistem no Brasil. / Vibrio parahaemolyticus (Vp) is naturally present in estuarine regions and is the main cause of gastroenteritis associated with the consumption of bivalve molluscan shellfish, specially raw oysters. In this research, a quantitative risk assessment was developed to evaluate the probability of Vp causing disease after consumption of raw oyster, produced and commercialized in the state of Sao Paulo. The study included the identification and characterization of the hazard, exposure assessment and risk characterization. A mathematical model was developed. This model takes into account the behavior of Vp in oysters in the productive chain, for each season of the year, besides the relationship between the number of cells of Vp ingested and the probability of developing the disease. The exposure assessment was done in three steps: farming, after harvesting and consumption. At the farming step, the factors that influence the prevalence and the population of Vp at the time of harvesting were considered. At the after harvesting step, the factors associated with transportation, handling and processing were considered. At the consumption step, factors related to the amount of oysters and the average weight per oyster consumed and the density of pathogenic Vp at the time of consumption were considered. Then, the quantitative model of exposure assessment was integrated to the dose-response model, BetaPoisson, in order to obtain a risk estimate. This calculation expresses the impact of the human exposure to Vp associated with the consumption of oysters on public health. The Monte Carlo simulation was used to evaluate the effect of variability and uncertainty of variables of the model in the risk estimation. The model predicts a probability of occurrence of the disease of 4,6x10-4 per serving of oyster consumed during one year. The variables showing the greatest influence on the risk of occurrence of disease are the density of Vp in oyster in the farming step, the temperature during transportation of oysters to the retail market and the percentage of pathogenic Vp strains in oysters,\' at the moment of consumption. The model indicates that the use of refrigeration during transportation of oysters to retail could reduce the risk of disease. The model allows the identification of factors and the simulation of scenarios in order to evaluate the behavior of V. parahaemolyticus, as a microbiologícal hazard, in the productive chain of oyster to the consumption. It is also possible to evaluate the impact of intervention measures in the productive chain. The assumptions Iimit the application of the model. Therefore, it is necessary to validate the model, particularly in relation to the number of cases of dísease caused by V. parahaemolyticus of which the data on epidemiologic surveillance do not exist in Brazil.