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Modulação da ativação de células dentríticas por Paracoccidioides brasiliensis / Modulation, activation of Dentritic cells by Paracoccidioides brasiliensisKaren Spadari Ferreira 15 December 2003 (has links)
A paracoccidioidomicose (PCM) é uma micose sistêmica, endêmica na América Latina, causada pelo fungo dimórfico térmico Paracoccidioides brasiliensis (P. brasiliensis), cujo principal componente antigênico é a glicoproteína de 43 kDa (gp43). Diferentes formas clínicas podem ser desenvolvidas e estão diretamente associadas com vários graus de depressão da resposta imune celular. Considerando a importância das células dendríticas na interação dos sistemas imune inato e adaptativo, e na ativação de células T \"naive\", no presente trabalho estudamos se células dendríticas interagem com leveduras de P. brasiliensis, assim como seu principal componente antigênico (gp43). Foi demonstrado pela primeira vez que células dendríticas poderiam ser infectadas por leveduras de P. brasiliensis, e esse fungo permaneceu viável após fagocitose. Analisamos por citometria de fluxo a expressão das moléculas de superfície observando diminuição significativa da expressão das moléculas de MHC-II, CD80 e CD54 em células dendríticas quando estas foram incubadas com leveduras da cepa Pb18 ou com gp43. Esse resultado mostrou que a ação do P. brasiliensis em células dendríticas poderia ser mediada pela gp43. Ao analisarmos a síntese de IL-12, observamos diminuição significativa desta interleucina, quando células dendríticas ativadas com LPS, foram cultivadas na presença de leveduras de P. brasiliensis ou gp43. Esses resultados sugerem que a gp43 pode afetar várias funções das células hospedeiras, indicando que esta inibição pode ser usada pelo P. brasiliensis para reduzir a eficiência da resposta imune, facilitando assim o estabelecimento da infecção primária indivíduos suscetíveis. / Paracoccidioidomycosis, endemic in Latin America, is a progressive systemic mycosis caused by dimorphic fungus Paracoccidioides brasiliensis, where the major antigenic component is a glycoprotein of 43kDa (gp43). The infection can evolve to different clinical forms that are associated to various degrees of suppressed cell-mediated immunity. The role of dendritic cells (DCs) in P.brasiliensis infection has never been investigated. With the recognition that DCs are able to initiate response in naïve T cells and that they also participate in Th cell education the present study was undertaken to understand whether DCs interact with P. brasiliensis or gp43, as well as to elucidate possible mechanisms and consequences of this interaction. In the present report, it was demonstrated for the first time that DCs could be infected by P. brasiliensis and survive. Our results indicate that P. brasiliensis infection and purified gp43 lead to down-regulation of MHC-II and adhesion properties of immature DCs. The down-regulation was also observed in LPS-induced DCs maturation, where the expression of MHC-II, CD80, CD54 and CD40 were significantly inhibited in the presence of P. brasiliensis or gp43. These data show that the actions of P. brasiliensis on DCs could be mediated by gp43. In addition, an inhibition of IL-12 production by gp43 was observed in LPS-induced DC maturation. These results suggest that gp43 affects many functions of the host cells, indicating that this inhibition might be used by P. brasiliensis to reduce the effectiveness of the immune response, thus facilitating the establishment and fate of primary infection in susceptible host.
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Proteção ou exacerbação de anticorpos monoclonais gerados contra antígenos de Paracoccidioides brasiliensis na infecção experimental. / Protection or exacerbation of monoclonal antibodies generated against antigens of Paracoccidioides brasiliensis in the experimental infection.Luciana Thomaz 25 September 2012 (has links)
Nesse trabalho avaliamos a proteção que o anticorpo monoclonal (AcM) contra CMH e contra Hsp60 fornecem aos animais infectados com as leveduras de Paracoccidioides brasiliensis e P. lutzii em modelo profilático. O tratamento com os AcMs de isotipos IgG2a e IgG2b foram protetores, induzindo a secreção das citocinas IL-12p70, IFN-<font face=\"Symbol\">g e TNF-<font face=\"Symbol\">a, padrão de resposta imune Th1. Nós mostramos por imunomarcação que moléculas de CMH e Hsp60 estão acessíveis na célula. E o anticorpo monoespecífico contra CMH e os anticorpos policlonais contra melanina, gerados nesse trabalho foram eficazes nos ensaios in vitro de proteção. Foram gerados anticorpos monoclonais contra glicoproteina extraída de Pb18, o AcM reconheceu, por imunomarcação, estruturas internas e a parede celular da levedura. Avaliamos um novo modelo de hospedeiro, com o uso da larva Galleria mellonella, o que pode servir de triagem e reduzir desta forma o uso excessivo de camundongos, as leveduras P. lutzii e H. capsulatum são letais para as larvas e evocam resposta celular que se organizam semelhante a um granuloma. / In this work we evaluated the protection that the monoclonal antibody (MAb) against Hsp60 and against CMH provides the animals infected with the yeast Paracoccidioides brasiliensis and P. lutzii in prophylactic model. The treatment with the MAbs of IgG2a and IgG2b isotypes were protective, inducing the secretion of IL-12p70, IFN-<font face=\"Symbol\">g and TNF-<font face=\"Symbol\">a, Th1 pattern of immune response. We show by immunogold that Hsp60 and MHC molecules are accessible on the cell. And the monospecific antibody against HCM and polyclonal antibodies against melanin, generated in this study were effective in in vitro assays of protection. Monoclonal antibodies were generated glycoprotein extracted from Pb18, Mab recognized by immunogold, internal structures and cell wall material. Evaluated a new type of host, using the larvae Galleria mellonella, which can serve as a screening and reduce thus the overuse of mice, yeast P. lutzii and H. capsulatum are lethal to larvae and evoke cellular responses that are organized like a granuloma.
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Monofosforil lipídeo A e diidrolipoil desidrogenase de Paracoccidioides brasiliensis têm efeito terapêutico na paracoccidiodomicose experimental / Monophosphoryl lipid A and diidrolipoil dehydrogenase from Paracoccidioides brasiliensis have therapeutic effect on experimental paracoccidioidomycosisTaise Natali Landgraf 26 September 2016 (has links)
Paracoccidioidomicose (PCM) é uma micose sistêmica causada por fungos dimórficos do gênero Paracoccidioides - P. brasiliensis ou P. lutzii. A alta incidência da PCM no Brasil, somada à gravidade que o quadro clínico pode assumir e ainda à ausência de um antifúngico de baixa toxicidade para tratamento de curta duração, motivaram a avaliação de adjuvantes e caracterização dos componentes antigênicos de P. brasiliensis em um modelo imunoterapêutico de PCM. Assim, inicialmente, avaliou-se o efeito de monofosforil lipídeo A (MPLA) de Salmonella minnesota, PAM3CSK4, hidróxido de alumínio e AS04 em camundongos cronicamente infectados com P. brasiliensis. Quando camundongos da linhagem BALB/c foram infectados pela via intratraqueal com 3 × 105 leveduras de P. brasiliensis, tratados no dia 20 após a infecção com um dos adjuvantes e analisados 30 dias após a administração do tratamento, observou-se que MPLA, ao contrário dos outros adjuvantes, induziu (1) uma redução significativa no número de unidades formadoras de colônias (UFC), (2) uma expressiva diminuição no número de granulomas e células fúngicas no tecido pulmonar e (3) uma resposta imunológica protetora (Th1) quando comparado aos animais controle tratados com PBS. Quanto ao rastreamento de antígenos de P. brasiliensis candidatos a agentes terapêuticos, evidenciou-se que as frações proteicas da preparação de exoantígenos (ExoAg) eram as mais promissoras. Dentre essas frações, a que continha o ExoAg majoritário diidrolipoil desidrogenase induziu maior porcentagem de proliferação de linfócitos T CD3+ esplênicos de camundongos infectados e tratados com MPLA. O gene de diidrolipoil desidrogenase foi clonado em vetor de expressão e a proteína recombinante produzida, purificada e utilizada no protocolo terapêutico da PCM experimental. Surpreendentemente, a administração terapêutica de diidrolipoil desidrogenase recombinante induziu uma redução significativa na contagem de UFC dos animais infectados cronicamente com P. brasiliensis, mesmo na ausência de adjuvantes, o que não foi observado quando foi administrada a preparação de ExoAg nos animais. A localização subcelular de diidrolipoil desidrogenase, por microscopia eletrônica de transmissão, utilizando anticorpos policlonais de camundongos contra essa proteína, mostrou que a mesma está localizada na mitocôndria e também no citoplasma. A análise da expressão gênica diferencial de diidrolipoil desidrogenase em P. brasiliensis mostrou que essa proteína é significativamente mais expressa em leveduras em comparação a hifas e formas de transição. Em conclusão, nossos resultados mostram os efeitos benéficos de MPLA na PCM experimental e sugerem que diidrolipoil desidrogenase é um alvo terapêutico potencial para o tratamento da PCM. / Paracoccidioidomycosis (PCM) is a systemic mycosis caused by the dimorphic fungus Paracoccidioides - P. brasiliensis and P. lutzii. The high incidence of PCM in Brazil, added to the severity of the disease and the absence of an antifungal that brings together low toxicity and short-term treatment, led us to evaluate adjuvants and characterize antigenic components of P. brasiliensis that could be used as immunotherapy in an experimental model of PCM. In this work, firstly, we evaluated monophosphoryl lipid A (MPLA) from Salmonella minnesota, PAM3CSK4, aluminum hydroxide and AS04 in mice chronically infected with P. brasiliensis. When mice were infected intratracheally with 3 × 105 P. brasiliensis yeasts, treated with one of the adjuvants or vehicle on day 20 postinfection, and analyzed 30 days after the treatment, we observed that MPLA, unlike other adjuvants, induced (1) a significant reduction in the number of colony forming units (CFU) in the lungs of the mice, (2) an expressive decrease of granulomas and yeast cells in lung tissue, and (3) a more protective immune response (Th1) when compared with the control mice. Concerning to detection of antigens for PCM therapy, we noticed that among the fractions of a preparation of exoantigens (ExoAg), the one containing the protein identified as dihydrolipoyl dehydrogenase induced a high percentage of proliferation of splenic CD3+ T lymphocytes from mice infected and treated with MPLA. The gene of dihydrolipoyl dehydrogenase was cloned into expression plasmid vector, and the recombinant protein produced, purified and used in the therapeutic protocol of experimental PCM. Surprisingly, the therapeutic administration of recombinant dihydrolipoyl dehydrogenase, but not ExoAg preparation, induced a significant reduction in fungal load in the animals chronically infected with P. brasiliensis, even in the absence of adjuvants. Immunogold labeling and transmission electron microscopy revealed that the dihydrolipoyl dehydrogenase is localized in mitochondria and cytoplasm of P. brasiliensis. The differential expression of dihydrolipoyl dehydrogenase gene in P. brasiliensis showed that yeast had an expression more significant than hyphae, with an intermediate level of gene expression in the transitional forms. In conclusion, our results show that MPLA and dihydrolipoyl dehydrogenase are potential therapeutic targets for the treatment of PCM due to their beneficial effects in a therapy model of PCM.
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Estudo da interação de linfócitos B-1 com antígenos de Paracoccidioides brasilienses / Study of the interaction of B-1 lymphocytes with antigens of Paracoccidioides brasiliensisVanessa Rosa Noal 04 December 2009 (has links)
Diversos dados na literatura têm demonstrado a participação de linfócitos B-1 em diferentes fenômenos imunológicos, tanto na resposta imune inata quanto na resposta imune adaptativa. Para melhor entendermos a ativação da resposta imune eficaz contra fungos patogênicos, pesquisamos a interação entre os linfócitos B-1 e o Paracoccidioides brasiliensis (P. brasiliensis), uma vez que este expressa moléculas antigênicas que podem ser reconhecidas pelo sistema imune. Utilizamos preparação antigênica do P. brasiliensis obtida de sua superfície leveduriforme denominada de CFA (antígeno livre da parede do fungo) e células leveduriforme do fungo. Observou-se que a maioria das células do sobrenadante da cultura celular de 4 dias de células totais aderentes peritoneais eram constituídos por linfócitos B-1; estas células expressam altos níveis de MHC-II (100%) e CD80 (90%). Contudo, não houve expressão significativa da molécula co-estimuladora CD86. Pela análise fenotípica, os linfócitos B-1 podem atuar como células apresentadoras de antígeno pois expressam CD80, CD86 e MHC-II; então realizamos o ensaio de proliferação celular utilizando linfócitos B-1 como células apresentadoras de antígenos e observamos proliferação celular de linfócitos TCD4+ significativa. Em relação às citocinas, analisamos a secreção de IL-10 e TNF-α do sobrenadante da cultura de linfócitos B-1 sem nenhum estímulo e observamos que estas células secretam tanto IL-10 quanto TNF-α; após estímulo de CFA, os valores aumentam significantemente. Analisamos a expressão de TLR-2, TLR-4, MyD88 e IL-10, por RT-PCR, dos linfócitos B-1 na presença de CFA. Encontramos expressão de TLR-2, MyD88 e IL-10 nas células com e sem estímulo. Analisamos a migração dos linfócitos B-1 da cavidade peritoneal de camundongos BALB/c após estímulo intraperitoneal (ip) com leveduras de PB. Decorridas 5 horas, foi observada grande diminuição dos linfócitos B-1 na cavidade peritoneal, que permanecia por 24 horas e 7 dias pós-infecção. Para melhor compreendermos a migração dos linfócitos B-1, foram utilizados camundongos CBA/N Xid (desprovidos de linfócitos B-1), cujo o peritônio foi reconstituído com linfócitos B-1, sendo infectados ip com leveduras de P brasiliensis. Os resultados demonstram que, após a infecção, os linfócitos B-1 migram da cavidade peritoneal para o baço. Também, observou-se aumento no número de células T com fenótipo de célula regulatória (CD4+CD25+Foxp3+). Nossos resultados sugerem que a elevada produção de IL-10 por células B-1, mediada provavelmente pela ligação de TLR-2, juntamente com a capacidade dos linfócitos B-1 em ativar linfócitos T, com a capacidade de migrar do peritônio para o baço e ativar células T regulatórias, poderia favorecer a sobrevivência do fungo no hospedeiro. / Innumerous data published in the literature have shown the involvement of B-1 cells in different immunological phenomena, both in the innate immnune response and the adaptive immune response. To better understand the activation of effective immune response against pathogenic fungi, we researched the interaction between B-1 cells and Paracoccidioides brasiliensis (P. brasiliensis), since it expresses that antigenic molecules can be recognized by the immune system. We used antigenic preparation of P. brasiliensis obtained from the surface of yeast called CFA (cell free antigen) and yeast cells of the fungus. It was observed that most cells in the cell culture supernatant 4 days of total adherent peritoneal cells consisted of B-1 cells, these cells express high levels of MHC-II (100%) and CD80 (90%). However, no significant expression of co-stimulatory molecule CD86 was observed. After phenotypic analysis, the B-1 cells can act as anyigen-presenting cells because they express C80, CD86 and MHC-II, then realized proliferation assay using B-1 cells as antigen presenting cells inducing was performed, and our results showed the significant proliferation of CD4 T cells. Regarding cytokines, we analyzed the IL-10 secretion and TNF-α in culture supernatant of B-1 cells without stimulation and found that these cells secrete both IL-10 and TNF-α, after stimulation of CFA. We analyzed the expression of TLR-2, TLR-4, MyD88 and IL-10 by RT-PCR, of the B-1 cells in the presence of CFA. We found expression of TLR-2, MyD88 and IL-10 cells with and without stimulus. We analyzed the migration of peritoneal B-1 cells after intraperitoneal (ip) infection with yeast from P. brasiliensis. After 5 hours, high decrease of B-1 cells in the peritoneal cavity was observed, which remained for 24 hours and 7 days post-infection. To better understand the migration of B-1 cells, we used mice CBA/N Xid (destitute of B-1 cells), reconstituted with B-1 cells, and infected with yeast P. brasiliensis. The results show that after the infection, the B-1 cells migrate from the peritoneal cavity to the spleen. Also, there was an increase in the number of T cells with regulatory cell phenotype (CD4+CD25+Foxp3+). Our results suggest that high production of IL-10 by B-1 cells, probably mediated by the binding of TLR-2, along with the ability of B-1 cells in activating T lymphocytes, with the ability to migrate from the peritoneum to the spleen and activate T regulatory cells, could favor the survival of the fungus in the host.
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Caracterização e Análise Funcional da Beta -1,3-glicanosiltransferase 2 de Paracoccidioides brasiliensis / Characterization and Functional Analysis of Beta-glucanosyltransferases -1.3 2 of Paracoccidioides brasiliensisLIMA, Patrícia de Sousa 29 January 2010 (has links)
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Previous issue date: 2010-01-29 / Paracoccidioides brasiliensis is the causative agent of paracoccidioidomycosis (PCM),
a systemic disorder geographically restricted to Central and South America, and one of the
most important endemic mycoses in these regions, especially among the male rural populations.
The disease is most likely caused by the inhalation of asexual spores (conidia) produced by the
mycelia form of the fungus, propagules that once in the lungs undergo differentiation towards
the parasitic yeast form. The cell wall of P. brasiliensis is a dynamic structure, essentially
composed of branched glucan (β-1,3 and β-1,6 glucans), chitin, lipids and mannoproteins.
Many enzymes are responsible for cell wall remodeling. One of them is the Beta-1,3-
glucanosyltransferase 2 (PbGel2p) presented here. The amino acid deduced sequence of
PbGel2p presented similarity to others proteins involved in fungal cell wall biosynthesis and
morphogenesis and it was characterized as a member of GH72 family, GH72_ subfamily. The
recombinant rPbGel2p was overexpressed in Escherichia coli and the polyclonal antibody was
obtained. The PbGel2p mRNA, as well as the protein, were detected at the highest level in the
mycelium phase. The potencial role of PbGel2p in cell wall biosynthesis and morphogenesis
was analyzed by assessing its ability to rescue the phenotype of the Saccharomyces cerevisiae
GAS1Δ. The results indicated that PbGel2p is a cell wall-associated protein that probably works
as a β-1,3-glucan elongase capable of mediating fungal cell wall integrity. In addition,
predicted protein-protein interactions between PbGel2p and others proteins of the fungus P.
brasiliensis were assessed by using a S. cerevisiae two hybrid system and pull-down assay. The
proteins that were found to interact with PbGel2p are: anthranilate synthase component 2
(involved in the tryptophan pathway), MYND domain protein SamB (related to fungal
morphogenesis), mitotic spindle checkpoint protein Mad2B (required of the organization of the
cytoskeleton and control of cell cycle), G protein complex beta subunit CpcB (organize the
cytoskeleton of actin), WD repeat protein (involved in the control of cell cycle),
phosphatidylinositol-4-phosphate-5-kinase its3 (required of the organization of the actin
cytoskeleton), Hsp60 (related of stress conditions like temperature) and ATPase (localized in
the plasma membrane / involved in the glucose metabolism). This suggested the relation of
PbGel2p in other process to maintenance of cell wall integrity. / Paracoccidioides brasiliensis é o agente causador da paracoccidioidomicose (PCM),
prevalente em países da América Central e do Sul sendo considerada uma das mais importantes
micoses endêmicas, especialmente entre a população rural masculina. A doença é causada pela
inalação dos esporos assexuais (conídios) produzidos pela forma miceliana do fungo. Nos
pulmões, os propágulos tendem à diferenciação para a forma leveduriforme parasitária. A
parede celular de P. brasiliensis é uma estrutura dinâmica, composta essencialmente por
glicanas ramificadas (ligações β-1,3 e β-1,6), quitina, lipídeos e manoproteínas. Muitas enzimas
estão envolvidas no seu remodelamento. Uma delas é a Beta-1,3-glicanosiltransferase 2
(PbGel2p), apresentada aqui. A sequência deduzida de aminoácidos de PbGel2p mostrou
similaridade com outras proteínas envolvidas na morfogênese e biossíntese da parede celular
fúngica e foi caracterizada como parte da família GH72, subfamília GH72_ . A proteína
recombinante rPbGel2p foi superexpressa em Escherichia coli e o anticorpo policlonal obtido.
Os níveis de transcritos que codificam para PbGel2p, assim como os de proteína, foram
detectados em maior teor na fase miceliana do fungo. O papel de PbGel2p na morfogênese e
biossíntese da parede celular foi analisado pela habilidade da proteína em resgatar o fenótipo
mutante para GAS1Δ de Saccharomyces cerevisiae. Os resultados indicaram que PbGel2p é
uma proteína associada à parede celular que provavelmente atua no alongamento da β-1,3-
glicana mediando a integridade da parede celular. Ainda, as interações proteína-proteína
preditas entre PbGel2p e outras proteínas de P. brasiliensis usando o sistema de duplo híbrido e
pull-down foram: componente 2 da antranilato sintase (envolvida na via do triptofano), proteína
SamB com domínio MYND (relacionada com a morfogênese fúngica), proteína Mad2B
(requerida na organização do citoesqueleto e controle do ciclo celular), subunidade beta da
CpcB (organiza o citoesqueleto de actina), proteína com repetição WD (envolvida no controle
do ciclo celular), fosfatidilinositol-4-fosfato-5-quinase (requerida para organização do
citoesqueleto de actina), Hsp60 (relacionada à condições de estresse como temperatura) e
ATPase (localizada na membrana plasmática/ involvida no metabolismo de glicose). Essas
interações sugerem a relação de PbGel2p em outros processos celulares para manutenção da
integridade da parede celular.
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An€álise da resposta de Paracoccidioides brasiliensis a diferentes tipos de agentes estressores e osmoreguladores e express o heteró‚loga e localizaçムo de β-1.3-glicana sintase / Analise response of Paracoccidioides brasiliensis to different types of stress agents and osmoreguladores and expresses Heteralogs and Location of the β-1.3-glucan synthaseTOMAZETT, Patrícia Kott 26 February 2010 (has links)
Made available in DSpace on 2014-07-29T15:25:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1
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Previous issue date: 2010-02-26 / Paracoccidioides brasiliensis is a thermo-dimorphic human pathogenic fungus
that lives at 23”C in the mycelium phase (infecting phase) and at 37”C in the yeast
phase (parasite phase). In attempt to survive, the cell wall of fungi can change its
composition and/or structure in response to environmental stress by compensatory
mechanisms. The molecules involved in these mechanisms are possible target for the
development of effective antifungal agents. In P. brasiliensis, the main components of
the cell wall are glucans and chitin polymers. These polymers make a primary barrier
that is responsible for the structural integrity and form of the cell wall. In this work the
behavior of P. brasiliensis was evaluated against stress conditions with the aim of study,
for the first time, the mechanisms used by this fungus in the maintenance of the cell
wall integrity. Our results shown that P. brasiliensis yeast cells are sensitive to cell wall
stressors calcofluor white (CFW), congo red (CR), SDS, KCl, NaCl and sorbitol. There
was an increase in the PbFKS1 transcripts expression and in the content of cell wall β-
1,3-glicana after treatment with all stressor agents. After treatment with SDS and KCl
the PbGFA1 transcripts expression and the cell wall GlcNAc residues also increased.
The transcript expression of PbGEL3 was also evaluated being increased after treatment
with CFW, NaCl and sorbitol. Thus we showed that these molecules are involved in the
maintenance of the cell wall against stress conditions. Apart from these analyses we
obtained the active recombinant protein PbFks1pc. Through the anti-PbFks1pc antibody
we performed immunocitolocalization assays. These experiments revealed the
localization of PbFks1p in regions of apical growth in the mycelium phase and in the
cell surface in yeast phase. / Paracoccidioides brasiliensis Š um fungo patog‰nico e termodim‚rfico que se
apresenta na forma de micŠlio a 23”C (forma infectante) e na forma de levedura a 37”C
(forma parasit€ria). A parede celular de fungos Š capaz de alterar sua composiƒ o e atŠ
mesmo sua estrutura em resposta a condiƒ•es ambientais de estresse atravŠs de
mecanismos compensat‚rios. As prote…nas envolvidas nestes mecanismos s o poss…veis
alvos para o desenvolvimento de agentes antifˆngicos espec…ficos. Em P. brasiliensis,
os principais pol…meros que constituem a parede celular s o glicanas e quitina. Estes
pol…meros formam uma barreira prim€ria que Š respons€vel pela integridade estrutural e
forma da parede celular. Neste trabalho, o comportamento de P. brasiliensis diante de
situaĥes de estresse foi investigado com o intuito de estudar, pela primeira vez, os
mecanismos utilizados por este fungo na manutenƒ o da integridade da parede celular.
Nossos resultados mostram que cŠlulas leveduriformes de P. brasiliensis s o sens…veis
aos agentes estressores da parede celular calcofluor white (CFW), congo red (CR), SDS,
NaCl, KCl e sorbitol. Houve um aumento na express o de transcritos de PbFKS1 e no
conteˆdo do pol…mero de β-1,3-glicana na parede celular ap‚s tratamento com todos os
agentes estressores. Ap‚s tratamento com SDS e KCl a express o de transcritos de
PbGFA1 assim como o conteˆdo de res…duos de GlcNAc na parede celular tambŠm
aumentaram. A express o dos transcritos de PbGEL3 tambŠm foi avaliada estando
aumentada ap‚s tratamento com CFW, NaCl e sorbitol. Desta forma, mostramos que
estas molŠculas est o envolvidas na manutenƒ o da parede celular diante de situaƒ•es
de estresse. AlŠm destas an€lises, a prote…na recombinante PbFks1pc ativa foi obtida.
AtravŠs do anticorpo anti-PbFks1pc realizamos ensaios de imunocitolocalizaƒ o. Estes
experimentos revelaram a presenƒa de PbFks1p em regi•es de crescimento apical no
micŠlio e na superf…cie celular em cŠlulas leveduriformes.
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Identificação e caracterização de moléculas envolvidas na interação de Paracoccidioides brasiliensis com o hospedeiro / Identification and characterization of involved molecules in the interaction of paracoccidioides brasiliensis with the hostDANTAS, Sabrina Fonseca Ingênito Moreira 31 March 2009 (has links)
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Previous issue date: 2009-03-31 / Paracoccidioides brasiliensis causes paracoccidioidomycosis (PCM), a systemic
mycosis presenting clinical manifestations ranging from mild to severe forms. A P.
brasiliensis cDNA expression library was produced and screened with pooled sera from
PCM patients adsorbed against antigens derived from in vitro-grown P. brasiliensis
yeast cells. Sequencing DNA inserts from clones reactive with PCM patients sera
indicated 35 open reading frames presenting homology to genes involved in metabolic
pathways, transport, among other predicted functions. The complete cDNAs encoding
aromatic L-amino acid decarboxylase (Pbddc), lumazine synthase (Pbls) and a
homologue of the high affinity copper transporter (Pbctr3) were obtained. Recombinant
proteins PbDDC and PbLS were obtained; a peptide was synthesized for PbCTR3. The
proteins and the synthetic peptide were recognized by sera of patients with confirmed
PCM and not by sera of healthy patients. Using the vivo-induced antigen technology
(IVIAT) we identified immunogenic proteins expressed at high levels during infection.
Quantitative real - time RT-PCR demonstrated high transcript levels of Pbddc, Pbls and
Pbctr3 in yeast cells infecting macrophages. Transcripts in yeast cells derived from
spleen and liver of infected mice were also measured by qRT-PCR. Our results suggest
a putative role for the immunogenic proteins in the infectious process of P. brasiliensis. / Paracoccidioides brasiliensis é o agente etiológico da paracoccidioidomicose (PCM),
uma micose sistêmica, prevalente nos países da América Latina. Uma biblioteca de
cDNA de expressão de Paracoccidioides brasiliensis foi construída e rastreada com
soros de pacientes acometidos por paracoccidioidomicose (PCM). Foram identificados
35 clones de cDNAs que codificam proteínas relacionadas com metabolismo celular,
transporte, energia, transcrição, endereçamento de proteínas, transdução de sinal e
componentes celulares. Os cDNAs codificantes da L- aminoacido aromatico -
descarboxilase (Pbddc), da lumazina sintase (Pbls) e do transportador de cobre de alta
afinidade foram obtidos. As proteínas recombinantes PbDDC e PbLS e o peptídio
sintético PbCTR3 foram reconhecidos por soros de pacientes com PCM e não reagiram
com soros controle. A técnica de IVIAT (tecnologia de antígenos induzidos in vivo)
propiciou a identificação de proteínas imunogênicas mais expressas durante o processo
infecçioso. RT-PCR em tempo real quantitativa (qRT-PCR) demostrou altos níveis de
transcritos de Pbddc, Pbls e Pbctr3 em células leveduriformes infectando macrófagos.
O transcritos de células leveduriformes de P. brasiliensis recuperadas de fígado e baço
de camundongos foram medidos por qRT-PCR. Estes resultados sugerem o provável
papel das proteínas imunogênicas no processo infeccioso de P. brasiliensis.
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Identificação proteômica, expressão heteróloga, citolocalização, estudos de regulação transcricional e traducional da Aconitase Mitocondrial de Paracoccidioides brasiliensis / Identification,characterization and regulation studies of the mitochondrial Aconitase of Paracoccidioides brasiliensisBRITO, Wesley de Almeida 18 November 2009 (has links)
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Previous issue date: 2009-11-18 / Paracoccidioides brasiliensis is a thermal-dimorphic fungus, the causative agent of
Paracoccidioidomycosis (PCM), an important endemic mycosis in Latin America. A protein
species preferentially expressed in yeast cells with a molecular mass of 80kDa and isoeletric
point (pI) of 7.79 was isolated from the proteome of P. brasiliensis and characterized as an
aconitase (E.C. 4.2.1.3). Aconitase is an enzyme that catalyzes the isomerization of citrate to
isocitrate in both the Krebs cycle (KC) and the glyoxylate cycle (GC). We report the cloning and
characterization of the cDNA encoding the aconitase of P. brasiliensis (PbACO). The cDNA
showed a 2337 bp open reading frame (ORF) and encoded a predicted protein with 779 amino
acids. A polyclonal antibody against the purified recombinant PbACO was obtained in order to
analyze the subcellular localization of the molecule in P. brasiliensis. The protein is present in
the extracellular fluid, cell wall, mitochondria, cytosol and peroxisomes of yeast cells as
demonstrated by western blot and immunocytochemistry analysis. The expression analysis of the
Pbaco gene was performed through quantitative real time RT-PCR and results demonstrated
increasing expression during differentiation from mycelium to yeast cells. Real time RT-PCR
assays was also used to evaluate the Pbaco expression when the fungus grows on media with
acetate and ethanol as sole carbon sources and in different iron levels. The results demonstrated
that Pbaco transcript is over expressed in acetate and ethanol as sole carbon sources and in highiron
conditions. / Paracoccidioides brasiliensis é um fungo termodimórfico, agente causador de uma importante micose
sistêmica na América Latina, a paracoccidioidomicose (PCM). Uma proteína apresentando massa
molecular de 80kDa e ponto isoelétrico (pI) de 7,79, preferencialmente expressa em células
leveduriformes, foi isolada do proteoma de P. brasiliensis e caracterizada como uma aconitase
(EC 4.2.1.3). Aconitase é uma enzima que catalisa a isomerização do citrato em isocitrato tanto
no ciclo de Krebs (CK) quanto no ciclo glioxalato (CG). No presente estudo reportamos a
clonagem e caracterização do cDNA da aconitase de P. brasiliensis (PbACO). O cDNA
apresentou um quadro aberto de leitura (ORF) com 2337 pares de bases, codificando uma predita
proteína com 779 resíduos de aminoácidos. Objetivando a localização da aconitase de P.
brasiliensis foi produzida e purificada uma proteína recombinante a qual foi utilizada para a
produção de um anticorpo policlonal anti-PbACO. A proteína foi localizada no fluído
extracelular, parede celular, mitocôndria, citosol e nos peroxissomos de células leveduriformes,
como demonstrado por ensaios de Western blotting e por imunocitoquímica. A análise da
expressão do gene Pbaco foi realizada através RT-PCR em tempo real e os resultados
demonstraram um aumento da expressão durante a diferenciação celular de micélio para
levedura. A expressão Pbaco também foi avaliada quando o fungo é cultivado em meios de
cultura contendo acetato e etanol como única fonte de carbono bem como em diferentes
concentrações de ferro. Os resultados demonstraram que o transcrito de Pbaco é mais expresso
em acetato e etanol como única fonte de carbono e em altas concentrações de ferro.
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Inibição da isocitrato liase de Paracoccidioides brasiliensis pelo produto natural argentilactona / Inhibition of isocitrate lyase by Paracoccidioides brasiliensis natural product argentilactonePRADO, Renata Silva do 20 November 2010 (has links)
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Previous issue date: 2010-11-20 / The fungus Paracoccidioides brasiliensis is the causative agent of paracoccidioidomicosys (PCM), the most prevalent human systemic mycosis in Latin America. The toxicity of drugs and the appearance of resistant strains have imposition the search for new therapeutic approaches. Plants with reputed antimicrobial uses represent a rich source for the screening of potential antifungal compounds. In this work, we investigated the inhibitory action of argentilactone, extracted from the essential oil of Hyptis ovalifolia, and its analogues on P. brasiliensis yeast cells, during the differentiation from mycelium to yeast, on native and recombinant PbICL. Sensitivity tests on plates, which assessed the activity of argentilactone on yeast cells of P. brasiliensis showed both argentilactone as reduced argentilactone interfered in fungus growth, affecting the cells in a dose-dependent way. The experiments evaluating the minimum inhibitory concentration (MIC), which evaluated the influence of the compounds during the transition from mycelium to yeast in P. brasiliensis showed that argentilactone and reduced argentilactone interferes in this process, also in a dose-dependent way. A specific activity of isocitrate lyase of the fungus, both recombinant as native, as measured by tests of enzyme activity was also affected by the compounds. The type of inhibition promoted by argentilactone and reduced argentilactone was defined as inhibition of mixed type through tests of enzyme kinetics. Different carbon sources (acetate and glucose) have directly influence on the processs of inhibition. The analogues epoxy argentilactone and diol argentilactone not inhibit the growth and differentiation of P. brasiliensis. In addition, it not inhibited the enzyme isocitrate lyase native or recombinant. / O fungo Paracoccidioides brasiliensis é o agente etiológico da paracoccidioidomicose (PCM), micose humana sistêmica de maior prevalência na América Latina. Devido à toxicidade dos antifúngicos existentes, e ao aparecimento de isolados resistentes, estudos em busca de novas terapias tem adquirido relevância. Plantas com propriedades terapêuticas representam uma fonte em potencial para descoberta de novos antifúngicos. Neste trabalho, foi investigada a influência de argentilactona, extraída do óleo essencial de Hyptis ovalifolia, e seus análogos obtidos sinteticamente sobre células leveduriformes de P. brasiliensis, durante o processo de diferenciação de micélio para levedura e sobre a enzima isocitrato liase recombinate (PbICLr) e nativa. Os testes de sensibilidade em placas, que avaliaram a atividade de argentilactona sobre células leveduriformes de P. brasiliensis, mostraram que tanto argentilactona como argentilactona reduzida interferiram no crescimento do fungo, afetando as células de modo dose-dependente. Os experimentos de avaliação de concentração inibitória mínima (CIM), que avaliaram a influência dos compostos durante a transição de micélio para levedura em P. brasiliensis mostraram que argentilactona e argentilactona reduzida interferem nesse processo, também de modo dose-dependente. A atividade específica da isocitrato liase do fungo, tanto recombinante como nativa, mensurada por testes de atividade enzimática, também foi afetada pelos compostos. O tipo de inibição promovida pela argentilactona e argentilactona reduzida foi definido como inibição do tipo mista, através de testes de cinética enzimática. Diferentes fontes de carbono (acetato e glicose) influenciaram diretamente o processo de inibição. Os análogos epoxi argentilactona e diol argentilactona não inibiram o crescimento de células leveduriformes e o processo de diferenciação de P. brasiliensis. Em adição, também não inibiram a atividade da enzima isocitrato liase recombinante e nativa.
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Caracterização de um Antígeno Rico em Prolina(PRA/Ag2) do fungo patogênico humano Paracoccidioides brasiliensis / Characterization of a Proline-Rich Antigen (PRA/Ag2) of the human pathogenic fungus Paracoccidioides brasiliensisCASTRO, Kelly Pacheco de 31 January 2008 (has links)
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Previous issue date: 2008-01-31 / The dimorphic fungus Paracoccidioides brasiliensis is the causative agent of the
most frequent systemic mycosis in Latin America. In humans, infection starts by
inhalation of fungal propagules, which reach the pulmonary epithelium and differentiate
into the yeast parasitic phase. Here we describe the characterization of a proline-rich
protein (PRA/Ag2) homologue of P. brasiliensis, a predictable cell wall protein, first
identified in Coccidioides immitis. The protein, the cDNA and genomic sequences were
analyzed. Southern blot analysis suggested that there is one copy of the gene in P.
brasiliensis. The cloned cDNA was expressed in Escherichia coli and the purified
rPbPRA/Ag2 was used to obtain polyclonal antibody. The purified recombinant protein
was recognized by sera of patients with proven paracoccidioidomycosis and not by sera
of healthy individuals. Immunoelectron microscopy and biochemical studies
demonstrated the presence of PbPRA/Ag2 in the fungal cell wall, linked through a GPIanchor.
The expression of the Pbpra/ag2 gene was analyzed by real time PCR and
results demonstrated developmental regulation in phases of P. brasiliensis, with a
higher expression in the mycelium saprobic phase. The protein expression analyses
corroborate the transcript levels. / O fungo dimórfico Paracoccidioides brasiliensis é o agente causador da micose sistêmica mais prevalente na América Latina. Em humanos, a infecção se dá pela inalação de propágulos do fungo, que ao alcançarem o epitélio pulmonar transformam se na fase leveduriforme, parasitária, do fungo P. brasiliensis. Neste trabalho,descrevemos a caracterização de um homólogo de PRA/Ag2 (Antígeno rico em prolina), uma proteína predita de parede celular, primeiramente identificada em Coccidioides immitis. A proteína, o cDNA e a seqüência genômica foram analisados.
Análises através de Southern blot sugerem que há somente uma cópia do gene em
P.brasiliensis. O cDNA clonado foi expresso em Escherichia coli e a rPbPRA/Ag2
purificada foi utilizada para obtenção do anticorpo policlonal. A proteína recombinante
purificada foi reconhecida pelo soro de pacientes com paracoccidioidomicose
comprovada e não foi reconhecida pelo soro de pacientes saudáveis. Microscopia
eletrônica e estudos bioquímicos demonstraram a presença do PbPRA/Ag2 na parede
celular de P. brasiliensis, ligada através de uma âncora de GPI. A expressão do gene
que codifica Pbpra/ag2 foi analisada através de PCR em Tempo Real e os resultados
demonstraram regulação da expressão nas fases de P. brasiliensis, com maior nível de
expressão na fase miceliana. Análises da expressão protéica corroboram os resultados
da RT-PCR em Tempo Real.
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