Made available in DSpace on 2014-07-29T15:16:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissert part 1 Benedito.pdf: 5001631 bytes, checksum: 7d51091e361c98586e384be80ebe9178 (MD5) Previous issue date: 2009-05-11 / The pathogenic fungus Paracoccidioides brasiliensis causative of Paracoccidioidomycosis (PCM), a pulmonary mycose acquired by inhalation of fungal airborne propagules, which may disseminate to several organs and tissues leading to a severe form of the disease. Adhesion and invasion to host cells are essential steps involved in the internalization and dissemination of pathogens. Inside host, P. brasiliensis use the glyoxylate cycle for intracellular survival. Here, we provide evidence that malate synthase of P. brasiliensis (PbMLS) is localized on the cell wall, and is secreted. PbMLS was overexpressed in Escherichia coli, and polyclonal antibody against this protein was obtained. By using Confocal Laser Scanning Microscopy and Western blot analysis, PbMLS was detected in the cytoplasm and the cell wall of the yeast phase of P. brasiliensis of mother and bud yeast cells. PbMLSr and the respective polyclonal antibody produced against this protein inhibited the interaction of P. brasiliensis to in vitro cultured epithelial cells A549. These observations indicated that cell wall-associated MLS of P. brasiliensis could be mediating the binding of fungal cells, thus contributing to the adhesion of fungus to host tissues and to the dissemination of infection. / O fungo de patogênico Paracoccidioides brasiliensis agente causador da Paracoccidioidomicose (PCM), uma micose pulmonar adquirida pela inalação de propágulos aéreos do fungo que pode se disseminar a vários órgãos e tecidos levando a uma forma severa da doença. Dentro do hospedeiro, P. brasiliensis usa o ciclo do glioxalato (CG) para sobrevivência intracelular. Adesão e invasão das células do hospedeiro são passos essenciais envolvidos na internalização e disseminação do patógeno. Aqui, nós evidênciamos que malato sintase de P. brasiliensis (PbMLS) é secretada, e é localizada na parede da célula. PbMLS foi superexpressa em Escherichia coli, e o anticorpo policlonal contra esta proteína foi obtido. Usando Microscopia Laser Confocal (CLSM) e análise de Western blot, PbMLS foi encontrada no citoplasma e na parede da célula na fase leveduriforme de P. brasiliensis nas células mãe e broto. PbMLSr e o respectivo anticorpo policlonal produzido contra esta proteína inibiram a interação de P. brasiliensis com células epiteliais A549 cultivads in vitro. Estas observações indicariam que MLS associada à parede da célula de P. brasiliensis pode estar mediando a ligação do fungo às células, contribuindo assim com a adesão do fungo aos tecidos hospedeiros e para a disseminação da infecção.

Paracoccidioides brasiliensis, um fungo termodimórfico, é o agente causador da paracoccidioidomicose (PCM), a micose sistêmica prevalente da América Latina. A patogenicidade aparenta estar intimamente relacionada com a transição dimórfica da forma de micélio para a de levedura, que é induzida pela mudança da temperatura do ambiente pela temperatura do hospedeiro mamífero. Há poucas informações disponíveis sobre genes de P. brasiliensis que são necessários durante a fase patogênica. Nós, então, realizamos as técnicas de SSH (“Suppression Subtraction Hybridization") e de “Macroarray" com o objetivo de identificar genes que sejam preferencialmente expressos na fase leveduriforme do isolado Pb18. Genes identificados em ambos os procedimentos estão mais expressos na fase leveduriforme e estão envolvidos em metabolismo básico, transdução de sinal, crescimento e morfogênese e metabolismo do enxofre. Para testar se as mudanças observadas na expressão gênica refletem as diferenças entre as condições de crescimento usadas para obter as duas formas morfológicas preferivelmente às diferenças intrínsecas dos tipos celulares, nós realizamos experimentos com RT-PCR em tempo real utilizando preparações de RNA derivadas de ambas as fases, micélio e levedura, crescidas a 26°C e 37°C nos meios de cultura completos (YPD e Sabouraud) e meio mínimo. Vinte genes, incluindo AGS1 ( -1,3-glucan synthase) e TSA1 (thiol-specific antioxidant), foram mostrados como mais expressos na levedura patogênica em relação ao micélio. Embora a expressão de RNA mensageiro foi bastante diferente em relação aos meios completos e meio mínimo, mostramos uma tendência geral para que esses genes serem mais expressos nas células leveduriformes patogênicas de P.x brasiliensis. Além disso, mostramos a complementação dos genes METR e SCONC de P. brasiliensis e uma cepa com estes genes deletados de Aspergillus nidulans, sugerindo uma possível homologia entre eles. Mostramos também a análise de genes da via do metabolismo do enxofre foram mais expressos na levedura patogênica de P. brasiliensis em relação ao micélio saprofítico. / Paracoccidioides brasiliensis, a thermodimorphic fungus, is the causative agent of paracoccidioidomycosis (PCM), a prevalent systemic mycosis in Latin America. Pathogenicity appears to be intimately related to the dimorphic transition from the hyphal to the yeast form, which is induced by a shift from environmental temperature to the temperature of the mammalian host. Little information is available on the P. brasiliensis genes necessary during the pathogenic phase. We have therefore undertaken Suppression Subtraction Hybridization (SSH) and macroarray analyses with the aim of identifying genes that are preferentially expressed in the yeast phase. Genes identified by both procedures as being more highly expressed in the yeast phase are involved in basic metabolism, signal transduction, growth and morphogenesis, and sulfur metabolism. In order to test whether the observed changes in gene expression reflect the differences between the growth conditions used to obtain the two morphological forms rather than differences intrinsic to the cell types, we performed real-time RT-PCR experiments using RNA derived from both yeast cells and mycelia that had been cultured at 37 and 26°C in either complete medium (YPD or Sabouraud) or minimal medium. Twenty genes, including AGS1 ( 1,3-glucan synthase) and TSA1 (thiol-specific antioxidant), were shown to be more highly expressed in the yeast cells than in the hyphae. Although their levels of expression could be different in rich and minimal media, there was a general tendency for these genes to be more highly expressed in the yeast cells. Moreover, complementation of P. brasiliensis METR and SCONC genes in strains of Aspergillus nidulans with these genes deleted suggested a possible homology between them. We show the analyses of genes involved in the xii sulphur metabolism pathway and these genes were more expressed in the pathogenic yeast than saprophytic mycelia of P. brasiliensis.

A paracoccidioidomicose (PCM) é uma doença sistêmica de caráter granulomatoso, causada pelo fungo termodimórfico Paracoccidioides spp. A PCM é endêmica na America Latina e aproximadamente 80% do pacientes vivem no território brasileiro. O tratamento medicamentoso é eficiente, entretanto, é longo e vários pacientes acabam abandonando e recidivas são comuns neste grupo. A utilização de uma vacina terapêutica poderia resultar na redução do tempo de tratamento assim como, recuperar a resposta imune do hospedeiro frente ao fungo. As vacinas de DNA são uma abordagem promissora na imunoterapia e podem ser injetadas por via intramuscular, intradérmica ou via mucosa. As proteínas de choque térmico (HSPs) são proteínas que estão ligadas a homeostase celular e também possuem efeitos imunológicos em diversos casos como doenças infecciosas e autoimunes. No presente trabalho, analisamos o esquema vacinal terapêutico em camundongos BALB/c previamente infectados intratraquealmente com 3x105 leveduras de P. brasiliensis Pb18, 60 dias depois, submetidos a imunização com pcDNA3 contendo sequências codificadoras de PbHSP60 e/ou IL-12 murina e/ou vetor vazio. Foi observada redução significativa no número de unidades formadoras de colônia (UFCs) nos pulmões de camundongos imunizados com PbHSP60. Os grupos que receberam PbHSP60+pcDNA3 vazio ou PbHSP60x2 apresentaram os maiores índices de redução da cargas fúngicas. A inclusão do plasmídeo contendo o inserto de mIL-12, resultou em um efeito deletério. A análise dos cortes histológicos indicou que os animais vacinados apresentavam áreas bem preservadas e com poucos ou nenhum foco de granuloma. Detectamos um perfil de citocinas típico Th1/Th2. Nossos resultados sugerem que a imunização utilizando plasmídeo contendo o inserto HSP60, tem grande potencial vacinal / The paracoccidioidomycosis (PCM) is a systemic granulomatous disease of character, caused by the thermally dimorphic fungus Paracoccidioides spp. The PCM is endemic in Latin America and approximately 80% of patients are living in Brazil. The medical treatment is effective, however, is long and many patients end up abandoning and relapses are common in this group.The use of a therapeutic vaccine could result in the reducing time of treatment as well as recover the host immune response against the fungus. DNA vaccines are a promising approach for immunotherapy and can be injected by intramuscular, intradermal, or mucosal route. The heat shock proteins (HSPs) are proteins that are linked to cellular homeostasis and also have immunological effects in many cases as infectious and autoimmune diseases. In the present study, we analyzed the therapeutic vaccine schedule in BALB/c mice previously infected intratracheally with 3x105 yeast of P. brasiliensis strain 18, and 60 days after, undergoing immunization with pcDNA3 containing coding sequences PbHSP60 and / or murine IL-12 and / or empty vector. Significant reduction was observed in the number of colony forming units (CFU) in the lungs of mice immunized with PbHSP60. The groups that received empty pcDNA3 and PbHSP60 or PbHSP60x2 have higher rates of reduced fungal loads. The inclusion of the plasmid containing the insert mIL-12 resulted in a deleterious effect. The analysis of histological sections indicated that vaccinated animals had wellpreserved, with few or no focus of granuloma areas. It was detected a profile typical Th1/Th2 cytokines. Our results suggest that immunization using plasmid containing the insert HSP60 vaccine has great potential

Ao longo dos anos, a humanidade contribuiu para o surgimento de diversos patógenos, tornando-se vítimas de doenças transmitidas dos animais para o homem, as chamadas antropozoonoses. Dentre os animais, os tatus, mamíferos selvagens primitivos, apresentam características anatômicas e fisiológicas peculiares, que os tornam mais susceptíveis à diversas doenças e potenciais reservatórios de patógenos zoonóticos, relevantes para a saúde pública. O objetivo deste estudo foi avaliar a prevalência de cinco patógenos zoonóticos (Toxoplasma gondii, Trypanosoma cruzi, Leishmania spp, Mycobacterium leprae e Paracoccidioides brasiliensis) em quatro espécies de tatus; P. maximus, E. sexcinctus, D. novemcinctus e C. unicinctus do Pantanal e Cerrado do Mato-Grosso-do-Sul. Um total de 50 tatus foram analisados. Sendo, 43 amostras de soros de indivíduos de vida livre (16 Priodontes maximus; 17 Euphractus sexcinctus; 02 Dasypus novemcinctus e 08 Cabassous unicinctus) provenientes do Pantanal e 07 conjuntos de fragmentos de tecidos (pulmão, fígado e baço), de 06 E. sexcinctus e 01 (D. novemcinctus) atropelados em três rodovias do Cerrado do Mato-Grosso-do-Sul. Dos 43 indivíduos amostrados no Pantanal, 13/43 ou 30,23% apresentaram anticorpos anti-T. gondii; 01/43 ou 2,32% anti-T. cruzi e 4/43 ou 9,30% anti-Leishmania (L.) infantum chagasi. Amostras de fragmentos de orelha dos 43 indivíduos do Pantanal, e fragmentos de tecido (pulmão, fígado e baço) dos tatus do Cerrado, também foram analisadas para M. leprae e Leishmania spp através de biologia molecular, nas quais foram negativas. Dos tatus provenientes do Cerrado, analisados para P. brasiliensis, 07 ou 100% dos indivíduos foram positivos. Baseado nestes resultados, pode-se afirmar que os tatus apresentam uma relação e histórico de exposição a estes patógenos, seja através do contato com outras espécies, seres humanos ou condições ambientais onde ocorrem. Contudo, confirma-se a importância destas espécies para o entendimento dos ciclos de transmissão de patógenos e de forma estratégica, como indicadoras da saúde de um ecossistema em programas de investigação e monitoramento de doenças, especialmente as zoonoses. / Over the years mankind has contributed to the emergence of several diseases, while becoming victims of those passed among humans and other animals, known as zoonosis. Armadillos are primitive wild mammals who present peculiar anatomical and physiological characteristics which make them susceptible and potential reservoirs of zoonotic pathogens relevant to public health. The goal of the present study was to evaluate the prevalence of five zoonotic pathogens (Toxoplasma gondii, Trypanosoma cruzi, Leishmania spp., Mycobacterium leprae and Paracoccidioides brasiliensis) in four armadillo species (Priodontes maximus, Euphractus sexcinctus, Dasypus novemcinctus and Cabassous unicinctus) found in Pantanal and Mato-Grosso-do-Sul tropical savanna ecoregion, the Cerrado. A total of 50 armadillos were sampled: 43 free living individuals from Pantanal (16 P. maximus; 17 E. sexcinctus; 02 D. novemcinctus and 08 C. unicinctus) and 07 individuals found dead in three different roads of the Cerrado. Of the 43 individuals sampled in Pantanal, 13 (30.23%) presented T. gondii antibodies; 01 (2.32%) showed antibodies anti-T. cruzi; and 04 (9.30%) showed anti-Leishmania (L.) infantum chagasi antibodies. All 50 samples were also analyzed by molecular biology based on the polymerase chain reaction (PCR). None of the samples tested positive for M. leprae and Leishmania spp. And all seven or (100%) individuals from the Cerrado were tested positive for P. brasiliensis. The results suggest that the armadillos have been exposed to these pathogens, either by contact with other species, including humans or by their own environmental conditions in certain ecosystems. The armadillo species studied may have a greater susceptibility to these pathogens in the natural environment where they occur. Armadillos are key species in understanding diseases transmission cycle, especially regarding zoonotic pathogens and they can strategically act as an indicator of ecosystem health for research programs and zoonotic diseases monitoring.

Espécies do gênero Paracoccidioides spp são fungos patogênicos, termodimórficos, agentes etiológicos de doença endêmica em diversas regiões da América Latina. O indivíduo infectado desenvolve uma resposta específica que, quando associada à alta produção de TNF-? e IFN-?, favorece a resistência ao fungo. Componentes de alguns fungos patogênicos foram caracterizados, por técnicas de knockdown gênico, como importantes para a virulência fúngica. Nosso grupo identificou paracoccina (PCN) como um componente de leveduras de P. brasiliensis; trata-se de uma proteína com um domínio enzimático, dotado de atividade quitinase e um domínio lectínico, ligante de GlcNAc. PCN é dotada das seguintes propriedades: (a) contribui para o crescimento do fungo; (b) promove a adesão da levedura à matriz extracelular, por ligar-se à laminina; (c) interage com N-glicanas de TLR2 e TLR4 e promove ativação celular; (d) estimula macrófagos a produzirem mediadores pró-inflamatórios como IL- 12, TNF-? e NO; (e) promove a polarização M1 de macrófagos; (f) induz atividade fungicida em neutrófilos, bem como formação de NETs e supressão da apoptose, eventos que se mostraram dependentes da síntese de novo de proteínas pelos neutrófilos estimulados. Dada a relevância das atividades biológicas de PCN, promovemos recentemente o silenciamento do gene que codifica essa proteína, através de metodologia que usa RNA anti-sense e transformação mediada por Agrobacterium tumefaciens (ATMT). Uma vez PCN silenciada, a levedura perdeu a capacidade de fazer a transição para micélio e diminuiu a resistência à atividade fungicida de macrófagos. A infecção de camundongos com as cepas silenciadas, em comparação com as WT, causou doença de menor gravidade, com carga fúngica reduzida e baixa taxa de mortalidade. Essas observações sugerem de que PCN funcione como um fator de virulência em P. brasiliensis, que afeta a patogênese da infecção. Neste trabalho, ampliamos as ferramentas moleculares de manipulação do fungo e viabilizamos a superexpressão de PCN em leveduras de P. brasiliensis, tendo como objetivos estudar seu papel na virulência e na patogênese da infecção, bem como determinar os mecanismos responsáveis por tais atividades. A inoculação de leveduras que superexpressam PCN (ov-PCN) em camundongos causou doença pulmonar muito grave, em comparação à doença leve e moderada causada por leveduras silenciadas em PCN e leveduras WT, respectivamente. Nesse sentido, nossos esforços se dedicaram à busca dos mecanismos dos mecanismos através dos quais PCN influencia o curso da infecção experimental. Na tentativa de identificar o papel exercido pelo domínio quitinase da PCN, coletamos o sobrenadante de culturas de leveduras ov-PCN e WT. Partículas de quitina presentes nesses sobrenadantes foram purificadas por afinidade à lectina WGA (wheat germ agglutinin). Através de medida da área das partículas capturadas, através de microscopia eletrônica e aplicação do programa ImageJ, verificamos que a superexpressão de PCN resultou em clivagem mais eficiente da quitina da parede de leveduras, uma vez que apenas partículas muito pequenas (mediana das medidas = 2 nm2) foram detectadas, enquanto as áreas das partículas de quitina obtidas de leveduras selvagens (WT) forneceram mediana 3 vezes maior (6 nm2). As partículas de quitina foram então utilizadas para estimular macrófagos a produzirem citocinas. As obtidas de ov-PCN estimularam preponderantemente a secreção da citocina antiinflamatória IL-10, enquanto os macrófagos estimulados com partículas de leveduras WT produziram mais TNF-? e IL-1?, ambas de efeito pró-inflamatório. Esses resultados permitiram a identificação de um mecanismo importante para que a superexpressão de PCN se associe à ocorrência de doença pulmonar muito grave: o microambiente anti-inflamatório criado pelo estímulo de macrófagos por PCN leva ao desenvolvimento de resposta imune não protetora do tipo Th2 e lesões mais graves. Um segundo mecanismo foi identificado ao compararmos a resistência de leveduras ov-PCN e WT às respostas efetoras de macrófagos. A superexpressão de PCN associou-se à maior internalização das leveduras e maior resistência à atividade fungicida exercida por macrófagos. O estudo demonstra que diferentes níveis da expressão de uma quitinase (como PCN) levam à resistência a atividades antifúngicas de macrófagos e a diferentes graus de clivagem de quitina. A clivagem, por sua vez, pode alterar a estrutura da parede celular fúngica e a geração de fragmentos de quitina, cujos tamanhos e concentrações influenciam a produção de citocinas pelos macrófagos. Sob a ação de citocinas pró- ou antiinflamatórias liberadas pelos macrófagos e, consequentemente, a montagem de respostas adaptativas pode ser decisiva para haver suscetibilidade ou resistência à infecção por P. brasiliensis. Este trabalho proporciona um importante avanço no conhecimento do papel de quitinases na resposta anti-fúngica do hospedeiro. / Species of the genus Paracoccidioides spp are thermodymorphic fungi that cause a systemic disease, which is endemic in several regions of the Latin America. The infected individual develops a specific response that, when associated with the high production of TNF-? and IFN- ?, favors resistance to the fungus. Components of some pathogenic fungi were characterized by gene knockdown techniques as important the for fungal virulence. Our group has identified a component of P. brasiliensis, named Paracoccin (PCN); it is a bifunctional protein with an enzymatic domain, endowed with chitinase activity and a lectin domain, which binds GlcNAc and chitin, a GlcNAc polymers. PCN has the following properties: (a) contributes to the fungus growth; (b) promotes the yeast adhesion to the extracellular matrix, by binding to laminina glycans; (c) interacts with TLR2 and TLR4 N-glycans, which triggers cell activation; (d) stimulates macrophages to produce proinflammatory mediators, such as IL-12, TNF-? and NO; (e) promotes the M1 polarization of macrophages; (f) induces the neutrophils fungicidal activity, NETs formation, and suppression of neutrophils apoptosis, which are depending events on the de novo protein synthesis by neutrophils. Given the relevant biological activities exerted by PCN, we have performed recently the silencing of the gene that codes for this protein through a system that uses RNA anti-sense and Agrobacterium tumefaciens mediated transformation (ATMT). Once having the PCN gene silenced, yeast lost the ability of doing the transition to mycelium and decreased its resistance to macrophages fungicidal activities. Mice infection with PCN-silenced yeasts, compared to the infected with WT yeasts, exhibited a milder pulmonary disease with reduced fungal burden and low mortality rate. These observations suggest that PCN acts as a P. brasiliensis virulence factor that affects the pathogenesis of the fungal infection. In the present study, we expanded the molecular tools for the fungus manipulation and enabled the overexpression of PCN in P. brasiliensis yeasts, aiming to elucidate the PCN role in the fungus virulence and the infection pathogenesis, as well as determining the responsible mechanisms for the PCN activities. Inoculation of the PCN overexpressing yeasts (ov-PCN) into mice caused a very severe lung disease, compared to the mild and moderate diseases caused by PCN-silenced and WT yeasts, respectively. Then our efforts became dedicated to the search of mechanisms through which PCN influences the course of the experimental fungal disease. In an attempt to identify the role of the PCN chitinase domain, we harvested the supernatant of the ov-PCN and WT yeasts cultures. Chitin particles contained in the supernatants have been captured by affinity to the immobilized WGA (wheat germ agglutinin) lectin. By measuring through electron microscopy and application of the ImageJ program the area of the isolated chitin particles, we verified that the overexpression of PCN resulted in a more efficient cleavage of whole chitin molecules contained in the yeast cell wall, since only very small particles (median of the measurements = 2 nm2) were detected, while the the chitin particles areas obtained from WT-yeasts provided a median 3 fold higher (6 nm2). Then, the preparations of chitin particles were taken to stimulate macrophages to produce cytokines. The particles obtained from ov-PCN have stimulated preponderantly the secretion of the anti-inflammatory cytokine IL-10, whereas the macrophages stimulated with WT yeast particles have produced higher concentrations of TNF-? and IL-1?, which are known proinflammatory cytokines. These results allowed the identification of an important mechanism for the association of PCN overexpression to the occurrence of very severe pulmonary disease: the anti-inflammatory microenvironment created by the macrophages stimulation with PCN leads to the development of a non-protective Th2-type immune response and the more severe pulmonary injury. A second mechanism was identified as implicated in the severity of the lung disease associated to PCN overexpression. We compared the sensitivity of ov-PCN and WT yeasts to macrophages effector functions. PCN overexpressing yeasts were better internalized by macrophages and more resistant to the fungicidal activity of these cells, events that contributes for the high pulmonary fungal load verified in mice infected with ov-PCN yeasts. The study demonstrates that different levels of a chitinase (PCN) expression and enzymatic activity lead yeasts to change their sensitivity to macrophages antifungal activities as well as to different grades of chitin cleavage. The cleavage, in its turn, leads to changes in the structure of the fungal cell wall and generation of chitin fragments, whose sizes and concentrations influence the cytokines production by macrophages. Under the influence of pro-inflammatory or anti-inflammatory cytokines released by macrophages, the mounted adaptative responses can be decisive in conferring susceptibility or resistance to the P. brasiliensis infection. This study provides an important advance in the knowledge on the role of a chitinase in the host antifungal response.

Espécies do gênero Paracoccidioides spp são fungos patogênicos, termodimórficos, agentes etiológicos de doença endêmica em diversas regiões da América Latina. O indivíduo infectado desenvolve uma resposta específica que, quando associada à alta produção de TNF-? e IFN-?, favorece a resistência ao fungo. Componentes de alguns fungos patogênicos foram caracterizados, por técnicas de knockdown gênico, como importantes para a virulência fúngica. Nosso grupo identificou paracoccina (PCN) como um componente de leveduras de P. brasiliensis; trata-se de uma proteína com um domínio enzimático, dotado de atividade quitinase e um domínio lectínico, ligante de GlcNAc. PCN é dotada das seguintes propriedades: (a) contribui para o crescimento do fungo; (b) promove a adesão da levedura à matriz extracelular, por ligar-se à laminina; (c) interage com N-glicanas de TLR2 e TLR4 e promove ativação celular; (d) estimula macrófagos a produzirem mediadores pró-inflamatórios como IL- 12, TNF-? e NO; (e) promove a polarização M1 de macrófagos; (f) induz atividade fungicida em neutrófilos, bem como formação de NETs e supressão da apoptose, eventos que se mostraram dependentes da síntese de novo de proteínas pelos neutrófilos estimulados. Dada a relevância das atividades biológicas de PCN, promovemos recentemente o silenciamento do gene que codifica essa proteína, através de metodologia que usa RNA anti-sense e transformação mediada por Agrobacterium tumefaciens (ATMT). Uma vez PCN silenciada, a levedura perdeu a capacidade de fazer a transição para micélio e diminuiu a resistência à atividade fungicida de macrófagos. A infecção de camundongos com as cepas silenciadas, em comparação com as WT, causou doença de menor gravidade, com carga fúngica reduzida e baixa taxa de mortalidade. Essas observações sugerem de que PCN funcione como um fator de virulência em P. brasiliensis, que afeta a patogênese da infecção. Neste trabalho, ampliamos as ferramentas moleculares de manipulação do fungo e viabilizamos a superexpressão de PCN em leveduras de P. brasiliensis, tendo como objetivos estudar seu papel na virulência e na patogênese da infecção, bem como determinar os mecanismos responsáveis por tais atividades. A inoculação de leveduras que superexpressam PCN (ov-PCN) em camundongos causou doença pulmonar muito grave, em comparação à doença leve e moderada causada por leveduras silenciadas em PCN e leveduras WT, respectivamente. Nesse sentido, nossos esforços se dedicaram à busca dos mecanismos dos mecanismos através dos quais PCN influencia o curso da infecção experimental. Na tentativa de identificar o papel exercido pelo domínio quitinase da PCN, coletamos o sobrenadante de culturas de leveduras ov-PCN e WT. Partículas de quitina presentes nesses sobrenadantes foram purificadas por afinidade à lectina WGA (wheat germ agglutinin). Através de medida da área das partículas capturadas, através de microscopia eletrônica e aplicação do programa ImageJ, verificamos que a superexpressão de PCN resultou em clivagem mais eficiente da quitina da parede de leveduras, uma vez que apenas partículas muito pequenas (mediana das medidas = 2 nm2) foram detectadas, enquanto as áreas das partículas de quitina obtidas de leveduras selvagens (WT) forneceram mediana 3 vezes maior (6 nm2). As partículas de quitina foram então utilizadas para estimular macrófagos a produzirem citocinas. As obtidas de ov-PCN estimularam preponderantemente a secreção da citocina antiinflamatória IL-10, enquanto os macrófagos estimulados com partículas de leveduras WT produziram mais TNF-? e IL-1?, ambas de efeito pró-inflamatório. Esses resultados permitiram a identificação de um mecanismo importante para que a superexpressão de PCN se associe à ocorrência de doença pulmonar muito grave: o microambiente anti-inflamatório criado pelo estímulo de macrófagos por PCN leva ao desenvolvimento de resposta imune não protetora do tipo Th2 e lesões mais graves. Um segundo mecanismo foi identificado ao compararmos a resistência de leveduras ov-PCN e WT às respostas efetoras de macrófagos. A superexpressão de PCN associou-se à maior internalização das leveduras e maior resistência à atividade fungicida exercida por macrófagos. O estudo demonstra que diferentes níveis da expressão de uma quitinase (como PCN) levam à resistência a atividades antifúngicas de macrófagos e a diferentes graus de clivagem de quitina. A clivagem, por sua vez, pode alterar a estrutura da parede celular fúngica e a geração de fragmentos de quitina, cujos tamanhos e concentrações influenciam a produção de citocinas pelos macrófagos. Sob a ação de citocinas pró- ou antiinflamatórias liberadas pelos macrófagos e, consequentemente, a montagem de respostas adaptativas pode ser decisiva para haver suscetibilidade ou resistência à infecção por P. brasiliensis. Este trabalho proporciona um importante avanço no conhecimento do papel de quitinases na resposta anti-fúngica do hospedeiro. / Species of the genus Paracoccidioides spp are thermodymorphic fungi that cause a systemic disease, which is endemic in several regions of the Latin America. The infected individual develops a specific response that, when associated with the high production of TNF-? and IFN- ?, favors resistance to the fungus. Components of some pathogenic fungi were characterized by gene knockdown techniques as important the for fungal virulence. Our group has identified a component of P. brasiliensis, named Paracoccin (PCN); it is a bifunctional protein with an enzymatic domain, endowed with chitinase activity and a lectin domain, which binds GlcNAc and chitin, a GlcNAc polymers. PCN has the following properties: (a) contributes to the fungus growth; (b) promotes the yeast adhesion to the extracellular matrix, by binding to laminina glycans; (c) interacts with TLR2 and TLR4 N-glycans, which triggers cell activation; (d) stimulates macrophages to produce proinflammatory mediators, such as IL-12, TNF-? and NO; (e) promotes the M1 polarization of macrophages; (f) induces the neutrophils fungicidal activity, NETs formation, and suppression of neutrophils apoptosis, which are depending events on the de novo protein synthesis by neutrophils. Given the relevant biological activities exerted by PCN, we have performed recently the silencing of the gene that codes for this protein through a system that uses RNA anti-sense and Agrobacterium tumefaciens mediated transformation (ATMT). Once having the PCN gene silenced, yeast lost the ability of doing the transition to mycelium and decreased its resistance to macrophages fungicidal activities. Mice infection with PCN-silenced yeasts, compared to the infected with WT yeasts, exhibited a milder pulmonary disease with reduced fungal burden and low mortality rate. These observations suggest that PCN acts as a P. brasiliensis virulence factor that affects the pathogenesis of the fungal infection. In the present study, we expanded the molecular tools for the fungus manipulation and enabled the overexpression of PCN in P. brasiliensis yeasts, aiming to elucidate the PCN role in the fungus virulence and the infection pathogenesis, as well as determining the responsible mechanisms for the PCN activities. Inoculation of the PCN overexpressing yeasts (ov-PCN) into mice caused a very severe lung disease, compared to the mild and moderate diseases caused by PCN-silenced and WT yeasts, respectively. Then our efforts became dedicated to the search of mechanisms through which PCN influences the course of the experimental fungal disease. In an attempt to identify the role of the PCN chitinase domain, we harvested the supernatant of the ov-PCN and WT yeasts cultures. Chitin particles contained in the supernatants have been captured by affinity to the immobilized WGA (wheat germ agglutinin) lectin. By measuring through electron microscopy and application of the ImageJ program the area of the isolated chitin particles, we verified that the overexpression of PCN resulted in a more efficient cleavage of whole chitin molecules contained in the yeast cell wall, since only very small particles (median of the measurements = 2 nm2) were detected, while the the chitin particles areas obtained from WT-yeasts provided a median 3 fold higher (6 nm2). Then, the preparations of chitin particles were taken to stimulate macrophages to produce cytokines. The particles obtained from ov-PCN have stimulated preponderantly the secretion of the anti-inflammatory cytokine IL-10, whereas the macrophages stimulated with WT yeast particles have produced higher concentrations of TNF-? and IL-1?, which are known proinflammatory cytokines. These results allowed the identification of an important mechanism for the association of PCN overexpression to the occurrence of very severe pulmonary disease: the anti-inflammatory microenvironment created by the macrophages stimulation with PCN leads to the development of a non-protective Th2-type immune response and the more severe pulmonary injury. A second mechanism was identified as implicated in the severity of the lung disease associated to PCN overexpression. We compared the sensitivity of ov-PCN and WT yeasts to macrophages effector functions. PCN overexpressing yeasts were better internalized by macrophages and more resistant to the fungicidal activity of these cells, events that contributes for the high pulmonary fungal load verified in mice infected with ov-PCN yeasts. The study demonstrates that different levels of a chitinase (PCN) expression and enzymatic activity lead yeasts to change their sensitivity to macrophages antifungal activities as well as to different grades of chitin cleavage. The cleavage, in its turn, leads to changes in the structure of the fungal cell wall and generation of chitin fragments, whose sizes and concentrations influence the cytokines production by macrophages. Under the influence of pro-inflammatory or anti-inflammatory cytokines released by macrophages, the mounted adaptative responses can be decisive in conferring susceptibility or resistance to the P. brasiliensis infection. This study provides an important advance in the knowledge on the role of a chitinase in the host antifungal response.

A calcineurina é uma fosfatase ativada por Ca2+ e calmodulina presente em todos os eucariotos que, em fungos, atua na sinalização de eventos em resposta a estímulos do ambiente e tem papel essencial na patogenicidade de fungos causadores de doenças. O Paracoccidioides brasiliensis é um fungo dimórfico causador da paracoccidioidomicose, uma micose sistêmica profunda de importância para a Saúde Pública no Brasil e no restante da América Latina. Neste e em outros fungos dimórficos patogênicos, a transição dimórfica é necessária para o desenvolvimento de patogenicidade, sendo a calcineurina essencial o dimorfismo. Neste trabalho foram caracterizadas as estruturas gênicas das duas subunidades que compõe o heterodímero de calcineurina e sua expressão durante a transição dimórfica. Foram sugeridos possíveis alvos moleculares de interação com a calcineurina através de bioinformática e os níveis de expressão de três deles foram analisados durante a transição dimórfica. Espera-se que este trabalho contribua para uma melhor compreensão dos mecanismos que regulam a transição dimórfica, virulência e patogenicidade em P. brasiliensis e, dessa forma, auxilie no desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas contra a paracoccidioidomicose. / The calcineurin is a Ca2+/almodulin-dependent phosphatase present in all eukaryotes. In fungi, it acts as a signaling molecule that works in response to environmental stimuli and has key role in pathogen city of diverse disease-causing fungi. Paracoccidioides brasiliensis is a dimorphic fungus and the etiological agent of paracoccidioidomycosis, a systemic mycosis important to public health in Brazil and other Latin Americans countries. As in other dimorphic pathogenic fungi, the dimorphic transition is necessary for the development of pathogenicity, with calcineurin playing an essential role to the process of dimorphism. In this work we characterized the gene structures of two subunits that make up the calcineurin heterodimer as well as its expression during the dimorphic transition. We raised possible targets for molecular interaction with calcineurin by bioinformatics and the levels of expression of three of them were examined during the dimorphic transition. We expect that this work might contribute to a better understanding of the mechanisms that regulate the dimorphic transition, virulence and pathogenicity in P. brasiliensis and thus help in developing of new therapeutic approaches against paracoccidioidomycosis.

Ao longo dos anos, a humanidade contribuiu para o surgimento de diversos patógenos, tornando-se vítimas de doenças transmitidas dos animais para o homem, as chamadas antropozoonoses. Dentre os animais, os tatus, mamíferos selvagens primitivos, apresentam características anatômicas e fisiológicas peculiares, que os tornam mais susceptíveis à diversas doenças e potenciais reservatórios de patógenos zoonóticos, relevantes para a saúde pública. O objetivo deste estudo foi avaliar a prevalência de cinco patógenos zoonóticos (Toxoplasma gondii, Trypanosoma cruzi, Leishmania spp, Mycobacterium leprae e Paracoccidioides brasiliensis) em quatro espécies de tatus; P. maximus, E. sexcinctus, D. novemcinctus e C. unicinctus do Pantanal e Cerrado do Mato-Grosso-do-Sul. Um total de 50 tatus foram analisados. Sendo, 43 amostras de soros de indivíduos de vida livre (16 Priodontes maximus; 17 Euphractus sexcinctus; 02 Dasypus novemcinctus e 08 Cabassous unicinctus) provenientes do Pantanal e 07 conjuntos de fragmentos de tecidos (pulmão, fígado e baço), de 06 E. sexcinctus e 01 (D. novemcinctus) atropelados em três rodovias do Cerrado do Mato-Grosso-do-Sul. Dos 43 indivíduos amostrados no Pantanal, 13/43 ou 30,23% apresentaram anticorpos anti-T. gondii; 01/43 ou 2,32% anti-T. cruzi e 4/43 ou 9,30% anti-Leishmania (L.) infantum chagasi. Amostras de fragmentos de orelha dos 43 indivíduos do Pantanal, e fragmentos de tecido (pulmão, fígado e baço) dos tatus do Cerrado, também foram analisadas para M. leprae e Leishmania spp através de biologia molecular, nas quais foram negativas. Dos tatus provenientes do Cerrado, analisados para P. brasiliensis, 07 ou 100% dos indivíduos foram positivos. Baseado nestes resultados, pode-se afirmar que os tatus apresentam uma relação e histórico de exposição a estes patógenos, seja através do contato com outras espécies, seres humanos ou condições ambientais onde ocorrem. Contudo, confirma-se a importância destas espécies para o entendimento dos ciclos de transmissão de patógenos e de forma estratégica, como indicadoras da saúde de um ecossistema em programas de investigação e monitoramento de doenças, especialmente as zoonoses. / Over the years mankind has contributed to the emergence of several diseases, while becoming victims of those passed among humans and other animals, known as zoonosis. Armadillos are primitive wild mammals who present peculiar anatomical and physiological characteristics which make them susceptible and potential reservoirs of zoonotic pathogens relevant to public health. The goal of the present study was to evaluate the prevalence of five zoonotic pathogens (Toxoplasma gondii, Trypanosoma cruzi, Leishmania spp., Mycobacterium leprae and Paracoccidioides brasiliensis) in four armadillo species (Priodontes maximus, Euphractus sexcinctus, Dasypus novemcinctus and Cabassous unicinctus) found in Pantanal and Mato-Grosso-do-Sul tropical savanna ecoregion, the Cerrado. A total of 50 armadillos were sampled: 43 free living individuals from Pantanal (16 P. maximus; 17 E. sexcinctus; 02 D. novemcinctus and 08 C. unicinctus) and 07 individuals found dead in three different roads of the Cerrado. Of the 43 individuals sampled in Pantanal, 13 (30.23%) presented T. gondii antibodies; 01 (2.32%) showed antibodies anti-T. cruzi; and 04 (9.30%) showed anti-Leishmania (L.) infantum chagasi antibodies. All 50 samples were also analyzed by molecular biology based on the polymerase chain reaction (PCR). None of the samples tested positive for M. leprae and Leishmania spp. And all seven or (100%) individuals from the Cerrado were tested positive for P. brasiliensis. The results suggest that the armadillos have been exposed to these pathogens, either by contact with other species, including humans or by their own environmental conditions in certain ecosystems. The armadillo species studied may have a greater susceptibility to these pathogens in the natural environment where they occur. Armadillos are key species in understanding diseases transmission cycle, especially regarding zoonotic pathogens and they can strategically act as an indicator of ecosystem health for research programs and zoonotic diseases monitoring.

Orientador: Liana Maria Cardoso Verinaud / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-04T22:32:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Brito_VaniaNieto_D.pdf: 17655224 bytes, checksum: 75de87a92111468f9002287b57e1c7fe (MD5) Previous issue date: 2005 / Resumo: O timo e o local de maturacao dos linfocitos T que coordenam a resposta imune apos o reconhecimento de antigenos; apesar disso, torna-se alvo em diversas infeccoes. O P. brasiliensis, causador da paracoccidioidomicose, e capaz de invadir o timo e induzir atrofia deste orgao em animais experimentais. Neste estudo, foi analisada a influencia da virulencia fungica (cepas Pb18 e Pb265), da linhagem murina (A/J e B10.A) e de citocinas pro-inflamatorias (TNF e IFN-g) nesse fenomeno. As leveduras da cepa virulenta Pb18 persistiram no timo por um periodo maior e induziram alteracoes histopatologicas mais intensas, embora o isolado Pb265, de baixa virulencia, tambem tenha causado atrofia. O padrao de atrofia, caracterizado por perda de peso do orgao, aumento na taxa de apoptose e perda de delimitacao corticomedular foi semelhante nas duas linhagens, contudo os camundongos B10.A apresentaram tambem alteracoes quantitativas nas subpopulacoes de timocitos e linfocitos T esplenicos. A infeccao fungica também provocou a depressao da resposta proliferativa frente a ConA de timocitos e esplenocitos de camundongos B10.A por um periodo mais prolongado do que de animais da linhagem A/J. Em ambas as linhagens, a infeccao provocou aumento na porcentagem de linfocitos T esplenicos de fenotipo CD4+CD8+. Houve reducao no numero de celulas timicas positivas para TNF e IFN-g apos infeccao com o P. brasiliensis. Utilizando-se camundongos deficientes para o receptor p55 de TNF ou para a producao de IFN-g, verificou-se que o TNF medeia o aumento na apoptose de timocitos pos-infeccao enquanto a perda de peso e da delimitação corticomedular sao desencadeadas pelo IFN-g. Nossos resultados indicam que a atrofia timica observada na paracoccidioidomicose experimental envolve a interacao de fatores relacionados ao fungo e ao hospedeiro, que podem influenciar o curso da doenca / Abstract: Thymus is the site of T cells maturation that orchestrates specific immune response following antigen recognition. In spite of this, it can be a target during many infectious diseases. Paracoccidioides brasiliensis, the etiological agent of paracoccidioidomycosis, is able to invade the thymus inducing atrophy in experimental models. In this study, it was analyzed the influence of fungal virulence (Pb18 and Pb265 isolates), murine strain (A/J e B10.A) and proinflammatory cytokines (TNF e IFN-g) in this phenomenon. Yeasts from virulent strain Pb18 persisted for a larger period in the thymus and induced stronger histopathological alterations, although poorly virulent Pb265 also has induced thymic atrophy. The pattern of atrophy that embodied organ weight decreases, increases in the apoptotic levels and the loss of corticomedullary delimitation was similar in both strains. However, B10. A strain also presented quantitative changes in the thymic and splenic T cell subpopulations. This strain showed a decreased proliferative response of thymocytes and splenocytes to Concanavalin A for a larger period than A/J strain, as well. Both strains had augmentation in the percentage of splenic CD4+CD8+ T cells. There was reduction in the amount of cells positive to TNF and IFN-g in the thymus after infection with P. brasiliensis. By using mice deficient to production of IFN-g or to p55 receptor of TNF it was seen that the TNF mediates the increase of apoptosis that takes place in the thymus after the infection, whereas organ weight decreases and loss of corticomedullary delimitation are performed by IFN-g. Our results suggest that thymic atrophy observed during experimental paracoccidioidomycosis involves interaction of fungal and host related factors and, most probably, influences the course of disease / Doutorado / Imunologia / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

Made available in DSpace on 2014-07-29T15:16:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 fernanda.pdf: 2058487 bytes, checksum: 8d18627071331444bbad758cdb3863e5 (MD5) Previous issue date: 2006-08-31 / The temperature-dependent dimorphic fungus Paracoccidioides brasiliensis is the etiological agent of Paracoccidioidomycosis (PCM), a human systemic mycosis highly prevalent in countries of Latin America. P. brasiliensis is subjected to different insults from human host, such as oxidative stress caused by reactive oxygen species produced by the host during the infection. Thioredoxin (TRX) is an intracellular redox protein that is required to maintain redox homeostasis in response to both reductive and oxidative stress conditions in several organisms. We report here the characterization of a 811 bp cDNA Pbtrx1, encoding a PbTRX1 of 116 amino acids, with a predicted molecular mass of 12 kDa and pI 5.2. This putative protein presented one highly conserved active site motif (WCGPC) between TRXs from several organisms. The phylogenetic analysis performed with PbTRX1 and TRXs from other organisms, putted P. brasiliensis in the fungi clade. We also performed the prediction of the secondary structure of PbTRX1 that shows a pattern characteristic of the open twisted alpha/beta, similar to TRX secondary structures described in other fungus. In order to obtain the recombinant PbTRX1, the expression construct pGEX-4T-3-trx1 was introduced into Escherichia coli cells and the expression and purification of the recombinant protein was obtained. The recPbTRX1 and PbTRX1 from yeast cells extract were found to catalyze the reduction of insulin. However the PbTRX1 from yeast cells extract treated with H2O2 showed highly insulin reduction activity than the yeast cells no treated. PbTRX1 was detected by Western blotting in the extracts from yeast cells growth and from mycelium to yeast transition. The yeast cells growth was significantly inhibited by H2O2; however the mycelium to yeast transition was little affected by this oxidant. Semi-quantitative RT-PCR was employed to analysis the expression of Pbtrx1 gene in response to H2O2. The level of Pbtrx1 transcripts was higher in yeast cells treated with H2O2 than in yeast cells no treated. To realize how P. brasiliensis deals with oxidative stress is essential to understand the mechanisms involved in its survival in the host. It may be possible that PbTRX1 enhances survival of P. brasiliensis in the host, protecting the fungus against the reactive oxygen species and allowing, in this way, the progress of the infection. / O fungo termodimórfico, Paracoccidioides brasiliensis, é o agente etiológico da paracoccidioidomicose (PCM), uma micose sistêmica humana, com alta prevalência na América Latina. No hospedeiro humano, o fungo P. brasiliensis está sujeito a vários insultos, tais como o estresse oxidativo causado pelas espécies reativas de oxigênio, que são produzidas pelas células de defesa do hospedeiro durante a infecção. A tiorredoxina (TRX) é proteina redox intracelular que participa da manutenção da homeostase redox da célula, tanto em condições de estresse oxidativo quanto redutor. Neste trabalho apresentamos a caracterização de um cDNA de 811 pb, designado como Pbtrx1, que codifica para uma proteína, PbTRX1, de 116 resíduos de aminoácidos com massa molecular predita de 12 kDa e pI de 5,2. PbTRX1 apresentou um motivo de sítio ativo conservado (WCGPC) entre as TRXs de vários organismos. Análise filogenética com PbTRX1 e TRXs de outros organismos colocou P. brasiliensis no clado de fungos. Foi também realizada a predição da estrutura secundária da PbTRX1, que apresentou um padrão característico formado por cadeias-β que estão envolvidas por α-hélices. Para obter a proteína recombinante, recPbTRX1, foi realizada a construção do pGEX-4T-3-trx1 e este foi introduzido nas células de Escherichia coli. Assim, a expressão e purificação da proteína recombinante foi obtida. A proteína recPbTRX1 e a PbTRX1, presente no extrato protéico de células leveduriformes, apresentaram atividade redutora de insulina. Entretanto, a PbTRX1 presente no extrato protéico de células leveduriformes tratadas com H2O2, mostrou maior atividade redutora de insulina quando comparada com extrato de células leveduriformes não tratadas. A PbTRX1 foi detectada, por Western blotting, em extratos de células leveduriformes em crescimento e durante a transição de micélio para levedura. O crescimento das células leveduriformes foi inibido por H2O2, entretanto a transição de micélio para levedura foi pouco afetada por este oxidante. A técnica de RT-PCR semi-quantitativo foi empregada para análise da expressão do Pbtrx1 em resposta ao H2O2. O nível de transcritos de Pbtrx1 foi maior nas células leveduriformes tratadas com H2O2 do que nas células não tratadas. Para compreender como P. brasiliensis lida com estresse oxidativo é essencial entender os mecanismos envolvidos em sua sobrevivência no hospedeiro. É possível que PbTRX1 aumente a sobrevivência de P. brasiliensis no hospedeiro, protegendo o fungo contra espécies reativas de oxigênio e, desta maneira, permitindo o progresso da infecção.