Made available in DSpace on 2014-06-12T15:04:52Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo4510_1.pdf: 1312401 bytes, checksum: 103b70bf03d8851fef2766e8bd0290f9 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2004 / Paracoccidioides brasiliensis é um fungo dimórfico e agente etiológico da paracoccidioidomicose, uma micose sistêmica de evolução aguda ou crônica que se não diagnosticada e tratada a tempo pode ser fatal. Um método molecular para caracterização e detecção de P. brasiliensis foi desenvolvido a partir da clonagem e do sequenciamento de um fragmento de DNA de ~750 pb, obtido por RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA), presente em isolados virulentos e ausente em isolados avirulentos deste fungo. Uma região interna do fragmento de DNA seqüenciado foi usada para desenhar primers que posteriormente foram utilizados em uma reação de hemi-nested PCR em tubo único. A reação de PCR específica foi capaz de amplificar DNA de três isolados de P. brasiliensis reconhecidamente virulentos e três isolados recentemente obtidos de pacientes com paracoccidioidomicose. A especificidade desta PCR foi confirmada pela ausência de produtos amplificados com DNA genômico de isolados de Histoplasma capsulatum, Blastomyces dermatitidis, Coccidioides immitis, Sporothrix schenckii, Cryptococcus neoformans, Candida albicans, Aspergillus fumigatus, Mycobacterium tuberculosis, Leishmania braziliensis, Trypanosoma cruzi, Schistosoma mansoni, DNA genômico humano (leucócitos) e de isolados de P. brasiliensis reconhecidamente avirulentas. A amplificação de cDNA de um isolado virulento sugere tratar-se de um gene expresso. A detecção específica de isolados virulentos de P. brasiliensis sugere ser este um candidato a marcador de virulência para este fungo. O potencial diagnóstico da PCR específica foi verificado com DNA extraído de aspirado de linfonodo de um paciente com paracoccidioidomicose

Orientador: Maria Heloisa Souza Lima Blotta / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-07T06:51:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Corvino_ClaudiaTres_M.pdf: 633875 bytes, checksum: 46aff21f882b64dcbb4eefa73f93a232 (MD5) Previous issue date: 2005 / Resumo: A interleucina 18 (IL-18) é uma citocina pró-inflamatória com importante participação tanto na resposta inata como adquirida. Concentrações elevadas de IL-18 são encontradas em várias doenças inflamatórias e infecciosas. A expressão aumentada de IL-18 pode contribuir para a resolução de processos infecciosos, mas também pode promover uma resposta inflamatória exagerada, prejudicial ao hospedeiro. O objetivo deste estudo foi determinar as concentrações séricas de IL-18 e outros mediadores inflamatórios (IL-12, sICAM-1, sTNFRI, sTNFRII, CXCL9, CXCL10), antes e após tratamento antifúngico, em pacientes com a forma juvenil (FJ) e adulta (FA) da paracoccidioidomicose (PCM), assim como em indivíduos normais saudáveis e relacionar com a atividade e gravidade da doença. Também foram avaliadas as concentrações de IgG total, subclasses de IgG e IgE anti-gp43 de P. brasiliensis. Todas as dosagens foram realizadas por método imunoenzimático (ELISA). Os níveis séricos basais de IL-18, IL-12, sICAM-1, sTNFRI, sTNFRII, CXCL9, CXCL10 estavam mais elevados em pacientes com PCM em relação ao grupo controle. Pacientes com a FJ apresentaram concentrações mais elevadas de IL-18 e sTNFRII em relação aqueles com a FA da PCM, enquanto estes mostraram maiores concentrações de sTNFRI em relação aos pacientes com a FJ. Houve correlação positiva entre as concentrações de IL-18 e sICAM-1 (r=0.62, p<0.0001), sTNFRI (r=0.61, p<0.0001), sTNFRII (r=0.64, p=0.002) e também em relação a gravidade da doença nos pacientes com a FJ. A terapia anti-fúngica resultou em significante diminuição das concentrações séricas de todos os mediadores inflamatórios analisados que, de maneira geral, atingiram os valores encontrados no grupo controle ao final de 2 anos de tratamento. A pesquisa de anticorpos mostrou níveis basais maiores de IgG4 e IgE nos pacientes com a FJ, enquanto que a IgG1 estava mais elevada naqueles com a FA. Em conjunto os resultados mostraram que uma forte resposta inflamatória marca a fase inicial da PCM humana e que mediadores como a IL-18 e o sTNFRII parecem contribuir em particular para uma forma mais grave da doença / Abstract: IL-18 is a pro-inflammatory cytokine of the IL-1 superfamily that exhibits broad functional effects in innate and acquired immune responses and which has been found in high levels in several chronic inflammatory and autoimmune diseases. Over-expression of IL-18 may promote early resolution of infection or could induce a detrimental exaggerated immune response. The aim of this study was to determine serum levels of IL-18 and other inflammatory mediators (IL-12, sICAM-1, sTNFRI, sTNFRII, CXCL9, CXCL10) at baseline and after antifungal therapy in serum from patients with juvenil (JF) and adult form (AF) of paracoccidioidomycosis (PCM) as well as in healthy controls (C), and to assess their possible relationships to the severity of disease. IL-18 and sTNFRII levels in patients with the JF of PCM were significantly higher than in the AF and controls. In relation to sICAM-1, no difference was observed between JF and AF but both presented higher levels than controls. sTNFRI levels were higher in patients with PCM than in controls, and significant higher concentrations were detected in AF patients as compared to JF ones. Moreover IL-12 and chemokines CXCL9 and CXCL10 were also higher in patients than in controls. In JF patients IL-18 levels significantly correlated with sICAM-1 (r=0.62, p<0.0001), sTNFRI (r=0.61, p<0.0001), sTNFRII (r=0.64, p=0.002), as well as with clinical severity. The results suggest the value of serum IL-18 and sTNFRs levels as a parameter of PCM severity and may support a possible role for them in the pathogenesis of the disease / Mestrado / Ciencias Biomedicas / Mestre em Ciências Médicas

Made available in DSpace on 2014-07-29T15:16:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao parte 1 lidiane biologia.pdf: 35041 bytes, checksum: c58f88ce1be4655ee71c7b5ab0bef247 (MD5) Previous issue date: 2008-04-03 / Paracoccidoides brasiliensis is a human pathogenic dimorphic fungus. The recombinant chitinase from P. brasiliensis, Pbcts1r, was overexpressed in Escherichia coli using pET-32a (+) as vector. The enzyme was produced as inclusion bodies and became soluble by Sarkosyl being purified by a single step using a Ni-NTA resin. Pbcts1r showed activity against 4-MU-(GlcNAc)3 and 4-MU-(GlcNAc)2, presenting a endochitinase activity. Immunoblot reaction with anti-Pbcts1r identified two proteins in yeast crude extract. A partial purification of P. brasiliensis yeast crude extract by cationic-exchange chromatography on HPLC revealed two different chitinases, Pbcts1 and Pbcts2, with molecular mass of 45 kDa and 34 kDa, respectively. Pbcts2 has exochitinase activity and Pbcts1 has endochitinase activities. Reactions with anti- Pbcts1r showed the presence of Pbcts1 and Pbcts2 in crude extracts of yeast and transition from mycelium to yeast. On mycelium crude extracts was found only Pbcts1 and on yeast cell wall extract only Pbcts2. Both proteins were found to be secreted by yeast parasitic phase showing their probable importance in the permanence of the fungus in the human host. Phylogenetic relationships between the orthologs Pbcts1 and the putative Pbcts2 indicated the presence of a common ancestral. During evolution, P. brasiliensis could have acquired Pbcts2 and Pbcts1 playing distinct roles in order to growth and survive in diverse environment on saprophytic and parasitic phases / Paracoccidioides brasiliensis é um fungo dimórfico patogênico humano. A quitinase recombinante de P. brasiliensis, Pbcts1r, foi superexpressa em Escherichia coli utilizando pET-32(a)+ como vetor. A enzima foi produzida em corpos de inclusão e se tornou solúvel pela adição de sarkosyl, sendo purificada em um único passo com a utilização da resina Ni-NTA. Pbcts1r mostrou atividade diante de 4-MU-(GlcNAc)3 e 4- MU-(GlcNAc)2, apresentando atividade de endoquitinase. A reação de imunoblot com anti-Pbcts1r identificou duas proteínas no extrato bruto de levedura. A purificação parcial do extrato bruto de P. brasiliensis por cromatografia de troca-catiônica em HPLC revelou duas quitinases diferentes, Pbcts1 e Pbcts2, com massas moleculares de 45 e 34 kDa, respectivamente. Pbcts2 tem atividade de exoquitinase e Pbcts1 de endoquitinase. Reações com anti-Pbcts1r mostraram a presença de Pbcts1 e Pbcts2 no extrato bruto de levedura e transição de micélio para levedura. No extrato bruto de micélio foi encontrado somente Pbcts1 e no extrato de parede celular de levedura somente Pbcts2. Ambas as proteínas foram encontradas secretadas pela fase parasitária (levedura), mostrando a provável importância dessas proteínas na permanência do fungo no hospedeiro. Relações filogenéticas entre os ortólogos Pbcts1 e a provável Pbcts2 indicam a presença de um ancestral comum. Durante a evolução, P. brasiliensis poderia ter adquirido Pbcts2 e Pbcts1 desempenhando diferentes papéis para o crescimento e sobrevivência do fungo na fase saprofítica e parasitária

Submitted by Luanna Matias (lua_matias@yahoo.com.br) on 2015-05-15T19:59:02Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Vanessa Rafaela Milhomem Cruz Leite - 2014.pdf: 2374224 bytes, checksum: bbdd09c7a011fbfa20239423f0d7f3fb (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Luanna Matias (lua_matias@yahoo.com.br) on 2015-05-19T14:14:18Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Vanessa Rafaela Milhomem Cruz Leite - 2014.pdf: 2374224 bytes, checksum: bbdd09c7a011fbfa20239423f0d7f3fb (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-05-19T14:14:18Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Vanessa Rafaela Milhomem Cruz Leite - 2014.pdf: 2374224 bytes, checksum: bbdd09c7a011fbfa20239423f0d7f3fb (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Previous issue date: 2014-03-13 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / The fungi of the genus Paracoccidioides sp are etiologic agents of disease paracoccidioidomycosis (PCM), are termodimórficos and have the ability to move the saprobiótica form to yeast form at a temperature around 37 ° C. The uptake is essential for the growth and adaptation of the fungus in host tissue, where nitrogen-dependent pathways have close relationship with pathogenicity. Pathogenic organisms possess a regulatory system called Nitrogen Catabolic Represion which is induced when nitrogen availability is limiting in surround causing the expression of genes necessary for nutrient uptake when preferred sources such as glutamine and ammonia are scarce. This regulatory process comprises a complex system in the infectious process. This study aims to identify proteins regulated by nitrogen depletion, where the pathogenic fungus Pb01-like was analyzed as a proteomic response. Pb01-like was grown in minimal medium control MMcM (+N) and treated MMcM (-N) for 6 hours at 37 ° C, cytoplasmic proteins were extracted and subjected to tryptic digestion and quantification. The proteomic profile revealed an expression of 135 proteins, 40 proteins induced or identified the treaty, 58 repressed or identified control and 44 proteins were expressed constitutively. In silico analyzes showed that the gene is regulated by formamidase areA transcription factor that responds conditions of nitrogen depletion in Aspergillus nidulans and the surrounding medium the enzymatic activity for the gene of formamidase Pb01-like induced depletion of nitrogen during. The amino acid sequence of the regulatory gene areA important in the metabolism of nitrogen was aligned between Pb01-like, Pb18, Aspergillus nidulans and Neurospora crasssa where this alignment showed high identity and homology of conserved zinc finger domains and DUF 1752. Metabolic pathways such as fermentation, gluconeogenesis, protein synthesis, nitrogen metabolism were induced for the depletion of nitrogen, showing a possible modulation of the metabolism of the fungus in order to be able to adapt to environments with nitrogen limitation. / Os fungos do genêro Paracoccidioides sp são agentes etiológicos da doença paracoccidioidomicose (PCM), são termodimórficos e possuem a capacidade de transitar da forma miceliana para a forma de levedura à temperatura em torno de 37°C. A captação de nitrogênio é essencial para o crescimento e adaptação do fungo em tecido hospedeiro, onde vias dependentes de nitrogênio possuem estreita relação com a patogenicidade. Organismos patogênicos possuem um sistema regulatório conhecido como Nitrogen Catabolic Repression que é induzido quando a disponibilidade de nitrogênio é limitante no meio, ocasionando a expressão de genes necessários para a captação do nutriente quando fontes preferenciais como a glutamina e amônia estão escassas. Esse processo regulatório compõe um complexo sistema no processo infeccioso. Este trabalho tem o objetivo de identificar proteínas reguladas pela depleção de nitrogênio, onde o fungo patogênico Pb01-like foi analisado quanto sua resposta proteômica. Pb01-like foi cultivado em meio mínimo controle MMcM (+N) e tratado MMcM (-N) por 6 horas a 37°C, as proteínas citoplasmáticas foram extraídas e submetidas a quantificação e digestão triptica. O perfil proteômico revelou uma expressão 135 proteínas, sendo 40 proteínas induzidas ou identificadas apenas no tratado, 58 proteínas reprimidas ou identificadas apenas no controle e 44 foram expressas constitutivamente. Análises in silíco revelou que o gene da formamidase é regulado pelo fator de transcrição areA, em Aspergillus nidulans que responde as condições de depleção de nitrogênio do meio circundante sendo a atividade enzimática para o gene da formamidase de Pb01-like induzida durante a depleção de nitrogênio. A sequência de aminoácidos do fator de transcrição areA importante regulador do metabolismo de nitrogênio foi alinhado entre Pb01-like, Pb18, Aspergillus nidulans e Neurospora crasssa onde esse alinhamento demonstrou uma alta identidade e homologia dos domínios conservados dedo de zinco e DUF 1752. Vias metabólicas como a fermentação, gliconeogênese, síntese de proteínas, metabolismo de nitrogênio estavam induzidas durante a depleção de nitrogênio, demonstrando uma possível modulação do metabolismo do fungo afim de conseguir adaptar-se a ambientes com limitação de nitrogênio.

Submitted by Erika Demachki (erikademachki@gmail.com) on 2015-01-29T18:42:14Z No. of bitstreams: 2 Tese - Luiz Augusto Pereira - 2008.pdf: 11628724 bytes, checksum: 97ca17282a858a05078e31d8a06bfefe (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Erika Demachki (erikademachki@gmail.com) on 2015-01-29T18:42:52Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Tese - Luiz Augusto Pereira - 2008.pdf: 11628724 bytes, checksum: 97ca17282a858a05078e31d8a06bfefe (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-01-29T18:42:52Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Tese - Luiz Augusto Pereira - 2008.pdf: 11628724 bytes, checksum: 97ca17282a858a05078e31d8a06bfefe (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Previous issue date: 2008-09-04 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Paracoccidioides brasiliensis, an important human pathogen causative of paracoccidioidomycosis (PCM), a systemic mycosis with broad distribution in Latin America. Adhesion to and invasion of host cells are essential steps involved in the infection and dissemination of pathogens. Furthermore, pathogens use their surface molecules to bind to host extracellular matrix components to establish infection. An adhesin of P. brasiliensiswas isolated from two dimensional electrophoresis and characterized. Peptides obtained by partial sequencing of the isolated protein, which presenteda molecular mass of 29 kDa and pI 5.8, were subjected to sequence analysis of their amino acids, that revealed strong homology to triose phosphate isomerase (TPI) from several sources. The complete cDNA and gene encoding TPI of P. brasiliensis (PbTPI) were characterized and both contained an open reading frame predicted to encode a 249 amino acid protein that presented all the peptides characterized in the native PbTPI. The complete coding PbTPI cDNA was cloned and over expressed in Escherichia coli host. The purified recombinant TPI was used to produce polyclonal antibody in rabbit. By immunoelectron microscopy and Western blot analysis, TPI was detected in the cell wall and the cytoplasm of the yeast phase of P. brasiliensis. The expression of PbTPI was analyzed in transition from mycelia to yeast phase. The native PbTPI is preferentially expressed in the yeast parasitic phase of P. brasiliensis. The recombinant PbTPI was found to bind to laminin and fibronectin in ligand far-Western blot assays. TPI binds preferentially to laminin, as determined by peptide inhibition assays. Of special note, the treatment of P. brasiliensisyeast cells with anti-PbTPI polyclonal antibody and the incubation of pneumocytes and VERO cells with the recombinant protein promoted inhibition of adherence and internalization of P. brasiliensisto those in vitrocultured cells. These observations indicate that TPI could be contribute to the adhesion of the microorganism to host tissues and to the dissemination of infection. / Paracoccidioides brasiliensis é um importante patógeno humano que causa a paracoccidioidomicose (PCM), uma micose sistêmica com ampla distribuição na América Latina. A adesão e a invasão de células são eventos essenciais envolvidos na infecção e disseminação do patógeno. Para isso, patógenos utilizam suas moléculas de superfície para se ligar a componentes da matriz extracelular e estabelecer a infecção. Uma proteína antigênica de P. brasiliensisfoi isolada a partir do gel de eletroforese bidimensional de proteínas totais do fungo e caracterizada. Peptídeos obtidos por sequenciamento parcial da proteína de 29 kDa e pI 5.8 mostraram homologia com triose fosfato isomerase (TPI) de diversos organismos. O cDNA e o gene completos que codificam para TPI de P. brasiliensis (PbTPI) foram caracterizados, e ambos contém uma ORF que codifica para uma proteína com 249 aminoácidos que apresenta todos os peptídeos caracterizados na PbTPI nativa. O cDNA completo que codifica para PbTPI foi expresso em Escherichia coli. A proteína recombinante TPI foi utilizada para produção de anticorpo policlonal em coelho. Através de imunomicroscopia de transmissão eletrônica e análises por Western blotting, foi detectada a presença da TPI, na parede celular de leveduras de P. brasiliensis e no citoplasma. A expressão da PbTPI foi analisada na transição das fases de micélio para levedura. A PbTPI nativa está preferencialmente expressa na fase parasitária de P. brasiliensis. A PbTPI recombinante foi capaz de se ligar a laminina e fibronectina em ensaios de Western blotting de afinidade. PbTPI se liga preferencialmente a laminina, como foi determinado por ensaio de inibição com peptídeos sintéticos. Uma observação importante, é que tanto o tratamento de P. brasiliensiscom anticorpo anti-PbTPI, quanto de pneumócitos e células VERO tratados com a TPI recombinante, promoveram considerável inibição da aderência e internalização de P. brasiliensisàs células cultivadas in vitro. Essas observações indicam que a TPI possivelmente contribui para a adesão do microrganismo aos tecidos do hospedeiro e para a disseminação da infecção.

Submitted by Franciele Moreira (francielemoreyra@gmail.com) on 2017-08-04T16:47:05Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Juliana Santana de Curcio - 2014.pdf: 2001377 bytes, checksum: 2f9ef22cd0a300cc93ee483fab0fb9c1 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2017-08-07T15:54:46Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Juliana Santana de Curcio - 2014.pdf: 2001377 bytes, checksum: 2f9ef22cd0a300cc93ee483fab0fb9c1 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-08-07T15:54:46Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Juliana Santana de Curcio - 2014.pdf: 2001377 bytes, checksum: 2f9ef22cd0a300cc93ee483fab0fb9c1 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2014-02-21 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Paracoccidioides spp. represents thermodimorphic fungi that cause paracoccidioidomycosis, the most widespread systemic mycosis in Latin America. During the establishment of the infection, proteins located in cell membranes are responsible for many essential processes for pathogen survival as transport of nutrients, accession, signaling and energy production. Cell membranes are basically composed of a lipid bilayer with proteins associated. The proteins can be associated with the membrane through transmembrane domains, posttranslational added modifications or through electrostatic interactions. Therefore the knowledge of the constitution of the proteins of membranes is important to understand some processes developed by Paracoccidioides sp. for its growth and survival within the host. To this end, two techniques of separation and identification of proteins were employed. The first methodology used two-dimensional electrophoresis and mass spectrometry, where the extract of membranes proteins was obtained after steps of ultracentrifugation and the second methodology used liquid chromatography coupled with mass spectrometry, to this methodology three protocols were employed to obtain the extract of membranes proteins. The first methodology employed ultracentrifugation, and the second e third methodology used ultracentrifugation/sonication and ultracentrifugation with elevation of pH respectively. After these steps, the extract of membranes proteins was obtained through of ultracentrifugation and elevation of pH with sodium carbonate. Transmission Electron Microscopy (TEM) was performed to confirm the quality of the sample, a fraction enriched in cell membranes of Paracoccidioides sp.. Posteriorly the proteins obtained by standard methodology were subjected to tryptic digestion and analyzed by NanoUPLC-MSE.. In silico analyzes of the identified proteins were performed to determine the location and possible association of the proteins with the cell membranes. From total of proteins identified, one hundred thirty -three proteins were identified as belonging the cell membranes of Paracoccidioides sp.. Eighty-eight proteins showed at least one transmembrane domain and thirteen identified proteins showed a signal peptide at the N-terminus, beyond the transmembrane domain. Different forms of association of the proteins with membranes of Paracoccidioides sp. were detected, including domain transmembrane, GPI anchor, prenylation, myristoylation, palmitoylation. The most of the of integral membrane proteins identified in proteome were annotated in the genome of Paracoccidioides sp. Together these results show the establishment of an experimental protocol for the extraction of membranes proteins of Paracoccidioides spp., as well identify proteins from membrane fractions this fungus. / Paracoccidioides spp. representa um gênero de fungos termodimórficos, agentes etiológicos da paracoccidioidomicose, a micose sistêmica mais comum na América Latina. Durante o processo infeccioso proteínas localizadas em membranas celulares são responsáveis por muitos processos essenciais para a sobrevivência do patógeno, como transporte de nutrientes, adesão, sinalização e produção de energia. Basicamente membranas celulares são constituídas de uma bicamada lipídica com proteínas associadas. As proteínas de membranas associam-se a bicamada lipídica através de domínios transmembrana, por adição de uma modificação pós traducional e por meio de interações eletrostáticas. Portanto, o conhecimento da constituição proteica das membranas de Paracoccidioides sp. permite entender alguns dos processos desenvolvidos pelo fungo para sobrevivência dentro do hospedeiro. Desta forma o presente trabalho teve como objetivo à determinação da metodologia para obtenção de proteínas de membranas e a consequente descrição dessas proteínas. Para este fim, duas técnicas de separação e identificação de proteínas foram empregadas. A primeira metodologia baseava-se em eletroforese bidimensional e espectrometria de massas onde o extrato proteico de membranas foi obtido após duas etapas de ultracentrifugação e a segunda metodologia utilizava cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas, para esta metodologia três protocolos foram empregados no intuito de obter extratos proteicos de membranas. O primeiro protocolo emprega ultracentrifugação e o segundo e terceiro protocolo empregava ultracentrifugação/sonicação e ultracentrifugação combinado com elevação do pH respectivamente. Após as etapas de padronização do protocolo, o extrato proteico de membranas foi obtido através de ultracentrifugação e solubilização com carbonato de sódio em pH elevado. A microscopia eletrônica de transmissão (MET) foi realizada para confirmar a qualidade da amostra enriquecida com a fração de membranas de Paracoccidioides sp.. Posteriormente o extrato proteico de membranas proveniente da metodologia padronizada foi submetido à digestão tríptica e analisado por NanoUPLC-MSE. Análises in silico das proteínas identificadas foram realizadas a fim de se determinar a localização destas proteínas e possíveis associações com as membranas. Do total de proteínas identificadas cento e trinta e três proteínas foram classificadas como pertencentes a membranas celulares de Paracoccidioides sp., oitenta e oito proteínas apresentaram ao menos um domínio transmembrana e treze proteínas, além de domínio transmembrana apresentaram um peptídeo sinal na porção N-terminal da proteína. Diferentes formas de associação com as membranas de Paracoccidioides sp. foram identificadas neste trabalho, incluindo domínio transmembrana, âncora de GPI, prenilação, palmitoilação e miristoilação. A maioria das proteínas integrais de membrana identificadas no proteoma já foram anotadas no genoma deste fungo. Juntos estes resultados demonstram o estabelecimento de um protocolo experimental para a extração de proteínas de membranas de Paracoccidioides spp., bem como identificam as proteínas de frações de membranas do fungo.

Conforme novas tecnologias e metodologias estão surgindo, e pesquisadores estão sedentos por ferramentas moleculares mas rápidas, mais eficientes e fáceis de usar, dominar os princípios e tecnologias do design de vetores e padronização de partes biológicas tornaram-se desafios fundamentais. Isso está abrindo espaço para o surgimento de uma disciplina inteiramente nova chamada Biologia Sintética. Esta área de estudo inovadora combina partes e módulos biológicos para criar sistemas mais confiáveis e robustos. Linhagens fúngicas são comumente alvo desses estudos, não apenas porque muitos achados fundamentais em relação à clonagem molecular surgiram das lições dadas por elas, mas também devido a um imenso e inexplorado potencial desses organismos em uma ampla gama de aplicações - desde biocombustíveis e produção de químicos finos até terapias biomédicas. Neste contexto, a presente dissertação é dividida em duas partes: a primeira diz respeito ao design e construção de uma ferramenta modular e versátil para ser aplicada em várias linhagens de fungos. Essa ferramenta é um plasmídeo binário para transformação mediada pro Agrobacterium tumefaciens, que foi construído em quatro diferentes versões contendo GFP ou mCherry como proteínas repórter e um gene sintético de resistência à higromicina como marcador de seleção. O vetor foi validado em Paracoccidioides lutzii, um patógeno oportunista humano dimórfico que é muito importante para medicina, mas ainda carecia de ferramentas genéticas eficientes. A segunda parte consiste na criação de uma biblioteca de promotores para a levedura oleaginosa Rhodosporidium toruloides, um promissor hospedeiro para a produção de bioprodutos a partir de biomassa, uma vez que pode eficientemente consumir açúcares C5 e C6 e aromáticos derivados da lignina. Vinte e nove promotores foram testados em um cassete de duplo-repórter - compreendendo ambas as proteínas fluorescentes GFP e mRuby - utilizando citometria de fluxo para análise de células únicas. A coleção de promotores apresentados neste trabalho é a maior disponível para R. toruloides até o momento e foi um avanço indispensável para superar a10 escassez de ferramentas para este organismo. Notavelmente, também apresentamos os primeiros promotores bidirecionais descritos para essa levedura e otimizamos o protocolo de transformação. Portanto, a Biologia Sintética foi eficientemente aplicada para expandir a coleção de partes biológicas padronizadas e otimizar vetores para transformação e manipulação genética de fungos. Estas ferramentas são de valor imediato e são aplicáveis a desafios muito distintos, mas igualmente importantes: a busca de novas soluções para a saúde humana e para uma economia bio-sustentável. / As new technologies and methodologies are surfacing, and researchers are now eager for fast, enhanced and easy-to-use molecular tools, mastering the principles and technologies of vector design and standardization of biological parts have become fundamental challenges. This is making room for the rise of an entirely novel discipline called Synthetic Biology. This innovative field of study combines biological parts and modules to create more reliable and robust systems. Fungal strains are commonly the target of these studies, not only because several fundamental findings regarding molecular cloning arose from lessons given by them, but also due to an immense and much unexplored potential of those organisms in a wide range of applications - ranging from biofuels and fine chemicals production to biomedical therapies. In this context, the present dissertation is divided in two parts: the first one concerns the design and construction of a modular and versatile tool to be applied in several fungal strains. This tool is a plasmid binary vector for Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation, which was built in four different versions containing either GFP or mCherry as reporter proteins and a synthetic hygromycin resistance gene as selection marker. The vector was validated in Paracoccidioides lutzii, a dimorphic human opportunist pathogen that is very important for health care but was still lacking efficient genetic tools. The second part consists in the creation of a promoter library for the oleaginous yeast Rhodosporidium toruloides, a promising host for the production of bioproducts from biomass since it can efficiently consume C5 and C6 sugars and lignin-derived aromatics. Twenty-nine promoters were tested with a dual-reporter cassette - comprising both GFP and mRuby fluorescent proteins - using flow cytometer for single-cell analysis. The assortment of promoters presented in this work is the largest set available for R. toruloides until now and was an imperative advancement to overcome the scarcity of tools for this organism. Remarkably, we also presented the first bidirectional promoters described for this yeast and optimized the transformation protocol. Thus, we efficiently applied Synthetic Biology to expand the collection of standard biological parts and to12 optimize vectors for fungal transformation and genetic manipulation. These tools are of immediate value and are applicable for very distinct but equally important challenges: the pursuit of new solutions for human health and for a sustainable biobased economy

Estudos em nosso laboratório caracterizaram camundongos B10.A como susceptíveis e camundongos A/J como resistentes à infecção pulmonar pelo P. brasiliensis. Para investigar o papel das células PMN na paracoccidioidomicose (PCM) pulmonar, camundongos B10.A e A/J foram depletados destas células através da inoculação in vivo por via intraperitoneal (i.p.) do anticorpo monoclonal anti-células PMN e infectados pela via intratraqueal (i.t.) com um milhão de leveduras viáveis. Camundongos-controle receberam doses equivalentes de IgG normal de rato. A depleção de granulócitos diminuiu o tempo de sobrevida dos animais B10.A, mas não dos animais A/J. Quando comparados com os animais não depletados, camundongos resistentes apresentaram aumento da carga fúngica no pulmão somente no dia 7 pós-infecção. Ao contrário, camundongos susceptíveis depletados de PMN apresentaram números mais elevados de células leveduriformes no pulmão, fígado e baço nos dias 7, 15, 30 e 120 pós-infecção, com relação aos seus grupos-controle tratados com IgG. A depleção dos granulócitos, entretanto, não alterou as reações de hipersensibilidade do tipo tardio (HTT) desenvolvidas por ambas as linhagens de animais. Considerando a resposta imune humoral, a depleção de células PMN levou à maior produção de anticorpos específicos em animais B10.A (Ig Total, IgG1, IgA e IgG3) e em animais A/J (Ig Total, IgG2a, IgG2b e IgG3). A depleção também alterou o padrão de citocinas pulmonares. Nos animais B10.A-tratados foram encontradas concentrações mais elevadas de IL-12 aos 15 dias e de IL-4 aos 120 dias pós-infecção, em comparação aos animais controle. Níveis de IL-12 significativamente mais altos foram detectados no grupo de animais A/J-depletados aos 7 e 120 dias e o IFN-&#947; foi detectado em níveis mais elevados em todo o curso da doença. Então, a depleção de PMN induz níveis mais altos de anticorpos e um ambiente mais pró-inflamatório no local da infecção. De acordo com esses dados, pudemos verificar que os neutrófilos são células importantes na defesa do hospedeiro à infecção pelo P.brasiliensis. Entretanto, o efeito protetor desta população celular depende do patrimônio genético do hospedeiro e é mais marcante na linhagem susceptível de camundongos. Neste trabalho também investigamos o efeito da depleção in vivo de leucócitos PMN na imunidade adquirida e protetora desenvolvida pela pré-imunização de animais B10.A. Assim, os camundongos foram previamente imunizados pela via s.c., depletados ou não de células PMN e desafiados i.t. com 1 milhão de células leveduriformes. Não foram detectadas diferenças significativas na contagem de fungos viáveis do pulmão, fígado e baço, entre os grupos imunizados tratados ou não com o AcM anti-PMN. A depleção não alterou a produção de anticorpos específicos, porém aumentou significativamente a síntese de IL-3, bem como a reatividade de HTT. Portanto, nossos resultados mostraram que, diferentemente da imunidade natural, os leucócitos PMN não exercem um papel protetor na fase adquirida da resposta imune à infecção com o P.brasiliensis. / Previous studies in our laboratory defined susceptible (B10.A) and resistant (A/J) mice to pulmonary P.brasiliensis infection. To investigate the role of PMN cells in pulmonary PCM, resistant and susceptible mice were depleted in vivo of these cells by intraperitoneal (i.p.) injection of a granulocyte-depleting monoclonal antibody and infected intratracheally (i.t) with one million yeast cells. Control mice received equivalent doses of normal rat IgG. PMN depletion decreased survival times of B10.A, but not of A/J infected mice. When compared with the non-depleted counterparts, resistant mice presented increased fungal loads in the lung only at day 7 after infection. On the contrary, PMN-depleted susceptible mice presented higher number of yeast cells in the lung, liver and spleen at days 7, 15, 30 and 120 after infection than their IgG-treated controls. PMN cells depletion, however, did not alter the DTH reaction developed by both mouse strains. Regarding humoral immune response, PMN cells depletion caused increased production of specific antibodies in B10.A (Total Ig, IgG1, IgA and IgG3) and A/J (Total Ig, IgG2a, IgG2b and IgG3) mice. Levels of pulmonary cytokines were also altered after PMN depletion. B10.A-treated mice presented increased levels of IL-12 and IL-4 at days 15 and 120 post-infection, respective/y. In A/J-depleted mice, augmented levels of IL-12 were detected at days 7 and 120 after infection; IFN-&#947;, however, was produced in higher levels during whole course of infection. Thus, PMN depletion induces higher levels of specific antibodies and enhanced pro-inflammatory milieu at the site of infection. As a whole, our data on PMN depletion at the onset of infection showed that neutrophils are important cells in host defense to P.brasiliensis infection. However, the effect of PMN depletion depends on the genetic background of the host and has a more pronounced effect in the susceptible strain of mice. We have also assessed the effect of in vivo depletion of the leukocytes on the acquired phase of immunity developed by B10.A mice previously immunized by the subcutaneous (s.c.) route were depleted or not of PMN cells and challenged i.t. with one million yeast cells. No differences were detected in the CFU counts in the lung, liver and spleen between untreated and PMN depleted vaccinated mice. PMN depletion also did not alter the production of specific antibodies but enhanced IL-3 synthesis as well as DTH reactivity. In conclusion, our results showed that, differently from natural immunity, PMN cells do not play a protective role in the acquired phase of immune response to P.brasiliensis infection.

A hiporreatividade das células T observada na resposta imune a antígenos de P. brasiliensis de pacientes com paracoccidioidomicose ativa deve contribuir para o não controle da doença, levando à disseminação do fungo. É, na maioria das vezes, reversível com tratamento antifúngico. Os mecanismos que levam a esta hiporreatividade não são bem conhecidos. No entanto, foram demonstrados em resultados prévios em nosso laboratório que células mononucleares de pacientes frente a gp43 apresentam níveis elevados de apoptose. Para tentarmos explicar esse mecanismo, nossa primeira hipótese foi de avaliar se a ativação celular desses pacientes estavam sendo prejudicada por uma ativação inadequada induzida pela expressão alterada de moléculas co-estimulatórias como CD80, CD86, CD28, CD152, ICOS e PD-1. A expressão dessas moléculas foi avaliada em células T e monócitos de pacientes com doença ativa (n = 7...) e controles curados (n = 2...) de um episódio prévio de PCM, mantidas em cultura com antígeno metabólico de Candida albicans (CMA), gp43 ou sem estímulo após 4 dias em cultura. Os resultados obtidos demonstraram que a expressão do CD28 foi comparável entre doentes e controles, e que a expressão de CD152, PD-1 e ICOS, que preferencialmente exercem um papel negativo na sinalização celular, foi maior em células T de pacientes, estimuladas ou não, quando comparadas com células de indivíduos controles. Em paralelo, foram realizados experimentos com a adição dos respectivos anticorpos bloqueadores, que, no entanto, não restabeleceu a proliferação celular dos pacientes. A expressão das moléculas CD80 e CD86 na superfície dos monócitos foi similar em pacientes e controles. Já a expressão dessas moléculas na superfície de linfócitos foi maior nos pacientes tanto em células estimuladas como não estimuladas. O bloqueio com os respectivos anticorpos no dia 0 inibiu a resposta tanto com gp43 como com CMA, porém de forma diferenciada. Nos pacientes e controles a inibição da molécula CD86 diminuiu a resposta tanto para gp43 como para CMA e a inibição da molécula CD80 diminuiu a resposta proliferativa apenas para gp43, e somente no grupo controle, sugerindo que os diferentes antígenos exigem diferentes moléculas durante o processo de apresentação antigênica. A adição desses anticorpos no 4o dia da cultura não modificou a resposta linfoproliferantiva dos pacientes e controles. Nossos dados favorecem a hipótese, derivada de outros modelos de exposição crônica a antígenos exógenos, de que a exposição repetida a antígenos de P. brasiliensis por um longo período in vivo, verificada nos pacientes com paracoccidioidomicose, levam as células T a um estado de tolerância adaptativa, que dificilmente é revertida in vitro. A partir desses resultados analisamos a participação da apoptose de células T nesse provável estado de tolerância nas células dos pacientes. Observamos que a expressão da molécula anti-apoptótica Bcl-2 está diminuída nas células T de pacientes previamente estimuladas comparadas com as células dos controles, e mesmo após o reestímulo in vitro a diminuição da expressão dessa molécula persiste. Desta forma, a diminuição da expressão da molécula Bcl-2 ex vivo nas células T de pacientes sugere fortemente que essas células estão vulneráveis a apoptose. Para corroborar esta hipótese, analisamos a expressão das caspases 8 e 9 na forma ativa. Inicialmente, analisamos a expressão destas moléculas em células mononucleares de pacientes e controles mantidas em cultura por 4 dias com e sem estímulo de CMA e gp43 e observamos que as células dos controles expressam maiores níveis de ambas moléculas em relação as células dos pacientes. Esses resultados foram surpreendentes uma vez que o aumento da expressão de moléculas que estariam direcionando as células para apoptose era esperado em células de pacientes e não de controles. Para explicar este resultado sugerimos a possibilidade (hipótese já apareceu várias vezes) de que as células dos pacientes poderiam estar entrando em apoptose num estágio mais inicial, antes do quarto dia. Por isso realizamos experimentos adicionais em que analisamos a expressão dessas caspases ex vivo. Com essa análise observamos que células TCD3+ de pacientes expressam altos níveis tanto de caspase 8 como caspase 9 comparadas às células de controles. Esses resultados podem ajudar a explicar porque nos ensaios para a análise da resposta proliferativa de pacientes com acréscimo de anticorpos bloqueadores de moléculas coestimulatórias, não houve reconstituição da resposta especifica a gp43: essas células estariam pré-ativadas e pré-programadas para entrarem apoptose, e, portanto, refratárias a tratamentos in vitro, como já descrito em células em estado de tolerância adaptativa. / The T-cell hypoproliferative reactivity observed in the immune response to P. brasiliensis antigens of patients with active paracoccidioidomycosis probably contributes to the failure of the host in controlling the infection, leading to a disseminated disease. It is, however, largely reversible with treatment in most patients. The mechanisms leading to this hyporresponsiveness are not well known. We have previously demonstrated that patients\' mononuclear cells in presence of gp43 exhibit enhanced apoptotic levels. I an attempt to explain such findings, we hypothethized that these cells were inadequately activated due to altered costimulatory molecules expression, such as CD80, CD86, CD28, CD152, ICOS e PD-1. Expression of these molecules were evaluated on T-cells and monocytes of the peripheral blood of patients with active, disseminated PCM (n = 7...), and healthy individuals with a past history of treated and cured PCM (n = 2...). These cells were cultured in presence of a Candida albicans metabolic antigen (CMA), gp43, or kept without exogenous stimuli for 4 days. Our results show tgat the expression of CD28 was comparable between patients an controls\' cells, and that CD152, PD-1 e ICOS, all of which known to deliver negative costimulatory signaling and to arrest cell cycle entry, were overexpressed in patients\' T-cells. In parallel, we performed additional experiments where the respective costimulatory signalings were blocked by addition of blocking antibodies specific to each of these molecules. Whatever the blocking antibody used, there was no reversal of the hypoproliferative state of patients\' T-cells. However, while the expression of the CD80 and CD86 molecules on monocytes was similar between controls and patients, their expression on T-cells was significantly higher in patients. Adding the respective blocking antibodies at day zero of the culture, we could observe that both the gp43 and the CMA responses were inhibited, but differentially according to the antibody employed. In both patients and controls the blocking CD86 signaling decreased the response to gp43 and CMA of patients and controls, while blocking of CD80 signaling decreased only the response to gp43, and only in the control group. These data suggest that different antigens may have different costimulatory requirements for antigen presentation. Addition of the antibodies at the ay 4 of culture did not restore the lymphoproliferative response or modified the response of the controls. Our results suggest that the hypothesis, raised from other models of prolonged foreign antigen exposure, that repetitive and persistent in vivo exposure to fungal antigens, which is described in patients with PCM, lead the T-cells to a adaptive tolerant state, which is hardly reverted in vitro. We then investigated the fate of such putatively tolerized patients\' cells, by analyzing the role that apoptosis may have in this tolerant state. We observed that expression of the antiapoptotic molecule Bcl-2 was lower in patients\' cells, even when the cells were in vitro reestimulated with CMA and gp43, suggesting that the cells are more susceptible to undergo apoptosis. When then analyzed the expression of the active form of the caspase 8 and 9 molecules. We first analyzed their expression on cells kept in cultures for 4 days with or without stimuli. Unexpectedly, we observed that controls\' cells, and not patients\' cells, exhibited higher levels of expression of both molecules. To explore further these data, we tested the hypothesis that the patients\' cells were already undergoing apoptosis at an earlier than 4 days stage. Caspases expression were therefore analyzed ex vivo. In fact, we observed that TCD3+ cells exhibited markedly enhanced caspase 8 and expression as compared to controls\' cells. These findings may help to explain why we failed to redress the proliferative responses to gp43 in the experiments where blocking antibodies were added: these cells would be committed to apoptotic death, thus refractory to in vitro manipulations, as described for adaptively tolerant T-cells.

Estudos em nosso laboratório caracterizaram camundongos B10.A como susceptíveis e camundongos A/J como resistentes à infecção pulmonar pelo P. brasiliensis. Para investigar o papel das células PMN na paracoccidioidomicose (PCM) pulmonar, camundongos B10.A e A/J foram depletados destas células através da inoculação in vivo por via intraperitoneal (i.p.) do anticorpo monoclonal anti-células PMN e infectados pela via intratraqueal (i.t.) com um milhão de leveduras viáveis. Camundongos-controle receberam doses equivalentes de IgG normal de rato. A depleção de granulócitos diminuiu o tempo de sobrevida dos animais B10.A, mas não dos animais A/J. Quando comparados com os animais não depletados, camundongos resistentes apresentaram aumento da carga fúngica no pulmão somente no dia 7 pós-infecção. Ao contrário, camundongos susceptíveis depletados de PMN apresentaram números mais elevados de células leveduriformes no pulmão, fígado e baço nos dias 7, 15, 30 e 120 pós-infecção, com relação aos seus grupos-controle tratados com IgG. A depleção dos granulócitos, entretanto, não alterou as reações de hipersensibilidade do tipo tardio (HTT) desenvolvidas por ambas as linhagens de animais. Considerando a resposta imune humoral, a depleção de células PMN levou à maior produção de anticorpos específicos em animais B10.A (Ig Total, IgG1, IgA e IgG3) e em animais A/J (Ig Total, IgG2a, IgG2b e IgG3). A depleção também alterou o padrão de citocinas pulmonares. Nos animais B10.A-tratados foram encontradas concentrações mais elevadas de IL-12 aos 15 dias e de IL-4 aos 120 dias pós-infecção, em comparação aos animais controle. Níveis de IL-12 significativamente mais altos foram detectados no grupo de animais A/J-depletados aos 7 e 120 dias e o IFN-&#947; foi detectado em níveis mais elevados em todo o curso da doença. Então, a depleção de PMN induz níveis mais altos de anticorpos e um ambiente mais pró-inflamatório no local da infecção. De acordo com esses dados, pudemos verificar que os neutrófilos são células importantes na defesa do hospedeiro à infecção pelo P.brasiliensis. Entretanto, o efeito protetor desta população celular depende do patrimônio genético do hospedeiro e é mais marcante na linhagem susceptível de camundongos. Neste trabalho também investigamos o efeito da depleção in vivo de leucócitos PMN na imunidade adquirida e protetora desenvolvida pela pré-imunização de animais B10.A. Assim, os camundongos foram previamente imunizados pela via s.c., depletados ou não de células PMN e desafiados i.t. com 1 milhão de células leveduriformes. Não foram detectadas diferenças significativas na contagem de fungos viáveis do pulmão, fígado e baço, entre os grupos imunizados tratados ou não com o AcM anti-PMN. A depleção não alterou a produção de anticorpos específicos, porém aumentou significativamente a síntese de IL-3, bem como a reatividade de HTT. Portanto, nossos resultados mostraram que, diferentemente da imunidade natural, os leucócitos PMN não exercem um papel protetor na fase adquirida da resposta imune à infecção com o P.brasiliensis. / Previous studies in our laboratory defined susceptible (B10.A) and resistant (A/J) mice to pulmonary P.brasiliensis infection. To investigate the role of PMN cells in pulmonary PCM, resistant and susceptible mice were depleted in vivo of these cells by intraperitoneal (i.p.) injection of a granulocyte-depleting monoclonal antibody and infected intratracheally (i.t) with one million yeast cells. Control mice received equivalent doses of normal rat IgG. PMN depletion decreased survival times of B10.A, but not of A/J infected mice. When compared with the non-depleted counterparts, resistant mice presented increased fungal loads in the lung only at day 7 after infection. On the contrary, PMN-depleted susceptible mice presented higher number of yeast cells in the lung, liver and spleen at days 7, 15, 30 and 120 after infection than their IgG-treated controls. PMN cells depletion, however, did not alter the DTH reaction developed by both mouse strains. Regarding humoral immune response, PMN cells depletion caused increased production of specific antibodies in B10.A (Total Ig, IgG1, IgA and IgG3) and A/J (Total Ig, IgG2a, IgG2b and IgG3) mice. Levels of pulmonary cytokines were also altered after PMN depletion. B10.A-treated mice presented increased levels of IL-12 and IL-4 at days 15 and 120 post-infection, respective/y. In A/J-depleted mice, augmented levels of IL-12 were detected at days 7 and 120 after infection; IFN-&#947;, however, was produced in higher levels during whole course of infection. Thus, PMN depletion induces higher levels of specific antibodies and enhanced pro-inflammatory milieu at the site of infection. As a whole, our data on PMN depletion at the onset of infection showed that neutrophils are important cells in host defense to P.brasiliensis infection. However, the effect of PMN depletion depends on the genetic background of the host and has a more pronounced effect in the susceptible strain of mice. We have also assessed the effect of in vivo depletion of the leukocytes on the acquired phase of immunity developed by B10.A mice previously immunized by the subcutaneous (s.c.) route were depleted or not of PMN cells and challenged i.t. with one million yeast cells. No differences were detected in the CFU counts in the lung, liver and spleen between untreated and PMN depleted vaccinated mice. PMN depletion also did not alter the production of specific antibodies but enhanced IL-3 synthesis as well as DTH reactivity. In conclusion, our results showed that, differently from natural immunity, PMN cells do not play a protective role in the acquired phase of immune response to P.brasiliensis infection.