Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:11Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-01-30. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:26:36Z : No. of bitstreams: 1 Publico-Tese%20Paloma%20Korehiza%20Maza%20versao%20final.pdf: 1568579 bytes, checksum: 8a94eab5c79046acd8162d9a949d2c36 (MD5) / Muitos patógenos são capazes de manipular a sinalização de células do hospedeiro para facilitar sua infecção. Nesta tese, demonstramos que o fungo Paracoccidioides brasiliensis promove um aumento na ativação de ERK1/2 e SFKs em células epiteliais A549 (de pulmão humano), de aproximadamente 6 e 7 vezes, respectivamente, em relação aos níveis basais. Utilizando PP2, inibidor da atividade de SFKs, e PD98059, inibidor da ativação da via ERK1/2, verificamos que a ativação de ERK1/2 é parcialmente dependente de SFKs ativadas e que provavelmente outras quinases também estão envolvidas neste evento. Além da modulação da sinalização de células do hospedeiro, diversos estudos têm demonstrado que patógenos seqüestram domínios presentes nas membranas da célula hospedeira denominados “membrane rafts”, os quais são enriquecidos em esfingolipídeos e colesterol e estão envolvidos em diversos eventos celulares, incluindo a sinalização celular. Por diferentes metodologias, como a desorganização de “membrane rafts” por drogas que extraem (metil-β- ciclodextrina, MβCD) ou que se ligam (nistatina) ao colesterol, e a localização do gangliosídeo GM1, um marcador de “membrane rafts”, utilizando a subunidade B da toxina da cólera (CTB), mostramos o envolvimento destes domínios de membranas de células epiteliais na adesão de P. brasiliensis. A partir do isolamento de membranas resistentes a detergente (DRMs) de células epiteliais após incubação com o fungo, mostramos a ativação e o deslocamento de SFKs para as frações que contêm os “membrane rafts”. Além disso, verificamos que a depleção do colesterol com MβCD inibe completamente a ativação de SFKs, corroborando a importância dos domínios de membranas para a ativação destas quinases. Os resultados apresentados nesta tese demonstram, pela primeira vez, que fungos patogênicos modulam a organização e a atividade de “membrane rafts” de células hospedeiras para o estabelecimento da infecção. / Many pathogens are able to manipulate host cell signaling in order to facilitate infection. In this thesis, we demonstrated that the fungus Paracoccidioides brasiliensis promotes an increase of ERK12 and SFK activation in A549 epithelial cells (human lung cells), by approximately 6- and 7-fold over basal levels, respectively. By using PP2, inhibitor for SFK activity, and PD98059, inhibitor for ERK1/2 activation, we verified that ERK1/2 activation is partially dependent of activated SFKs and probably other kinases are involved in this event. Besides modulation of host cell signaling, several studies have been demonstrated that pathogens hijack domains that are present in host cell membranes called membrane rafts, which are cholesterol- and sphingolipidenriched domains, that are involved in several cell events, including cell signaling. By using several approaches, such as membrane rafts disruption with cholesterolextractor (methyl-β-cyclodextrin, MβCD) or –binding (nystatin) drugs, and the localization of ganglioside GM1, a membrane raft marker, by using cholera toxin subunit B (CTB), we showed the involvement of these epithelial cell membrane domains in P. brasiliensis adhesion. By isolating detergent-resistant membrane (DRM) from epithelial cells after incubation with this fungus, we showed the activation and the dislodgment of SFKs to fractions which contain membrane rafts. Moreover, we verified that cholesteroldepletion with MβCD completely inhibits SFK activation, corroborating the importance of membrane domains in activation of these kinases.The results presented in this thesis demonstrate for the first time that pathogenic fungi may modulate the organization and activity of host cell membrane rafts for infection establishment. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

A hiporreatividade das células T observada na resposta imune a antígenos de P. brasiliensis de pacientes com paracoccidioidomicose ativa deve contribuir para o não controle da doença, levando à disseminação do fungo. É, na maioria das vezes, reversível com tratamento antifúngico. Os mecanismos que levam a esta hiporreatividade não são bem conhecidos. No entanto, foram demonstrados em resultados prévios em nosso laboratório que células mononucleares de pacientes frente a gp43 apresentam níveis elevados de apoptose. Para tentarmos explicar esse mecanismo, nossa primeira hipótese foi de avaliar se a ativação celular desses pacientes estavam sendo prejudicada por uma ativação inadequada induzida pela expressão alterada de moléculas co-estimulatórias como CD80, CD86, CD28, CD152, ICOS e PD-1. A expressão dessas moléculas foi avaliada em células T e monócitos de pacientes com doença ativa (n = 7...) e controles curados (n = 2...) de um episódio prévio de PCM, mantidas em cultura com antígeno metabólico de Candida albicans (CMA), gp43 ou sem estímulo após 4 dias em cultura. Os resultados obtidos demonstraram que a expressão do CD28 foi comparável entre doentes e controles, e que a expressão de CD152, PD-1 e ICOS, que preferencialmente exercem um papel negativo na sinalização celular, foi maior em células T de pacientes, estimuladas ou não, quando comparadas com células de indivíduos controles. Em paralelo, foram realizados experimentos com a adição dos respectivos anticorpos bloqueadores, que, no entanto, não restabeleceu a proliferação celular dos pacientes. A expressão das moléculas CD80 e CD86 na superfície dos monócitos foi similar em pacientes e controles. Já a expressão dessas moléculas na superfície de linfócitos foi maior nos pacientes tanto em células estimuladas como não estimuladas. O bloqueio com os respectivos anticorpos no dia 0 inibiu a resposta tanto com gp43 como com CMA, porém de forma diferenciada. Nos pacientes e controles a inibição da molécula CD86 diminuiu a resposta tanto para gp43 como para CMA e a inibição da molécula CD80 diminuiu a resposta proliferativa apenas para gp43, e somente no grupo controle, sugerindo que os diferentes antígenos exigem diferentes moléculas durante o processo de apresentação antigênica. A adição desses anticorpos no 4o dia da cultura não modificou a resposta linfoproliferantiva dos pacientes e controles. Nossos dados favorecem a hipótese, derivada de outros modelos de exposição crônica a antígenos exógenos, de que a exposição repetida a antígenos de P. brasiliensis por um longo período in vivo, verificada nos pacientes com paracoccidioidomicose, levam as células T a um estado de tolerância adaptativa, que dificilmente é revertida in vitro. A partir desses resultados analisamos a participação da apoptose de células T nesse provável estado de tolerância nas células dos pacientes. Observamos que a expressão da molécula anti-apoptótica Bcl-2 está diminuída nas células T de pacientes previamente estimuladas comparadas com as células dos controles, e mesmo após o reestímulo in vitro a diminuição da expressão dessa molécula persiste. Desta forma, a diminuição da expressão da molécula Bcl-2 ex vivo nas células T de pacientes sugere fortemente que essas células estão vulneráveis a apoptose. Para corroborar esta hipótese, analisamos a expressão das caspases 8 e 9 na forma ativa. Inicialmente, analisamos a expressão destas moléculas em células mononucleares de pacientes e controles mantidas em cultura por 4 dias com e sem estímulo de CMA e gp43 e observamos que as células dos controles expressam maiores níveis de ambas moléculas em relação as células dos pacientes. Esses resultados foram surpreendentes uma vez que o aumento da expressão de moléculas que estariam direcionando as células para apoptose era esperado em células de pacientes e não de controles. Para explicar este resultado sugerimos a possibilidade (hipótese já apareceu várias vezes) de que as células dos pacientes poderiam estar entrando em apoptose num estágio mais inicial, antes do quarto dia. Por isso realizamos experimentos adicionais em que analisamos a expressão dessas caspases ex vivo. Com essa análise observamos que células TCD3+ de pacientes expressam altos níveis tanto de caspase 8 como caspase 9 comparadas às células de controles. Esses resultados podem ajudar a explicar porque nos ensaios para a análise da resposta proliferativa de pacientes com acréscimo de anticorpos bloqueadores de moléculas coestimulatórias, não houve reconstituição da resposta especifica a gp43: essas células estariam pré-ativadas e pré-programadas para entrarem apoptose, e, portanto, refratárias a tratamentos in vitro, como já descrito em células em estado de tolerância adaptativa. / The T-cell hypoproliferative reactivity observed in the immune response to P. brasiliensis antigens of patients with active paracoccidioidomycosis probably contributes to the failure of the host in controlling the infection, leading to a disseminated disease. It is, however, largely reversible with treatment in most patients. The mechanisms leading to this hyporresponsiveness are not well known. We have previously demonstrated that patients\' mononuclear cells in presence of gp43 exhibit enhanced apoptotic levels. I an attempt to explain such findings, we hypothethized that these cells were inadequately activated due to altered costimulatory molecules expression, such as CD80, CD86, CD28, CD152, ICOS e PD-1. Expression of these molecules were evaluated on T-cells and monocytes of the peripheral blood of patients with active, disseminated PCM (n = 7...), and healthy individuals with a past history of treated and cured PCM (n = 2...). These cells were cultured in presence of a Candida albicans metabolic antigen (CMA), gp43, or kept without exogenous stimuli for 4 days. Our results show tgat the expression of CD28 was comparable between patients an controls\' cells, and that CD152, PD-1 e ICOS, all of which known to deliver negative costimulatory signaling and to arrest cell cycle entry, were overexpressed in patients\' T-cells. In parallel, we performed additional experiments where the respective costimulatory signalings were blocked by addition of blocking antibodies specific to each of these molecules. Whatever the blocking antibody used, there was no reversal of the hypoproliferative state of patients\' T-cells. However, while the expression of the CD80 and CD86 molecules on monocytes was similar between controls and patients, their expression on T-cells was significantly higher in patients. Adding the respective blocking antibodies at day zero of the culture, we could observe that both the gp43 and the CMA responses were inhibited, but differentially according to the antibody employed. In both patients and controls the blocking CD86 signaling decreased the response to gp43 and CMA of patients and controls, while blocking of CD80 signaling decreased only the response to gp43, and only in the control group. These data suggest that different antigens may have different costimulatory requirements for antigen presentation. Addition of the antibodies at the ay 4 of culture did not restore the lymphoproliferative response or modified the response of the controls. Our results suggest that the hypothesis, raised from other models of prolonged foreign antigen exposure, that repetitive and persistent in vivo exposure to fungal antigens, which is described in patients with PCM, lead the T-cells to a adaptive tolerant state, which is hardly reverted in vitro. We then investigated the fate of such putatively tolerized patients\' cells, by analyzing the role that apoptosis may have in this tolerant state. We observed that expression of the antiapoptotic molecule Bcl-2 was lower in patients\' cells, even when the cells were in vitro reestimulated with CMA and gp43, suggesting that the cells are more susceptible to undergo apoptosis. When then analyzed the expression of the active form of the caspase 8 and 9 molecules. We first analyzed their expression on cells kept in cultures for 4 days with or without stimuli. Unexpectedly, we observed that controls\' cells, and not patients\' cells, exhibited higher levels of expression of both molecules. To explore further these data, we tested the hypothesis that the patients\' cells were already undergoing apoptosis at an earlier than 4 days stage. Caspases expression were therefore analyzed ex vivo. In fact, we observed that TCD3+ cells exhibited markedly enhanced caspase 8 and expression as compared to controls\' cells. These findings may help to explain why we failed to redress the proliferative responses to gp43 in the experiments where blocking antibodies were added: these cells would be committed to apoptotic death, thus refractory to in vitro manipulations, as described for adaptively tolerant T-cells.

Orientador: Ana Marisa Fusco Almeida / Coorientador: Fernando Rogério Pavan / Banca: Katiany Rizzieri Caleffi Ferracioli / Banca: Luís Otávio Regasini / Banca: Maria José Soares Mendes Giannini / Banca: Marlus Chorilli / Resumo: As infecções pulmonares são um problema global e estão classificadas em terceiro lugar entre as principais causas de morte. Entre as infecções pulmonares crônicas estão a tuberculose (TB) e a paracoccidioidomicose (PCM). A TB é uma doença cujo principal agente etiológico é o Mycobacterium tuberculosis e a PCM tem como agente etiológico o complexo Paracoccidioides spp. As duas doenças podem ocorrer na forma de coinfecção, com incidência aproximada de 2,8 a 5,5% dos casos nos países da América do Sul e 10% no Brasil. Ambos os microrganismos já foram descritos na forma de biofilme monoespécie e o tratamento de ambas as doenças tem merecido atenção, devido a casos de resistência e as poucas opções terapêuticas. Diante do exposto, este trabalho visa mostrar, pela primeira vez, a capacidade de M. tuberculosis e P. brasiliensis se associarem por meio do crescimento na forma de um biofilme misto in vitro, a fim de elaborar um novo protótipo de 3'chalcona carreada numa nanoemulsão com atividade para as formas planctônica e de biofilme. Para isso, inicialmente foi padronizada e caracterizada a formação dos biofilmes monoespécie da linhagem ATCC M. tuberculosis (H37Rv), da linhagem clínica (Rv40) e da linhagem de P. brasiliensis (Pb18) e dos biofilmes mistos das associações de H37Rv+Pb18 e Rv40+ Pb18 (nesta ordem de crescimento), ambas as associações mostraram um aparente sinergismo entre elas. Na formação do biofilme misto inverso denominado assim pela ordem de associação, onde primeir... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Pulmonary infections are a global problem and rank third among the leading causes of death. Among the chronic lung infections are tuberculosis (TB) and paracoccidioidomycosis (PCM). The TB is a disease whose main etiologic agent is Mycobacterium tuberculosis and PCM has the etiological agent Paracoccidioides spp. The two diseases may occur in the form of coinfection, with an approximate incidence of 2.8 to 5.5% of the cases in the countries of South America and 10% in Brazil. Both microorganisms have already been described in the form of monospecies biofilm and the treatment of both diseases has deserved attention, due to cases of resistance and the few therapeutic options. In view of the above, this research aims to show, for the first time, the ability of M. tuberculosis and P. brasiliensis to associate by means of growth in the form of a mixed biofilm in vitro, in order to elaborate a new prototype in a nanoemulsion with activity for planktonic and biofilm forms. For this purpose, it was initially standardized and characterized the formation of monospecies biofilms of the ATCC strain M. tuberculosis (H37Rv), the clinical lineage (Rv40) and the P. brasiliensis (Pb18) lineage and the mixed biofilms of the associations of H37Rv + Pb18 and Rv40 + Pb18 (in this order of growth), both associations showed an apparent synergism between them. In order to establish the mixed biofilm (Pb18 + H37Rv), it was first proposed the association of P. brasiliensis (Pb18), followed by ATCC M. tuberculosis (H37Rv) with order of inverse growth, in this association a apparent competition between the microorganisms was observed. All biofilms, monospecies and mixed, were consolidated from 30 to 45 days... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Paracoccidioides brasiliensis é o agente da paracoccidioidomicose (PCM), uma doença sistêmica crônica prevalente na América Latina. Até o momento, não existe uma vacina eficaz para esta enfermidade. O potencial da radiação gama para a atenuação de patógenos e desenvolvimento de uma vacina foi explorado neste trabalho. Em nosso laboratório desenvolvemos leveduras de P. brasiliensis atenuadas por irradiação gama. Estas perderam a capacidade de reprodução, mas mantiveram a sua morfologia, a síntese e secreção de proteínas, o metabolismo oxidativo e o seu perfil antigênico. O objetivo deste trabalho foi avaliar a capacidade protetora induzida pela imunização com as leveduras radioatenuadas em modelo animal. A atenuação da virulência das leveduras radioatenuadas foi avaliada em camundongos BALB/c e Nude-Nude. O efeito protetor foi avaliado em grupos de camundongos BALB/c submetidos a uma ou duas imunizações. Cada grupo foi dividido em três subgrupos, que foram desafiados 30, 45 e 60 dias após a imunização. Os camundongos foram sacrificados 30 e 90 dias após o desafio. Os órgãos removidos foram usados para recuperação de unidades formadoras de colônias (UFCs), análise histológica e determinação de citocinas. Os soros foram coletados semanalmente para avaliar os títulos de IgG e o padrão de IgG1 e IgG2a produzido no curso da infecção. Para avaliar o tipo de resposta imune desencadeada, as citocinas IFN-g, TNF-a, IL-10 e IL-5 foram determinadas por PCR em tempo real. As leveduras radioatenuadas perderam a sua virulência, pois não foram capazes de provocar infecção em camundongos BALB/c e Nu/Nu. Nenhuma UFC foi recuperada nem foram observadas alterações histopatológicas nos camundongos infectados com o fungo radioatenuado. Os camundongos infectados com P. brasiliensis não irradiado mostraram altos níveis de produção do anticorpo IgG, enquanto a infecção com as leveduras radioatenuadas não estimulou alterações significativas destes níveis. Os camundongos infectados com a levedura radioatenuada apresentaram um aumento na produção de IFN-g e TNF-a, indicando uma estimulação da imunidade celular. O ensaio de proteção realizado com camundongos imunizados uma vez mostrou uma redução significativa na recuperação das UFCs avaliadas 30 dias após o desafio. Entretanto, foi verificado um aumento na recuperação das UFCs dos tecidos 90 dias após o desafio. Apesar de um grau significativo de proteção ter sido alcançado, estes resultados mostram que somente uma imunização não foi suficiente para conferir uma proteção a longo prazo, uma vez que alguns focos do fungo não foram eliminados. Uma proteção eficiente foi desenvolvida no grupo dos camundongos imunizados duas vezes. A imunização foi capaz de reduzir a infecção inicial e desencadear uma proteção a longo prazo. Uma proteção de 99,5% foi obtida nos camundongos analisados 90 dias após desafio. Neste mesmo período os níveis de IFN-g e TNF-a aumentaram significativamente, enquanto os de IL-10 e IL-5 diminuíram. Quando analisados 30 dias após o desafio os camundongos não desenvolveram um padrão totalmente polarizado de resposta Th1/Th2, mas uma tendência para um padrão Th1 foi evidente após 90 dias. Os níveis de IgG aumentaram em ambos os grupos após o desafio. Concluímos que a imunização com as leveduras radioatenuadas foi capaz de desencadear uma resposta imune protetora a longo prazo. Estas células são uma ferramenta valiosa em estudos da imunidade protetora e na pesquisa de vacina para a PCM. / Paracoccidioides brasiliensis is fungus agent of paracoccidioidomycosis (PCM), a chronic systemic disease prevalent in Latin American. To date, there is no effective vaccine. The potential of gamma radiation for pathogens attenuation and vaccine development was explored in this work. In our laboratory were developed yeast cells of P. brasiliensis attenuated by gamma radiation, which lose the reproductive ability, while retaining the morphology, the synthesis and secretion of proteins, the oxidative metabolism and the expression of the antigens present in the native yeast. The aim of the present work was to evaluate the protection elicited by the immunization with this cells in animal model. The virulence attenuated was evaluated in BALB/c and Nude-Nude mice. The protector effect was evaluated in BALB/c mice groups immunized once or twice. Each group was divided in three sub groups that were challenge 30, 45 or 60 days after the immunization. The mice were sacrificed 30 and 90 days after challenge. The removed organs were used for colonyforming units (CFUs) recover, histopathological analysis and cytokine determination. The sera were collected weekly to evaluate the IgG antibody titers and the IgG1 and IgG2a pattern in the course of infection. To evaluate the type of elicited immune response the cytokines IFN-g, TNF-a, IL-10 and IL-5 were determined by real time PCR. The radioattenuated yeast loses its virulence since fails in producing infection in BALB/c and Nude-Nude mice. No CFUs were recovered neither histological changes observed in the mice infected with the radioattenuated cells. The mice infected with the not irradiated P. brasiliensis showed a high level of antibody production while the infection with the radioattenuated yeast did not significantly change the antibody level. The mice infected with the radioattenuated yeast presented an increase in the IFN-g and TNF-a production and an inhibition of the IL-10 synthesis, indicating a stimulation of the cellular response. The protection assay performed with mice immunized once showed a significant reduction in the CFUs recovery evaluated 30 days after the challenge. However, when examined 90 days after the challenge the CFUs recovered from organs increased. Even so a significant degree of protection has been reached these results point that only one immunization was not enough to confer a long lasting protection, since some focus of the fungi were not eliminated. An efficient protection against highly infective forms of P. brasiliensis was developed in the mice group immunized twice. The immunization was able to reduce the initial infection and elicited a long lasting protection. A 99,5 % protection was obtained in the mice analyzed 90 days post challenge. At the same time the levels of IFN-gDQG71). increased significantly while the IL-10 and IL-5 decreased. When analyzed after 30 days, the mice had not developed a totally polarized pattern of Th1/Th2 response but, a trend to a Th1 response was evident after 90 days. The level of IgG increased in both immunized groups after the challenge. We concluded that the immunization with the radioattenuated yeast cells was able to elicit a long lasting protective immune response and these cells are valuable tool for protective immunity studies and vaccine research for PCM.

Fungos do complexo de espécies do gênero Paracoccidioides são agentes causadores da Paracoccidioidomicose (PCM), uma micose sistêmica e endêmica na América Latina. Lesões orais ocorrem em aproximadamente 80% dos pacientes com a forma crônica e são caracterizadas pela presença de granulomas que podem indicar a extensão da doença, de acordo com sua organização. A evolução da doença depende não somente da virulênica do fungo, mas também da integridade da resposta imune e de fatores genéticos do hospedeiro. Dentre este último, destacam-se os polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) em vários componentes da resposta imunológica. Dentre os SNPs, cujas associações já foram descritas para diversas doenças infecciosas, destacam-se os presentes em genes como TNF-α, JAK1, VDR, DC-SIGN e FcγRIIa. Dessa forma, este trabalho teve como objetivo avaliar a frequência dos SNPs DC-SIGN (rs4804803), FcγRIIa (rs1801274), JAK1 (rs11208534), TNF-α (rs1800629) e VDR (rs7975232) em amostras de DNA de pacientes com PCM oral e verificar se há associações com o padrão de organização dos granulomas nas lesões. Para isso, foram utilizadas 66 amostras de DNA obtidas a partir de biópsias de lesões orais e suas respectivas lâminas para a classificação do granuloma e 106 amostras de DNA de indivíduos saudáveis. A genotipagem foi realizada pelo método de discriminação alélica por PCR em tempo real e os resultados demonstraram que no SNP VDR (rs7975232), o genótipo CC (p-valor<0,001, OR = 5,94, IC 95% 2,07 – 17,05) ou indivíduos que carregam o alelo C (p-valor = 0,027, OR = 2,71 IC 95% 1,07 – 6,86 para CC+AC) e o genótipo GG no DC-SIGN (rs4804803) (p-valor = 0,032, OR = 3,76, IC 95% 1,06 – 13,38) estão associados ao aumento do risco de desenvolvimento da PCM oral. Porém, não foram observadas correlações com o tipo de granuloma. Esses dados indicam que as variações derivadas dos SNPs VDR (rs7975232) e DC-SIGN (rs4804803) estão relacionadas à susceptibilidade da PCM oral nas amostras analisadas. / Fungi of the complex of species of the genus Paracoccidioides are agents that cause Paracoccidioidomycosis (PCM), a systemic mycosis and endemic in Latin America. Oral lesions occur in approximately 80% of patients with the chronic form and are characterized by the presence of granulomas that can indicate the level of the inflammatory reaction and the extension of the PCM. The disease evolution depend not only of the fungi strain, but also on the integrity and type of the immune response and on host genetic factors. Among the latter, single nucleotide polymorphisms (SNPs) are highlighted in several components of the immune response. Among the SNPs whose associations have already been described for various infectious diseases, those present in genes such as TNF-α, JAK1, VDR, DC-SIGN and FcγRIIa are highlighted. In this context, this work aimed to evaluate the presence of the SNPs CD209 (rs4804803), FcγRIIa (rs1801274), JAK1 (rs11208534), TNF-α (rs1800629) and VDR (rs7975232) in the DNA samples from patients with oral PCM and its associations with the organization patterns of the granulomas in the lesions. For this, 66 samples of DNA obtained from oral lesions biopsies and respective slides of the biopsies for granuloma type classification and a control group of 106 DNA samples of healthy individuals were used. Genotyping was performed by real-time PCR and allele discrimination method. The results demonstrate that in the VDR (rs7975232) SNP, CC genotype(p-value <0.001, OR = 5.94, 95% CI 2.07 - 17.05), or individuals carrying the C allele (p-value = 0.027, OR = 2.71 CI 95% 1.07 - 6.86) and the GG genotype on DC-SIGN (rs4804803) (p-value = 0.032, OR = 3.76, 95% CI, 1,06 - 13,38) are associated with an increased risk of developing oral PCM, but not to the type of granuloma. Thus, the data presented in this work indicate that the variations derived from VDR (rs7975232) and DC-SIGN (rs4804803) SNPs are related to oral PCM susceptibility in the south/southwest of the state of Minas Gerais.

Paracoccidioidomicose é adquirida pela via respiratória e a enzima indolamina-2,3-dioxigenase (IDO) e o catabolismo do triptofano estão envolvidos no controle da imunidade inata e adaptativa contra patógenos. Investigamos o papel da IDO na doença em animais suscetíveis (B10.A) e resistentes (A/J). Caracterizamos o efeito do tratamento com 1-Metil-DL-Triptofano (1MT) no fenótipo e comportamento de células dendríticas (DCs) e T reguladoras (Tregs) de A/J e B10.A quanto à expressão de IDO. IDO controla a carga fúngica de A/J e B10.A, reduzindo a imunidade de TCD4 e TCD8 e aumentando Tregs. Constatamos que IDO diminuiu a migração de DCs para o pulmão de A/J e B10.A e a inibição da atividade anti-inflamatória de IDO por 1MT tem um efeito deletério somente em B10.A cuja suscetibilidade é ligada à excessiva atividade pró-inflamatória. A infecção de A/J e B10.A parece induzir as funções catalítica e sinalizadora de IDO.Grande parte da função de IDO nos mecanismos imunorreguladores na paracoccidioidomicose se faz através da modulação da função de DCs em A/J e B10.A. / Paracoccidioidomycosis is acquired by the respiratory route and the enzyme indoleamine-2,3-dioxygenase (IDO) and tryptophan catabolism are involved in the control of innate and adaptive immunity against pathogens. We investigated the role of IDO in the infection in susceptible (B10.A) and resistant (A/J) mice. We characterized the effect of treatment with 1-Methyl-DL-Tryptophan (1MT) in the behavior and phenotype of dendritic cells (DCs) and regulatory T cells (Tregs) from A/J and B10.A for expression of IDO. IDO controls the fungal load in A/J and B10.A, reducing the immunity of CD4 and CD8 T cells and Tregs increased. IDO decreased the migration of DCs to the lung of A/J and B10.A and inhibition of anti-inflammatory activity of IDO by 1MT has a deleterious effect only in B10.A whose susceptibility is linked to excessive proinflammatory activity. Infection of A/J and B10.A appears to induce catalytic functions of IDO. Much of the function IDO immunoregulatory mechanisms paracoccidioidomycosis is done by modulating the function of DCs in A/J and B10.A.

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In Brazil, the highest mortality rate among the systemic mycoses is caused by an endemic disease named paracoccidioimycosis, which the etiologic agent is the dimorphic fungus Paracoccidioides spp. The worldwide increased resistance to the commercially available antifungal agents, their limited spectrum of activity against some fungal pathogens and concerns with their toxic side effects are reasonable evidence of the necessity of novel therapeutic strategies, especially the development of new antifungal agents. Thus, the essential gene rim8 was identified by comparative genomics as an orthologous sequence in the genome of human pathogenic fungi absent in the human genome. In filamentous fungi and yeasts, gene expression regulation by the ambient pH involves components of a signaling pathway that mediate proteolytic activation of the transcription factor PacC/Rim101 in response to alkaline environmental pH. The rim8 gene in yeasts, also called palF in filamentous fungi, performs an essential step in this signaling pathway. It is important for host-pathogen interaction, leading to increased virulence and pathogen survival. Thus, Rim8 is a very interesting and promising drug target. The aim of this work is to optimize heterologous expression and purification of Rim8 protein from P. luzii to further perform its structural and functional characterization and also, to use it as a molecular target for drugs development. The rim8 gene was chemically synthesized with a histidine tag and cloned into a pET-21a vector. Heterologous expression of the gene was made using two strains of E. coli, obtaining the best conditions using LB medium with 0.5% glucose at 30 ??C for 2 hours and 0.25 mM IPTG and adding protease inhibitor cocktail. The Rim8 heterologous protein was purified using a nickel affinity chromatography column. Expression and purification results were analyzed by SDS-PAGE and in some cases, confirmed by western blot. Immunization of BALB/c mice was performed with the purified protein to obtain anti- Rim8 antibodies. The antibody production was confirmed by ELISA test. The protein immunocitolocalization in P. lutzii cells showed a difuse protein-plasma membrane association at acidic pH. At neutral pH the fluorescence pattern is showed as localized foci in plasma membrane and later, with extracellular alcalinization, it migrates into the cytosol. Thus, it can be inferred that this work gives some contribution to the development of new antifungal drugs, but still must undergo further production steps, proteolysis reduction and protein purification to allow structural and functional characterization of Rim8. / Infec????es f??ngicas invasivas s??o um problema de sa??de p??blica no mundo, j?? que aumentam a morbidade e o tempo de interna????o de pacientes. A micose sist??mica com o maior ??ndice de mortalidade no Brasil, onde ?? considerada end??mica, ?? a paracoccidioidomicose, causada pelo fungo dim??rfico Paracoccidioides spp. A tend??ncia global de aumento da resist??ncia aos agentes antif??ngicos dispon??veis comercialmente, o espectro limitado de atividade contra alguns fungos patog??nicos e a preocupa????o com a toxicidade s??o evid??ncias da necessidade de novas estrat??gias terap??uticas, sobretudo do desenvolvimento de novas drogas antif??ngicas. Nesse sentido, o gene essencial rim8 foi identificado por gen??mica comparativa como uma sequ??ncia ort??loga no genoma de fungos patog??nicos humanos e ausente em humanos. Em fungos filamentosos e leveduras, a regula????o da express??o g??nica pelo pH envolve componentes de uma via de sinaliza????o que levam ?? ativa????o proteol??tica do fator de transcri????o PacC/Rim101 em resposta ?? alcaliniza????o do pH externo. O gene rim8 em leveduras ou palF em fungos filamentosos possui um papel essencial nessa cascata de sinaliza????o, sendo importante para a intera????o pat??geno-hospedeiro, aumento de virul??ncia e sobreviv??ncia do pat??geno. Por isso, Rim8 ?? um alvo molecular promissor e bastante interessante para o desenvolvimento de drogas. O objetivo deste trabalho ?? otimizar a express??o heter??loga e purifica????o da prote??na Rim8 de P. lutzii, visando realizar a caracteriza????o estrutural e funcional da prote??na para futuramente utiliz??-la como alvo molecular para o desenvolvimento de drogas. O gene rim8 foi sintetizado quimicamente com cauda de histidinas e foi clonado em vetor pET-21a. A express??o heter??loga do gene foi padronizada usando duas estirpes de E. coli, obtendo as melhores condi????es para purifica????o com o uso de meio LB contendo 0,5% de glicose a 30??C por 2 h e 0,25 mM de IPTG e coquetel de inibidores de proteases. Os resultados da express??o e purifica????o foram analisados por SDS-PAGE e/ou confirmados por western blot. Realizou-se a imuniza????o de camundongos BALB/c com a prote??na purificada para obten????o de anticorpos anti-Rim8. A produ????o dos anticorpos foi confirmada por ELISA. A imunocitolocaliza????o em c??lulas de P. lutzii mostrou que a prote??na se encontra associada ?? membrana plasm??tica de forma difusa em pH ??cido, em seguida apresenta focos localizados em resposta a um pH pr??ximo da neutralidade e, por fim, migra para o interior da c??lula em pH alcalino. Sendo assim, pode-se inferir que o trabalho apresenta contribui????es para o desenvolvimento de novas drogas antif??ngicas, al??m de auxiliar o entendimento do processo biol??gico no qual a prote??na RIM8 est?? envolvida.

Submitted by Cleide Dantas (cleidedantas@ufpa.br) on 2014-02-07T13:21:34Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) Tese_EstudoParacoccidioidesBrasiliensis.pdf: 3428553 bytes, checksum: 1b04b3595eca1da764d4fab1ea70087e (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Rosa Silva(arosa@ufpa.br) on 2014-02-07T14:55:05Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) Tese_EstudoParacoccidioidesBrasiliensis.pdf: 3428553 bytes, checksum: 1b04b3595eca1da764d4fab1ea70087e (MD5) / Made available in DSpace on 2014-02-07T14:55:05Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) Tese_EstudoParacoccidioidesBrasiliensis.pdf: 3428553 bytes, checksum: 1b04b3595eca1da764d4fab1ea70087e (MD5) Previous issue date: 2010 / O objetivo deste trabalho foi o de verificar a presença do Paracoccidioides brasiliensis no município de Buriticupu, localizado na Amazônia Maranhense. Foram realizados testes intradérmicos com paracoccidioidina em 491 indivíduos, havendo 60 intradermorreações positivas ao antígeno. Observou-se não haver diferença estatística significante na amostra em relação à positividade ao teste e as variáveis sexo, hábitos sócio-culturais e nível de escolaridade, embora, descritivamente, o sexo feminino tenha sido o mais freqüente, totalizando 33 pacientes, e que positivo-reagentes possuíam hábitos que propiciavam o contato com o patógeno e, ainda, constatou-se serem os níveis de escolaridade predominantes o analfabetismo (18 testados) e o 1º grau incompleto (26 testados). Cinqüenta e um pacientes positivos aos testes intradérmicos à paracoccidoidina (85%) eram naturais do Estado do Maranhão. Ao analisarem-se os dados clínicos e laboratoriais gerais nos prontuários dos seis pacientes diagnosticados com a doença paracoccidioidomicose, constatou-se que todos eram lavradores com mais de 10 anos de residência em Buriticupu, possuindo a presença do fungo em raspado de mucosa bucal à coloração do PAS e Gomori-Groccot, com exceção de dois pacientes: um com 36 meses de tratamento e outro com 12 meses de terapêutica, e sem lesão bucal inicial ou posterior, ambos sem relatos de abandono de tratamento. Verificou-se, portanto, que a citologia esfoliativa é um método fácil e de baixo custo no auxílio do controle terapêutico dos pacientes. / The objective of this study was to verify the presence of Paracoccidioides brasiliensis in the municipality of Buriticupu, located in the Amazon Maranhense. Intradermics tests were conducted with paracoccidioidine in 491 individuals, with 60 intradermics positive to the antigen. There was no statistically significant difference in the sample in relation to the positive test and the variables gender, socio culturals habits and level of education, although describe, the female has been the most frequent, totaling 33 patients, and that positive - reagents have habits that provide contact with the pathogen, and it was found to be the prevailing levels of schooling illiteracy (18 tested) and 1 st degree incomplete (26 tested). Fifty-one patients testing positive for intradermics to paracoccidoidine (85%) were the natural state of Maranhão. In reviewing the clinical data and laboratory records in general of the six patients diagnosed with the disease paracoccidioidomycosis, found that all were farmers with more than 10 years of residence in Buriticupu, with the presence of the fungus in the oral mucosa scraped the colouring of PAS and Gomori - Groccot, except for two patients: one with 36 months of treatment and another with 12 months of therapy, and without injury initial oral or later, both without reports of abandonment of treatment. We, therefore, that the exfoliative cytology is an easy way and low cost in aid of therapeutic control of patients.

Submitted by Cleide Dantas (cleidedantas@ufpa.br) on 2014-02-07T14:19:40Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) Tese_InqueritoParacoccidiodinaCinco.pdf: 1133779 bytes, checksum: 9199e67b1a7eb4a05373218168c984ce (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Rosa Silva(arosa@ufpa.br) on 2014-02-11T12:11:18Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) Tese_InqueritoParacoccidiodinaCinco.pdf: 1133779 bytes, checksum: 9199e67b1a7eb4a05373218168c984ce (MD5) / Made available in DSpace on 2014-02-11T12:11:18Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) Tese_InqueritoParacoccidiodinaCinco.pdf: 1133779 bytes, checksum: 9199e67b1a7eb4a05373218168c984ce (MD5) Previous issue date: 2011 / A paracoccidioidomicose constitui um importante problema de saúde pública na América Latina. No Brasil, essa doença é menos freqüente nas regiões Norte e Nordeste, predominando as áreas endêmicas na região Sudeste. Apesar das condições fisiográficas da região Norte favorecerem o desenvolvimento do Paracoccidioides brasiliensis, mesmo assim, os relatos de casos são escassos. Talvez, isto deva-se ao fato da pouca consideração sobre as micoses profundas entre os diagnósticos diferenciais das condições clínicas crônicas, justificadas no fato de que a região não é considerada endêmica. Com o objetivo de descrever a prevalência da paracoccidioidomicose em cinco cidades do Estado do Acre, foi realizado estudo transversal em base populacional, por meio de inquérito com a intradermorreação à paracoccidioidina. A leitura do teste intradérmico foi realizada com 24 e 48 horas, sendo considerados reatores as pessoas com endurações de 5 ou mais milímetros de diâmetro. Foram estudadas 439 pessoas e os índices de paracoccidioidomicose-infecção na leitura de 48 horas foi de 41,2%. Os achados deste estudo indicam que o P. brasiliensis causa infecção em considerável número de pessoas na área estudada e, portanto, futuros estudos clínico-epidemiológicos e micológicos devem melhor esclarecer a história natural da micose nessa região. / Paracoccidioidomycosis constitutes an important public health problem in Latin America. In Brazil, this disease is less frequent in North and Northeast regions, predominating the endemic areas in the Southeast. Despite the physiographic conditions of the North region favoring the development of Paracoccidioides brasiliensis, even so, the case reports are scarce. Perhaps this is due to the little consideration of deep mycoses about the differential diagnosis of chronic medical conditions, justified by the fact that the region is not considered endemic. With the objective of describing the prevalence of paracoccidioidomycosis in five cities of Acre, a cross-sectional population-based study was conducted, through a survey with the paracoccidioidin intradermal. The reading of the intradermal test was performed within 24 and 48 hours, being considered reactors the people with hardened areas of 5mm or more in diameter. Four hundred thirty-nine (439) people were studied and paracoccidiodomycosis-infection in the 48-hour reading was 41.2%. The findings of this study indicate that P. brasiliensis infection causes a considerable number of people in the study area to get infected, and therefore future clinical-epidemiological and mycological studies should better clarify the natural history of mycosis in this region.

Submitted by Cleide Dantas (cleidedantas@ufpa.br) on 2014-02-07T16:20:40Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) Dissertacao_AvaliacaoTesteAglutinacao.pdf: 1885858 bytes, checksum: cb62c37788b948803bf5e0ecbafe06ea (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Rosa Silva (arosa@ufpa.br) on 2014-04-01T16:51:41Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertacao_AvaliacaoTesteAglutinacao.pdf: 1885858 bytes, checksum: cb62c37788b948803bf5e0ecbafe06ea (MD5) license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-04-01T16:51:41Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertacao_AvaliacaoTesteAglutinacao.pdf: 1885858 bytes, checksum: cb62c37788b948803bf5e0ecbafe06ea (MD5) license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) Previous issue date: 2009 / Paracoccidioidomicose (PCM), uma micose sistêmica granulomatosa causada pelo fungo dimórfico Paracoccidioides brasiliensis, é endêmica na América do Sul. Conídios provavelmente agem como propágulos infectantes e são inalados para os pulmões, onde ocorre a transformação à forma leveduriforme patogênica. Duas principais formas clínicas são consideradas: a forma aguda ou subaguda (tipo juvenil) e a forma crônica (tipo adulto). O diagnóstico definitivo da PCM inclui a observação direta da levedura multibrotante característica em fluidos biológicos e secções teciduais ou isolamento do fungo de materiais clínicos. Na PCM, testes sorológicos, além de auxílio diagnóstico, têm a função de acompanhamento durante e pós-tratamento. Portanto, a técnica utilizada precisa aliar sensibilidade e especificidade, para que o valor preditivo seja máximo e reprodutível. O propósito deste estudo foi avaliar um teste de aglutinação com látex (LA) para detectar anticorpos anti-P.brasiliensis contra antígeno bruto do fungo. Cinqüenta e uma (51) amostras de soro de pacientes com PCM foram testadas. Positividade foi observada em 84,31% (43/51), cujos padrões de aglutinação variaram de 1+ a 4+. Reatividade dessas amostras foi verificada em títulos variando entre 1:2 e 1:64. Reatividade cruzada foi observada com outras doenças fúngicas (aspergilose e histoplasmose), e com doenças não fúngicas. Amostras de soro humano normal não foram reativas. A sensibilidade, especificidade e valores preditivos, positivo e negativo, produzidos pelo teste LA foram 84,31%, 81,05%, 70,49% e 90,59%, respectivamente. Em conclusão, estes resultados mostram que o teste LA é instrumento útil no sorodiagnóstico da PCM, além de vantagens como baixo custo e rápida execução, a despeito de outros testes, tais como ID e Western blotting. / Paracoccidioidomycosis (PCM), a granulomatous sistemic mycosis caused by dimorphic fungus Paracoccidioides brasiliensis, is endemic in South America. Conidia probably act as the infectious propagules and are inhaled into the lungs where transformation to the pathogenic yeast form occurs. Two main clinical forms are considered: the acute or subacute form (juvenile type) and the chronic form (adult type). A definitive diagnosis of PCM includes direct observation of the characteristic multiple budding yeast in biological fluids and tissue sections or isolation of the fungus from clinical materials. In PCM, serologic tests beside aiding the diagnosis has a monitoring function during and after treatment. Therefore, the technique used needs to ally sensitivity and specificity, in order that the predictive value is maximized and reproducible. The purpose of this study was the evaluation of a latex agglutination (LA) test for detecting anti-P. brasiliensis antibodies by the using of crude antigen from fungus. Fifty-one (51) samples of serum of patients with PCM were tested. Positivity was observed in 84,31% (43/51), whose standards of agglutination varied from 1+ to 4+. Reactivity of these samples was checked in titles varying between 1:2 and 1:64. Crossed reactivity was observed by other fungal diseases (aspergillosis and histoplasmosis), and by diseases not caused by fungi. Samples of human normal serum were not reactive. Use of the LA test permitted the detection of more than 80% of 51 proven PCM cases. The sensitivity, specificity, and positive and negative predictives values were 84,31%, 81,05%, 70,49% and 90,59%, respectively. In conclusion, this results showed that the LA test is a useful tool in serodiagnosis for PCM, beyond of advantages as lower cost and performance when compared to other tests such as ID and Western blotting.