Submitted by Erika Demachki (erikademachki@gmail.com) on 2015-01-30T18:09:44Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Lucas Nojosa Oliveira - 2014.pdf: 3496210 bytes, checksum: ee39300fc3e6a76f167fcc74a33b646f (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Erika Demachki (erikademachki@gmail.com) on 2015-01-30T18:10:02Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Lucas Nojosa Oliveira - 2014.pdf: 3496210 bytes, checksum: ee39300fc3e6a76f167fcc74a33b646f (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-01-30T18:10:02Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Lucas Nojosa Oliveira - 2014.pdf: 3496210 bytes, checksum: ee39300fc3e6a76f167fcc74a33b646f (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Previous issue date: 2014-08-01 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Paracoccidioidomycosis (PCM) is an endemic disease in Latin America caused by fungi of the genus Paracoccidioides which is composed of two species P. lutzii e P. brasiliensis. The fungus grows as mycelium in saprophytic environment, and as yeast in host. Paracoccidioides spp present multinucleated yeast cells. The characterization of the nuclear proteome an important step to understand the biology of the fungus, and contributes to future studies of possible pharmacological targets. In this study we aimed to characterize the profile of the nuclear proteome of Paracoccidioides species in yeast form. A total of 570 proteins were identified and classified as nuclear, using a combination of method sample enrichment, proteomic of high accuracy technique, NanoUPLC-MS E , and bioinformatic filters. The results revealed important proteins related to DNA maintenance, regulation and gene expression, synthesis and processing of messenger and ribosomal RNA and nuclear-cytoplasmic traffic. Uncharacterized proteins and proteins commonly known as cytoplasmic were identified in fraction enriched nuclear and require further studies to demonstrate its nuclear roles. This is the first descriptive nuclear proteome of Paracoccidioides spp. and opens the way for new researches. / A paracoccidioidomicose (PCM) é uma doença endêmica da América Latina causada pelos fungos do gênero Paracoccidioides contituído de duas espécies P. lutzii e P.brasiliensis. O fungo cresce como micélio no ambiente saprofítico, e como levedura no hospdeiro. As células leveduriformes de Paracoccidioides spp. apresentam-se multinucleadas. Caracterizar o perfil protéico nuclear é um importante passo para compreender a biologia do fungo, e contribui para estudos futuros de possíveis alvos farmacológicos. Neste trabalho objetivamos caracterizar o perfil do proteoma nuclear das espécies de Paracoccidioides nas formas leveduriformes. Um total de 570 proteínas foram identificadas e classificadas como nucleares utilizando a combinação de um método de enriquecimento da amostra, uma técnica proteômica de alta acurácia, NanoUPLC-MS E , e a aplicação de filtros de bioinformática. Os resultados revelaram importantes proteínas relacionadas à manutenção do DNA, regulação e expressão gênica, síntese e processamento de RNA mensageiro e ribossomal e transporte núcleo-citoplasma. Proteínas não caracterizadas e proteínas comumente conhecidas como citoplasmáticas foram identificadas na fração enriquecida nuclear e necessitam de estudos adicionais para elucidar seus papéis nucleares. Esse é o primeiro trabalho proteômico descritivo do núcleo de Paracoccidioides spp., onde demonstra novas moléculas para estudos futuros.

Submitted by Erika Demachki (erikademachki@gmail.com) on 2017-02-16T17:00:17Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Edilânia Gomes Araújo Chaves - 2013.pdf: 3289607 bytes, checksum: 174bfb3cce0a9109022321f4adf3368d (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Erika Demachki (erikademachki@gmail.com) on 2017-02-17T16:53:18Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Edilânia Gomes Araújo Chaves - 2013.pdf: 3289607 bytes, checksum: 174bfb3cce0a9109022321f4adf3368d (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-02-17T16:53:18Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Edilânia Gomes Araújo Chaves - 2013.pdf: 3289607 bytes, checksum: 174bfb3cce0a9109022321f4adf3368d (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2013-03-20 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Paracoccicoidioides is the etiological agent of paracoccidioidomycosis (PCM), a disease considered one of the main causes of mortality among systemic mycoses in Brazil. The success in establishing of the infection is related with the ability of fungus to adhere and degrade components of the extracellular matrix (ECM). Human plasminogen (hPlg) is a protein of blood plasma of the host that presents fibrinolytic activity when activated into plasmin. Many pathogens are able to subvert the plasminogen/plasmin system using linker molecules and promote the degradation of tissue barriers. In this work, we identified through Far Western and proteomic analysis, a total of 15 proteins secreted of Paracoccidioides that are plasminogen binding proteins. Those proteins are probable targets of the interaction of the fungus with the host and could contribute to the invasiveness of the fungus. The fructose 1,6-biphosphate aldolase was described in other organisms such as plasminogen binder and presentes participation in the adherence of Paracoccidioides to host cells. This protein selected for validation tests and their presence was observed on the surface and secretory vesicles of the fungus. FBA confirm the ability to convert plasminogen to plasmin in the presence of tissue plasminogen activator (tPA) and this interaction promoted the degradation of fibrin. In infection assays, the addition of antibodies blocking the FBA binding site reduced the interaction of the fungus with macrophages and the interaction of FBA with Plg increased the rate of cell invasion. These data suggest that the FBA can contribute to adhesion, invasion and spread process of the fungus. / Paracoccicoidioides é o agente etiológico da paracoccidioidomicose (PCM), uma doença considerada como primeira causa de mortalidade entre as micoses sistêmicas no Brasil. O sucesso no estabelecimento da infeção está relacionado com a capacidade do fungo de aderir e degradar componentes da matriz extracelular (MEC). O plasminogênio humano (hPlg) é uma proteína presente no plasma, a qual possui atividade fibrinolítica quando é ativado em plasmina. Muitos micro-organismos patogênicos são capazes de subverter o sistema plasminogênio/plasmina através de moléculas ligantes e promovem a degradação de barreiras teciduais. Neste trabalho foram identificadas, através de Far-Western e análise proteômica, um total de 15 proteínas secretadas por Paracoccidioides com habilidade de ligação ao plasminogênio. Essas proteínas são prováveis alvos da interação do patógeno com o hospedeiro, que contribui para o potencial invasivo do fungo. A frutose 1,6-bifosfato aldolase (FBA) foi descrita em outros organismos como ligante de plasminogênio e possui participação na adesão de Paracoccidioides às células do hospedeiro. Selecionamos esta proteína para ensaios de validação e foi observada sua presença na superfície e em vesículas secretoras do fungo. Confirmamos a capacidade da FBA de converter plasminogênio em plasmina na presença do ativador tecidual de plasminogênio (tPA) e essa interação promoveu a degradação de fibrina. Em ensaios de infecção, a adição de anticorpos que bloqueiam o sítio de ligação da FBA reduziu a interação do fungo com macrófagos e a interação de FBA com Plg aumentou o índice de invasão celular. Esses dados sugerem que a FBA pode contribuir no processo de adesão, invasão e disseminação do fungo.

A paracoccidioidomicose (PCM) é uma micose sistêmica endêmica na América Latina, sendo o Brasil o país com maior número de casos. A enfermidade é adquirida por meio da inalação de propágulos de fungos do gênero Paracoccidioides e afeta principalmente os pulmões. Anteriormente, nosso grupo mostrou que o tratamento de camundongos infectados com P. brasiliensis com uma dose da proteína de estresse térmico de 60kDa recombinante de P. brasiliensis (PbHsp60r) induzia um efeito prejudicial na PCM, aumentando carga fúngica e lesão pulmonar, quando comparado a animais infectados e tratados com o veículo. No presente trabalho, buscou-se determinar se outra forma de apresentação da PbHsp60r poderia gerar um efeito benéfico em camundongos infectados com P. brasiliensis. Optou-se pelo plasmídeo pVAX1 subclonado com o gene da PbHsp60 (pVAX1-PB_HSP60). Após subclonagem do gene, foi mostrado, por Western blot, que anticorpos específicos para PbHsp60 eram produzidos por camundongos imunizados com três doses da construção e que a proteína era sintetizada por células HEK293 transfectadas com pVAX1-PB_HSP60. O tratamento dos animais infectados com três doses de pVAX1-PB_HSP60 ou pVAX1 subclonado com Hsp65 de M. leprae (pVAX1-ML_HSP65), que reconhecidamente melhora a PCM experimental, induziu uma diminuição de carga fúngica e da lesão pulmonar quando comparado com animais infectados e tratados com pVAX1 ou PBS. Uma dose de uma dessas construções não induziu melhora significativa na PCM quando comparado aos controles. Como esperado, os animais infectados e tratados com uma dose da PbHsp60r tiveram uma piora dos parâmetros de infecção, o que curiosamente não foi observado com os animais tratados com três doses dessa proteína recombinante, cuja melhora foi muito similar a dos animais infectados e tratados com três doses das construções plasmidiais. Ao pesquisar porque uma dose induz piora da infecção, observouse que PbHsp60r induz morte de linfócitos esplênicos in vitro, em um mecanismo dependente de TLR4, proteína adaptadora TRIF e receptor 1 de TNF. Esses resultados abrem perspectivas de se avaliar a importância da morte de células da resposta imunológica no curso da infecção por P. brasiliensis. / Paracoccidioidomycosis (PCM) is a systemic mycosis endemic in Latin America and Brazil, which holds most of the PCM cases. PCM is acquired through the inhalation of propagules of fungi from genus Paracoccidioides and mainly affects the lungs. We have previously shown that P. brasiliensis-infected mice treated with single dose of recombinant 60-kDa-heat shock protein from P. brasiliensis (rPbHsp60) had a worsening of infection when compared with animals only infected. In this study, we investigate whether the treatment of infected mice with PbHsp60 gene cloned into a plasmid (pVAX1-PB_HSP60) would render an efficient immune response and improvement of the disease. After cloning of the PbHsp60 gene, we first showed that immunization of mice with three doses of pVAX1-PB_HSP60 induced production of specific anti-PbHsp60 antibody and that pVAX1-PB_HSP60-transfected HEK293 cells synthesized the PbHsp60. Interestingly, mice treated with three doses, but not single dose, of pVAX1-PB_HSP60, and pVAX1 subcloned with Hsp65 from Mycobacterium leprae (pVAX1- ML_HSP65), which induces a beneficial effect in experimental PCM, had an improvement in fungal load and lung injury when compared with infected mice treated with pVAX1 or PBS. Unlike animals infected and treated with single dose of rPbHsp60, which had a worsening of infection parameters, treatment with three doses of rPbHsp60 interestingly induced a beneficial effect in the infected animals, as seen with the plasmid constructs. In investigating the causes of this worsening of PCM triggered by injection of a single dose of protein, we showed that rPbHsp60 induced the death of splenic lymphocytes in vitro in a mechanism dependent on Tolllike receptor 4, TRIF adapter protein and TNF receptor 1. These results open perspectives to evaluate the importance of cell death of the immune response in the course of P. brasiliensis infection.

A paracoccidioidomicose (PCM) é uma micose sistêmica, endêmica na América Latina, causada pelo fungo dimórfico térmico Paracoccidioides brasiliensis (P. brasiliensis), cujo principal componente antigênico é a glicoproteína de 43 kDa (gp43). Diferentes formas clínicas podem ser desenvolvidas e estão diretamente associadas com vários graus de depressão da resposta imune celular. Considerando a importância das células dendríticas na interação dos sistemas imune inato e adaptativo, e na ativação de células T \"naive\", no presente trabalho estudamos se células dendríticas interagem com leveduras de P. brasiliensis, assim como seu principal componente antigênico (gp43). Foi demonstrado pela primeira vez que células dendríticas poderiam ser infectadas por leveduras de P. brasiliensis, e esse fungo permaneceu viável após fagocitose. Analisamos por citometria de fluxo a expressão das moléculas de superfície observando diminuição significativa da expressão das moléculas de MHC-II, CD80 e CD54 em células dendríticas quando estas foram incubadas com leveduras da cepa Pb18 ou com gp43. Esse resultado mostrou que a ação do P. brasiliensis em células dendríticas poderia ser mediada pela gp43. Ao analisarmos a síntese de IL-12, observamos diminuição significativa desta interleucina, quando células dendríticas ativadas com LPS, foram cultivadas na presença de leveduras de P. brasiliensis ou gp43. Esses resultados sugerem que a gp43 pode afetar várias funções das células hospedeiras, indicando que esta inibição pode ser usada pelo P. brasiliensis para reduzir a eficiência da resposta imune, facilitando assim o estabelecimento da infecção primária indivíduos suscetíveis. / Paracoccidioidomycosis, endemic in Latin America, is a progressive systemic mycosis caused by dimorphic fungus Paracoccidioides brasiliensis, where the major antigenic component is a glycoprotein of 43kDa (gp43). The infection can evolve to different clinical forms that are associated to various degrees of suppressed cell-mediated immunity. The role of dendritic cells (DCs) in P.brasiliensis infection has never been investigated. With the recognition that DCs are able to initiate response in naïve T cells and that they also participate in Th cell education the present study was undertaken to understand whether DCs interact with P. brasiliensis or gp43, as well as to elucidate possible mechanisms and consequences of this interaction. In the present report, it was demonstrated for the first time that DCs could be infected by P. brasiliensis and survive. Our results indicate that P. brasiliensis infection and purified gp43 lead to down-regulation of MHC-II and adhesion properties of immature DCs. The down-regulation was also observed in LPS-induced DCs maturation, where the expression of MHC-II, CD80, CD54 and CD40 were significantly inhibited in the presence of P. brasiliensis or gp43. These data show that the actions of P. brasiliensis on DCs could be mediated by gp43. In addition, an inhibition of IL-12 production by gp43 was observed in LPS-induced DC maturation. These results suggest that gp43 affects many functions of the host cells, indicating that this inhibition might be used by P. brasiliensis to reduce the effectiveness of the immune response, thus facilitating the establishment and fate of primary infection in susceptible host.

Nesse trabalho avaliamos a proteção que o anticorpo monoclonal (AcM) contra CMH e contra Hsp60 fornecem aos animais infectados com as leveduras de Paracoccidioides brasiliensis e P. lutzii em modelo profilático. O tratamento com os AcMs de isotipos IgG2a e IgG2b foram protetores, induzindo a secreção das citocinas IL-12p70, IFN-<font face=\"Symbol\">g e TNF-<font face=\"Symbol\">a, padrão de resposta imune Th1. Nós mostramos por imunomarcação que moléculas de CMH e Hsp60 estão acessíveis na célula. E o anticorpo monoespecífico contra CMH e os anticorpos policlonais contra melanina, gerados nesse trabalho foram eficazes nos ensaios in vitro de proteção. Foram gerados anticorpos monoclonais contra glicoproteina extraída de Pb18, o AcM reconheceu, por imunomarcação, estruturas internas e a parede celular da levedura. Avaliamos um novo modelo de hospedeiro, com o uso da larva Galleria mellonella, o que pode servir de triagem e reduzir desta forma o uso excessivo de camundongos, as leveduras P. lutzii e H. capsulatum são letais para as larvas e evocam resposta celular que se organizam semelhante a um granuloma. / In this work we evaluated the protection that the monoclonal antibody (MAb) against Hsp60 and against CMH provides the animals infected with the yeast Paracoccidioides brasiliensis and P. lutzii in prophylactic model. The treatment with the MAbs of IgG2a and IgG2b isotypes were protective, inducing the secretion of IL-12p70, IFN-<font face=\"Symbol\">g and TNF-<font face=\"Symbol\">a, Th1 pattern of immune response. We show by immunogold that Hsp60 and MHC molecules are accessible on the cell. And the monospecific antibody against HCM and polyclonal antibodies against melanin, generated in this study were effective in in vitro assays of protection. Monoclonal antibodies were generated glycoprotein extracted from Pb18, Mab recognized by immunogold, internal structures and cell wall material. Evaluated a new type of host, using the larvae Galleria mellonella, which can serve as a screening and reduce thus the overuse of mice, yeast P. lutzii and H. capsulatum are lethal to larvae and evoke cellular responses that are organized like a granuloma.

Paracoccidioidomicose (PCM), micose sistêmica prevalente na América Latina, é uma doença granulomatosa causada pelo fungo termodimórfico do gênero Paracoccidioides spp. O maior número de casos dessa doença tem sido reportado no Brasil, Colômbia, Venezuela e Argentina. A existência de extensas áreas endêmicas, alto potencial incapacitante devido a fibroses pulmonares, grande quantidade de mortes prematuras, faz com que a PCM seja considerada um grave problema de Saúde Pública. Apesar do tratamento medicamentoso ser relativamente eficiente, o tempo longo de uso das drogas e os efeitos colaterais provocados podem levar a diminuição da adesão ao tratamento diminuindo assim eficácia. O uso de vacinas terapêuticas pode ser uma importante ferramenta no controle da PCM. Uma das modalidades investigadas pelo nosso grupo é a utilização de células dendríticas (DCs) pulsadas com o peptídeo P10 como vacina terapêutica no controle da PCM. Resultados apresentados por nosso grupo, demonstraram que DCs diferenciadas a partir de células de medula óssea de camundongos saudáveis pulsadas com o peptídeo 10 (P10) podem ser utilizadas como adjuvante no tratamento da paracoccidioidomicose experimental em camundongos imunocompetentes e imunossuprimidos. Assim sendo, nossa proposta no presente trabalho foi avaliar se DCs diferenciadas de células de medula óssea (BMDCs) ou de monócitos circulantes (MoDCs) de camundongos (BALB/c) infectados apresentam modulação prévia devido à exposição a antígenos fúngicos, avaliamos in vitro a capacidade das células dendríticas diferenciadas a partir de monócitos circulantes de camundongos infectados com Pb18 estimular proliferação de linfócitos CD8+ e CD4+, analisamos a capacidade de células dendríticas derivadas de monócitos circulantes de camundongos infectados com Pb18 pulsadas com P10 em induzir uma resposta protetora. Nossos resultados obtidos são promissores e reforçam dados já publicados pelo grupo os quais demonstraram a eficiência do peptídeo P10 no tratamento da paracoccidioidomicose experimental; apontam que o P10 é capaz de modular ativamente células dendríticas diferenciadas de monócitos circulantes e diferenciadas de células de medula óssea; demonstram que BMDCs e MoDCs pulsadas ou não com P10 tem a capacidade de estimular proliferação de linfócitos T CD4+ e CD8+; confirmaram que BMDC e MoDCs pulsadas ou não com P10 diminuem a carga fúngica no tecido pulmonar, estimulando um padrão de citocinas misto, porém com predominância de citocinas pró-inflamatórias que incitam resposta imune celular do tipo Th1, que é protetora na PCM. Estes dados foram respaldados com a análise dos cortes histológicos onde os pulmões dos camundongos tratados com BMDCs ou MoDCs pulsadas com P10 apresentaram parênquima pulmonar mais conservado em comparação com os pulmões dos grupos que não receberam tratamento com BMDCs ou MoDCs, com diminuição significativa de células fúngicas viáveis / Paracoccidioidomycosis (PCM), a systemic mycosis prevalent in Latin America, is a granulomatous disease caused by the thermodymorphic fungus of the genus Paracoccidioides spp. The highest number of cases of this disease has been reported in Brazil, Colombia, Venezuela and Argentina. The existence of extensive endemic areas, a high incapacitating potential due to pulmonary fibroses, and a large number of premature deaths, makes the PCM considered a serious public health problem. Although the drug treatment is relatively efficient, the long time of use of the drugs and the side effects provoked can lead to the decrease of the adherence to the treatment thus diminishing their effectiveness. The use of therapeutic vaccines can be an important tool in the control of PCM. One of the modalities investigated by our group is the use of dendritic cells (DCs) pulsed with the peptide P10 as therapeutic vaccine in the control of PCM. Results presented by our group demonstrated that DCs differentiated from bone marrow cells of healthy mice pulsed with peptide 10 (P10) can be used as an adjuvant in the treatment of experimental paracoccidioidomycosis in immunocompetent and immunosuppressed mice. Thus, our proposal in the present study evaluated the capacity of differentiated DCs of bone marrow cells (BMDCs) or circulating monocytes (MoDCs) of infected mice (BALB/c) exhibited previous modulation due to exposure to fungal antigens, we evaluated in vitro the ability of differentiated dendritic cells from circulating monocytes from Pb18 infected mice to stimulate proliferation of CD8+ and CD4+ lymphocytes, we analyzed the ability of dendritic cells derived from circulating monocytes from mice infected with P. brasiliensis pulsed with P10 to induce a protective response. Our results are promising and reinforce data already published by the group which demonstrated the efficiency of the peptide P10 in the treatment of experimental paracoccidioidomycosis; suggest that P10 is capable of actively modulating differentiated dendritic cells from circulating and differentiated monocytes from bone marrow cells; demonstrate that BMDCs and MoDCs pulsed or not with P10 have the ability to stimulate proliferation of CD4+ and CD8+ T lymphocytes; confirmed that BMDC and MoDCs pulsed or not with P10 decrease the fungal load in lung tissue, stimulating a pattern of mixed cytokines but with a predominance of pro-inflammatory cytokines that stimulate Th1-type cellular immune response that is protective in PCM, these data were supported with analysis of the histological sections where the lungs of the mice treated with BMDCs or MoDCs pulsed or not with P10 showed more conserved pulmonary parenchyma compared to the lungs of the groups that did not receive treatment with BMDCs or MoDCs, with significant decrease of viable fungal cells

Diversos dados na literatura têm demonstrado a participação de linfócitos B-1 em diferentes fenômenos imunológicos, tanto na resposta imune inata quanto na resposta imune adaptativa. Para melhor entendermos a ativação da resposta imune eficaz contra fungos patogênicos, pesquisamos a interação entre os linfócitos B-1 e o Paracoccidioides brasiliensis (P. brasiliensis), uma vez que este expressa moléculas antigênicas que podem ser reconhecidas pelo sistema imune. Utilizamos preparação antigênica do P. brasiliensis obtida de sua superfície leveduriforme denominada de CFA (antígeno livre da parede do fungo) e células leveduriforme do fungo. Observou-se que a maioria das células do sobrenadante da cultura celular de 4 dias de células totais aderentes peritoneais eram constituídos por linfócitos B-1; estas células expressam altos níveis de MHC-II (100%) e CD80 (90%). Contudo, não houve expressão significativa da molécula co-estimuladora CD86. Pela análise fenotípica, os linfócitos B-1 podem atuar como células apresentadoras de antígeno pois expressam CD80, CD86 e MHC-II; então realizamos o ensaio de proliferação celular utilizando linfócitos B-1 como células apresentadoras de antígenos e observamos proliferação celular de linfócitos TCD4+ significativa. Em relação às citocinas, analisamos a secreção de IL-10 e TNF-&#945; do sobrenadante da cultura de linfócitos B-1 sem nenhum estímulo e observamos que estas células secretam tanto IL-10 quanto TNF-&#945;; após estímulo de CFA, os valores aumentam significantemente. Analisamos a expressão de TLR-2, TLR-4, MyD88 e IL-10, por RT-PCR, dos linfócitos B-1 na presença de CFA. Encontramos expressão de TLR-2, MyD88 e IL-10 nas células com e sem estímulo. Analisamos a migração dos linfócitos B-1 da cavidade peritoneal de camundongos BALB/c após estímulo intraperitoneal (ip) com leveduras de PB. Decorridas 5 horas, foi observada grande diminuição dos linfócitos B-1 na cavidade peritoneal, que permanecia por 24 horas e 7 dias pós-infecção. Para melhor compreendermos a migração dos linfócitos B-1, foram utilizados camundongos CBA/N Xid (desprovidos de linfócitos B-1), cujo o peritônio foi reconstituído com linfócitos B-1, sendo infectados ip com leveduras de P brasiliensis. Os resultados demonstram que, após a infecção, os linfócitos B-1 migram da cavidade peritoneal para o baço. Também, observou-se aumento no número de células T com fenótipo de célula regulatória (CD4+CD25+Foxp3+). Nossos resultados sugerem que a elevada produção de IL-10 por células B-1, mediada provavelmente pela ligação de TLR-2, juntamente com a capacidade dos linfócitos B-1 em ativar linfócitos T, com a capacidade de migrar do peritônio para o baço e ativar células T regulatórias, poderia favorecer a sobrevivência do fungo no hospedeiro. / Innumerous data published in the literature have shown the involvement of B-1 cells in different immunological phenomena, both in the innate immnune response and the adaptive immune response. To better understand the activation of effective immune response against pathogenic fungi, we researched the interaction between B-1 cells and Paracoccidioides brasiliensis (P. brasiliensis), since it expresses that antigenic molecules can be recognized by the immune system. We used antigenic preparation of P. brasiliensis obtained from the surface of yeast called CFA (cell free antigen) and yeast cells of the fungus. It was observed that most cells in the cell culture supernatant 4 days of total adherent peritoneal cells consisted of B-1 cells, these cells express high levels of MHC-II (100%) and CD80 (90%). However, no significant expression of co-stimulatory molecule CD86 was observed. After phenotypic analysis, the B-1 cells can act as anyigen-presenting cells because they express C80, CD86 and MHC-II, then realized proliferation assay using B-1 cells as antigen presenting cells inducing was performed, and our results showed the significant proliferation of CD4 T cells. Regarding cytokines, we analyzed the IL-10 secretion and TNF-&#945; in culture supernatant of B-1 cells without stimulation and found that these cells secrete both IL-10 and TNF-&#945;, after stimulation of CFA. We analyzed the expression of TLR-2, TLR-4, MyD88 and IL-10 by RT-PCR, of the B-1 cells in the presence of CFA. We found expression of TLR-2, MyD88 and IL-10 cells with and without stimulus. We analyzed the migration of peritoneal B-1 cells after intraperitoneal (ip) infection with yeast from P. brasiliensis. After 5 hours, high decrease of B-1 cells in the peritoneal cavity was observed, which remained for 24 hours and 7 days post-infection. To better understand the migration of B-1 cells, we used mice CBA/N Xid (destitute of B-1 cells), reconstituted with B-1 cells, and infected with yeast P. brasiliensis. The results show that after the infection, the B-1 cells migrate from the peritoneal cavity to the spleen. Also, there was an increase in the number of T cells with regulatory cell phenotype (CD4+CD25+Foxp3+). Our results suggest that high production of IL-10 by B-1 cells, probably mediated by the binding of TLR-2, along with the ability of B-1 cells in activating T lymphocytes, with the ability to migrate from the peritoneum to the spleen and activate T regulatory cells, could favor the survival of the fungus in the host.

Paracoccina (PCN) é um constituinte de Paracoccidioides brasiliensis, um patógeno humano que causa a paracoccidioidomicose, micose sistêmica mais prevalente na América Latina. A PCN é uma proteína de função dual, com domínios de atividade lectínica e de N-acetilglicosaminidase. Análises proteômicas da preparação paracoccina revelaram a sua correspondência com uma proteína hipotética de P. brasiliensis do isolado 18 (Pb18), anotada como PADG-3347.1, que tem sequência polipeptídica semelhante a família das endoquitinases 18. Essas endoquitinases apresentam domínios distintos de atividade lectínica e enzimática. O conjunto de exons do gene correspondente, PADG-3347.1, foi clonado e expresso em E. coli, e as características físicas e biológicas da proteína recombinante foram comparadas com as da PCN. Além disso, a PADG-03347.1 recombinante (rPCN) foi avaliada por suas propriedades imunomoduladoras e sua capacidade em conferir proteção contra a infecção por P. brasiliensis. Nesse sentido, investigamos a interferência da administração profilática e terapêutica de rPCN no curso da infecção por P. brasiliensis em camundongos BALB/c. A histopatologia pulmonar dos camundongos tratados com a rPCN, mostrou menor ocorrência de granulomas, e estes também foram menores do que os observados nos animais controles. Consistente com a observação de poucas leveduras no centro dos granulomas, a contagem de UFC a partir do homogenato pulmonar dos camundongos tratados foi inferior ao observado nos animais controles. Além disso, a administração de rPCN, foi associada com altos níveis de IL-12, IFN-, TNF-, NO e IL-10 detectados no homogenato pulmonar. Os altos níveis de citocinas produzidos nos animais tratados com rPCN nos levou a investigar a ocorrência de interação da lectina com receptores presentes em células da imunidade inata, tais como TLR2 e TLR4. Verificamos que a rPCN ativa TLR2, nas formas homo ou heterodimérica, e TLR4, de modo independente dos correceptores CD14 e CD36. Estes dados revelam um possível mecanismo pelo qual rPCN gera proteção nos camundongos contra a PCM. rPCN, administrada terapêutica ou profilaticamente, induz a ativação de TLRs e imunidade Th1, conferindo proteção contra a infecção por P. brasiliensis. / Paracoccin is a constituent of Paracoccidioides brasiliensis, a human pathogen that causes paracoccidioidomycosis, the most prevalent systemic mycosis in Latin America. Paracoccin is a dual function protein exerting lectin and N-acetylglucosaminidase activities. Proteomic analysis of paracoccin preparation revealed its correspondence with a hypothetical protein from P. brasiliensis isolate Pb18 (Pb18), annotated as PADG-3347.1, which has a polypeptide sequence similar to the family 18 endochitinases. These endochitinases have distinct lectin and enzymatic domains. The multi-exon assembly of the correspondent gene (PADG-3347) was cloned and expressed in E. coli, and the physical and biological features of the recombinant protein were compared to those of the native paracoccin. Moreover, recombinant PADG-3347.1 (rPCN) was evaluated for its immunomodulatory properties and its ability to confer protection against murine P. brasiliensis infection. Thus, we investigated the interference of prophylactic and therapeutic administration of rPCN on the course of P. brasiliensis infection in BALB/c mice. The pulmonary histopathology of the treated mice showed lower incidence of granulomas, which were also smaller than those observed in the control animals. Consistently with the observation of few yeasts in the center of the granulomas, the CFU count provided by lung homogenates of treated mice was lower than the provided by control mice. Furthermore, administration of rPCN was associated with higher levels of IL-12, IFN-, TNF-, NO and IL-10, detected in the lung homogenates of animals. The high levels of cytokines produced in the rPCN treated mice prompted us to investigate the occurrence of interaction of the lectin with receptors present in innate immune cells, such as TLR2 and TLR4. We verified that rPCN activates TLR2,in homo or heterodimeric forms, and TLR4, in a manner that does not depend on CD14 and CD36 coreceptors. These data reveal a possible mechanism by which rPCN generates protection in mice against PCM. rPCN, administered therapeutic or prophylactically, induces TLRs activation and Th1 immunity, conferring protection against P. brasiliensis infection.

Paracoccidioidomicose (PCM), micose sistêmica prevalente na América Latina, é uma doença granulomatosa causada pelo fungo termodimórfico do gênero Paracoccidioides spp. O maior número de casos dessa doença tem sido reportado no Brasil, Colômbia, Venezuela e Argentina. A existência de extensas áreas endêmicas, alto potencial incapacitante devido a fibroses pulmonares, grande quantidade de mortes prematuras, faz com que a PCM seja considerada um grave problema de Saúde Pública. Apesar do tratamento medicamentoso ser relativamente eficiente, o tempo longo de uso das drogas e os efeitos colaterais provocados podem levar a diminuição da adesão ao tratamento diminuindo assim eficácia. O uso de vacinas terapêuticas pode ser uma importante ferramenta no controle da PCM. Uma das modalidades investigadas pelo nosso grupo é a utilização de células dendríticas (DCs) pulsadas com o peptídeo P10 como vacina terapêutica no controle da PCM. Resultados apresentados por nosso grupo, demonstraram que DCs diferenciadas a partir de células de medula óssea de camundongos saudáveis pulsadas com o peptídeo 10 (P10) podem ser utilizadas como adjuvante no tratamento da paracoccidioidomicose experimental em camundongos imunocompetentes e imunossuprimidos. Assim sendo, nossa proposta no presente trabalho foi avaliar se DCs diferenciadas de células de medula óssea (BMDCs) ou de monócitos circulantes (MoDCs) de camundongos (BALB/c) infectados apresentam modulação prévia devido à exposição a antígenos fúngicos, avaliamos in vitro a capacidade das células dendríticas diferenciadas a partir de monócitos circulantes de camundongos infectados com Pb18 estimular proliferação de linfócitos CD8+ e CD4+, analisamos a capacidade de células dendríticas derivadas de monócitos circulantes de camundongos infectados com Pb18 pulsadas com P10 em induzir uma resposta protetora. Nossos resultados obtidos são promissores e reforçam dados já publicados pelo grupo os quais demonstraram a eficiência do peptídeo P10 no tratamento da paracoccidioidomicose experimental; apontam que o P10 é capaz de modular ativamente células dendríticas diferenciadas de monócitos circulantes e diferenciadas de células de medula óssea; demonstram que BMDCs e MoDCs pulsadas ou não com P10 tem a capacidade de estimular proliferação de linfócitos T CD4+ e CD8+; confirmaram que BMDC e MoDCs pulsadas ou não com P10 diminuem a carga fúngica no tecido pulmonar, estimulando um padrão de citocinas misto, porém com predominância de citocinas pró-inflamatórias que incitam resposta imune celular do tipo Th1, que é protetora na PCM. Estes dados foram respaldados com a análise dos cortes histológicos onde os pulmões dos camundongos tratados com BMDCs ou MoDCs pulsadas com P10 apresentaram parênquima pulmonar mais conservado em comparação com os pulmões dos grupos que não receberam tratamento com BMDCs ou MoDCs, com diminuição significativa de células fúngicas viáveis / Paracoccidioidomycosis (PCM), a systemic mycosis prevalent in Latin America, is a granulomatous disease caused by the thermodymorphic fungus of the genus Paracoccidioides spp. The highest number of cases of this disease has been reported in Brazil, Colombia, Venezuela and Argentina. The existence of extensive endemic areas, a high incapacitating potential due to pulmonary fibroses, and a large number of premature deaths, makes the PCM considered a serious public health problem. Although the drug treatment is relatively efficient, the long time of use of the drugs and the side effects provoked can lead to the decrease of the adherence to the treatment thus diminishing their effectiveness. The use of therapeutic vaccines can be an important tool in the control of PCM. One of the modalities investigated by our group is the use of dendritic cells (DCs) pulsed with the peptide P10 as therapeutic vaccine in the control of PCM. Results presented by our group demonstrated that DCs differentiated from bone marrow cells of healthy mice pulsed with peptide 10 (P10) can be used as an adjuvant in the treatment of experimental paracoccidioidomycosis in immunocompetent and immunosuppressed mice. Thus, our proposal in the present study evaluated the capacity of differentiated DCs of bone marrow cells (BMDCs) or circulating monocytes (MoDCs) of infected mice (BALB/c) exhibited previous modulation due to exposure to fungal antigens, we evaluated in vitro the ability of differentiated dendritic cells from circulating monocytes from Pb18 infected mice to stimulate proliferation of CD8+ and CD4+ lymphocytes, we analyzed the ability of dendritic cells derived from circulating monocytes from mice infected with P. brasiliensis pulsed with P10 to induce a protective response. Our results are promising and reinforce data already published by the group which demonstrated the efficiency of the peptide P10 in the treatment of experimental paracoccidioidomycosis; suggest that P10 is capable of actively modulating differentiated dendritic cells from circulating and differentiated monocytes from bone marrow cells; demonstrate that BMDCs and MoDCs pulsed or not with P10 have the ability to stimulate proliferation of CD4+ and CD8+ T lymphocytes; confirmed that BMDC and MoDCs pulsed or not with P10 decrease the fungal load in lung tissue, stimulating a pattern of mixed cytokines but with a predominance of pro-inflammatory cytokines that stimulate Th1-type cellular immune response that is protective in PCM, these data were supported with analysis of the histological sections where the lungs of the mice treated with BMDCs or MoDCs pulsed or not with P10 showed more conserved pulmonary parenchyma compared to the lungs of the groups that did not receive treatment with BMDCs or MoDCs, with significant decrease of viable fungal cells

A paracoccidioidomicose (PCM) é uma micose sistêmica endêmica na América Latina, sendo o Brasil o país com maior número de casos. A enfermidade é adquirida por meio da inalação de propágulos de fungos do gênero Paracoccidioides e afeta principalmente os pulmões. Anteriormente, nosso grupo mostrou que o tratamento de camundongos infectados com P. brasiliensis com uma dose da proteína de estresse térmico de 60kDa recombinante de P. brasiliensis (PbHsp60r) induzia um efeito prejudicial na PCM, aumentando carga fúngica e lesão pulmonar, quando comparado a animais infectados e tratados com o veículo. No presente trabalho, buscou-se determinar se outra forma de apresentação da PbHsp60r poderia gerar um efeito benéfico em camundongos infectados com P. brasiliensis. Optou-se pelo plasmídeo pVAX1 subclonado com o gene da PbHsp60 (pVAX1-PB_HSP60). Após subclonagem do gene, foi mostrado, por Western blot, que anticorpos específicos para PbHsp60 eram produzidos por camundongos imunizados com três doses da construção e que a proteína era sintetizada por células HEK293 transfectadas com pVAX1-PB_HSP60. O tratamento dos animais infectados com três doses de pVAX1-PB_HSP60 ou pVAX1 subclonado com Hsp65 de M. leprae (pVAX1-ML_HSP65), que reconhecidamente melhora a PCM experimental, induziu uma diminuição de carga fúngica e da lesão pulmonar quando comparado com animais infectados e tratados com pVAX1 ou PBS. Uma dose de uma dessas construções não induziu melhora significativa na PCM quando comparado aos controles. Como esperado, os animais infectados e tratados com uma dose da PbHsp60r tiveram uma piora dos parâmetros de infecção, o que curiosamente não foi observado com os animais tratados com três doses dessa proteína recombinante, cuja melhora foi muito similar a dos animais infectados e tratados com três doses das construções plasmidiais. Ao pesquisar porque uma dose induz piora da infecção, observouse que PbHsp60r induz morte de linfócitos esplênicos in vitro, em um mecanismo dependente de TLR4, proteína adaptadora TRIF e receptor 1 de TNF. Esses resultados abrem perspectivas de se avaliar a importância da morte de células da resposta imunológica no curso da infecção por P. brasiliensis. / Paracoccidioidomycosis (PCM) is a systemic mycosis endemic in Latin America and Brazil, which holds most of the PCM cases. PCM is acquired through the inhalation of propagules of fungi from genus Paracoccidioides and mainly affects the lungs. We have previously shown that P. brasiliensis-infected mice treated with single dose of recombinant 60-kDa-heat shock protein from P. brasiliensis (rPbHsp60) had a worsening of infection when compared with animals only infected. In this study, we investigate whether the treatment of infected mice with PbHsp60 gene cloned into a plasmid (pVAX1-PB_HSP60) would render an efficient immune response and improvement of the disease. After cloning of the PbHsp60 gene, we first showed that immunization of mice with three doses of pVAX1-PB_HSP60 induced production of specific anti-PbHsp60 antibody and that pVAX1-PB_HSP60-transfected HEK293 cells synthesized the PbHsp60. Interestingly, mice treated with three doses, but not single dose, of pVAX1-PB_HSP60, and pVAX1 subcloned with Hsp65 from Mycobacterium leprae (pVAX1- ML_HSP65), which induces a beneficial effect in experimental PCM, had an improvement in fungal load and lung injury when compared with infected mice treated with pVAX1 or PBS. Unlike animals infected and treated with single dose of rPbHsp60, which had a worsening of infection parameters, treatment with three doses of rPbHsp60 interestingly induced a beneficial effect in the infected animals, as seen with the plasmid constructs. In investigating the causes of this worsening of PCM triggered by injection of a single dose of protein, we showed that rPbHsp60 induced the death of splenic lymphocytes in vitro in a mechanism dependent on Tolllike receptor 4, TRIF adapter protein and TNF receptor 1. These results open perspectives to evaluate the importance of cell death of the immune response in the course of P. brasiliensis infection.