Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2015. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2015-11-03T14:18:27Z No. of bitstreams: 1 2015_PatriciaAlvesSilva.pdf: 1963450 bytes, checksum: 252f173b1b9d8c60126eea7dac7dc38c (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2015-12-30T11:53:23Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_PatriciaAlvesSilva.pdf: 1963450 bytes, checksum: 252f173b1b9d8c60126eea7dac7dc38c (MD5) / Made available in DSpace on 2015-12-30T11:53:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_PatriciaAlvesSilva.pdf: 1963450 bytes, checksum: 252f173b1b9d8c60126eea7dac7dc38c (MD5) / O crescente número de casos de infecções fúngicas sistêmicas tem sido motivo de grande preocupação em âmbito mundial. As opções terapêuticas disponíveis atualmente são limitadas, dividida em quatro grupos: os Polienos (anfotericina B), Fluoropirimidinas (flucitosina), Azólicos (cetoconazol, fluconazol, itraconazol, posaconazol e voriconazol) e Equinocandinas (caspofungina, micafungina e anidulafungina. Além disso, vem sendo observado há algum tempo o surgimento de resistência aos agentes antifúngicos como Anfotericina B e derivados azólicos, surgindo à necessidade do desenvolvimento de novos antifúngicos. Atualmente, a pesquisa e o desenvolvimento de drogas consomem muito tempo e apresentam altos riscos. O planejamento baseado na estrutura e no mecanismo de ação tem se mostrado uma estratégia eficiente e menos dispendiosa para desenvolvimento de novos fármacos. Neste contexto, em resultados preliminares obtidos pelo grupo, por meio de análise in silico, foram identificados quatro possíveis genes-alvos, que estão presentes em sete fungos patogênicos humanos relevantes e ausentes no genoma humano. Entre estes genes-alvo está o kre2 ou Mnt1, que codifica uma proteína de aproximadamente 49 kDa, a α - 1,2 manosiltransferase. Esta é uma proteína importante para viabilidade celular e virulência do patógeno no interior do hospedeiro. Além da seleção dos dez genes candidatos, nosso grupo identificou por métodos in silico de modelagem molecular e screening virtual, 17 compostos de baixa massa molecular (small molecules) que potencialmente têm capacidade de inibir a enzima α - 1,2- manosiltransferase (KRE2) de P. lutzii. Das 17 moléculas selecionadas, uma se destacou nos testes de susceptibilidade contra fungos de importância médica e foi denominada de molécula 3. Com testes de inibição in vitro promissores surgiu-se a necessidade de avaliar se de fato esta molécula é capaz de inibir especificamente o alvo molecular KRE2 de P. lutzii. Os resultados alcançados neste trabalho apontam para o sucesso na obtenção desta proteína no sistema de expressão heteróloga em Pichia pastoris. Uma vez que este sistema realiza glicosilação de proteínas, possibilita o dobramento correto da enzima alvo, e fornece as condições necessárias para continuidade dos experimentos. Quantidades razoáveis da proteína foram produzidas heterologamente, o que possibilitou a realização dos ensaios para determinação dos parâmetros cinéticos e testes de inibição enzimática usando a molécula 3 contra o alvo KRE2 de P. lutzii. Utilizando substrato marcado com [14C] nas reações, foi determinado o Km aparente de KRE2 de P. lutzii que atingiu 3,7 pM, demonstrando alta afinidade da enzima pelo substrato em relação aos dados descritos na literatura. De forma semelhante, os testes de inibição enzimática utilizaram o isótopo radioativo e a molécula 3 foi usada contra as enzimas KRE2 de P. lutzii e MNT1 de Cândida albicans. Os resultados obtidos para KRE2 de P. lutzii demonstram que na presença da molécula inibidora, foi observada uma redução da atividade enzimática de até 60%. No entanto, a redução da atividade enzimática de MNT1 de Cândida albicans ficou em 20%. Faz-se necessário destacar que a molécula 3 apresenta problemas de solubilidade e que novos ensaios de susceptibilidade contra espécies de Cândida spp. utilizando Pluronic F-127 associados a molécula 3 foram realizados pelo nosso grupo e os resultados foram promissores. Desta forma, o melhoramento da solubilidade da molécula 3 representa um avanço nos testes de inibição in vitro, o que aumenta a expectativa de um MIC90 melhor para os outros fungos de importância médica. Os resultados apresentados neste trabalho representam um avanço na validação da molécula 3 como inibidor de KRE2 de P. lutzii, o que poderá contribuir com dados relevantes para o desenvolvimento de novas drogas para o tratamento de micoses de relevância mundial. / The occurrence of growth of systemic infections has been the cause of great concern worldwide. The therapeutic options currently available are limited, and are divided into four groups, Polyenes (amphotericin B), fluoropyrimidines (flucitosine), Azoles (ketoconazole, fluconazole, itraconazole, posaconazole and voriconazole) and Echinocandins (caspofungin, micafungin and anidulafungin. Furthermore, this is observed of resistance to antifungal agents such as amphotericin B and azoles, leading to the need of development of new antifungal agents. Currently, the research and drug development, consume much time and it have high risks. The planning based on structure and mechanism of action has proven to be an efficient and less expensive strategy for development of new drugs. In this context, in preliminar results obtained by the group using in silico analysis identified four possible target genes which are present in seven relevant human pathogenic fungi and absent in the human genome. Among these target genes Kre2 or Mnt1 is responsible to encode a protein of approximately 49 kDa, the α - 1,2 mannosyltransferase. This is an important protein for cell viability and virulence of the pathogen within the host. Besides the selection of ten candidate genes, our group identified using in silico methods of molecular modeling and virtual screening 17 compounds of low molecular weight (small molecules) that potentially have the ability to inhibit the enzyme α - 1,2 mannosyltransferase (KRE2) of P. lutzii. Of the 17 molecules selected, one highlighted out in susceptibility tests against fungi of medical importance and was called molecule 3. With in vitro inhibition tests promising, the need to evaluate if in fact this molecule is able to specifically inhibit the molecular target KRE2 of P. lutzii emerged. The results obtained in this study point to the success in getting this protein in heterologous expression system in Pichia pastoris. Once this system performs glycosylation of proteins, it allows the correct folding of the target enzyme, favoring the necessary conditions to continue the experiments. Reasonable amounts of protein were produced heterologously, allowing the tests to determine the kinetic parameters and enzyme inhibition tests using the molecule 3 against the target KRE2 P. lutzii. Using labeled substrate [14C] in the reactions, apparent Km of KRE2 of P. lutzii was determined, which reached 3.7 pM, demonstrating the high affinity of the enzyme for the substrate in comparison to data in the literature. Similarly, the enzymatic inhibition tests used the radioactive isotope and the molecule 3 was used against enzymes KRE2 of P. lutzii and MNT1 of Candida albicans. The results obtained for KRE2 of P. lutzii demonstrated that in the presence of the inhibitor molecule, was observed a reduction in the enzymatic activity by 60%. However, reduction of the enzymatic activity of MNT1 of Candida albicans was 20%. It is necessary to point out that the molecule 3 shows solubility issues, additional susceptibility testing against species of Candida spp. using Pluronic F-127 linked to molecule3 were carried out by our group with promising results. Thus, the improvement of the solubility of the molecule 3 represented an advance in vitro inhibition tests, which increases the expectation of better MIC90 for other fungi of medical importance. The results presented in this work represents an advancement in the validation of the molecule 3 as an inhibitor of KRE2 of P. lutzii, which may contribute to important data for the development of new drugs for the treatment of fungal infections of global relevance.

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:18Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-10-28 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Paracoccidioides brasiliensis (Pb), é uma micose sistêmica grave com formas aguda e crônica. As proteases ou peptidases são enzimas proteolíticas que ocorrem em todos os organismos e correspondem a 1-5% de seus conteúdos genéticos. Estas enzimas estão envolvidas em processos biológicos essenciais, como a coagulação sanguínea, morte celular e diferenciação de tecidos. Várias etapas proteolíticas importantes ocorrem durante a invasão metastática de tumores, assim como no ciclo de infecção de um grande número de vírus e microrganismos patogênicos. Um número reduzido de proteases do Pb já foram isoladas e caracterizadas, tampouco sua atividade durante o desenvolvimento da doença foi determinado, e até o momento, nenhuma atividade oligopeptidásica foi descrita nesse fungo. No presente trabalho foi demonstrada a presença de uma atividade metalo-peptidásica thimet oligopeptidase (TOP)-like no extrato citosólico de leveduras de P. brasiliensis, isolado 18 (Pb18). Nossos resultados mostraram a hidrólise do peptídeo com supressão intramolecular de fluorescência Abz-GFSPFRQ-EDDnp pelo extrato citosólico de leveduras de P. brasiliensis. Esse substrato é clivado preferencialmente pela TOP de mamíferos, e corroborando esse resultado, observou-se a inibição da hidrólise desse peptídeo por ο-fenantrolina e JA-2, inibidores seletivos de metalo-proteases e TOP, respectivamente. Utilizando-se peptídeos e inibidores seletivos para diferentes proteases, não se detectou a presença de atividade neurolisina-like ou neprilisina-like, e também se descartou a presença de serino-peptidases, cisteíno-peptidases e enzima conversora da angiotensina I. A maior atividade enzimática do extrato citosólico sobre os outros preparados (membrana/parede celular ou lisado total das leveduras) pode indicar uma localização citosólica dessa enzima. Não foi observada a secreção da peptidase no sobrenadante de cultura in vitro, mesmo após adição de soro fetal bovino. Todavia, a peptidase com atividade TOP-like de Pb parece ser secretada in vivo, ou liberada após lise do fungo por componentes efetores da resposta imune, uma vez que anticorpos capazes de inibir a atividade peptidásica são encontrados em soros de pacientes com paracoccidioidomicose, e soros com maior título em imunodifusão contém maiores concentrações de anticorpos enzima-específicos. Várias enzimas da família M3 clivam bradicinina, importante mediador inflamatório in vivo. A hidrólise da bradicinina e do substrato Abz-GFSPFRQEDDnp pelo extrato citosólico de P. brasiliensis, gera os mesmos fragmentos observados após clivagem pela TOP de mamíferos, que são diferentes dos gerados pela clivagem com MIP de mamíferos e OpdA bacteriana, sendo mais um indicador da presença majoritária de uma peptidase com atividade TOP-like em P. brasiliensis. A clivagem da bradicinina pela metalooligopeptidase com atividade TOP-like de Pb, poderia ocorrer no sítio inflamatório e poderia estar envolvida na inibição da indução de uma resposta imune protetora contra o fungo, favorecendo a permanência do mesmo no hospedeiro. Observamos ainda que o gene homólogo de TOP em P. brasiliensis é quase duas vezes mais expresso no virulento em comparação ao não virulento. O aumento da hidrólise do substrato Abz-GFSPFRQ-EDDnp também foi observado no isolado de maior virulência quando comparado ao de menor virulência. A possível relação entre a expressão da metalooligopeptidase com a virulência do fungo sugere que essa peptidase possa ser classificada como um fator de virulência fúngica, no entanto experimentos complementares são necessários para sua confirmação. A expressão da gp43 também foi analisada no isolado virulento e não virulento e observou-se uma expressão aumentada em até treze vezes no primeiro. Para melhor caracterização dessas metalo-oligopeptidases é necessária a obtenção da proteína recombinante, ou da proteína purificada nativa, isolada do lisado fúngico. Não obtivemos sucesso na expressão das proteínas recombinantes, tampouco no isolamento da peptidase nativa por métodos cromatográficos. Nossos resultados sugerem a presença de uma atividade metalooligopeptidásica TOP-like na fração citosólica de leveduras de P. brasiliensis. Liberação in vivo dessa enzima após a lise de fungos ou secreção estimulada por fatores do hospedeiro, pode ter um papel na inflamação e desenvolvimento da micose. / Paracoccidioidomycosis (PCM), caused by the pathogenic fungus Paracoccidioides brasiliensis (Pb) is a systemic mycosis with severe acute and chronic forms. Proteases or peptidases are proteolytic enzymes that occur in all organisms and constitute 1-5% of their genetic contents. These enzymes are involved in biological processes such as blood clotting, cell death and tissue differentiation. Several important proteolytic steps occur during the invasion of metastatic tumors, as well as in the infection of a large number of viruses and pathogens. To date, a small number of Pb proteases were isolated and characterized, also, their activities during the development of the disease was not determined, and an oligopeptidase activity was not detected in this fungus. In the present work, we demonstrated a metallopeptidase thimet oligopeptidase (TOP)-like activity in the cytosolic extract of Pb18 yeasts. Our results shown a major hydrolysis of the fluorescence resonance energy transfer (FRET) peptide Abz-GFSPFRQ-EDDnp, preferentially cleaved by TOP from mammals, and the inhibition of the hydrolysis of this peptide by orthophenantrolin and JA-2, selective inhibitors of metalloproteases and TOP, respectively. The presence of neurolysin- like and neprilysin-like, serinepeptidases, cysteine-peptidases and angiotensin converting enzyme I was discarded by analyzing selective FRET peptides and inhibitors. The higher peptidase activity of cytosolic extracts over the membrane/cell wall and total yeast lysate preparations may indicate that this enzyme is localized in the yeast cytosol. The metallo-oligopeptidase activity was not detected on in vitro culture supernatants, even after addition of fetal calf serum. However, the peptidase with TOP-like activity of P. brasiliensis seems to be secreted in vivo, or released after fungal lysis by immune factors, since antibodies that can inhibit this enzymatic activity were found in sera from paracoccidioidomycosis patients, and serum with highest titer in immunodiffusion contains higher concentrations of enzymespecific antibodies. Bradykinin, an important inflammatory mediator in vivo, is cleaved by several enzymes from the M3 family. The same fragments observed after hydrolysis by TOP were observed after cytosolic extract hydrolysis of bradykinin and the substrate Abz-GFSPFRQ-EDDnp. MIP and bacterial OpdA hydrolysis of these peptides generate different fragments, and this is an additional indicator of a major TOP-like activity in P. brasiliensis yeast cells Bradykinin hydrolysis by the TOP-like metallopeptidase of P. brasiliensis may occur in inflammatory processes and this suggests that the enzyme may be involved in the inhibition of a protective anti-fungal response induction, limiting fungal elimination. We also observed that the expression of the TOP homologous gene in P. brasiliensis has almost a two-fold increased in the virulent isolate 18 compared to the non-virulent isolate. Increased hydrolysis of the substrate Abz-GFSPFRQ-EDDnp was also observed in the most virulent isolate compared to the non-virulent. The possible correlation between TOP-like peptidase expression and fungal virulence suggests that this peptidase could be classified as a fungal virulence factor, however, additional experiments are needed to confirm this hypothesis. Gp43 expression was also analyzed in both isolates, and it was observed a thirteen-fold increase in the expression on the virulent isolate. In order to better characterize the P. brasiliensis TOP-like activity, we attempted to obtain the purified recombinant or the native protein, isolated from fungal lysate. However, we were not successful in the expression of recombinant proteins and neither on the isolation of the native protein using chromatographic methods. Our results suggest the presence of a TOP-like activity in the cytosolic fraction of P. brasiliensis yeasts. In vivo release of this enzyme after fungal lysis, or host factors-stimulated secretion, may have a role in inflammation and development of the disease. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Made available in DSpace on 2015-12-10T14:24:31Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-04-30. Added 1 bitstream(s) on 2015-12-10T14:30:44Z : No. of bitstreams: 1 000851710_20160722.pdf: 735546 bytes, checksum: 011c591d928a97fba211a8ca067ba722 (MD5) Bitstreams deleted on 2016-07-25T13:17:40Z: 000851710_20160722.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2016-07-25T13:18:47Z : No. of bitstreams: 1 000851710.pdf: 5518013 bytes, checksum: 8a378cf5a8a0a17841f43b423f397e01 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Programa de Apoio ao Desenvolvimento Científico da Faculdade de Ciências Farmacêuticas da UNESP (PADC) / Paracoccidioides brasiliensis é o agente causador da paracoccidioidomicose (PCM), micose sistêmica com ampla distribuição na América Latina. A adesão e invasão de células do hospedeiro são eventos cruciais envolvidos na infecção e disseminação do patógeno. Além disso, estes utilizam suas moléculas de superfície para se ligar aos componentes da matriz extracelular para estabelecer a infecção. O sucesso de colonização dos tecidos do hospedeiro pelo fungo é um evento complexo, geralmente envolvendo um ligante codificado pelo patógeno (adesinas) e um receptor da célula (freqüentemente um componente da matriz extracelular). A identificação de mecanismos de adesão, invasão ou evasão imune por Paracoccidioides é extremamente relevante e tem sido alvo de pesquisas recentes desenvolvidas por vários grupos. Neste intuito o estudo dos passos envolvidos desde o contato inicial de P. brasiliensis até os que culminam com a sua entrada na célula através da caracterização funcional de proteínas de membrana de P. brasiliensis, principais alvos de interação com moléculas do hospedeiro, é de grande importância. O Fator de elongação Tu, pertence ao grupo de proteínas denominadas moonlighting, tais moléculas possuem a capacidade de exercer mais de uma função e, normalmente, localizam-se em diferentes compartimentos da célula. Há relatos que EF-Tu de agentes patogênicos possa atuar como um fator de virulência. Previamente esta proteína foi identificada em P. brasiliensis por análise proteômica, sendo diferencialmente expressa quanto o fungo foi cultivado na presença de sangue de carneiro, porém esta ainda não foi caracterizada sendo interessante então a elucidação do seu papel na interação deste fungo às células epiteliais. O objetivo deste estudo foi produzir a proteína EF-Tu recombinante e seu respectivo anticorpo policlonal, verificar... / Paracoccidioides brasiliensis is the causative agent of paracoccidioidomycosis (PCM), a systemic mycosis with broad distribution in Latin America. The adhesion and host cell invasion are critical events involved in the infection and dissemination of the pathogen. Furthermore, they use their surface molecules to bind to extracellular matrix components to establish infection. The successful colonization of host tissues by the fungus is a complex event, usually involving a linker encoded by the pathogen (adhesins) and a cell receptor (often an extracellular matrix component). The identification of adhesion mechanisms, invasion or immune evasion by P. brasiliensis is extremely important and has been investigated in recent studies developed by several groups. In order to study the steps involved from the initial contact of P.brasiliensis until the culminating in its entry into the host cell through the functional characterization of P. brasiliensis membrane proteins, the main targets of interaction with host molecules, is of great importance. The elongation factor Tu (EF-Tu) belongs to the group of proteins called moonlighting such molecules have the ability to perform more than one function, and typically are located in different compartments of the cell. There are reports that EF-Tu of pathogens can act as a virulence factor. This protein has been previously identified in P. brasiliensis by proteomic analysis, but this has not yet been characterized as being interesting then the elucidation of its role in interacting of the fungus with epithelial cells. For this purpose the aim of this study was to produce the recombinant protein and its respective polyclonal antibody, verify your role in the fungus interaction with pneumocytes, extracellular matrix and plasminogen. Also in order to characterize the EF-Tu protein the present study aimed to obtain isolated with low expression of the gene encoding EF-Tu and with this verifies the role of EF-...

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:25:25Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-06-22Bitstream added on 2014-06-13T18:26:25Z : No. of bitstreams: 1 silva_acap_me_arafcf.pdf: 700931 bytes, checksum: 859de3c2d6bc2ff9e78faf746b707164 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / Paracoccidioides brasiliensis e P. lutzii são fungos dimórficos, agentes etiológicos da paracoccidioidomicose, que é uma micose humana sistêmica geograficamente confinada na América Latina. Vários antifúngicos podem ser utilizados para o tratamento dessa doença, tais como anfotericina B, sulfamídicos e azólicos (itraconazol) e de maneira geral seu uso é prolongado. As limitações frequentes dos antifúngicos e o aumento na incidência das infecções fúngicas sistêmicas têm ressaltado a necessidade da descoberta e do desenvolvimento de novos fármacos. O objetivo deste estudo foi comparar a atividade antifúngica de anfotericina B, itraconazol e galatos de alquila anti-complexo de Paracoccidioides por métodos fenotípicos e proteômicos. Para tanto foi padronizado o teste de sensibilidade para selecionar o galato de maior potência, utilizando o documento M27-A2 (2002), modificado pela adição de Alamar Blue. Adicionalmente, análises proteômicas foram realizadas antes e após tratamento com o antifúngico selecionado para verificar o perfil das possíveis proteínas-alvo. A atividade antifúngica foi estudada contra isolados de P. brasiliensis (S1, S2 e PS3) e P. lutzii, (Pb01-like), e depois o teste foi estendido para mais seis isolados. O valor da CIM do ácido gálico variou de 31,25 a 0,250 mg/L para todos os isolados. Os galatos mostraram valores de CIM entre 16 a 0,004 mg/L. O menor valor de CIM foi observado para seis galatos que possuem uma substituição por uma cadeia relativamente longa de carbonos. O perfil proteico dos isolados Pl01 e Pb18 foi estudado por eletroforese 2D após contato com anfotericina B , itraconazol e o galato de decila (todos a uma concentração de 0,125 mg/L. Mais de 130 spots para ambos os fungos foram observados e a maioria destas proteínas... / Paracoccidioides brasiliensis and P. lutzii are dimorphic fungi, etiological agents of paracoccidioidomycosis, which is a systemic human mycosis geographically restricted to Latin America. Various antifungal agents may be used to treat this disease, such as amphotericin B, sulfamidic agents and itraconazole, and these drugs are used in long-term therapies. The limitations of antifungals and increased incidence of systemic fungal infections has underscored the need for discovery and development of new drugs. The objective of this study was to compare the antifungal activity of amphotericin B, itraconazole and alkyl gallates anti-Paracoccidioides complex by phenotypic and proteomic methods. Thus, the susceptibility test was applied to select the most potent gallate, using the document M27-A2 (2002), modified by the addition of Alamar Blue. Finally, proteomic analyses was developed before and after the treatment with the antifungal agent selected, to study the protein profile after this treatment. The antifungal activity was evaluated against isolates of P. brasiliensis (S1, S2 and PS3) and P. lutzii (PB01-like), and after, the test has been extended to six isolates. The MIC values of gallic acid varied from 31.25 to 0.250 mg/L for all isolates. The gallates showed MIC values ranging from 16 to 0,004 mg/L. The lowest MIC value was observed for six gallates bearing a substitution for a long side chain. The protein profile of isolates Pb18 and Pl01 was studied by 2D electrophoresis after contact with amphotericin B, itraconazole and decyl gallate, all in the concentration of (0.125 mg/L ). More than 130 spots for both species were observed, and the most of these proteins... (Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:26:03Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2006-04-07Bitstream added on 2014-06-13T19:53:57Z : No. of bitstreams: 1 angella_af_me_botib.pdf: 1771008 bytes, checksum: 49bffe6b87df00a6ffab3e65cd19bdaa (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O fungo termo dimórfico, Paracoccidioides brasiliensis é o agente etiológico da Paracoccidioidomicose (PCM), a micose sistêmica mais prevalente da América Latina. Este fungo vem sendo frequentemente isolado de amostras clínicas, tecidos de tatu (Dasypus novemcinctus) e recentemente foi também isolado de cão. Este trabalho avaliou a transição de micélio para levedura (M-L), a termo tolerância e o perfil de virulência em nove isolados de P. brasiliensis (quatro de pacientes humanos, quatro de tatus e um de cão), bem como a sua relação com a seqüência parcial e expressão do gene hsp70 (Heat Shock Protein 70) através de Real Time RT-PCR. Tanto os dados morfológicos como moleculares se mostraram variáveis dentre os diferentes isolados. Alguns destes dados, como sequenciamento e morfologia leveduriforme corroboram com a divisão de nossos isolados nas duas espécies crípticas simpátricas previamente propostas por Matute et al (2006). Nossos resultados confirmam que a HSP70 pode ser um importante fator de virulência por estar associado à termo tolerância, mas sua expressão parece não ser diretamente associada a altos padrões de virulência. / The thermo dimorphic fungus Paracoccidioides brasiliensis is the etiological agent of Paracoccidioidomycosis (PCM), the most prevalent systemic mycosis in Latin America. The previous phylogenetic species recognition proved the existence of, at least, three cryptic species in this pathogen. In this work we evaluated the mycelia to yeast (M-Y) transition, thermo tolerance and virulence profiles of nine isolates of P. brasiliensis, (including members of two of the three species) as well as its relation to the partial sequence and expression of hsp70 gene. It was observed a large phenotypic variability concerning the M-Y transition. The isolates Bt84 and T10 took more time to convert to the yeast form. These same isolates presented stretched yeast cells at 36°C, instead of the typical round cells. It was also observed arthroconidia production during the M-Y transition for some of the nine isolates studied. The hsp70 expression showed to be variable among our isolates. The partial sequencing of hsp70 gene resulted in a Neighbour Joining tree that divided our isolates in two main groups. Conclusions: Our data confirm that hsp70 gene might be an important virulence factor, associated with the thermo tolerance, but its expression does not seem to be directly related to high virulence profiles. We also presented some preliminary results about mycological characters that could be important candidates for morphologic markers for species recognition, as well as the partial sequencing of one member of the hsp70 gene family that allowed the separation of our isolates in two clusters, that correspond to the two sympatric cryptic species that occur in our PCM hyper endemic area (Botucatu, SP, Brazil).

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:26:03Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-02-27Bitstream added on 2014-06-13T20:14:33Z : No. of bitstreams: 1 theodoro_rc_me_botib.pdf: 1627532 bytes, checksum: 84aa1424194b14fdd0953c57c4c5c2a6 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O fungo termo dimórfico, Paracoccidioides brasiliensis é o agente etiológico da Paracoccidioidomicose (PCM), a micose sistêmica mais prevalente da América Latina. Este fungo vem sendo frequentemente isolado de amostras clínicas, tecidos de tatu (Dasypus novemcinctus) e recentemente foi também isolado de cão. Este trabalho avaliou a transição de micélio para levedura (M-L), a termo tolerância e o perfil de virulência em nove isolados de P. brasiliensis (quatro de pacientes humanos, quatro de tatus e um de cão), bem como a sua relação com a seqüência parcial e expressão do gene hsp70 (Heat Shock Protein 70) através de Real Time RT-PCR. Tanto os dados morfológicos como moleculares se mostraram variáveis dentre os diferentes isolados. Alguns destes dados, como sequenciamento e morfologia leveduriforme corroboram com a divisão de nossos isolados nas duas espécies crípticas simpátricas previamente propostas por Matute et al (2006). Nossos resultados confirmam que a HSP70 pode ser um importante fator de virulência por estar associado à termo tolerância, mas sua expressão parece não ser diretamente associada a altos padrões de virulência. / The thermo dimorphic fungus Paracoccidioides brasiliensis is the etiological agent of Paracoccidioidomycosis (PCM), the most prevalent systemic mycosis in Latin America. The previous phylogenetic species recognition proved the existence of, at least, three cryptic species in this pathogen. In this work we evaluated the mycelia to yeast (M-Y) transition, thermo tolerance and virulence profiles of nine isolates of P. brasiliensis, (including members of two of the three species) as well as its relation to the partial sequence and expression of hsp70 gene. It was observed a large phenotypic variability concerning the M-Y transition. The isolates Bt84 and T10 took more time to convert to the yeast form. These same isolates presented stretched yeast cells at 36°C, instead of the typical round cells. It was also observed arthroconidia production during the M-Y transition for some of the nine isolates studied. The hsp70 expression showed to be variable among our isolates. The partial sequencing of hsp70 gene resulted in a Neighbour Joining tree that divided our isolates in two main groups. Our data confirm that hsp70 gene might be an important virulence factor, associated with the thermo tolerance, but its expression does not seem to be directly related to high virulence profiles. We also presented some preliminary results about mycological characters that could be important candidates for morphologic markers for species recognition, as well as the partial sequencing of one member of the hsp70 gene family that allowed the separation of our isolates in two clusters, that correspond to the two sympatric cryptic species that occur in our PCM hyper endemic area (Botucatu, SP, Brazil).

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:26:42Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-02-28Bitstream added on 2014-06-13T19:13:53Z : No. of bitstreams: 1 fernandes_rk_me_botfm.pdf: 1449236 bytes, checksum: 7642944fe5ad7bf06d645c01bd3ea971 (MD5) / O fungo Paracoccidioides brasiliensis é o agente etiológico da Paracoccidioidomicose, uma micose sistêmica, endêmica na América Latina. As células dendríticas (DCs) desempenham papel crucial na detecção de patógenos, desencadeamento de uma resposta inicial do hospedeiro, assim como na instrução da resposta imune adaptativa. Mediadores liberados pelas DCs, de uma forma autócrina, modulam as suas funções. Entre esses, destacamos as prostaglandinas e leucotrienos. Assim, avaliamos se DCs humanas produzem PGE2 e LTB4 em resposta ao fungo, a participação de receptores de reconhecimento de padrões moleculares (PRRS) nessa produção, assim como o papel modulador desses eicosanóides sobre a maturação fenotipica dessas células e a produção das citocinas IL-6, IL-10, IL-12, IL-23 e TNF-α. DCs humanas imaturas (CD14- / CD1ahigh / CD83 low) obtidas a partir da diferenciação de monócitos cultivados com GM-CSF e IL-4 (7 dias) liberaram substanciais concentrações de PGE2 e LTB4 que aumentaram significativamente, no caso da PGE2, com incubação com LPS durante 1h, 2h, 4h, 8h, 12h, 18h, 24h ou 48h. No entanto, os níveis de PGE2 e LTB4 foram significativamente inibidos após o desafio com as duas cepas do fungo. Ensaios de bloqueio dos PRRS mostraram que o processo de inibição de PGE2 envolveu o receptor de manose. Adicionalmente, ensaios de fenotipagem mostraram que após o desafio com o fungo, as DCs não alteraram o seu fenótipo de imaturas para o de células maduras. Assim, detectamos uma clara associação entre inibição da produção de PGE2 e LTB4 e a incapacidade do fungo em induzir a maturação de DCs. Ensaios utilizando PGE2 ou LTB4 exógenos confirmaram essa associação. Estas células ainda produzem altos níveis de IL-6... / The fungus Paracoccidioides brasiliensis is the etiological agent of paracoccidioidomycosis, a systemic mycosis, endemic in Latin America. Dendritic cells (DCs) play a crucial role in the detection of pathogens, triggering an initial response from the host as well as the instruction of the adaptive immune response. Mediators released by DCs, by an autocrine way, modulate their functions. Among these, we highlight the prostaglandins and leukotrienes. We therefore assessed whether human DCs produce PGE2 and LTB4 in response to fungus, the participation of recognition receptors of molecular patterns (PRRS) in this production, as well as the modulating role of these eicosanoids on phenotypic maturation of these cells and the production of the cytokines IL-6, IL-10, IL-12, IL-23 e TNF-α. Human immature DCs (CD14-/ CD1ahigh/CD83low) derived from the differentiation of monocytes cultured with GMCSF and IL-4 (7 days) released substantial concentrations of PGE2 and LTB4 which increased significantly in the case of PGE2, with incubation with LPS for 1h, 2h, 4h, 8h, 12h, 18h, 24h or 48h. However, the levels of PGE2 and LTB4 were significantly inhibited after challenge with two different strains of the fungus. Trials have shown that blockade of PRRS process involved the inhibition of PGE2 mannose receptor. Additionally, phenotyping assays showed that after challenge with the fungus, DCs did not change their phenotype of immature cells to mature ones. Accordingly, we detected a clear association between inhibition of the production of PGE2 and LTB4 fungus and inability to induce maturation of DCs. Assays using exogenous PGE2 and LTB4 confirmed this association. These cells also produce high levels of IL-6 in response to fungus, which, however, were not associated with inhibition of the production of eisosanóides. Rather than that, these DCs do not produce... (Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2015-06-17T19:33:33Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-07-11. Added 1 bitstream(s) on 2015-06-18T12:48:23Z : No. of bitstreams: 1 000832029.pdf: 1345027 bytes, checksum: 6207079d0ab94cde1a6d3a7db40846f6 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Paracoccidiodomicose (PCM) é uma micose sistêmica endêmica na América Latina, de alta prevalência no Brasil, que tem como agente etiológico os fungos dimórficos do gênero Paracoccidioides, P. brasiliensis e P. lutzii. No processo de infecção as adesinas, substâncias sintetizadas por estes fungos que se ligam a matriz extracelular, são importantes fatores de virulência para o estabelecimento da infecção. A proteína de 30kDa, pertencente a família de proteínas 14-3-3, se destaca no processo adesivo deste fungo. As proteínas 14-3-3 são uma família de proteínas presentes em todas as células eucariotas e possuem múltiplas funções. Em P. brasiliensis, a proteína 14-3-3Pb, liga-se a laminina, principal componente da matriz extracelular das células hospedeiras, e durante a infecção sua expressão é aumentada. Com o intuito de compreender melhor a função desta proteína o objetivo deste estudo foi realizar a análise funcional da 14-3-3Pb através da obtenção de um homólogo funcional em S. cerevisiae e análise do anticorpo monoclonal anti-14-3-3Pb. S. cerevisiae foi escolhida como modelo de estudo por ser uma levedura amplamente utilizada na pesquisa genética, ao contrário de P. brasiliensis, e por possuir duas isoformas de 14-3-3, Bmh1p e Bmh2p, com alta identidade com 14-3-3Pb Para obtenção do homólogo funcional, foi realizada a transformação do vetor pYES-14-3-3Pb em S. cerevisiae. A partir da obtenção dos transformantes a avaliação da complementação foi realizada e foi observado uma complementação parcial das proteínas Bmh1p e Bmh2p por 14-3-3Pb. Ainda foram realizados teste de sensibilidade aos antifúngicos e a derivados semissintéticos do ácido gálico, onde foi possível observar um aumento da sensibilidade das linhagens com nocaute para os genes BMH1 e BMH2, S. cerevisiae Δbmh1 e Δbmh2, quando comparado à linhagem selvagem. A análise do anticorpo monoclonal foi realizada através de ensaio... / Paracoccidioidomycosis (PCM) a systemic mycosis endemic in Latin America, with high prevalence in Brazil, has as etiological agent dimorphic fungi Paracoccidioides spp., P. brasiliensis e P. lutzii. During the infection process the adhesins, substances synthetized by fungi that interacts with host's extracellular matrix (ECM), are important virulence factors for the establishment of infection. A 30kDa protein that belongs to 14-3-3 proteins family stands out in the adhesion process of this fungus. The 14-3-3 proteins are present in all eukaryotic cells and play multiple functions. In P. brasiliensis, the 14-3-3Pb protein binds to lamin, the major component of ECM from host cells, and during the infection the expression is increased. In order to have a better understanding of 14-3-3Pb functions the aim of this study is to perform a functional analysis of this protein through achieving a functional homologous in S. cerevisiae and to analyze the monoclonal antibody anti-14-3-3Pb during infection. S. cerevisiae was chosen as model because it's widely use in genetic research, unlike P. brasiliensis, and has two isoforms of 14-3-3 proteins, Bmh1p and Bmh2p, with high identity with 14-3-3Pb. The functional homologous were obtained by yeast transformation of pYES-14-3-3Pb vector. Complementation assay was performed with obtained transformants, and it was observed that 14-3-3Pb partially complements Bmh1p and Bmh2p, with higher complementation of Bmh2p. Also susceptibility assays were performed with antifungal drugs and semi-synthetic compounds derived from gallic acid where it was observed that S. cerevisiae wild type was less sensitive to antifungals than the knockout strains, S. cerevisiae Δbmh1 and Δbmh2. Monoclonal antibody anti14-3-3Pb was evaluated alone and in association with substances with antifungal activities through inhibition adhesion assay, where it was observed that the anti-14-3-3Pb alone is able to inhibit P. brasiliensis ...

Made available in DSpace on 2015-06-17T19:34:02Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-04-28. Added 1 bitstream(s) on 2015-06-18T12:47:32Z : No. of bitstreams: 1 000829993.pdf: 2533065 bytes, checksum: 0c6cd0ff5f622d1b517444518875e22e (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / O gênero Paracoccidioides consiste de fungos dimórficos, agentes etiológicos da paracoccidioidomicose (PCM). Atualmente, estudos filogenéticos dividem o gênero Paracoccidioides em duas espécies denominadas Paracoccidioides brasiliensis e Paracoccidioides lutzii. A primeira é dividida em três espécies filogenéticas S1, PS2 e PS3, e a segunda é chamada de Pb01-like. A correta taxonomia molecular do gênero abriu novas possibilidades para o estudo e compreensão de suas relações com seu hospedeiro. Os fungos do gênero Paracoccidioides têm algumas características que permitem o seu crescimento em condições adversas, que podem contribuir para o desenvolvimento da doença, e têm mecanismos que lhes permitem aderir e invadir os tecidos do hospedeiro. A adesão ocorre através de uma classe específica de proteínas presentes na parede celular, essas proteínas são chamadas adesinas, e são capazes de mediar interações do fungo com os tecidos do hospedeiro durante a infecção. Diferenças na adesão são responsáveis pelo aumento da virulência/patogenicidade de um isolado em relação aos outros. O objetivo deste trabalho foi contribuir para ao maior conhecimento de componentes superficiais de espécies do gênero Paracoccidioides e sua influência na virulência. Para tanto, foram analisados os perfis de adesão e expressão de adesinas, bem como a clonagem e expressão heteróloga da proteína CS (Cell surface protein) que pode estar envolvida na virulência de Paracoccidioides spp e a caracterização e identificação de moléculas por phage display com capacidade de inibir a ligação de Paracoccidioides spp. Assim, ao se avaliar o perfil de adesão das espécies P. brasiliensis e P. lutzii bem como uma análise da expressão de genes codificantes de adesinas previamente caracterizadaspor PCR em Tempo Real, verificou-se alta heterogeneidade de comportamento nas diferentes espécies em relação à adesão, mostrando ainda ... / The Paracoccidioides genus consists of dimorphic fungi, etiologic agents of paracoccidioidomycosis (PCM). Currently, phylogenetic studies divide the Paracoccidioides genus in two species named Paracoccidioides brasiliensis and Paracoccidioides lutzii. The first is divided in three phylogenetic species, S1, PS2 and PS3 and the second is named Pb01-like. The correct molecular taxonomy of this fungus has opened new possibilities for the study and understanding of their relationships with their hosts. The fungi of the Paracoccidioides genus have some features that allow their growth in adverse conditions provided by the host, which may contribute to disease development and it have mechanisms that enable them to adhere and invade host tissues. Adhesion is provided by a particular class of proteins present in the cell wall called adhesins, capable of mediating interactions with the fungal host tissues during infection. Differences in adhesion are responsible for increased virulence/pathogenicity of an isolate in relation to others. The goal of this study was to contribute to a better knowledge of the superficial components of the species of Paracoccidioides genus e its influence in the fungi virulence. For this, we analyzed the adhesion profile and the adhesins expression during the interaction of the fungi with the host, cloned and expressed the CS protein, in a heterologous system, which may be involved in virulence of Paracoccidioides spp. as well as characterize and identify molecules capable of inhibit the adhesion of Paracoccidioides spp. using a Phage Display system. So, when we evaluated the adhesion profile of the species P. brasiliensis and P. lutzii, as well as the analysis of the expression of genes coding adhesins by Real Time PCR, it has been founded a high heterogeneity of behavior in the different species, showing that the adhesins 14-3-3 and enolase are the most used ones adhesins by the pathogen, independent of the strain ... / FAPESP: 2011/18038-9 / CNPq: CNPQ403586/2012-7

Made available in DSpace on 2015-09-17T15:25:11Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-02-20. Added 1 bitstream(s) on 2015-09-17T15:49:09Z : No. of bitstreams: 1 000845987_20170602.pdf: 10278101 bytes, checksum: 8bc5f7049c5eea183e2c927c4ab882a0 (MD5) Bitstreams deleted on 2017-06-02T11:56:30Z: 000845987_20170602.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2017-06-02T11:57:15Z : No. of bitstreams: 1 000845987.pdf: 10438412 bytes, checksum: 21849d7366b4147f3d91d763a4e2c419 (MD5) / Chalconas são flavonoides de cadeia aberta, apresentam diversas atividades biológicas e podem ser sintetizadas por várias metodologias, principalmente pela condensação de Claisen-Schmidt. A Hepatite C se apresenta como uma doença de grande incidência na população mundial, e dependendo de seu grau, pode levar a carcinoma hepatocelular. A paracocidioidomicose, uma micose sistêmica causada por Paracoccidioides brasiliensis, tem grande incidência no Brasil, principalmente em pessoas imunodeprimidas, sua forma aguda pode levar a comprometimentos de órgãos como baço e fígado. A mieloperoxidase (MPO) é uma enzima essencial na resposta imune contra a invasão de patógenos. No estresse oxidativo a atividade clorinante de MPO tem um aspecto negativo, pois está correlacionada a disfunções endoteliais. O presente trabalho teve como objetivo a síntese de três séries de aminochalconas e seus análogos arílicos, com grupos amino nas posições 2', 3' e 4' (anel A), substituintes doadores e aceptores de elétrons no anel B. A fim de avaliar seus efeitos de acordo com as posições dos grupos amino e do bioisosterismo de anel, essas substâncias foram testadas quanto à capacidade de inibição de replicação do HCV, de inibição do crescimento de P. brasiliensis, e da inibição da atividade clorinante de MPO. As substâncias foram sintetizadas com rendimentos altos, uma vez que para 79% das substâncias foram superiores a 75%. A substância LQVM 22 foi capaz de inibir a replicação do HCV em 41%, a 2 µmol L-1. As substâncias LQVM 16 e LQVM 17 demonstraram potente atividade anti-P. brasiliensis, exibindo valores de CIM90 de 0,49 µg mL-1. A substância LQVM 20 foi um potente inibidor da atividade clorinante de MPO, apresentando CI50 de 0,34 µmol L-1. Nossos estudos químicos e biológicos de aminochalconas e seus análogos arílicos conduziram a descoberta de hits, valiosos protótipos... / Chalcones are open chain flavonoids. They show a broad range of biological activities. These compounds can be synthesized by several methodologies, mainly by ClaisenSchmidt condensation. Hepatitis C is a disease of great incidence in worldwide population, and according to its severity can lead to hepatocellular carcinoma. Paracoccidioidomycosis is a systemic mycosis caused by Paracoccidioides brasiliensis, and has a great incidence in Brazil, in imunodefficient pacients, its acute form can lead to commitment of organs such as spleen and liver. Myeloperoxidase (MPO) is an essential enzyme in imune response against patogen invasion. However, the MPO activity has been correlated with some endotelial disfunctions. The present work aimed the synthesis of three series of aminochalcones and the aryl analogues, with amino group at positions 2', 3' and 4' (ring A), and with donors and withdraw electron substituents on B ring. In order to evaluate the effects of the different positions of amino groups and the ring bioisosterism, these substances were evaluated for the inhibition of HCV replication, P. brasiliensis growth and clorinating MPO activity. The substances were synthesised with high yields, once 79% showed yield above 75%. Compound LQVM 22 was able to inhibit HCV replication in 41 %, at 2 µmol L-1. Compounds LQVM-16 and LQVM-17 demonstrated potent anti-P. brasiliensis activity, exhibiting MIC90 values of 0,49 µg mL-1. Compound LQVM-20 was the potentest inhibitor of MPO chlorinate activity, showing IC50 of 0,34 µmol L-1.Our chemical and biological studies of aminochalcones, and their aryl analogues led to the discovery of hits, which are valuable prototypes to developing of innovatives therapeutical agents...