Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2017. / Submitted by Raquel Almeida (raquel.df13@gmail.com) on 2017-05-04T18:30:54Z No. of bitstreams: 1 2017_LuisJanssenMaia.pdf: 1744454 bytes, checksum: 5d3e4add2c64e65f580db3e08b18a8cf (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2017-06-05T20:49:19Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_LuisJanssenMaia.pdf: 1744454 bytes, checksum: 5d3e4add2c64e65f580db3e08b18a8cf (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-05T20:49:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_LuisJanssenMaia.pdf: 1744454 bytes, checksum: 5d3e4add2c64e65f580db3e08b18a8cf (MD5) Previous issue date: 2017-06-05 / A paracoccidioidomicose é uma micose sistêmica causada por fungos termodimórficos do gênero Paracoccidioides. Embora seja uma das micoses sistêmicas de maior importância na América Latina, tanto por número de ocorrências quanto pela morbidade causada pela forma crônica da doença, trata-se de uma doença negligenciada e, portanto, vários aspectos relevantes à clínica da micose e à biologia do fungo não estão bem elucidados. A despeito dos registros de ocorrência da micose, o diagnóstico dessa é de difícil execução, pela dificuldade de se isolar o fungo a partir de hospedeiros infectados e pela relativa falta de padronização e elevada ocorrência de reações cruzadas em testes de imunodiagnóstico. Assim, dentre as estratégias para a melhoria do diagnóstico da doença, está o uso de proteínas expressas de forma heteróloga para servirem como alvos mais específicos e padronizáveis nestes testes. Já em relação à biologia de fungos, é sabido que poucas espécies fúngicas são capazes de infectar organismos homeotérmicos, em relação ao número de espécies capazes de infectar organismos pecilotérmicos. Em face disso, alguns trabalhos na literatura sugerem que a temperatura dos hospedeiros representa uma barreira importante para a infecção fúngica e que os mecanismos moleculares de termotolerância dos fungos patogênicos são fatores de virulência importantes. Recentemente, a proteína TCTP foi encontrada em trabalhos de proteoma em ambas as fases micelial e leveduriforme de Paracoccidioides lutzii, além de possuir estrutura primária idêntica à TCTP de Paracoccidioides brasiliensis, fazendo dessa proteína um candidato para imunodiagnóstico. Além disso, a proteína TCTP foi apontada em outros organismos como uma chaperona molecular de importância em situações de estresse térmico. Assim, o presente trabalho objetiva avaliar estas duas vertentes para os fungos do gênero Paracoccidioides. Propiedades relevantes para o imunodiagnóstico foram preditas in silico e apontam para a presença de fosforilações na proteína, bem como um alto grau de conservação de estrutura primária em eucariotos e, particularmente, em fungos. A proteína foi produzida em quantidades apreciáveis e com pureza considerável por meio de expressão heteróloga em Escherichia coli. Ensaios de ELISA e Western Blot utilizando a TCTP indicam que a proteína não foi reconhecida pela maioria dos soros oriundos de camundongos infectados com P.brasiliensis. Já em relação às propriedades de chaperona, ensaios de dicroísmo circular indicam que a proteína nativa é termoestável. Além disso, a expressão da TCTP em culturas de E.coli as tornaram mais resistentes a estresse térmico. Como perspectivas a esse trabalho estão a aplicação de sub-regiões da proteína como alvos em imunodiagnóstico e aplicações no desenvolvimento de vacinas contra a micose, além de se caracterizar as propriedades de chaperona propriamente ditas da TCTP. / Paracoccidioidomycosis is a systemic mycosis caused by thermodimorphic fungi of the Paracoccidioides genus. Even though it is one of the most important systemic mycosis in Latin America, as a consequence of the number of its occurrences and the morbidity caused by the chronic phase of the disease, it is a neglected disease and, as such, many relevant aspects of its clinical approach and of the fungal biology are yet to be characterized. Despite the high occurrence records, the diagnostic of this mycosis is hard to be executed, because of the difficulty of isolating the fungus from infected hosts and because of the high cross-reaction occurrences in immunodiagnostic tests. In order to improve the diagnostics, one of the strategies being employed is the use of heterologously expressed proteins as targets of the immunodiagnostic tests, as they can be more precise and standardisable targets. As for the fungal biology, it is known that few fungal species are able to infect homeotherm hosts, in comparison to the number of species able to infect poikilotherm hosts. In face of this, some studies in the literature suggest the host temperature as an important barrier to the fungal infection and molecular mechanisms associated with the fungal thermotolerance as important virulence factors. Recently, the TCTP protein was found in proteome studies of both the mycelial and yeast forms of Paracoccidioides lutzii, in addition of having identical primary protein structure with the Paracoccidioides brasiliensis form of TCTP, properties which make this protein an interesting target for immunodiagnostics. In addition, the TCTP protein was identified as a molecular chaperone with significant importance in thermal stress situations. Therefore, the present study aims to evaluate these two aspects for the fungi of the Paracoccidioides genus. Relevant properties for the immunodiagnosis using this protein were predicted in silico and point to a considerable amount of phosphorilations in it as well as a high conservation of it among eukariotes and, particularly, in fungi. The protein was produced in considerable amounts and purity through heterologous expression in Escherichia coli.Immunodiagnostic tests of ELISA and Western Blot assays using the TCTP indicate this protein as not being recognized by most mice sera experimentally infected with P.brasiliensis. As in relation to the chaperone properties of the protein, circular dichroism assays indicate the native protein as thermally stable. Moreover, TCTP expression in E.coli cultures made them more resistant to thermal stress. The perspectives of this study are the application of sub-regions of the protein as targets in immunodiagnostic assays, as well as applications in vaccine development against the mycosis and the evaluation of the chaperone properties themselves of TCTP.

Resumo: O fungo termo dimórfico, Paracoccidioides brasiliensis é o agente etiológico da Paracoccidioidomicose (PCM), a micose sistêmica mais prevalente da América Latina. Este fungo vem sendo frequentemente isolado de amostras clínicas, tecidos de tatu (Dasypus novemcinctus) e recentemente foi também isolado de cão. Este trabalho avaliou a transição de micélio para levedura (M-L), a termo tolerância e o perfil de virulência em nove isolados de P. brasiliensis (quatro de pacientes humanos, quatro de tatus e um de cão), bem como a sua relação com a seqüência parcial e expressão do gene hsp70 (Heat Shock Protein 70) através de Real Time RT-PCR. Tanto os dados morfológicos como moleculares se mostraram variáveis dentre os diferentes isolados. Alguns destes dados, como sequenciamento e morfologia leveduriforme corroboram com a divisão de nossos isolados nas duas espécies crípticas simpátricas previamente propostas por Matute et al (2006). Nossos resultados confirmam que a HSP70 pode ser um importante fator de virulência por estar associado à termo tolerância, mas sua expressão parece não ser diretamente associada a altos padrões de virulência. / Abstract: The thermo dimorphic fungus Paracoccidioides brasiliensis is the etiological agent of Paracoccidioidomycosis (PCM), the most prevalent systemic mycosis in Latin America. The previous phylogenetic species recognition proved the existence of, at least, three cryptic species in this pathogen. In this work we evaluated the mycelia to yeast (M-Y) transition, thermo tolerance and virulence profiles of nine isolates of P. brasiliensis, (including members of two of the three species) as well as its relation to the partial sequence and expression of hsp70 gene. It was observed a large phenotypic variability concerning the M-Y transition. The isolates Bt84 and T10 took more time to convert to the yeast form. These same isolates presented stretched yeast cells at 36°C, instead of the typical round cells. It was also observed arthroconidia production during the M-Y transition for some of the nine isolates studied. The hsp70 expression showed to be variable among our isolates. The partial sequencing of hsp70 gene resulted in a Neighbour Joining tree that divided our isolates in two main groups. Our data confirm that hsp70 gene might be an important virulence factor, associated with the thermo tolerance, but its expression does not seem to be directly related to high virulence profiles. We also presented some preliminary results about mycological characters that could be important candidates for morphologic markers for species recognition, as well as the partial sequencing of one member of the hsp70 gene family that allowed the separation of our isolates in two clusters, that correspond to the two sympatric cryptic species that occur in our PCM hyper endemic area (Botucatu, SP, Brazil). / Orientador: Eduardo Bagagli / Coorientador: Ivan de Godoy Maia / Banca: Everaldo dos Reis Marques / Banca: Maria Terezinha Serrão Peraçoli / Mestre

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:19Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-02-20Bitstream added on 2014-06-13T20:35:39Z : No. of bitstreams: 1 silva_jf_me_arafcf.pdf: 3465468 bytes, checksum: eab4e4e0a1aeaa20d426752498e4bdf0 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / Paracoccidioides brasiliensis é um fungo dimórfico causador da paracoccidioidomicose, doença de comprometimento orgânico múltiplo e de evolução prolongada. A virulência de P. brasiliensis pode ser atenuada ou perdida após subseqüentes ciclos de subcultivos durante longos períodos e restabelecida após inoculações em animais ou pela passagem em cultura de células. Um aspecto importante na interação entre P.brasiliensis e seu hospedeiro é a habilidade do fungo em aderir aos componentes da matriz extracelular. O entendimento e identificação destas moléculas revestem-se de importância na descoberta de tratamentos eficientes para as micoses sistêmicas. Assim, neste trabalho, foram estudados 13 diferentes isolados de P. brasiliensis quanto ao padrão de infecção à cultura de células epiteliais pulmonares (A549), genotipagem com os iniciadores OPJ4, M13 e GACA4 empregando as técnicas de RAPD e PCR fingerprinting, bem como a verificação de proteínas expressas diferencialmente, e sua capacidade de ligação a componentes da matriz extracelular (MEC). Os diferentes isolados de P. brasiliensis apresentaram maior capacidade de infecção após reisolamento de células epiteliais. As amostras mais aderentes foram Pb18, Pb2508 e Pb2367 e as menos aderentes foram Pb2669, Pb2508 e Pb2367. Quanto aos genótipos, perfis diferenciais foram observados e correlação com padrão de infecção e distribuição geográfica foi observada para alguns isolados com dois dos iniciadores (OPJ4 e M13). A análise protéica dos extratos “cell free” de P. brasiliensis, por eletroforese bidimensional também forneceu perfis diferenciais entre as amostras subcultivadas e reisoladas e 62 ligantes de colágeno tipo I, 18 de laminina e 23 de fibronectina de um total de 420 proteínas expressas foram observados...

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:19Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-07-05Bitstream added on 2014-06-13T20:35:40Z : No. of bitstreams: 1 marcos_cm_me_arafcf.pdf: 2508470 bytes, checksum: bc1a1f1c4040c405fe6c122e87b067ff (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / Paracoccidioides brasiliensis é um importante patógeno humano que causa a paracoccidioidomicose (PCM), uma micose sistêmica com ampla distribuição na América Latina. A adesão e invasão de células são eventos cruciais envolvidos na infecção e disseminação do patógeno. Além disso, patógenos utilizam suas moléculas de superfície para se ligar aos componentes da matriz extracelular para estabelecer a infecção. Uma proteína antigênica de P. brasiliensis foi isolada de géis de eletroforese bidimensional do cell-free do fungo e caracterizada. Peptídeos foram obtidos da proteína de 54 kDa e pI 5,6 e mostraram homologia com enolase de Paracoccidioides brasiliensis e outros fungos. A proteína foi purificada através de eletroeluição e utilizada para a produção de anticorpo policlonal em coelho. Por microscopia de fluorescência não foi possível observar a localização exata desta proteína, apenas que se encontra aparentemente distribuídapor todo o fungo, foi possível verificar alterações no citoesqueleto de pneumócitos durante a infecção por P. brasiliensis. A localização foi confirmada por microscopia imunoeletrônica a presença de enolase foi detectada principalmente na parede celular de leveduras de P. brasiliensis e também no citoplasma, ela se demonstrou mais expressa quando este fungo foi cultivado em meio onde houve acréscimo de sangue de carneiro e durante a situação de infecção a pneumócitos. A enolase purificada foi capaz de se ligar a fibronectina, fibrinogênio, laminina, plasminogênio, colágenos tipo I e IV. Foi confirmado que a ligação desta proteína à pneumócitos é influenciada pela sequência de aminoácidos Arg-Gly-Asp contida provavelmente nos receptores da matriz extracelular presentes na célula do hospedeiro. Essas informações indicam que a enolase possivelmente contribui para a adesão do microrganismo aos tecidos do... / Paracoccidioides brasiliensis is an important human pathogen that causes paracoccidioidomycosis (PCM), a systemic mycosis with a wide distribution in Latin America. The ability of P. brasiliensis to cause not only human diseases but also mycoses with a variety of clinical manifestations from localized forms to the disseminated disease progressing to lethality, probably depends on the relationship between the virulence of the fungus, its ability to interact with and to invade the surface structures of the host and the immune response of the host. The adhesion of the pathogen leads to the recognition of carbohydrate and protein ligands on the surface of the host cell or proteins of the extracellular matrix (ECM). The large number of tissue types that fungi can colonize and infect suggests that they use a variety of surface molecules for adhesion.Understanding the interactions between P. brasiliensis and the host tissue depends on the study of the different steps of the process of colonization, especially adhesion, in which the pathogen recognizes ligands on the surface of host cells. This study aimed to verify the role of enolase in the host cell-fungus interaction and the ability of enolase to bind to extracellular matrix components, to determine its subcellular localization. The data revealed that fibronectin is the major ligand of enolase. Evaluation of the location of enolase at an ultrastructural level revealed that it is distributed in various cellular compartments, but at a high level in the cell wall. This suggests that enolase performs additional functions related to the glycolytic pathway and also plays a role of adhesion in P. brasiliensis. Therefore, this study increases the knowledge about the characteristics of enolase and its influence on the binding process of P. brasiliensis

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:24:16Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-05-18Bitstream added on 2014-06-13T20:31:23Z : No. of bitstreams: 1 trindade_bc_me_botfm.pdf: 386096 bytes, checksum: 6ac59f53d4ce6464ee8a4aac318a9483 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / Camundongos selecionados para a máxima (AIRmax) ou mínima (AIRmin) reação inflamatória aguda apresentam desvio de freqüência do gene Slc11a1. Este gene está envolvido no transporte de íons divalentes no compartimento endossomal/lisossomal de macrófagos e neutrófilos, interferindo na sua ativação e suscetibilidade a infecções. Neste estudo, nós investigamos a interação dos alelos Slc11a1 R (Slc11a1rGly169) e S (expressão nula da proteína Slc11a1, Slc11a1sAsp169) com os loci de características quantitativas (QTL) moduladores da inflamação, durante a paracoccidioidomicose (PCM) em linhagens AIRmaxRR, AIRmaxSS, AIRminRR and AIRminSS homozigotas para o gene Slc11a1, produzidas por acasalamentos assistidos por genotipagem. Nós verificamos que o alelo R em homozigose foi responsável por um maior influxo neutrofílico em camundongos com background AIRmax. Observamos ainda, que as linhagens AIRmaxRR e AIRmaxSS foram mais resistentes enquanto a linhagem AIRmin portadora do alelo R foi implicada em uma maior recuperação de UFC de P. brasiliensis. Desta forma, apesar de não observarmos diferença na recuperação de UFC entre as sublinhagens AIRmax, um aumento no influxo de neutrófilos para o pulmão dos animais AIRmaxRR pode ter compensado a influência do alelo Slc11a1 R na multiplicação do fungo. Nós também mostramos que o número de UFC nos pulmões foi relacionado a síntese de IL-4 e IL-10 neste órgão, mas a produção de óxido nítrico foi semelhante em ambas as linhagens mostrando que este metabólito não foi o fator determinante de resistência/suscetibilidade nas linhagens analisadas. Quanto a análise de diferentes citocinas em sobrenadante de cultura de células do baço e no pulmão das linhagens utilizadas, mostramos que o gene modula a síntese de várias citocinas, porém... / Mice selected for the maximum (AIRmax) or minimum (AIRmin) acute inflammatory reaction show disequilibrium of the Slc11a1 gene. This gene is involved in the transport of divalent ions at the endosomal/lysosomal compartment within macrophages and neutrophils, interfering in their activation and susceptibility to infections. In this study, we investigated the interaction of the Slc11a1 R (Slc11a1rGly169) and S (null Slc11a1 protein expression, Slc11a1sAsp169) alleles with the Quantitative Trait Loci (QTL) modulated-inflammation during paracoccidioidomycosis in homozygous AIRmaxRR, AIRmaxSS, AIRminRR and AIRminSS lines produced by genotype-assisted breedings. It could be verified that R allele in homozygosis is associated with a more intense neutrophil influx in AIRmax background. The AIRmax lines showed to be more resistant wile AIRmin bearing allele R implicated in a higher recovered P. brasiliensis CFU. Although, the increase of neutrophil influx to the lungs in AIRmaxRR mice can be compensating the influence of Slc11a1 R allele in P. brasilinsis multiplication. We have also observed that the number of CFU in lungs was not related to NO production but instead to modulation of IL-4 and IL-10 synthesis in the lungs. Moreover, we present the effect of Slc11a1 modulating the release of differents cytokines in both supernatant of spleen cells and lungs, but this effect was time-dependent and change in accordance of host genetic background and microenviroment produced by immune response during P. brasiliensis infection. In conclusion, these findings suggest that the lower PMN leukocyte infiltration to the lungs and Slc11a1 R genotype seemed to be a decisive factor in determining the susceptibility profiles in P.brasiliensis infection.

Submitted by MARLUCE FRANCISCA HRYCYK null (marluce@unemat.br) on 2018-03-23T15:42:38Z No. of bitstreams: 1 Texto final 23 03 18.pdf: 2572888 bytes, checksum: 00a5717448a63a2138d8dbcd62ca9c06 (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Pizzani null (luciana@btu.unesp.br) on 2018-03-26T17:45:23Z (GMT) No. of bitstreams: 1 hrycyk_mf_dr_bot.pdf: 2473289 bytes, checksum: 4273a8f7803f0e2dda1dadd73582c9a2 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-03-26T17:45:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 hrycyk_mf_dr_bot.pdf: 2473289 bytes, checksum: 4273a8f7803f0e2dda1dadd73582c9a2 (MD5) Previous issue date: 2018-03-01 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Mato Grosso (FAPEMAT) / Paracoccidioides spp. são fungos que vivem no ambiente (solo) e em associação com tecidos de hospedeiros mamíferos. Apresentam como característica de patogenicidade o termo-dimorfismo, em que, a 25º C apresenta a fase micelial e produz suas partículas infectantes (conídios) e a 35-37º C está sob forma de leveduras (forma parasitária). As características morfológicas e micromorfológicas são importantes, mas insuficientes para a diferenciação entre os genótipos. Contudo, o avanço no conhecimento da Biologia Molecular nos últimos anos permitiu uma grande compreensão da biologia e das relações filogenéticas de Paracoccidioides spp. A região de ITS1-5.8S-ITS2 (rDNA) tem sido largamente usada na identificação de diversos fungos, sendo muito útil para discriminar entre P. brasiliensis e P. lutzii, no entanto, ela não separa entre as genótipos do complexo P. brasiliensis (S1, PS2, PS3 e PS4), no qual, recentemente foi proposto um rearranjo taxonômico, em que foram descritas como novas espécies de Paracoccidioides: P. brasiliensis para S1, P. americana para PS2, P. restrepiensis para PS3 e P. venezuelensis para PS4. Além do seqüenciamento do ITS, é necessário incluir outras regiões gênicas mais ou menos polimórficas para estudos filogenéticos que visam identificar Paracoccidioides spp. como nesse estudo. Este trabalho teve como objetivo mapear áreas de ocorrência e isolar Paracoccidioides a partir de tatus (Dasypus novemcinctus), bem com detectar molecularmente por Nested-PCR o DNA do fungo em amostras de solo e nos órgãos (baço, fígado e linfonodos mesentéricos) de tatus. Nós isolamos o fungo de tatus do Sudeste (Botucatu/SP) e Centro-Oeste (Alta Floresta/MT). Todos os isolados foram caracterizados molecularmente pelo seqüenciamento ITS-rDNA e gp43 exon 2 e por PCR-RFLP de alfa tubulina (tub1) como P. brasiliensis e P. americana. A reação de Nested-PCR foi sensível e permitiu detectar o DNA de Paracoccidioides nas amostras de tecido (baço, fígado e linfonodos mesentéricos) de D. novemcinctus e também no solo dos Estados de São Paulo e Mato Grosso. A construção filogenética com os amplicons ambientais de solo mostrou que P. lutzii está amplamente presente nessas regiões (Sudeste e Centro-Oeste), além do que, amplicons de P. lutzii de Alta Floresta/MT clusterizaram em um clado separadamente, sugerindo que espécies crípticas podem existir, dentro de P. lutzii. / Paracoccidioides spp. are fungi that live in the environment (soil) and in association with tissues of mammalian hosts. They present as a characteristic of pathogenicity the thermo - dimorphism, in which, at 25º C it presents the m ycelial phase and produces its infective particles (conidia) and at 35 - 37º C it is in the form of yeasts (parasitic form). The morphological and micromorphological characteristics are important, but insufficient for the differentiation between the genotype s. However, the advance in the knowledge of Molecular Biology in recent years has allowed a great understanding of the biology and phylogenetic relationships of Paracoccidioides spp. The region of ITS1 - 5.8S - ITS2 (rDNA) has been widely used in the identific ation of several fungi, in which it is very useful in the discrimination between P. brasiliensis and P. lutzii , however, it does not separate between genotypes of the complex P. brasiliensis (S1, PS2, PS3 and PS4), in which recently a taxonomic rearrangeme nt was proposed, described as new species of Paracoccidioides : P. brasiliensis for S1, P. americana for PS2, P. restrepiensis for PS3 and P. venezuelensis for PS4 . In addition to the sequencing of ITS, it is necessary to include other more or less polymorp hic gene regions for phylogenetic studies aimed at identifying Paracoccidioides spp. as in this study . The objective of this work was to map out occurrence areas and isolate Paracoccidioides from armadillos ( Dasypus novemcinctus ), as well as molecularly de tect the DNA of the fungus in soil samples and organs (spleen, liver and mesenteric lymph nodes) by Nested - PCR . We isolated the armadillo fungus from the Southeast (Botucatu / SP) and Central West (Alta Floresta / MT). All isolates were molecularly charac terized by ITS - rDNA and gp43 exon 2 sequencing and by alpha tubulin (tub1) PCR - RFLP as P. brasiliensis and P. americana . The Nested - PCR reaction was sensitive and allowed to detect the DNA of Paracoccidioides in tissue samples (spleen, liver and mesenteric lymph nodes) of D. novemcinctus and also in the soil of the States of São Paulo and Mato Grosso. Phylogenetic construction with environmental soil amplicons showed that P. lutzii is widely present in these regions (Southeast and Center - West), in addition, P. lutzii amplicons from Alta Floresta / MT cluster in a clade separately, suggesting that species may exist within P. lutzii .

Made available in DSpace on 2016-09-27T13:40:04Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-07-31. Added 1 bitstream(s) on 2016-09-27T13:45:14Z : No. of bitstreams: 1 000868835.pdf: 1467491 bytes, checksum: 8ee2f2f1a6a55757ee87dffc67df02b2 (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / A paracoccidioidomicose, uma das mais importantes micoses sistêmicas da América Latina, é causada pelas espécies crípticas Paracoccidioides brasiliensis e P. lutzii. Ainda não é claro como o processo de especiação dentro do gênero Paracoccidioides influi em aspectos como virulência e patogenia da doença. O objetivo deste trabalho é caracterizar algumas dessas diferenças entre as duas espécies crípticas, utilizando-se de modelo experimental alternativo, as larvas da traça de cera Galleria mellonella. Este modelo tem sido utilizado em estudos envolvendo outros patógenos, porém ainda é pouco explorado em Paracoccidioides spp. No presente estudo, G. mellonella refletiu diferenças entre a virulência de cargas fúngicas distintas, bem como dentre isolados variados e destes com os grupos controle. Além disso, foi possível a recuperação do patógeno a partir de larvas experimentalmente infectadas. Isolados P. lutzii apresentaram níveis de virulência variáveis, sendo pertencentes a esta espécie os isolados com maior e menor virulência observadas neste estudo (8334 e Pb01, respectivamente). Já os isolados pertencentes a espécie P. brasiliensis (Pb339, Pb192 e T15LN1) apresentaram taxas de mortalidade mais homogêneas e intermediárias. Tais resultados credenciam as larvas de G. mellonella como modelo de experimentação adequado para o estudo do processo de virulência em Paracoccidioides spp. Ainda, foi realizado knockdown do gene codificador da gp43 (PbGP43), o antígeno imunodominante em P. brasiliensis e do seu homólogo em P. lutzii (PlP43) utilizando-se a estratégia de RNA antisense combinada com transformação mediada por Agrobacterium tumefaciens. Foram obtidos três transformantes P. brasiliensis com expressão de PbGP43 de cerca de 8%, 14% e 36% quando comparados com a expressão do isolado selvagem original Pb192. Além disso foram obtidos dois transformante P. lutzii com expressão de PlP43 por volta de 23% e... / Paracoccidioidomycosis (PCM), an important systemic mycosis in Latin America, is caused by the cryptic species Paracoccidioides brasiliensis and P. lutzii. How these species differ in their virulence factors is still unknown and needs to be properly evaluated. While the role of PbGP43, which codes gp43, as a virulence factor is relatively well established for P. brasiliensis, the same is not true for its ortholog in P. lutzii, namely PlP43. PbGP43 and PlP43 present differences in their nucleotide sequences, expression levels, epitope occurrence and influences on PCM diagnosis. Herein, we obtained PbGP43 and PlP43 knockdown strains by antisense RNA technology combined with ATMT, in order to comparatively evaluate their effects on virulence, employing the alternative experimental host Galleria mellonella larvae. Our results suggest that p43 is important in the P. lutzii infectious process, as previously demonstrated by gp43 in P. brasiliensis. We confirmed G. mellonella as a useful model for studying P. brasiliensis and P. lutzii virulence, since it reflects variation between inoculum size and different strains, as well as between wild-type and respective knockdown transformant strains. Virulence levels may vary among isolates of the same species, probably reflecting that the physiological condition is more important than the species effect. Re-isolation of Paracoccidioides from experimentally infected G. mellonella larvae is possible and might be useful for epigenetic studies related to infection / CNPq: 143371/2011-8

Submitted by REGINALDO KELLER FERNANDES null (regiskeller@msn.com) on 2017-04-12T12:10:23Z No. of bitstreams: 1 Tese Dr definitiva.pdf: 5601863 bytes, checksum: 50eec58640e31a0c12ce54dde368d5a3 (MD5) / Approved for entry into archive by Luiz Galeffi (luizgaleffi@gmail.com) on 2017-04-17T20:28:15Z (GMT) No. of bitstreams: 1 fernandes_rk_dr_bot.pdf: 5601863 bytes, checksum: 50eec58640e31a0c12ce54dde368d5a3 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-17T20:28:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 fernandes_rk_dr_bot.pdf: 5601863 bytes, checksum: 50eec58640e31a0c12ce54dde368d5a3 (MD5) Previous issue date: 2017-02-24 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / A paracoccidioidomicose (PCM) é uma micose sistêmica endêmica na América Latina, principalmente no Brasil, Argentina e Venezuela, e que promove um importante impacto na saúde pública. Seu agente etiológico é um fungo termodimórfico pertencente ao gênero Paracoccidioides que compreende o Paracocidioides brasiliensis (Pb) e suas espécies crípticas S1, PS2, PS3 e Paracoccidioides lutzii. As consequências da interação do fungo com as células da resposta imune inata, tais como as células dendríticas (DC), destacando a capacidade destas células para instruir a resposta imune adaptativa, não são totalmente compreendidas. Em estudo anterior, descobrimos que DCs não maturam em resposta ao desafio com Pb. Esta falha foi associada à inibição de PGE2 nas DCs pelo fungo, uma vez que este eicosanóide é um fator importante para a maturação dessas células. Na tentativa de melhor entender este processo e suas conseqüências para a instrução da resposta adaptativa CD4, nós buscamos analisar o perfil transcricional de DCs em resposta ao Pb assim como o de linfócitos CD4+ cocultivados com DCs sensibilizados com o fungo. Para estas análises, nós utilizamos a metodologia de RNA-seq, que permitiu o sequenciamento de alto rendimento e a quantificação sistemática de expressão gênica. Após as análises, os genes que foram regulados positivamente ou negativamente em ambas as células (DCs e CD4) foram listados e as funções das proteínas codificadas por eles, identificadas. A análise geral das proteínas codificadas por esses genes, como diversas citocinas e quimiocinas, mediadores inflamatórios, bem como fatores de transcrição envolvidos na diferenciação de populações de linfócitos, permitiram determinar o perfil de resposta adaptativa que foi diferenciado após Interação de DCs com células CD4, bem como alguns mecanismos que levaram a este perfil. / FAPESP: 2013/14733-0

Orientador: Maria José Soares Mendes Giannini / Coorientador: Alexandra Ivo Medeiros / Banca: Carlos Pelleschi Taborda / Banca: Sonia Rozental / Banca: Maria do Rosário Rodrigues Silva / Banca: Anderson Assunção Andrade / Resumo: O fungo do gênero Paracoccidioides é o agente etiológico da paracoccidioidomicose (PCM), micose de grande importância no Brasil e América Latina. Há diferentes terapias disponíveis, como os antifúngicos da classe dos poliênicos, azóis e sulfonamidas. O desenvolvimento de novos antifúngicos com eficácia superior é necessário para prevenir recaídas e diminuir os efeitos secundários, o período de tratamento e sequelas. A molécula de ácido gálico com diferentes modificações (galatos de alquila) apresentou atividade antifúngica contra um painel representativo de fungos patogênicos. O galato de decila (G14) foi objeto de estudo deste trabalho, para o qual a interação Paracoccidioides¬-hospedeiro foi relacionada ao mecanismo de ação. Para tanto, o fungo Paracoccidioides lutzii (Pl01) foi desafiado com o G14 para análise das alterações no desenvolvimento de brotamentos e na viabilidade celular pelo ensaio de MTT. Foi avaliada a influência do G14 na taxa de interação de Pl01 com a linhagem de macrófago alveolar murino AMJ2-C11, com as linhagens pulmonares de mamífero A549 e MRC-5, e hemócitos da larva de Galleria mellonella utilizando ensaios por citometria de fluxo. O G14 ainda foi avaliado quanto à taxa de sobrevivência da larva de G. mellonella infectada e a capacidade na modulação da produção de óxido nítrico em macrófago RAW. O estudo do mecanismo de ação foi realizado pelo ensaio de interação químico-genética seguida da interação genética, que consiste na comparação de uma coleç... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The fungus of genus Paracoccidioides is the etiological agent of paracoccidioidomycosis (PCM), an important mycosis in Brazil and Latin America. There are different available therapies, as antifungals belong to the class of polyenes, azoles and sulfonamides. The development of new antifungal agents with greater effectiveness is required to prevent relapse and reduce side effects, the period of treatment and sequelae. The gallic acid molecule with different modifications (alkyl gallates) showed antifungal activity against a representative panel of pathogenic fungi. The decyl gallate (G14) was the study object of this work, for which the Paracoccidioides-host interaction was connected with the mechanism of action. Therefore, the fungus Paracoccidioides lutzii (Pl01) was challenged with the G14 to analyze the changes in the development of budding and cell viability by MTT assay. Then, it was assessed the influence of the G14 in the interaction rate of Pl01 with murine alveolar macrophage lineage AMJ2-C11, with mammalian lung lineage A549 and MRC-5, and hemocytes of Galleria mellonella larvae using assays by flow cytometry. The compound G14 was evaluated for survival rate of infected G. mellonella larvae and to capacity of modulation of nitric oxide production in RAW macrophages. The mechanism of action was performed by chemical-genetic interaction assay followed by genetic interaction, which involves comparing a mutant collection, of Saccharomyces cerevisiae yeast, with hypersen... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Orientador: Angela Maria V. Campos Soares / Coorientador: Luciane Alarcão Dias-Melicio / Banca: Denise Fecchio / Banca: Dulce Helena Jardim Costantino / Resumo: O fungo Paracoccidioides brasiliensis é o agente etiológico da Paracoccidioidomicose, uma micose sistêmica, endêmica na América Latina. As células dendríticas (DCs) desempenham papel crucial na detecção de patógenos, desencadeamento de uma resposta inicial do hospedeiro, assim como na instrução da resposta imune adaptativa. Mediadores liberados pelas DCs, de uma forma autócrina, modulam as suas funções. Entre esses, destacamos as prostaglandinas e leucotrienos. Assim, avaliamos se DCs humanas produzem PGE2 e LTB4 em resposta ao fungo, a participação de receptores de reconhecimento de padrões moleculares (PRRS) nessa produção, assim como o papel modulador desses eicosanóides sobre a maturação fenotipica dessas células e a produção das citocinas IL-6, IL-10, IL-12, IL-23 e TNF-α. DCs humanas imaturas (CD14- / CD1ahigh / CD83 low) obtidas a partir da diferenciação de monócitos cultivados com GM-CSF e IL-4 (7 dias) liberaram substanciais concentrações de PGE2 e LTB4 que aumentaram significativamente, no caso da PGE2, com incubação com LPS durante 1h, 2h, 4h, 8h, 12h, 18h, 24h ou 48h. No entanto, os níveis de PGE2 e LTB4 foram significativamente inibidos após o desafio com as duas cepas do fungo. Ensaios de bloqueio dos PRRS mostraram que o processo de inibição de PGE2 envolveu o receptor de manose. Adicionalmente, ensaios de fenotipagem mostraram que após o desafio com o fungo, as DCs não alteraram o seu fenótipo de imaturas para o de células maduras. Assim, detectamos uma clara associação entre inibição da produção de PGE2 e LTB4 e a incapacidade do fungo em induzir a maturação de DCs. Ensaios utilizando PGE2 ou LTB4 exógenos confirmaram essa associação. Estas células ainda produzem altos níveis de IL-6... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The fungus Paracoccidioides brasiliensis is the etiological agent of paracoccidioidomycosis, a systemic mycosis, endemic in Latin America. Dendritic cells (DCs) play a crucial role in the detection of pathogens, triggering an initial response from the host as well as the instruction of the adaptive immune response. Mediators released by DCs, by an autocrine way, modulate their functions. Among these, we highlight the prostaglandins and leukotrienes. We therefore assessed whether human DCs produce PGE2 and LTB4 in response to fungus, the participation of recognition receptors of molecular patterns (PRRS) in this production, as well as the modulating role of these eicosanoids on phenotypic maturation of these cells and the production of the cytokines IL-6, IL-10, IL-12, IL-23 e TNF-α. Human immature DCs (CD14-/ CD1ahigh/CD83low) derived from the differentiation of monocytes cultured with GMCSF and IL-4 (7 days) released substantial concentrations of PGE2 and LTB4 which increased significantly in the case of PGE2, with incubation with LPS for 1h, 2h, 4h, 8h, 12h, 18h, 24h or 48h. However, the levels of PGE2 and LTB4 were significantly inhibited after challenge with two different strains of the fungus. Trials have shown that blockade of PRRS process involved the inhibition of PGE2 mannose receptor. Additionally, phenotyping assays showed that after challenge with the fungus, DCs did not change their phenotype of immature cells to mature ones. Accordingly, we detected a clear association between inhibition of the production of PGE2 and LTB4 fungus and inability to induce maturation of DCs. Assays using exogenous PGE2 and LTB4 confirmed this association. These cells also produce high levels of IL-6 in response to fungus, which, however, were not associated with inhibition of the production of eisosanóides. Rather than that, these DCs do not produce... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre