Orientador : Prof. Dr. Silvio Marques Zanata / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciencias Biológicas (Microbiologia, Parasitologia e Patologia Básica). Defesa: Curitiba, 22/03/2011 / Inclui referências : f. 54-57 / Área de concentração / Resumo: O câncer de mama é um mal que acomete mais de 49.000 mulheres anualmente no Brasil. Na decisão terapêutica para esse tipo de tumor, é importante a definição de alguns parâmetros ligados a proteínas presentes ou não no carcinoma. Dentre essas proteínas, destaca-se o receptor ? de estrógeno (hER?). A detecção do receptor de estrógeno é feita através de imunohistoquímica e para essa técnica são usados anticorpos monoclonais anti hER?. Uma vez que o Brasil ainda é totalmente dependente da importação desse insumo, a obtenção de linhagens de hibridomas secretores desses anticorpos torna-se uma questão de soberania. No presente trabalho, foi elaborado todo o processo e ferramentas necessários para a obtenção dos hibridomas. Partindo-se do RNA total de células produtoras desse receptor, foi produzido cDNA a partir do qual o fragmento codificante para hER? foi clonado em plasmídeo para produção de proteína recombinante em sistema heterólogo em E. coli. Essa proteína foi fusionada a uma cauda de histidina que foi utilizada na sua purificação por cromatografia de afinidade a metal imobilizado. O peptídeo purificado foi utilizado como antígeno na imunização de camundongos Balb/C. Animais que apresentaram uma boa resposta imunológica frente ao antígeno de interesse foram eutanasiados e tiveram o seu baço removido para a realização dos ensaios de fusão. Os esplenócitos dissociados foram fusionados a células de linhagens de mieloma através da utilização de polietilenoglicol com o objetivo de se obter hibridomas secretores de anticorpos monoclonais de interesse. Durante o período do trabalho nenhum hibridoma estável foi obtido, no entanto foram desenvolvidas todas as ferramentas necessárias para a obtenção do insumo. Palavras-chave: hER?, receptor de estrógeno, anticorpos policlonais, anticorpos monoclonais, proteinas recombinantes. / Abstract: Breast cancer is a disease that affects more than 49,000 women annually in Brazil. To achieve a therapeutic decision for this type of tumor, it is important to define some parameters linked to proteins present or absent in the carcinoma. Among those proteins, the estrogen receptor ? (hER?) is highlighted. The detection of estrogen receptor ? is made by immunohistochemistry and, for this technique, monoclonal antibodies against hER? are used. Since Brazil is still completely dependent on imports of this material, obtaining hibridoma lines that produce those antibodies becomes an issue of sovereignty. In this study, the hole process and tools necessary to obtain those hybridomas was developed. Starting from the total RNA of cells that produce the receptor, cDNA was produced. The encoding sequence for hER? was cloned into a plasmid from which the recombinant protein was produced in heterologous system in E. coli. This protein was fused to a histidine tag that was used for its purification by Immobilized Metal Affinity Chromatography. The purified peptide was used as antigen to immunize Balb/C mice. Animals that showed a good immune response against the antigen of interest were euthanized and had their spleen removed for fusion assay. The dissociated splenocytes were fused to myeloma cell lines by using polyethyleneglycol in order to obtain hybridomas secreting monoclonal antibodies of interest. During the study, no stable hybridoma was obtained, however have been developed all the tools necessary to obtain the desired material. Key words: hER?, estrogen receptor, polyclonal antibodies, monoclonal antibodies, recombinant proteins.

Orientadora : Profª Drª Giseli Klassen / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Microbiologia, Parasitologia e Patologia Básica. Defesa: Curitiba, 18/11/2014 / Inclui referências / Resumo: As metástases são um grande problema para pacientes com câncer de mama, chegando a ser a causa de 90% dos casos de morte desta neoplasia. A proteína matriz metaloprotease 14 (MMP-14) tem uma importante contribuição no desencadeamento da migração celular nos carcinomas mamários, pela sua atividade proteolítica, e também pela ativação de outras metaloproteases solúveis capazes de degradar componentes da matriz extracelular. Sabe-se que a regulação do gene MMP14 está intimamente relacionada com aspectos epigenéticos, através da metilação de uma ilha de CpG localizada na região promotora. Estudos têm demonstrado que o padrão de metilação ao longo do corpo do gene também pode apresentar um importante papel na regulação da transcrição gênica e, para tanto, o objetivo deste estudo foi verificar o papel da metilação do corpo do gene MMP14 na regulação da expressão em diferentes linhagens tumorais de mama. As linhagens HB4aC3.6, HB4aC5.2, PMC42 e MCF-7 foram avaliadas quanto a expressão do gene estudado por RT-PCR e RT-qPCR. Duas regiões que continham ilhas de CpG, uma localizada na região promotora (-161 a +186) e outra no primeiro íntron do corpo do gene (+242 a +869), foram amplificadas e sequenciadas após o tratamento com bissulfito de sódio. Os resultados obtidos mostraram que as linhagens HB4aC3.6, HB4aC5.2 e PMC42 expressam o gene MMP14 e que suas taxas de metilação global, de ambas as ilhas de CpG avaliadas, não passam de 15%. Por outro lado, a linhagem MCF7 foi a única que não expressou o gene MMP14, e apresentou taxas de metilação global que ultrapassam 75%, em ambas as ilhas de CpG. Assim, mostrou-se uma correlação entre a ausência de expressão e alta metilação da ilha de CpG não só da região promotora, mas também da localizada no primeiro íntron. Estes resultados também permitiram a identificação de regiões diferencialmente metiladas nas linhagens de mama para padronização da técnica de MSP-PCR. A linhagem MCF7, quando submetida ao tratamento com os compostos desmetilantes (DAC) e inibidores desacetilantes de histona (TSA), passou a expressar o gene MMP14 e reduziu suas taxas de metilação global, indicando uma estreita relação entre epigenética e regulação deste gene incluindo a região intrônica. Nas regiões desmetiladas pelos tratamentos, foi possível identificar um sítio de ligação do fator de transcrição GLI3, que pode estar auxiliando na expressão de MMP14. Concluímos que a metilação da ilha de CpG localizada no íntron do gene MMP14 parece estar atuando cooperativamente com a região promotora para promover ou silenciar a transcrição do gene. Estudos de metilação no corpo do gene são recentes e, portanto, novos dados podem contribuir para entender a importância da metilação dessas regiões de DNA nos mecanismos de tumorigênese. Palavras-chave: Câncer de mama. MMP-14. Ilha de CpG intrônica. Metilação. / Abstract: Metastasis is a major problem for patients with breast cancer, being the cause of 90% of deaths from this neoplasia. The protein matrix metalloprotease 14 (MMP-14) has a major contribution in the initiation of cell migration in breast carcinomas, due to its proteolytic activity, and also by the activation of other soluble metalloproteases capable of degrading components of the extracellular matrix. It is known that the regulation of the MMP14 gene is closely related to epigenetic events by methylation of a CpG island located in the promoter region. Studies have shown that the methylation pattern along the body of the gene may also have a role in regulating gene transcription and, therefore, the aim of this study was to investigate the role of methylation in the body of MMP14 in regulating the expression of this gene in different breast tumor cell lines. The expression of the gene was evaluated by RT-PCR and RT-qPCR in the HB4aC3.6, HB4aC5.2, PMC42 and MCF-7 cell lines. Two regions containing CpG islands, one located in the promoter (-161 to +186), and another region in the first intron of the gene body (+242 to +869), were amplified and sequenced after treatment with sodium bisulfite. The results showed that the HB4aC3.6, HB4aC5.2 and PMC42 lines expressed MMP14 and their rates of global methylation of both CpG islands was no more than 15%. On the other hand, the MCF7 line was the only one that did not express the MMP14 gene and presented global methylation rates exceeding 75% in both CpG islands. This showed a correlation between the absence of high expression and methylation of the CpG island not only of the promoter region but also of the first intron. These results also allowed the identification of different methylated regions in breast cancer cell lines for the standardization of MSP-PCR. The MCF7 line, when subjected to treatment with the demethylating compound (DAC) and the inhbitors of histone deacethylating compund (TSA), expressed MMP14 and reduced its rates of global methylation, indicating a close relationship between epigenetics and regulation of this gene including the intronic region. In regions demethylated by the treatment it was possible to identify a binding site of the transcription factor GLI3, which may be promoting the expression of MMP14. We conclude that methylation of the CpG island located in the intron of the MMP14 gene seems to be working cooperatively with the promoter region to permit or silence the transcription of the gene. Studies of methylation in the body of the gene are new, and, therefore, new data can contribute to understand the importance of DNA methylation of these regions in the mechanisms of tumorigenesis. Keywords: Breast cancer. MMP-14. Intronic CpG island. Methylation.

Orientador: Pedro Ribas Werner / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciencias Agrarias / Estudou-se a histologia e a ultraestrutura do tentáculo e da região anterior do pé de B. occidentalis, espécie de planorbídeo não suscetível ao S. mansoni. Os dois órgãos possuem os mesmos elementos celulares variando apenas a predominância de um e outro. A epiderme é composta por uma camada única de células prismáticas ciliadas, não ciliadas e glandulares globosas. As células não ciliadas compõem quase a totalidade da epiderme do tentáculo; sua superfície externa é recoberta por microvilos e numerosas mitocôndrias e vesículas de aspecto lisossomal concentram-se na porção apical da célula. As células ciliadas, características do pé, diferenciam-se das demais pela presença de cílios, cujas raízes longas e estriadas mantêm-se em contato através de pés basais. O tentáculo possui uma artéria central envolta por tecido conjuntivo denso e fibras musculares lisas circulares e longitudinais. Na porção sub-epidermal do tentáculo é característica a presença de tecido conjuntivo frouxo, formado pelas projeções citoplasmáticas de fibroblastos. O número de células secretárias sub-epidermais e de células sensoriais nervosas é reduzido. No pé, encontra-se tecido conjuntivo denso, com grande número de células com pigmento que parecem estar repletas de grânulos de melanina. Há uma grande concentração de células secretórias sub-epidermais, freqüentemente dispostas em grupos, com reações distintas ao P.A.S. As fibras musculares lisas são de espessura variada e não possuem orientação determinada / The normal histology and ultrastructure of the tentacle and anterior region of the foot of Biomphalaria occidentalis were studied. This species of planorbid is not susceptible to the infection of Schistosoma mansoni. Both organs were shown to have the same celular elements in variable proportions. The epidermis, in general, is composed by a single layer of tall columnar ciliated cells, non-ciliated cells and glandular goblet cells. The epidermis of the tentacle is almost entirely composed by non ciliated cells. These cells have their surface covered by microvilli and have numerous mitochondria and lysossomal-like vesicles in their apical regions. The ciliated cells, which are more numerous in the foot differenciate from the others by cilia whose roots are long and interconnected by basal feet. The tentacle has a single central artery surrounded by dense connective tissue and smooth muscle fibers disposed circular and longitudinally. The subepidermal portions of the tentacle characteristically has loose connective tissue, formed by the cytoplasmic projections of fibroblasts. Dense connective tissue is found in the foot and in the deep part of the tentacle. In In these regions, there are numerous pigment cells, which appear to be melanine laden. Subepidermal secretory cells and sensory cells are present in small numbers. In the foot there is a great concentration of subepidermal secretory cells, often in groups which react differently to the PAS staining technic. The smooth muscle fibers show variable thickness and do not have any orientation

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:33:24Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2005-05-24Bitstream added on 2014-06-13T18:07:30Z : No. of bitstreams: 1 silva_ma_dr_arafcf.pdf: 976242 bytes, checksum: 452382843f6dbbd98e65fdd05a72d135 (MD5) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / Trypanosoma cruzi é um protozoário flagelado causador da doença de Chagas que, segundo estimativas da OMS afeta 16-18 milhões de pessoas na América Latina, causando danos sociais extremamente graves. A doença apresenta formas clínicas variadas que incluem a forma indeterminada, cardiomiopatia e alterações digestivas. Variações intraespecíficas nas diferentes cepas de Trypanosoma cruzi estudadas foram demonstradas em nível morfo-biológico, bioquímico e genético. Essa heterogeneidade poderia explicar a variabilidade nas manifestações clínicas da doença de Chagas e as diferenças regionais de sua morbidade. Com o objetivo de caracterizar quatro cepas de Trypanosoma cruzi isoladas de pacientes chagásicos crônicos, residentes na região de Araraquara - SP, parâmetros biológicos e moleculares foram avaliados. Para estudar o comportamento biológico das cepas, três grupos de camundongos Swiss, não isogênicos, pesando 10-12g foram infectados com formas sangüíneas das cepas em estudo. Foram avaliados os seguintes aspectos: período pré-patente, curvas de parasitemia, morfologia do parasita no sangue periférico, taxas de mortalidade e lesões histopatológicas. Três cepas apresentaram parasitemia patente com períodos pré-patentes variáveis, baixa parasitemia e formas tripomastigotas largas durante todo o curso da infecção. Uma cepa apresentou parasitemia sub-patente. Nenhum animal morreu durante o período do estudo. Exame histopatológico mostrou ninhos de formas amastigotas no coração de animais infectados para duas cepas e inflamação em vários órgãos para todas as cepas. Para a caracterização molecular o DNA do parasita foi extraído de formas epimastigotas mantidas em meio LIT. Parte do espaçador não transcrito do gene de mini-exon foi amplificado por PCR. Todas as cepas geraram produtos com 250 pb. Os dados biológicos e moleculares permitiram a classificação de todas as cepas como T.cruzi II. / Trypanosoma cruzi is a flagellate protozoan agent of Chagas disease that, according to the OMS estimation, affect 16-18 milion of people in Latin America, making serious social damage. The illness shows varied clinicals forms that include indeterminate form, cardiomiopathy and digestive alterations. Intra-specific variations among differents Trypanosoma cruzi strains studied have been demonstrated on morpho-biological, genetic and biochemical levels. Such heterogeneity can explain the variability of Chagas disease in clinical manifestations and in the regional differences of the morbidity rate. This research has the objective to characterize four strains of Trypanosoma cruzi isolated from humans patients, residents in Araraquara - SP region, by evaluating biological and molecular parameters. In order to study the biological behavior of Trypanosoma cruzi strains, three groups of albino Swiss mice, weighting 10-12g were intraperitoneally inoculated with bloodstreams forms of the strains in study. Pre-patent period, parasitaemia patterns, tripomastigote morphology, mortality rate and tissue distribution of the protozoan were analysed. Three strains showed patent parasitemy with variable pre-patent period, low parasitemy and broad forms during the whole infection period. One strain showed sub-patent parasitemy. Mortality rates were null. Histopathological analysis showed amastigotes forms in heart for two strains and inflamatory process in several organs for all the strains. For the molecular characterization, the parasite DNA was extracted from epimastigotes forms kept in LIT medium. Part of the non-transcribed spacer of the mini-exon gene was amplified by PCR. All the strains generated products with 250 pb. The molecular and biological informations allowed to classify all the strains as T.cruzi II.

Made available in DSpace on 2015-09-17T15:24:03Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-11-22. Added 1 bitstream(s) on 2015-09-17T15:48:29Z : No. of bitstreams: 1 000842326.pdf: 1568778 bytes, checksum: 44ee70fd5854d8be4d8c71d1f4d50503 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / A subfamila Triatominae compreende 146 espécies, agrupadas em 18 gêneros e cinco tribos. O gênero Triatoma é o mais representativo da subfamília com 80 espécies descritas, as quais estão agrupadas em oito complexos e oito subcomplexos, sendo essa classificação baseada principalmente em características morfológicas. Triatoma rubravaria é considerado um importante vetor na transmissão da doença de Chagas no Estado do Rio Grande do Sul, uma vez que houve um aumento de sua captura e encontros de colônias intradomiciliares após o programa de combate ao T. infestans. Possui hábitos rupestres e é encontrado em buracos e fendas de locais pedregosos, juntamente com T. carcavalloi, T. circummaculata e T.klugi, os quais mostram semelhanças morfológicas. Marcadores moleculares pertencentes ao DNA nuclear, como os espaçadores internos transcritos (ITS) apresentam uma evolução mais rápida, permitindo estabelecer relações recentes ao passo que a grande subunidade ribossomal 28S (D2), por ser bem conservado, permite estabelecer relação entre organismos distantemente relacionados. Marcadores mitocondriais (Citocromo B - CytB e Citocromo Oxidase I - COI) apresentam taxa de mudança dez vezes mais rápida que aquelas apresentadas pelo DNA nuclear, sendo, portanto, úteis para estabelecer relações filogenéticas entre organismos que divergiram recentemente. A análise Bayesiana por meio de sequencias pertecentes ao mtDNA (CytB e COI) reafirmam o posicionamento de espécies no subcomplexo rubrovaria e indica T. carcavalloi como espécie irmã do grupo formado por T. klugi + T. rubrovaria + T. circummaculata. A análise bayesiana de seis populações de T. rubrovaria mostrou a população coletada em Canguçu isolada das demais, sugerindo que se trata de espécie críptica. / The subfamily Triatominae comprises 146 species grouped in 18 genera and five tribes. The genus Triatoma is the most representative subfamily with 80 described species, which are grouped into eight complex and eight subcomplexes and this classification being based primarily on morphological characteristics. Triatoma rubravaria is considered an important vector in the transmission of Chagas disease in the state of Rio Grande do Sul since it was detected an increase of their capture and meetings colonies household after the program to combat of T. infestans. T. rubrovaria is found in groves and crevices of rocky areas within T. carcavalloi, T. circummaculata and T.klugi, which show morphological similarities. Molecular markers belonging to the nuclear DNA, as the internal transcribed spacers (ITS) have more rapid evolution, establishing recent relationships while the large ribosomal subunit 28S (D2), being well maintained, allows establishing the relationship between distantly related organisms. Mitochondrial markers (Cytochrome B - CytB and Cytochrome Oxidase I - COI) present a rate of change ten times faster than those presented by nuclear DNA, and are therefore useful for establishing phylogenetic relationships between organisms that diverged recently. A Bayesian analysis using mtDNA sequences belonging to (CytB and COI) reaffirmed the positioning of the species and indicates subcomplex rubrovaria and indicates T. carcavalloi as sister species from the group of T. klugi + T. rubrovaria + T. circummaculata. A Bayesian analysis of six populations of T. rubrovaria showed the population collected in Canguçu isolated from the others, suggesting that they are cryptic species. / FAPESP: 09/52236-2

Orientador : João Aristeu da Rosa / Banca: Maria Tercília Vilela de Azeredo Oliveira / Banca: José Clóvis do Prado Júnior / Banca: Marcos Takashi Obara / Banca: Carlos Eduardo de Almeida / Resumo: A subfamila Triatominae compreende 146 espécies, agrupadas em 18 gêneros e cinco tribos. O gênero Triatoma é o mais representativo da subfamília com 80 espécies descritas, as quais estão agrupadas em oito complexos e oito subcomplexos, sendo essa classificação baseada principalmente em características morfológicas. Triatoma rubravaria é considerado um importante vetor na transmissão da doença de Chagas no Estado do Rio Grande do Sul, uma vez que houve um aumento de sua captura e encontros de colônias intradomiciliares após o programa de combate ao T. infestans. Possui hábitos rupestres e é encontrado em buracos e fendas de locais pedregosos, juntamente com T. carcavalloi, T. circummaculata e T.klugi, os quais mostram semelhanças morfológicas. Marcadores moleculares pertencentes ao DNA nuclear, como os espaçadores internos transcritos (ITS) apresentam uma evolução mais rápida, permitindo estabelecer relações recentes ao passo que a grande subunidade ribossomal 28S (D2), por ser bem conservado, permite estabelecer relação entre organismos distantemente relacionados. Marcadores mitocondriais (Citocromo B - CytB e Citocromo Oxidase I - COI) apresentam taxa de mudança dez vezes mais rápida que aquelas apresentadas pelo DNA nuclear, sendo, portanto, úteis para estabelecer relações filogenéticas entre organismos que divergiram recentemente. A análise Bayesiana por meio de sequencias pertecentes ao mtDNA (CytB e COI) reafirmam o posicionamento de espécies no subcomplexo rubrovaria e indica T. carcavalloi como espécie irmã do grupo formado por T. klugi + T. rubrovaria + T. circummaculata. A análise bayesiana de seis populações de T. rubrovaria mostrou a população coletada em Canguçu isolada das demais, sugerindo que se trata de espécie críptica. / Abstract: The subfamily Triatominae comprises 146 species grouped in 18 genera and five tribes. The genus Triatoma is the most representative subfamily with 80 described species, which are grouped into eight complex and eight subcomplexes and this classification being based primarily on morphological characteristics. Triatoma rubravaria is considered an important vector in the transmission of Chagas disease in the state of Rio Grande do Sul since it was detected an increase of their capture and meetings colonies household after the program to combat of T. infestans. T. rubrovaria is found in groves and crevices of rocky areas within T. carcavalloi, T. circummaculata and T.klugi, which show morphological similarities. Molecular markers belonging to the nuclear DNA, as the internal transcribed spacers (ITS) have more rapid evolution, establishing recent relationships while the large ribosomal subunit 28S (D2), being well maintained, allows establishing the relationship between distantly related organisms. Mitochondrial markers (Cytochrome B - CytB and Cytochrome Oxidase I - COI) present a rate of change ten times faster than those presented by nuclear DNA, and are therefore useful for establishing phylogenetic relationships between organisms that diverged recently. A Bayesian analysis using mtDNA sequences belonging to (CytB and COI) reaffirmed the positioning of the species and indicates subcomplex rubrovaria and indicates T. carcavalloi as sister species from the group of T. klugi + T. rubrovaria + T. circummaculata. A Bayesian analysis of six populations of T. rubrovaria showed the population collected in Canguçu isolated from the others, suggesting that they are cryptic species. / Doutor

Orientador: Reinaldo José da Silva / Banca: Lucia Helena O'Dwyer de Oliveira / Banca: Mônica Regina Vendrame Amarante / Resumo: O presente estudo relata a ocorrência de helmintos na espécie exótica Tupinambis merianae, e nas espécies endêmicas Trachylepis atlantica e Amphisbaena ridleyi procedentes do arquipélago de Fernando de Noronha, Estado do Pernambuco, Brasil. Ao todo nove espécies de helmintos foram identificadas, principalmente, no trato digestivo e órgãos acessórios, com as seguintes prevalências (P) e intensidade média de infecção (IMI): T. merianae - Diaphanocephalus galeatus (P=96%; IMI=20,5), Spinicauda spinicauda (P=100%; IMI=197,8) e Oochoristica iguanae (P=20%; IMI=4,4); T. atlantica - Moaciria alvarengai (P=20%; IMI=1,0), S. spinicauda (P=92%; IMI=22,1), Mesocoelium monas (P=4%; IMI=3,0), Platynosomum sp. (P=8%; IMI=7,0) e Oochoristica travassosi (P=24%; IMI=1,7); e A. ridleyi - Aplectana albae (P= 96%; IMI= 143,4), Thelandros alvarengai (P=8%; IMI=1,0), M. monas (P=44%; IMI=2,8), Platynosomum sp. (P=36%; IMI= 13,8) e Oochoristica travassosi (P=56%; IMI=2,6). Em T. merianae foi observado que mais de 80% dos animais possuíam associação entre duas espécies de helmintos. Em T. atlântica o parasitismo foi monoespecífico em 50% dos animais, mas a associação entre dois parasitas também foi alta (41.7%). Em A. ridleyi houve maior dispersão de associação, foi observado desde parasitismo monoespecífico até associação entre 5 parasitas. A helmintofauna observada neste trabalho permite concluir que helmintos podem ser carreados com seus hospedeiros quando introduzidos numa nova localidade, e também que os helmintos introduzidos podem infectar os animais endêmicos dessa nova localidade. / Abstract: This study reports the occurrence of helminths in the introduced specie Tupinambis merianae, and in the endemic species Trachylepis atlantica and Amphisbaena ridleyi from Fernando de Noronha archipelago, State of Pernambuco, Brazil. Nine species of helminths were found mainly in the digestive tract and accessory organs, with the follow prevalence (P) and mean infection intensity (MII): T. merianae - Diaphanocephalus galeatus (P=96%, IMI=20.5), Spinicauda spinicauda (P=100%, IMI=197.8) and Oochoristica iguanae (P=20%, MII=4.4); T. atlantica - Moaciria alvarengai (P=20%, MII=1.0), S. spinicauda (P=92%, MII=22.1), Mesocoelium monas (P=4%, MII=3.0), Platynosomum sp. (P=8%, MII=7.0) and Oochoristica travassosi (24%, MII=1.7); and A. ridleyi - Aplectana albae (P= 96%, MII= 143.4), Thelandros alvarengai (P=8%, MII=1.0), M. monas (P=44%, MII=2.8), Platynosomum sp. (P=36%; MII= 13.8) and O. travassosi (P=56%; MII=2.6). In T. merianae was observed that more than 80% of the animals had association between 2 helminth species. In species T. atlantica the parasitism was monospecific in 50% of specimens, but association between 2 parasites also was high (41.7%). In A. ridleyi there was greater dispersion of association, and monospecific parasitism until association among 5 parasites were observed. The helminth fauna observed allowed to conclude that helminthes can be carried together with their host when they are introduced in a new geographical place and also that these introduced helminthes can infect endemic or native hosts. / Mestre

Orientadora : Profª. Drª. Larissa M. Alvarenga / Coorientador : Profª. Drª. Andrea E. M. Stinghen e Profª. Drª. Juliana F. de Moura / Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciencias Biológicas (Microbiologia, Parasitologia e Patologia Básica). Defesa: Curitiba, 08/04/2016 / Inclui referências : f. 65-73 / Área de concentração: Patologia / Resumo: Os produtos finais de glicação avançada (AGEs) são um grupo heterogêneo de moléculas que se acumulam no plasma e tecidos em diversas condições clínicas, tais como envelhecimento, diabetes e falência renal. Evidências crescentes apontam tais moléculas como toxinas urêmicas as quais são efetoras no processo fisiopatológico de complicações vasculares e renais, em virtude de sua capacidade de modificar de forma irreversível as propriedades químicas e funcionais de uma série de moléculas, entre elas as proteínas. Existem atualmente mais de 20 tipos de AGEs descritos, metilglioxal, N-carboximetillisina (CML) e pentosidina os melhores caracterizados até o momento, e que servem como marcadores de acúmulo de AGEs em uma ampla gama de tecidos, sendo a CML o domínio antigênico mais abundante e melhor caracterizado. O presente estudo teve como objetivo produzir e caracterizar anticorpos monoclonais anti-CML para uso na confecção de ensaios que possam detectar e quantificar essa toxina em fluídos biológicos e aplicação desta ferramenta no entendimento das vias de sinalização envolvidas com a progressão da Doença Renal Crônica (DRC). Para tanto, três diferentes moléculas protéicas carreadoras foram modificadas por glicação: hemocianina de molusco (KLH), soro albumina bovina (BSA) e soro albumina humana (HSA); caracterizadas por eletroforese e espectrometria de massa. As moléculas glicadas foram usadas como imunógenos em camundongos Balb-c para produzir anticorpos policlonais e monoclonais epítopo-específico capazes de reconhecerem o domínio CML. Sete clones e quatorze subclones foram obtidos e testados frente ao CML e respectivos controles. Dentre os subclones, o anticorpo monoclonal mAb 2D6G2, foi selecionado com base nos ensaios de especificidade para melhor caracterização e empregado na detecção de CML. Para validação dos anticorpos produzidos foram utilizados soros de pacientes em diferentes estágios de DRC. Posteriormente, diferentes condições como variação nas concentrações de antígenos, anticorpos e diluições dos soros foram avaliadas a fim de padronizar um teste de ELISA competitivo capaz de detectar e quantificar CML em soro. Os resultados obtidos permitiram correlacionar concentração de CML nos soros com os diferentes estágios da doença. Além disso, o mAb 2D6G2, foi empregado em ensaios in vitro em células THP-1 com intuito de avaliar a interação de CML-HSA no ambiente celular. Nossos resultados demonstram a eficiência do anticorpo produzido, e abrem novas perspectivas para o emprego de tais anticorpos como bioferramenta na detecção, quantificação e entendimento dos mecanismos celulares e moleculares envolvidos na toxicidade urêmica relacionada a DRC. . Palavras chave: Doença renal crônica, toxinas urêmicas, AGEs, CML, anticorpo monoclonal. / Abstract: The advanced glycation end products (AGEs) are a heterogeneous group of molecules that accumulate in the plasma and tissues in several clinical conditions such as aging, diabetes and renal failure. These molecules have been show to act as uremic toxins and effectors in the pathophysiological vascular damage and renal complications, because of their ability to modify irreversibly chemical and functional properties of a number of molecules, among them proteins. Currently over 20 types of AGEs are described, including: methylglyoxal, N-carboxymethyllysine (CML) and, pentosidine, and they function as AGEs accumulation biomarkers widely used in several tissues, being CML the major antigenic domain. This work aimed the production and characterization anti-CML monoclonal antibodies for detection and quantification of this toxin in biological fluids. In addition this antibody may be used as a tool to investigate the signaling pathways involved in the CKD progression. Thus, three carrier proteins were modified by glycation: keyhole limpet hemocyanin (KLH), bovine serum albumin (BSA) and human serum albumin (HSA); characterized by gel electrophoresis and mass spectrometry. The glycated molecules were used in Balb-c as immunogens to have the production of epitope-specific polyclonal and monoclonal antibodies able to recognize CML. Fourteen hybridomas were obtained and tested against CML and their respective controls. Among the hybridomas, mAb 2D6G2 was selected based on specificity assays and employed for further CML toxin characterization and detection. Analysis of serum sample from patients who presented different CKD stages were used for validation of home-made antibody. Furthermore, different conditions of antigens and antibodies concentrations, and serum dilutions were evaluated to standardize a ELISA competitive test capable to detect and measure serum CML.The results allowed to correlate CML concentration in serum samples with the different CKD stages. Beside, mAb 2D6G2 was employed in vitro in order to assess CML-HSA interaction with THP-1 cells. These results demonstrate the efficiency of the antibody mAb 2D6G2, and our data open new avenues for the use antibodies as tools in the detection, quantification and understanding of the cellular and molecular mechanisms involved in uremic toxicity related to CKD. Key words: chronic kidney disease, uremic toxins, AGEs, CML, monoclonal antibody.

Orientadora : Profª Drª Edilene Alcântara de Castro / Co-orientadora : Profª Drª Adriana Oliveira Costa / Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciencias Biológicas (Microbiologia, Parasitologia e Patologia Básica). Defesa: Curitiba, 30/09/2014 / Inclui referências / Resumo: O protozoário Cryptosporidium pertence ao filo Apicomplexa. Possui capacidade de infectar todas as classes de vertebrados (aquáticos, aéreos, terrestres), inclusive o ser humano. Atualmente, são reconhecidas vinte e uma espécies de Cryptosporidium e aproximadamente 40 genótipos foram identificados. A infecção ocorre por meio da ingestão de oocistos liberados infectantes nas fezes dos hospedeiros. Algumas espécies apresentam potencial zoonótico, como C. parvum e C. meleagridis. Cryptosporidium causa diarreia, normalmente com cura espontânea, sendo mais grave em indivíduos imunodeprimidos ou portadores de doenças autoimunes. As coleções de água potável e de recreação são as principais fontes de infecção. Em países desenvolvidos faz-se o monitoramento da água, para consumo, distribuída à população, porém naqueles em desenvolvimento o mesmo não ocorre e a doença é considerada negligenciada. No mundo poucos trabalhos são encontrados tratando da prevalência e dinâmica da transmissão da criptosporidiose em zoológicos, os quais apresentam singularidades que facilitam este tipo de estudo, apesar do fato de os animais não estarem em seus habitats naturais. No Brasil, não existem estudos em zoológicos contemplando a detecção de Cryptosporidium em fezes de animais e nas águas dos lagos presentes nestes ambientes. O objetivo do presente trabalho foi verificar a presença de Cryptosporidium em fezes de aves e mamíferos e nas águas dos recintos e lagos do Zoológico Municipal de Curitiba. No período de março/2011 a dezembro/2011, 249 amostras fecais (121 de aves e 128 de mamíferos) foram coletadas e processadas para detecção, identificação morfológica e molecular. As fezes foram filtradas, sedimentadas e submetidas ao protocolo de purificação em solução saturada de NaCl. O material foi analisado por meio da técnica de Ziehl-Neelsen modificada e processado para extração de DNA e detecção por PCR e Nested PCR. Amostras de seis coleções aquáticas (três em cada coleção, N=18) também foram coletadas para análise. A água foi filtrada em membrana de acetato-celulose e o eluato obtido foi processado para a realização da técnica de coloração de Ziehl-Neelsen modificada, e detecção molecular do parasito por PCR e nested PCR, usando iniciadores para a região hiper-variada do gene 18SSU rDNA. Das amostras fecais analisadas, duas foram positivas para a coloração de Ziehl-Neelsen modificada sendo uma de ararajuba (Guaruba guarouba) e outra de papapagaio-de-cara-roxa (Amazona brasiliensis). A Nested PCR foi positiva nas duas amostras anteriores e em uma terceira, proveniente de outro papagaio-da-cara-roxa. O material de um quarto animal, um papagaio-de-peito-roxo (Amazona vinacea), também foi positivo na PCR de primeira etapa. Das coleções aquáticas amostradas uma apresentou positividade em duas das três amostras coletadas. O registro de Cryptosporidium nestas aves é o primeiro na literatura mundial. Os isolados obtidos foram sequenciados. A espécie C. galli foi identificada nas amostras provenientes de aves e C. parvum nas amostras provenientes de coleções aquáticas e para o controle de referência. Uma árvore filogenética utilizando análise Bayesiana foi construída e nela os isolados identificados ficaram em um mesmo ramo, com um bom suporte, já o controle ficou no mesmo grupo da sequência de C. parvum do GenBank. Estes resultados indicam similaridade dos isolados encontrados. Conclui-se que o presente trabalho poderá servir como subsídio para a ambientação dos recintos e para o manejo dos animais, principalmente no que se refere ao contato com as águas do ambiente para a saúde dos animais, dos trabalhadores e visitantes do zoológico, devido à identificação de uma espécie de potencial zoonótico C. parvum. Palavras-chave: Zoonoses; Saúde Pública; Animais Silvestres; protozoários. / Abstract: The Cryptosporidium protozoan belongs to the phylum Apicomplexa. It is capable of infecting all vertebrate classes (aquatic, aerial, and terrestrial), including humans. Currently, twenty one species of the genus Cryptosporidium are recognized, and approximately 40 genotypes were identified. Infection occurs through the ingestion of infected oocysts released in the feces of the hosts. Some species have zoonotic potential, such as C. parvum and C. meleagridis. Cryptosporidium causes diarrhea, usually with spontaneous cure, being more worrisome in immunocompromised individuals or patients with autoimmune diseases. The collections of drinking water and recreation are the main sources of infection. In developed countries the drinking water supplied to the population is monitored for this pathogen, however the same does not occur in developing countries where the disease is considered neglected. In the world few studies dealing with the prevalence and transmission dynamics of cryptosporidiosis in zoos are found. These spaces have singularities that facilitate this type of study, despite the fact that animals are not in their natural habitats. In Brazil, there are no studies in these environments contemplating cryptosporidiosis. This work aims to verify Cryptosporidium infection in captive birds and mammals, and also in the water bodies and pounds in the enclosures of the Municipal Zoo of Curitiba. From March 2011 to December 2011, 249 fecal samples, 121 birds and 128 mammals were collected and processed for morphological and molecular identification of Cryptosporidium. Feces were filtered, pelleted and subjected to the purification protocol in saturated NaCl solution. Samples were analyzed following Ziehl-Neelsen modified technique, and processed for DNA extraction and detection by PCR and Nested PCR. Water samples from six sites (three in each site, N=18) were also collected for analysis. The water was filtered through a cellulose-acetate membrane and the eluate obtained was processed by Ziehl-Neelsen modified technique, followed by the molecular detection through PCR and Nested PCR, using primers for the hyper-diverse region of the rDNA gene 18SSU. Two fecal samples were positive on microscopy for Cryptosporidium: one from Golden Parakeet (Guaruba guarouba) and other from Red-tailed Amazon (Amazona brasiliensis). The Nested PCR was positive for the two previous samples and also in a third from another Red-tailed Amazon. The material of a fourth animal, Vinaceous Amazon (Amazona vinacea), was also positive in PCR first step. For the water collection, one was positive in two of the three samples. The record of Cryptosporidium in these birds is the first in the world literature. The isolates obtained were sequenced. The species C. galli was identified for isolates from birds and C. parvum isolate derived for the collection of water and the control reference. A phylogenetic tree was constructed using Bayesian analysis, where the isolates identified in this study clustered in the same branch, with good support, since the control group was the same sequence of C. parvum from GenBank. These results indicate similarity of isolates found. We conclude that this study can serve as input to the ambiance of the grounds and for the handling of animals, especially with regard to contact with the waters of the environment for the animals' health, workers and visitors to the zoo, due to identifying a kind of C. parvum zoonotic potential. Keywords: Zoonoses, Public Health; Wild Animals; Protozoa.

Resumo: Os helmintos gastrintestinais de bovinos têm sido relatados como um problema na produção animal no Brasil e no mundo. O uso de anti-helmínticos no controle de endoparasitoses é uma prática comum, porém, essa utilização de forma indiscriminada pode causar efeitos negativos como o seleção de parasitos resistentes a drogas. O problema da resistência parasitária é mundial e, no Brasil, esse fenômeno tem ocorrido em muitos estados principalmente em Cooperia sp. e Haemonchus sp. Estudos em pequenos ruminantes sobre a tentativa de reversão da resistência têm crescido nos últimos anos, porém, em bovinos essa prática ainda carece de investigações. Novas metodologias têm sido estudadas para controlar as endoparasitoses como o uso de extratos vegetais. O objetivo do presente estudo foi avaliar in vitro por meio do teste de eclodibilidade de ovos (TEO) e do teste de migração de larvas em ágar (TMLA) a atividade dos óleos essenciais de Eucalyptus staigeriana, Carapa guianensis, Cymbopogon martinii, Cymbopogon schoenanthus e Mentha piperita sobre nematódeos gastrintestinais de bovinos. Detectou-se efeito ovicida para E. staigeriana, C. martinii, C. schoenanthus e M. piperita com as respectivas doses de 1,04; 0,22; 0,26 e 0,43 mg/mL que inibiram 50% da eclodibilidade (DL50). Efeito larvicida foi detectado em C. martinii, C. schoenanthus e M. piperita com DL50 de 17,47; 12,29 e 16,82 mg/mL. A cromatografia gasosa dos óleos essenciais revelou a presença de terpenos como o limoneno, geranial e neral para E. staigeriana, geraniol para C. martinii, geraniol, geranial e neral para C. schoenanthus e mentol para M. piperita. O óleo de Carapa guianensis apresentou ácidos graxos oleico e palmítico como principais constituintes. Testes de atividade antiproliferativa em células tumorais e normais humanas resultaram em baixa toxicidade dos óleos sugerindo uma possível segurança no uso in vivo, porém, testes de toxicidade em cobaias devem ser realizados. Conclui-se que os óleos essenciais de Eucalyptus staigeriana, Cymbopogom martinii, C. schoenanthus e Mentha piperita são candidatos no controle de helmintos gastrintestinais de bovinos.