Xanthomonas axonopodis pv. manihotis (Xam) est une bactérie à gram négatif causant le Cassava Bacterial Blight (CBB) sur Manihot esculenta Crantz. Le manioc représente une des sources les plus importantes de carbohydrates pour près d'un milliard de personnes sur terre et une source importante d'énergie du fait de sa forte concentration en amidon. Le CBB constitue une limitation importante à la production massive de manioc et nos connaissances sur cette maladie sont encore insuffisantes. La pathogénie de nombreuses phytobactéries dépend de l'injection d'effecteurs de type III via un système de sécrétion de type III dans la cellule eucaryote hôte Parmi tous les effecteurs référencés aujourd'hui, les effecteurs de type TAL pour Transcription Activator-Like sont particulièrement intéressant. Une fois injectés dans la cellule végétale, les effecteurs TAL sont importés au noyau et y modulent l'expression de gènes cibles au bénéfice de la bactérie. Chez Xam, TALE1Xam est le seul gène de cette famille qui a été étudié au niveau fonctionnel. Cette étude a pour objectif majeur d'identifier les gènes de manioc dont l'expression est modifiée en présence de TALE1Xam. Le transcriptome de plantes de manioc inoculées avec XamΔTALE1Xam vs. XamΔTALE1Xam (TALE1Xam) a été analysé par RNAseq. Les données obtenues confrontées à la recherche bioinformatique de promoteurs de gènes potentiellement directement activés par TALE1Xam ont permis d'établir une liste de gènes ciblés par TALE1Xam candidats. Un candidat majeur ressort de cette analyse comme étant particulièrement intéressant, il s'agit d'un gène codant un facteur de transcription de type B3 régulant l'activité de protéines de type "Heat Shock". L'analyse fonctionnelle de ce candidat permettra de valider sa fonction en tant que gène de sensibilité du manioc à Xam. / Xanthomonas axonopodis pv. manihotis (Xam) is a gram negative bacteria causing the Cassava Bacterial Blight (CBB) in Manihot esculenta Crantz . Cassava represents one of the most important sources of carbohydrates for around one billion people around the world as well as a source of energy due to its high starch levels content. The CBB disease represents an important limitation for cassava massive production and little is known about this pathosystem. Bacterial pathogenicity often relies on the injection in eucaryotic host cells of effector proteins via a type III secretion system (TTSS). Between all the type III effectors described up to now, Transcription Activator-Like Type III effectors (TALE) appear as particularly interesting. Once injected into the plant cell, TAL effectors go into the nucleus cell and modulate the expression of target host genes to the benefit of the invading bacteria by interacting directly with plant DNA. In Xam, only one gene belonging to this family has been functionally studied so far. It consists on TALE1xam. This work aim to identify cassava genes whose expression will be modified upon the presence of TALE1xam. By means of cassava plants challenged with Xam Δ TALE1xam vs. Xam + TALE1xam together with the TAL effectors code, statistical analyses between RNAseq experiments and a microarray containing 5700 cassava genes, we seek out direct TALE1xam target genes. Hence, through transcriptomic, functional qRT validation and specific artificial TALEs design we proposed that TALE1xam is potentially interacting with a Heat Shock Transcription Factor B3. Moreover we argue that this gene is responsible of the susceptibility during Xam infection. Furthermore this work represents the first complete transcriptomic approach done in the cassava/Xam interaction and open enormous possibilities to understand and study CBB.

Le genre Rickettsia, sont des petites bactéries Gram-négatives et symbiotes intracellulaires obligatoires des eucaryotes. Les Rickettsia sont surtout connus pour leur pathogénicité et pour provoquer des maladies graves chez l'homme et les autres animaux. À ce jour, 26 espèces valides de Rickettsies ont été identifiées dans le monde entier, dont 20 sont des agents pathogènes éprouvées. Toutes les espèces de Rickettsies validées sont associées à des arthropodes. Les phylogénies basées sur divers marqueurs moléculaires ont présenté des topologies discordantes, avec seulement R. bellii et R. canadensis qui ne sont classées ni parmi la fièvre boutonneuse groupe rickettsies, ni parmi le typhus groupe rickettsies. En utilisant les méthodes avancées de séquençage de génomes entiers, nous avons obtenu et analysé quatre séquences génomiques de Rickettsies : R. helvetica, R. honei, R. australis et R. japonica. Via la phylogénomique qui constitue une nouvelle stratégie permettant de mieux comprendre leur évolution, l'on remarque que ces micro-organismes ont subi une évolution génomique réduite au cours de spécialisation en intracellulaire. Plusieurs caractéristiques évolutives, comme le réarrangement des gènes, la réduction génomique, le transfert horizontal de gènes et l'acquisition d'ADN égoïste, ont formé les génomes Rickettsia d'aujourd'hui. Ces processus peuvent jouer un rôle important pour équilibrer la taille du génome afin de l'adapter au mode de vie intracellulaire. En outre, la pathogénicité des rickettsies peut être associée à la réduction génomique. / The Rickettsia genus is composed of small, Gram-negative, bacteria that are obligate intracellular eukaryotic symbionts. Members of the genus Rickettsia are best known for infecting and causing severe diseases in humans and other animals. To date, 26 valid Rickettsia species have been identified worldwide, including 20 that are proven pathogens. All validated Rickettsia species are associated to arthropods that act as vectors and/or reservoirs. The phylogenies based on various molecular markers have resulted in discrepant topologies, with R. bellii and R. canadensis being classified neither among spotted fever nor typhus group rickettsiae. In this thesis, using the advanced whole genomic sequencing methods, we have and analyzed the genomic sequences from four Rickettsia species, including R. helvetica, R. honei, R. australis and R. japonica. Phylogenomics constitute a new strategy to better understand their evolution. These microorganisms underwent a reductive genomic evolution during their specialization to their intracellular lifestyle. Several evolutive characteristics, such as gene rearrangement, reduction, horizontal gene transfer and aquisition of selfish DNA, have shaped Rickettsia genomes. These processes may play an important role in free-living bacteria for balancing the size of genome in order to adapt the intracellular life style. In addition, in contrast with the concept of bacteria becoming pathogens by acquisition of virulence factors, rickettsial pathogenecity may be linked to genomic reduction of metabolism and regulation pathways.

Un paradigme actuel en virologie est que les virus de plantes ne peuvent pas affecter les animaux vertébrés et ne sont pas pathogènes pour l'homme. Cependant, plusieurs éléments remettent en question ce paradigme. L'objectif de cette Thèse a été d'étudier si les tobamovirus peuvent être pathogènes chez l'homme. Ce manuscrit comprend :1) une revue de la littérature portant sur la présence et l'impact potentiel des virus de plantes chez les animaux dont l'homme. 2) une étude sur l'exposition humaine aux tobamovirus et les effets possibles Dans la région de Marseille, nous avons montré la présence du PMMoV dans 7.2% des selles de patients et dans 57 % des produits alimentaires à base de piment. De plus, la présence du PMMoV dans les selles de patients a pu être corrélée des signes cliniques. De plus, nous avons montré que le TMV infectieux était présent dans le tabac de toutes les cigarettes testées mais aussi dans 45 % des salives de fumeurs testées. 3) une étude in vivo. Suite à une inoculation intra-trachéal des souris avec du TMV, nous avons constaté que le virus persiste jusqu'à 14 jours dans le tissu pulmonaire et les macrophages pulmonaires. De plus, nous avons détecté du TMV dans le cytoplasme des macrophages murins jusqu'à 15 jours après inoculation. 4) une étude sur le mode de transmission du TMV à l'homme. Le TMV détecté dans la salive des fumeurs ne serait pas véhiculé par la fumée de cigarette, mais par contact avec du tabac infecté. Nos résultats suggèrent que la frontière entre virus de plantes et virus d'animaux n'est pas aussi stricte qu'il est communément admis et incitent à réévaluer l'éventuelle pathogénicité des phytovirus pour l'homme. / A current paradigm in virology is that plant viruses cannot affect vertebrates and are not pathogenic for humans. However, several recent findings challenge this paradigm. The aim of this thesis was to investigate whether tobamoviruses may be pathogenic in humans. This manuscript contains: 1) A review of the literature of the reasons why plant viruses may cross the border from plants to vertebrates and the possible impact of plant viruses in animals including humans. 2) A study on exposure to tobamovirus and possible effects of these viruses for humans. In the Marseille geographical area, we showed the presence PMMoV in 7.2% of stools from patients tested and in 57% of food products containing hot peppers. In addition, the presence of PMMoV in the stools of patients could be significantly correlated with clinical symptoms. Then, we showed that infectious TMV was present in the tobacco of all cigarettes tested and TMV RNA was detected in 45% of smokers' saliva tested. 3) In vivo study: mice intra-tracheal inoculation with TMV. The results showed the persistence until 14 days of viruses in the lung tissue and in lung alveolar macrophages of mice. In addition, we detected TMV in the cytoplasm of murine macrophages up to 15 days after inoculation. 4) A study of TMV transmission to humans through cigarette smoking. TMV does not seem to be vehicled by cigarette smoke to smoker's saliva but by direct contact with infected tobacco. Our results suggest that the boundary between plant viruses and animal viruses is not as strict as it is commonly accepted and prompt to reassess the potential pathogenicity of these plant viruses for humans.

O isolamento do vírus da raiva (genótipo 1) a partir de morcegos não hematófagos está se tornando cada vez mais freqüente nas grandes cidades do Brasil. Este trabalho foi delineado para investigar a patogenicidade de um isolado do vírus da raiva, do morcego insetívoro Lassiurus ega, procedente do município de Presidente Prudente SP, em comparação ao vírus fixo da raiva, amostra CVS/32 (Challenge Vírus Standard). Os vírus foram reativados por meio de inoculação intracerebral em camundongos e os experimentos de patogenicidade foram realizados em camundongos e hamsters, desafiando-os pelas vias intramuscular (IM), intradérmica (ID), intranasal (IN) e abrasão superficial da pele (AP). A presença do vírus nos cérebros de animais que haviam manifestado sinais compatíveis à raiva, foi confirmada mediante a prova de imunofluorescência direta. Foram considerados para a avaliação da patogenicidade o quadro clínico, proporção de mortos, e a duração dos períodos de incubação (PI) e clínicos (PC) em dias. Em hamsters, o isolado de L. ega exibiu um quadro furioso, com proporção total de mortos de 2.60%; assim discriminada: 2.08% IM (PI: 11 dias; PC: 6 dias) e 8.33% IN (PI:10.66 ± 1.15 e PC: 7.33 ± 1.54). A presença do vírus no SNC foi detectada apenas em animais inoculados por essas vias. Por outro lado, o vírus CVS produziu um quadro paralítico com mortalidade total de 39.84%, com a seguinte distribuição: 62.50% IM (PI 7.50 ± 2.33; PC: 5.13 ± 1.89) 78.12% ID (PI 9.13 ± 2.23; PC 3.88 ± 2.23) 18.75% IN (PI 12.00 ± 2.77; PC 7.14 ± 2.54). Em camundongos, o isolado do L. ega manifestou sinais de agressividade e a raiva foi confirmada em animais inoculados IM e IN. A proporção de mortos observados em camundongos foi de 50.00% (PI 16.80 ± 2.20; PC 1.4 ± 0.54) e 30% (PI 14 ± 4.35; PC: 2.66 ± 0.57) respectivamente e o vírus CVS produziu mortalidade de 45.00% (PI: 6.30 ± 0.67; PC: 1.5 ± 0.70), 70% (PI: 7.14 ± 1.34; PC 2.28 ± 1.25) e 30% (PI:10.00; PC:1) pelas vias mencionadas acima, com quadro clínico de paralisia. O isolado de L. ega mostrou diferenças na proporção de mortos e quadro clínico furioso quando comparado com o CVS nos dois modelos animais. Os resultados sugerem que o contato com os morcegos insetívoros infectados pelo vírus da raiva representa um risco de transmissão da doença, por meio de ferimentos superficiais da pele provocadas pelas mordeduras ou ainda pela via respiratória, supostamente por meio de aerossóis. Pelo sequenciamento completo da proteína G viral do isolado do L. ega, foram observadas substituições na seqüência de aminoácidos nos sítios antigênicos AI, AII, assim como no domínio de fusão dependente de baixo pH. Os resultados obtidos, sugerem que as diferenças no comportamento biológico podem estar associadas às substituições encontradas na sequencia de aminoácidos da proteína G. / The isolation of rabies virus (genotype 1) from the non-hematophagous bats is becoming frequent in heavy urbanized areas in Brazil. This work intended to investigate the pathogenicity of a Brazilian rabies virus isolate from the insectivorous bat Lassiurus ega, from PresidentePrudente-SP, comparing with the CVS/32 (Challenge Virus Standard) fixed rabies virus strain. The viruses were reactivated through intracerebral inoculation into mice and the pathogenicity experiments were made in hamsters and mice, challenged by intramuscular (IM), intradermal (ID) and intranasal (IN) routes and by superficial abrasion of skin. The presence of virus in the brain of animals manifesting the signs compatible with rabies was confirmed by the direct immunofluorescence test. For the evaluation of the pathogenicity, the clinical manifestations, incubation (IP) and clinical (CP) periods in days and the mortality were considered. In hamsters, the isolate of L. ega exhibited a furious form of rabies with total mortality rate of 2.60%, with following distribution: 2.08% IM (IP: 11 days; CP: 6 days) and 8.33% IN (IP: 10.66 ± 1.15 and PC: 7.33 ± 1.54). The presence of rabies virus in the CNS was detected only in animals inoculated through IM and IN routes. The CVS strain has provoked paralytic disease with a total mortality rate of 39.84% as the follow: 62.50% IM (IP 7.50 ± 2.33; CP: 5.13 ± 1.89), 78.12% ID (IP 9.13 ± 2.23; CP 3.88 ± 2.23) and 18.75% IN (IP 12.00 ± 2.77; CP 7.14 ± 2.54). In mice, the isolate of L. ega manifested signs of aggressiveness and rabies was confirmed in animals that were inoculated intramuscularly and intranasally. The total mortality rate observed in mice was 20%, by the IM route was 50% (IP 16.80 ± 2.20; CP 1.4 ± 0.54) and 30% by the intranasal route (IP 14.00 ± 4.35; CP: 2.66 ± 0.57) respectively. The CVS strain showed a total mortality rate of 45.00% and by the IM route, 100% (PI: 6.30 ± 0.67; CP: 1.5 ± 0.70), by the ID route, 70% (IP: 7.14 ± 1.34; CP 2.28 ± 1.25) and by IN, 30% (IP: 10, 00; C: 1.00) showing signs of paralysis. Compared to the CVS strain, the isolate of L. ega showed difference in mortality rate and signs of aggressiveness were found both in hamster and mouse model. The results suggest that the contact with the insectivorous bats infected with rabies virus would represent a risk of disease transmission, by means of superficial wounds of the skin inflicted by bites or by inhalation of aerosols. By the complete sequencing of the viral G protein of the isolate of L. ega, sequencings of amino acids substitutions were observed at antigenic sites AI, AII, as well as the in domain of fusion dependent on low pH. According to the results, differences in the biological behavior may be associated to the substitutions found in the amino acids sequence of the G protein.

Xylella fastidiosa é o agente etiológico de diversas doenças em plantas, incluindo a Clorose Variegada dos Citros (CVC), uma séria ameaça à indústria citrícola. Os níveis de transcritos sob diferentes disponibilidades de ferro foram medidos com microarranjos de DNA representando 2608 (91,6%) sequências codificadoras (CDS) da cepa 9a5c de X. fastidiosa. Na presença de 100 uM pirofosfato férrico, 218 e 256 CDS foram consideradas como reguladas positiva e negativamente, respectivamente. Quando tratada com o quelante de ferro 2,2\'-dipiridil, 193 CDS foram consideradas como reguladas positivamente e 216 negativamente. A expressão diferencial de um subconjunto de 44 CDS foi também avaliada por RT-qPCR, que mostrou uma correlação de Pearson de 0,77 com os resultados dos microarranjos. As CDS diferencialmente expressas nas variações de concentração de ferro participam em diversas funções celulares. Muitas CDS envolvidas com funções regulatórias, patogenicidade e estrutura celular foram moduladas em ambas as condições testadas, sugerindo que grandes mudanças na arquitetura celular e metabolismo ocorrem quando células de X. fastidiosa são expostas a variações extremas na concentração de ferro. Interessantemente, as CDS moduladas incluem as de síntese e secreção de bacteriocinas similares à colicina tipo V e funções ligadas a formação de pilus e fímbria. Nós também investigamos a contribuição do regulador transcricional Fur no stimulon do ferro em X. fastidiosa. Para tal, as regiões promotoras do genoma da cepa 9a5c foram varridas em busca de Fur boxes putativas. Nossas análises identificaram que regiões promotoras de 49 CDS contem elementos com características de Fur boxes. A funcionalidade de pelo menos uma das Fur boxes identificadas foi confirmada através de ensaios de alteração de mobilidade eletroforética que demonstraram sua interação específica com a proteína recombinante Fur de X. fastidiosa. Entretanto, nem todos os genes cuja expressão é modulada por alterações na concentração de ferro, são diretamente regulados por Fur, apoiando a hipótese de que Fur não é o único responsável pela modulação do stimulon de ferro em X. fastidiosa. Em conjunto, nossos dados apresentam novas evidências da relação entre a disponibilidade de ferro e a regulação de determinantes de patogenicidade e virulência em X. fastidiosa. / Xylella fastidiosa is the etiologic agent of a wide range of plant diseases including citrus variegated chlorosis (CVC), a major threat to citrus industry. Transcript levels in different iron availabilities were assessed with DNA microarrays representing 2608 (91.6%) coding sequences (CDS) of X. fastidiosa CVC strain 9a5c. In the presence of 100 uM of ferric pyrophosphate, 218 and 256 CDS were considered as up- and down-regulated, respectively. When treated with the iron chelator 2,2\'-dipyridyl, 193 CDS were considered as up-regulated and 216 as down-regulated. Differential expression for a subset of 44 CDS was further evaluated by RT-qPCR that showed a Pearson correlation of 0.77 with array results. The CDS differentially expressed upon the iron concentration shift participate in diverse cellular functions. Many CDS involved with regulatory functions, pathogenicity and cell structure, were modulated in both conditions tested suggesting that major changes in cell architecture and metabolism occur when X. fastidiosa cells are exposed to extreme variations in iron concentration. Interestingly, the modulated CDS include those related to colicin V-like bacteriocin synthesis and secretion and to pili/fimbriae functions. We also investigated the contribution of the ferric uptake regulator Fur to the iron stimulon of X. fastidiosa. Thus, the promoter regions of strain 9a5c genome were screened for putative Fur boxes. Our analyses identified Fur boxes-like elements in promoter regions of 49 CDS. The functionality of at least one Fur box was confirmed by electrophoretic mobility shift assays which demonstrated its interaction with X. fastidiosa recombinant Fur. However, not all genes that appeared to be modulated by iron concentration shift are directly regulated by Fur. This supports the hypothesis that Fur is not solely responsible for the modulation of the iron stimulon of X. fastidiosa. Taken together, our data present novel evidence for iron regulation of pathogenicity and virulence determinants in X. fastidiosa.

Leptospirose é uma zoonose mundial que causa grandes prejuízos econômicos e sociais. Os mecanismos de patogenicidade da leptospira ainda não estão totalmente elucidados. Nesse trabalho foi avaliado o papel de três proteínas hipotéticas de superfície na patogenia da leptospirose: LIC11009, LIC11360 e LIC11975. Os genes foram clonados a partir do DNA da L. interrogans sorovar Copenhageni e as proteínas recombinantes foram purificadas por cromatografia de afinidade. RT-qPCR mostrou a transcrição dos genes em leptospiras. As proteínas recombinantes reagiram com soro de humanos diagnosticados com leptospirose. rLIC11009 induziu somente resposta imune Th1 em camundongos, enquanto que rLIC11360 e rLIC11975 induziram resposta Th1 e Th2. As três proteínas recombinantes se ligaram à laminina e plasminogênio, enquanto rLIC11360 e rLIC11975 também se ligaram à fibronectina plasmática e fibrinogênio. Em adição, rLIC11360 se ligou ainda aos reguladores do sistema complemento fator H e C4BP. Os resultados sugerem que as proteínas estudadas podem auxiliar a leptospira a evadir e invadir o hospedeiro. / Leptospirosis is a worldwide zoonosis that causes great economic and social losses. The pathogenic mechanisms of leptospira are not yet fully elucidated. In this study we evaluated the role of three hypothetical surface proteins in the leptospiral pathogenesis: LIC11009, LIC11360 and LIC11975. Genes were cloned from DNA of L. interrogans serovar Copenhageni and the recombinant proteins were purified by affinity chromatography. RT - qPCR data have shown that the genes are fully transcribed in leptospires. Recombinant proteins reacted with sera from humans diagnosed with leptospirosis. rLIC11009 induced Th1 immune response in mice, whereas rLIC11360 and rLIC11975 promoted both Th1 and Th2. The three recombinant proteins interacted with laminin and plasminogen while, rLIC11360 and rLIC11975, also interacted with plasma fibronectin and fibrinogen. In addition, rLIC11360 interacted with the complement regulators factor H and C4BP. These results suggest that the proteins tested can help leptospires to evade and invade the host.

Hipercolesterolemia familiar (HF) é uma doença autossômica dominante, caracterizada por elevados níveis plasmáticos da lipoproteína de baixa densidade (LDL), desenvolvimento de xantoma tendíneo e arco corneal, além do aumento do risco de doença coronariana e acidente vascular cerebral prematuros. Frequentemente subdiagnosticada, estima-se que apenas 10% dos 400.000 indivíduos com HF no Brasil têm conhecimento da própria doença; afetando, desta forma, a qualidade e a expetativa de vida dos pacientes. Mutações no gene do receptor da LDL (LDLR) são consideradas as alterações genéticas mais frequentes para o desenvolvimento da hipercolesterolemia familiar, pois comprometem a capacidade de remoção das partículas de LDL circulantes, promovendo seu aumento em níveis plasmáticos. Já foram descritas mais de 1600 mutações diferentes no gene LDLR associadas ao fenótipo da HF; entretanto, ainda é difícil determinar em muitas delas o efeito deletério na atividade do receptor. O objetivo desse estudo foi identificar e caracterizar funcionalmente mutações no gene LDLR não descritas na literatura para determinar sua patogenicidade na hipercolesterolemia familiar. Foi avaliada a atividade residual de LDLR através da captação de LDL marcado com fluoróforo lipofílico em cultura de linfócitos T dos pacientes portadores das mutações analisadas após estimulação dos linfócitos T por mitógenos específicos. As mutações Cys82Ser, Thr404Ser, Gly529Arg e His285Tyr foram consideradas patogênicas por acarretarem diminuição da atividade residual do receptor de LDL. As mutações Glu 602X e His388ProfsX53 confirmaram sua patogenicidade e podem ser considerados como controle positivo para futuros ensaios funcionais. Estudos que esclareçam os mecanismos moleculares da HF e da relação genótipo/fenótipo abrem perspectivas para o desenvolvimento de terapias mais específicas na redução dos níveis de colesterol e, consequentemente, da morbidade e mortalidade associadas às doenças cardiovasculares. / Familial hypercholesterolemia (FH) is an autosomal dominant disorder characterized by elevated plasma levels of low-density lipoprotein (LDL), and development of corneal arcus tendinous xanthoma, and increased risk of coronary heart disease and premature stroke. Often misdiagnosed, it is estimated that only 10% of the 400.000 patients with FH in Brazil has knowledge of the disease itself, affecting in this way the quality and life expectancy of patients. Mutations in the LDL receptor (LDLR) are considered the most frequent genetic alterations for the development of familial hypercholesterolemia because compromise the ability of removal of circulating LDL particles, promoting its increase in plasma levels. Have been described over 1600 different mutations in the LDLR gene associated with the phenotype of FH, however, it is still difficult to determine in many of the deleterious effects on receptor activity. The aim of this study was to identify mutations in the LDLR gene and functionally characterize mutations not described in the literature to determine its pathogenicity in familial hypercholesterolemia. The residual activity of LDLR was evaluated by raising LDL labeled with lipophilic fluorophore in cultured T lymphocytes of patients with the analyzed mutations after stimulation of T lymphocytes by specific mitogen. The substitution mutations Cys82Ser, Thr404Ser, Gly529Arg e His285Tyr were considered pathogenic because it causes decrease of the residual activity of the LDL receptor in T lymphocytes. The His388ProfsX53 and Glu602X mutations confirmed their pathogenicity and can be considered as positive control for future functional assays. Studies to clarify the molecular mechanisms of HF and genotype/ phenotype open perspectives for the development of more specific therapies for reducing cholesterol levels, and therefore the morbidity and mortality associated with cardiovascular diseases.

A leptospirose é uma zoonose disseminada mundialmente, causada por bactérias do gênero Leptospira. A melhor maneira de contornar o problema é por de medidas preventivas, já que a contenção da proliferação de roedores é inviável e não há vacina eficaz disponível. Estratégias de genômica funcional têm identificado um grande número de proteínas a serem estudadas. Esse fato aliado a dados da literatura, que identificaram proteínas envolvidas na patogenicidade e que são expressas somente em condição de virulência, levou à proposição da utilização da proteômica para canalizar os estudos. A metodologia envolveu obtenção de extratos protéicos de leptospiras retiradas de animais infectados, sua separação por gel bidimensional, e identificação dos spots por espectrometria de massas. O objetivo central foi a identificação de proteínas expressas em bactérias virulentas e ausentes nas não-virulentas. A identificação dessas proteínas pode facilitar a busca de proteínas envolvidas na virulência e infecção da leptospirose. Adicionalmente, é um avanço no esclarecimento da biologia e patogenicidade das leptospiras, bem como para o reconhecimento de candidatos potenciais para a composição de vacinas e/ou métodos diagnósticos mais eficientes. / Leptospirosis, one of the most spread zoonosis worldwide, is caused by bacteria of the genus Leptospira. Preventive measures are the best way to control the disease due to the difficulty to impair the proliferation of rodents and because no efficient vaccine is currently available. Functional genomics strategies have pointed a large number of proteins that could be important immunogens. This fact allied to published data reporting the identification of proteins involved in pathogenesis that are expressed only in virulent strains, led us to propose the use of proteomics as a tool to narrow down these studies. The methodology involved the preparation of protein extracts from tissuederived leptospires, separation by two-dimensional gel and identification of the spots by mass spectrometry. The central objective was to identify proteins expressed only in virulent bacteria. The identification of these proteins could help the search for proteins involved in virulence with a role during infection. Additionally, the data presented here represent a large step to clarify the biology and pathogenicity of leptospires, as well as the identification of potentially important vaccine candidates and/or proteins to compose more efficient diagnostic methods.

O cancro cítrico é considerado na atualidade uma das doenças mais perigosas e prejudiciais à citricultura brasileira e mundial, devido aos danos causados na produção e qualidade dos frutos, sendo a Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac) a bactéria fitopatogênica responsável por tais prejuízos. Nosso laboratório iniciou estudos de identificação e análise funcional das interações proteína-proteína de Xac envolvendo sistemas importantes para sua patogenicidade (Alegria et. al., 2004). Nosso objetivo principal foi o estudo funcional e fisiológico de interações já identificadas entre proteínas do sistema de secreção do tipo III (T3SS) da Xac. O foco de nossa pesquisa foi tentar desvendar a importância biológica, na patogenicidade de Xac, das interações proteína-proteína: HrpB2-HrcU; HpaA-HpaB-HrcV; HrpD6-HrpB1- HrpW. Com este intuito clonamos, expressamos e purificamos as proteínas recombinantes. Produzimos soros policlonais específicos contra cada uma das proteínas citadas acima. Estudamos a interação entre as proteínas in vitro por meio de técnicas como Far-Western Blot, Pull Down, fluorescência e dicroísmo circular. Outro enfoque do nosso trabalho foi monitorar a contribuição individual destas proteínas no desenvolvimento da doença in planta. Para isso produzimos cepas de Xac mutantes para os genes hrpB2, hrcU, hpaA, hpaB, hrpB1 e hrpG. Os nocautes não polares foram infiltrados em plantas de laranja pêra, assim como também as cepas de complementação correspondentes, e assim foi testada a habilidade de desenvolver o cancro cítrico e/ou reverter os sintomas da doença. Também foi monitorada a capacidade de multiplicação e sobrevida in planta das cepas Xac ΔhrpB2, ΔhrcU e ΔhpaB, assim como a secreção das proteínas HrpB2 e HpaA pelo T3SS de Xac. Estudamos com mais detalhe a possível função de HrpB2 no T3SS de Xac, desenvolvendo experimentos para determinar a região da proteína imprescindível para sua função permanecer inalterada. Realizamos mutações sítio dirigidas, a fim de introduzir códons de terminação em diferentes regiões da proteína e testar a habilidade desses fragmentos de reverter os sintomas da doença na planta. Monitoramos a capacidade de proteínas mutantes de reverter fenótipos de patogenicidade em citrus, ausentes na cepa Xac ΔhrpB2 e revertidos na cepa de complementação Xac ΔhrpB2+pUFR047_hrpB2. Desta maneira, determinamos que os últimos seis aminoácidos de HrpB2 estão envolvidos no desenvolvimento da/s função/ões em Xac. / Citrus canker, caused by the bacterial pathogen Xanthomonas axonopodis pv citri (Xac), is a disease with significant economic consequences for the Brazilian and global citrus industry due to reductions in production and fruit quality. Our laboratory has initiated studies for the identification and functional analysis of protein-protein interactions involving Xac systems involved in pathogenicity (Alegria et. al., 2004). One objective has been to study functional and physiological interactions between proteins that make up the Xac Type III secretion system (T3SS). The focus of the present study is to unravel the biological significance in Xac pathogenicity of the following previously identified protein-protein interactions: HrpB2-HrcU; HpaA-HpaBHrcV; HrpD6-HrpB1-HrpW. With therefore cloned, expressed and purified the above-mentioned recombinant proteins. Specific polyclonal serum were produced and interactions between the proteins were studied in vitro using a variety of methods, including Far-Western Blot, Pull Down, fluorescence and circular dichroism. To monitor the individual contribution of these proteins in disease development in planta, we produced mutant Xac strains in which the hrpB2, hrcU, hpaA, hpaB, hrpB1 and hrpG genes were disrupted. The nonpolar knockouts as well as the corresponding complementation strains were infiltrated into Citrus sensensis plants and the development of citrus canker symtoms and bacterial proliferation in planta was evaluated. We also evaluated the T3SS-dependent secretion of proteins HpaA and HrpB2 by these Xac mutant strains. Structure-function relationships of the HrpB2 protein were studied in more detail. We developed experiments to determine the region of the protein essential for its function. We produced a series of hrpB2 mutants which were used to complement the hrpB2 knockout strain and evaluated their abilities to reverse the symptoms of the disease in the plant. The results demonstrate that the last six amino acids HrpB2 are important for its function in the development of disease symptoms by Xac.

O fosfato inorgânico é um composto essencial por estar relacionado com diversos processos metabólicos e biossíntese de moléculas relevantes à sobrevivência celular. Em bactéria são conhecidos dois tipos principais de transportadores específicos de fosfato inorgânico, o sistema Pit, de baixa afinidade, e o sistema Pst de alta afinidade, um ABC transportador, ativado sob carência de fosfato extracelular. A interação deste sistema com a fisiologia e patogênese de Streptococcus mutans, o principal agente etiológico da cárie dental, foi estudada neste trabalho. Os genes que codificam o sistema Pst de S. mutans UA159, estão organizados em um óperon policistrônico (pstS, C1, C, B, smu.1134 e phoU). A análise das sequências de aminoácidos das proteínas do sistema Pst de S. mutans com ortólogos do gênero Streptococcus, demonstrou maior identidade com bactérias da cavidade oral. Análise de prevalência do gene pstS, que codifica a proteína ligadora, demonstrou conservação entre todas as cepas laboratoriais e clínicas avaliadas. A deleção de pstS reduziu a capacidade de incorporação de ortofosfato que se refletiu na diminuição da taxa de replicação celular em meios com diferentes concentrações de fosfato inorgânico. A mutação também reduziu a capacidade da bactéria em aderir à superfícies abióticas e diminuiu sua hidrofobicidade de superfície, além de aumentar a resistência intrínseca a ácido. No entanto, não houve alteração na eficiência de transformação bacteriana. Por fim, o gene pstS de S. mutans foi clonado, expresso e a proteína purificada utilizada para obter anticorpos que inibiram o crescimento de S. mutans in vitro. Deste modo, segere-se que o sistema Pst é relevante na fisiologia e patogênese de S. mutans. / Inorganic phosphate is an essential compound related to several metabolic process and biosynthesis of molecules relevant to cellular survival. Bacteria are known to posses two main types of specific inorganic phosphate transporters, the low-affinity Pit system, and the high affinity Pst system, an ABC transporter family constituent, activated by extracellular phosphate starvation. The aim of this work was to study the role of Pst system in physiology and pathogenesis of Streptococcus mutans, the main etiological agent of dental caries. The genes of the Pst system of S. mutans UA159, are organized in a polycistronic operon (pstS, C1, C, B, smu.1134 and phoU). The amino acid sequence analysis of Pst proteins of S. mutans related to orthologs of Streptococcus genus, showed the highest identity value when compared to oral cavity bacteria. The PstS binding protein was present in all tested clinical and laboratory strains of S. mutans. The pstS mutant showed a decreased capacity of ortophosphate uptake which leaded to growth deficiency in different phosphate concentrations. The mutation also reduced the bacteria adherence to abiotic surfaces and the hydrophobicity of the cell surface, diverging from the increase the intrinsic acid resistance. Otherwise, there was no change in the bacterial transformation eficiency. Finally, the S. mutans pstS gene was cloned, expressed and the purified protein was used to obtain antibodies that inhibited the growth of S. mutans in vitro. Taking together, these results suggesting that the Pst transport system is relevant to S. mutans physiology and pathogenesis.