FARIAS, Vilmara Albuquerque de. Peptidases cisteínicas do fruto de noni (Morinda citrifolia L.) como agentes coagulantes de leite. 2016. 103 f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica)- Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2016. / Submitted by Jairo Viana (jairo@ufc.br) on 2017-07-04T22:32:48Z No. of bitstreams: 1 2016_dis_vafarias.pdf: 3744946 bytes, checksum: 498727253a7b625743f5ee4f1eb84bae (MD5) / Approved for entry into archive by Jairo Viana (jairo@ufc.br) on 2017-07-04T22:33:07Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_dis_vafarias.pdf: 3744946 bytes, checksum: 498727253a7b625743f5ee4f1eb84bae (MD5) / Made available in DSpace on 2017-07-04T22:33:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_dis_vafarias.pdf: 3744946 bytes, checksum: 498727253a7b625743f5ee4f1eb84bae (MD5) Previous issue date: 2016 / Milk-clotting is a basic step in the production of the whole cheese. The calf rennet, which has as the main constituent chymosin has been widely used for this purpose since it has high specificity for hydrolysis of the κ-casein. As a result of increased global cheese demand, along with a reduced supply of calf rennet, it has intensified the search for alternative sources. Chymosin produced by genetically modified microorganisms have proven to be an efficient substituent, however, attention has been focused on natural sources of peptidases which may promote different characteristics to the final product. Therefore this study aimed to characterize biochemically the peptidases of the pulp of the fruits of noni, and evaluate their technological potential and possible application in the hydrolysis of milk proteins and the production of cheese. For this, PPN obtained in sodium phosphate buffer 50 mM pH 7.0 was subjected: (i) proteolytic activity assays and (ii) milk-clotting by varying assay conditions and pretreatments PPN; (Iii) Hydrolysis of the total casein and κ-casein, over time analyzed by SDS-PAGE in gels of 15% polyacrylamide; (IV) Cheese production type "rennet". PPN peptidases have optimum pH activity around 6.0 and temperature 50 °C, inhibited by iodoacetamide and E-64. They showed low stability at alkaline pHs and temperatures above 40 °C after incubation for 30 min. Under the effect of divalent ions, proteolytic activity was inhibited by Mn, Co, Cu and Zn, however, it was not affected by Fe, Mg and Ca, either in the presence of NaCl, where there was even a significant increase in activity in all concentrations tested. The clotting activity, a reduction in the MCA (Milk-Clotting Activity) values when that activity occurred at concentrations above 60 mM CaCl2 and 0.1 M NaCl. PPN was able of to hydrolyse the three types of casein (α, β and κ). β- and κ- casein showed greater susceptibility to degradation. The products obtained from the hydrolysis of the κ-casein performed either by PPN as the commercial rennet (Coalhopar) had a mass of approximately 16 kDa, probably corresponding to the peptide para-κ-casein. The cheeses produced by PPN and commercial rennet have similar characteristics as the moisture values, fresh and dry mass, differing in clotting time. Coalhopar coagulated milk in about 3 min, while PPN extended to 8 min. PEN showed a yield (w:w) to about 79.02 g of noni pulp for the production a kilogram of cheese, which is equivalent to a mass of less than whole fruit. / A coagulação do leite é uma etapa básica na produção de todo queijo. O coalho de vitelo, que possui como principal constituinte a quimosina tem sido amplamente utilizado para esta finalidade, por apresentar alta especificidade de hidrólise pela κ-caseína. Em decorrência do aumento da demanda mundial de queijo e a escassez de coalho animal, tem se intensificado a busca por fontes alternativas. Quimosina produzida através de microrganismos geneticamente modificados provaram ser um substituinte eficiente, no entanto, a atenção tem sido voltada para fontes naturais de peptidases que possam conferir características diferenciadas ao produto final. Diante disso este trabalho objetivou caracterizar bioquimicamente as peptidases da polpa de noni (PPN), bem como avaliar seu potencial tecnológico e possível aplicação na hidrólise das proteínas do leite e na produção de queijos. Para isso, PPN extraídas em tampão fosfato de sódio 50 mM pH 7,0, foi submetido à: (I) Ensaios de atividade proteolítica e de (II) coagulação do leite variando-se as condições do ensaio e os pré-tratamentos de PPN; (III) Hidrólise da caseína total e κ-caseína, analisadas ao longo do tempo através de SDS-PAGE, em géis de 15% de poliacrilamida; (IV) Produção de queijo tipo “coalho”. Peptidases da polpa de noni apresentaram um pH ótimo de atividade em torno de 6,0 e temperatura ótima de 50 °C, sendo inibida por iodoacetamida e E-64. Apresentaram baixa estabilidade em pHs alcalinos e em temperaturas acima de 40 °C, após incubação por 30 min. Sob o efeito de íons divalentes, a atividade proteolítica foi inibida por Mn, Co, Cu e Zn, no entanto, não foi afetada por Fe, Mg e Ca, tampouco na presença de NaCl, onde houve, inclusive, um aumento significativo na atividade em todas as concentrações testadas. Quanto à atividade de coagulação do leite, houve uma redução nos valores de MCA (inglês, Milk-Clotting Activity) quando essa atividade ocorreu na presença de concentrações acima de 60 mM de CaCl2 e 0,1 M de NaCl. PPN foram capazes de hidrolisar os três tipos de caseínas (α, β e κ), com β e κ-caseína apresentando maior susceptibilidade à degradação. Os produtos obtidos a partir da hidrólise da κ-caseína, realizados tanto com PPN quanto pelo coalho comercial (Coalhopar) apresentaram massa de aproximadamente 16 kDa, provavelmente correspondendo ao peptídeo para-κ-caseína. Os queijos produzidos com PPN e coalho comercial apresentam características semelhantes quanto aos valores de umidade, massa fresca e seca, diferindo no tempo de coagulação. Coalhopar coagulou o leite em cerca de 3 min, enquanto que PPN estendeu-se até 8 min. PPN apresentou um rendimento (m:m) cerca de 79,02 g de polpa de noni para a produção de cada quilo de queijo, o que equivale à massa inferior a de um fruto inteiro.

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:23Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-05-27. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:25:27Z : No. of bitstreams: 1 Publico-00268a.pdf: 1567152 bytes, checksum: edde41fc5183eb2ec3800911222b1493 (MD5). Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:25:27Z : No. of bitstreams: 2 Publico-00268a.pdf: 1567152 bytes, checksum: edde41fc5183eb2ec3800911222b1493 (MD5) Publico-00268b.pdf: 2029279 bytes, checksum: 0ce31c253ab625a6b402e5c0b4abffe0 (MD5) / O vírus da febre aftosa (FMDV), um patógeno que afeta animais no mundo todo, possui um RNA genômico de fita simples que, após infectar a célula, é imediatamente traduzido numa única poliproteína. Esta poliproteína produzida é processada durante a síntese em várias proteínas maduras através de peptidases codificadas pelo próprio vírus. A primeira clivagem da poliproteína viral é realizada pela Lbpro entre sua própria região C-terminal e a região N-terminal da proteína VP4. Lbpro também cliva especificamente dois homólogos dos fatores eucarióticos de iniciação (eIF) 4G, resultando na supressão da translação proteica do hospedeiro realizadas através dos mRNAs cap-dependentes. Consequentemente, o RNA do FMDV, que inicia a tradução via IRES, e não requer o eIF4G intacto, pode usar livremente a maquinaria de síntese protéica do hospedeiro para tradução viral. Nós usamos uma série de peptídeos fluorogênicos desenhados especificamente para examinar a especificidade por substratos, efeitos do pH e força iônica sobre a atividade catalítica da Lbpro e sua mutante sLbpro. Comparadas com outras cisteínos peptidases, como a papaína e catepsinas, Lbpro e sLbpro possuem muitas caracteríticas únicas como alta sensibilidade à sais e um sítio de ligação ao substrato muito específico, extendendo-se até a posição P7. Análises de dados estruturais mostraram que Lbpro liga os resíduos P1-P3 do substrato em uma conformação extendida, enquanto os resíduos P4-P7 são ligados numa curta hélice 310. A especificidade da Lbpro, revelada através dos peptídios substituídos pode ser explicada para todas as posições, exceto para P5. / Foot-and-mouth disease virus (FMDV), a global animal pathogen, possesses a single-stranded RNA genome that, on release into the infected cell, is immediately translated into a single polyprotein. This polyprotein product is cleaved during synthesis by proteinases contained within it into the mature viral proteins. The first cleavage is performed by the leader protease (Lbpro) between its own C-terminus and the N-terminus of VP4. Lbpro also specifically cleaves the two homologues of the cellular eukaryotic initiation factor (eIF) 4G, resulting in shut-off of host capdependent mRNA translation. Consequently, FMDV RNA, which initiates translation via IRES, and does not require intact eIF4G, can freely use the host protein synthesis machinery for viral protein synthesis. We used a panel of specifically designed fluorogenic peptides to examine the substrate specificity, effects of pH and ionic strength on Lbpro activity and of its shorter mutant sLbpro. Compared with other cysteine peptidases, how papain and the cathepsins, Lbpro and sLbpro possesses several unusual characteristics, including a high sensitivity to salt and a very specific substrate binding site extending up to P7. Indeed, almost all substitutions investigated were detrimental to Lbpro and sLbpro activity. Analysis of structural data showed that Lbpro binds residues P1 to P3 in an extended conformation whereas residues P4 to P7 are bound in a short 310 helix. The specificity of Lbpro as revealed by the substituted peptides could be explained for all positions except P5. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Submitted by Daniella Sodre (daniella.sodre@ufpe.br) on 2015-04-17T15:38:30Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Tese Renata Cristina da Penha França.pdf: 3945808 bytes, checksum: 4675019a8f00e532930096e155b2dc6f (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-17T15:38:30Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Tese Renata Cristina da Penha França.pdf: 3945808 bytes, checksum: 4675019a8f00e532930096e155b2dc6f (MD5) Previous issue date: 2013-02-26 / FACEPE / Com a diminuição dos estoques pesqueiros e a estagnação das capturas observada desde o final da década de 1980, a aquicultura converteu-se atualmente em uma atividade consolidada capaz de abastecer e suprir à incessante demanda por produtos pesqueiros e proteicos de alto valor nutricional por seu crescente aporte na produção mundial de pescados. O bijupirá (Rachycentron canadum), conhecido internacionalmente como cobia é uma espécie nativa da costa brasileira e tem sido apontada como excelente candidato para desenvolver a piscicultura marinha nacional. Visando um melhor conhecimento sobre as exigências nutricionais e a fisiologia digestiva desta espécie. O objetivo do presente trabalho foi realizar a caracterização bioquímica e molecular da tripsina presente nos cecos pilóricos do bijupirá (Rachycentron canadum), testar a compatibilidade da tripsina purificada com sabões em pó e a sua estabilidade através de ensaios in vitro na presença de agentes surfactantes e oxidantes e comparar as peptidases digestivas presentes entre espécimes selvagens e cultivados no início do processo de domesticação em Pernambuco. Peptidases presentes nos cecos pilóricos de bijupirás selvagens e cultivados (R. canadum) foram caracterizadas quanto as suas propriedades físico-químicas através de ensaios de pH, temperatura ótima, estabilidade térmica, SDS-PAGE, efeito de inibidores e zimogramas utilizando substratos específicos para tripsina e quimotripsina (BApNA e SApNA), respectivamente. A temperatura e o pH ótimos obtidos para a tripsina-símile dos animais selvagens e cultivados foram de 55 e 60°C e 8,0 e 10,0, respectivamente, enquanto que para quimotripsina-símile foram de 50 e 45°C e 9,5 e 8,0 respectivamente. A tripsina-símile dos bijupirás selvagens e cultivados foi fortemente inibida com a utilização de inibidores clássicos como o PMSF (inibidor de serino proteases), TLCK (inibidor clássico de tripsina) e benzamidina (inibidor clássico de tripsina). O mesmo padrão foi observado para a quimotripsina-símile utilizando o TPCK (inibidor clássico de quimotripsina). O perfil eletroforético dos animais selvagens e cultivados revelaram bandas que variaram entre 6 kDa e 195 kDa. As bandas caseinolíticas observadas no zimograma revelaram pequenas variações que podem ser indicativos do processo inicial de adaptação enzimática do bijupirá frente às novas condições de cultivos quando comparados aos animais selvagens. O processo de purificação da tripsina do bijupirá utilizando-se a cromatografia de afinidade por BPTI-sepharose demonstrou ser um método eficiente, com alta reprodutibilidade, rápido e viável que permitiu o isolamento da tripsina presente no ceco pilórico e apresentou pH ótimo de 8,5, temperatura ótima de 50ºC, estabilidade térmica até 55ºC, Km de 0,38mM, Kcat 3,14 s-1 e Kcat/Km 8.26 s-1 mM-1 utilizando BApNA (8mM) como substrato. Estas caracterísiticas físico-químicas e cinéticas foram semelhantes a outras tripsinas de peixes reportadas na literatura. A mesma apresentou-se estável na presença de agesntes oxidantes e surfactantes e compatível com sabões em pó comerciais e que pode ser empregada na indústria de detergentes como nova fonte alternativa de enzimas.

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:55:15Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo9639_1.pdf: 2959564 bytes, checksum: c8360ee63b22e54ee20baf9b0c416dc9 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2011 / Peptidases dos cecos pilóricos de bijupirás selvagens e cultivados (Rachycentron canadum) foram caracterizados utilizando substratos específicos de tripsina e quimotripsina, inibidores e íons metálicos. Além disso, o perfil protéico foi determinado empregando SDS-PAGE e zimogramas. Para tanto pH ótimo e temperatura dos bijupirás selvagens e cultivados foi 7,0-10,0 e 40-60 ° C para a tripsina, como 7,0-9,5 e 40-55 ° C para quimotripsina. A tripsina e quimotripsina foram estáveis por 30 min a 50 ° C. O perfil eletroforetíco e zimograma foram similares para bijupirás selvagens e cultivados com faixas que variam de 195 kDa a 6 kDa. A atividade da enzima (BApNA como substrato) foi fortemente inibida por benzamidina e TLCK, sintéticos inibidores de tripsina, onde, como, a atividade de quimotripsina (SApNA como substrato) foi ligeiramente inibido por um inibidor de quimotripsina específico (TPCK). O uso de substratos e inibidores específicos sugerem a presença de tripsina e quimotripsina no cecos pilóricos de ambos animais selvagens e cultivados (Rachycentron canadum). Além disso, observou-se que os zimogramas dos animais selvagens e cultivados foram semelhantes, sugerindo que peptidases digestiva não foram influenciadas pela dieta artificial empregada e nem pela gestão de cultivo

La base moléculaire de la progression du cancer ovarien epithelial (COE) est encore peu comprise. Récemment, l'importance de la perturbation épigénétique de la régulation de gènes par l'hypométhylation globale du génome a commencé à être plus appréciée. L'hypométhylation est très peu étudiée dans le COE bien que l'on ait déjà montré qu'il existe une relation entre hypométhylation de l'ADN et la progression, l'invasion tumorale ainsi que la formation de métastases. Cette étude vise à identifier des gènes qui pourraient être activés par l'hypométhylation de leur région promotrice, ce qui contribuerait à la progression tumorale. Afin d'identifier de nouveaux gènes hypométhylés, quatre lignées cellulaires ovariennes (Skov3, Tovll2, Tov21 et Ovcar3) ont été traitées avec un donneur de groupement méthyl, du S-Adenosylmethionine (AdoMet), afin d'inhiber la déméthylation de l'ADN. Plusieurs gènes sous-exprimés après traitement ont été identifiés par l'analyse de l'expression génique globale en utilisant la technique de micropuces à ADN. Cette analyse a permis d'identifier le gène TMPRSS3 comme une cible potentielle d'hypométhylation dans le COE. Le gène TMPRSS3-D est connu pour son implication dans la migration et invasion dans le COE. Le statut de méthylation de la région promotrice du gène TMPRSS3 a été vérifié par analyse Methylation-Spécific PCR (MSP) et par Bisulfite Specific PCR (BSP). L'évaluation de son rôle potentiel dans l'étiologie du COE a été faite par la technique d'interférence à l'ARN. L'analyse d'expression génique globale en utilisant le clone où l'expression de TMPRSS3-D a été supprimée et son contrôle correspondant a permis de mieux comprendre l'effet moléculaire de TMPRSS3-D. Pris ensemble, les résultats présentés dans ce mémoire confirment le rôle potentiel du gène TMPRSS3-D dans l'invasion et métastase du COE et plus important, nos données indiquent que la surexpression de TMPRSS3-D dans le COE est due aux mécanismes épigénétiques reliés à l'hypométhylation de sa région promotrice.

O Câncer é uma doença responsável pelos maiores índices de morbidade e mortalidade em todo o mundo. A ocorrência do câncer é relacionada com vários fatores, entre eles, ambientais, nutricionais, genéticos, infecções virais e estilo de vida. Devido a complexidade da doença, há uma busca incessante em novos tratamentos. Atualmente, os medicamentos conhecidos, além de danificar células anormais prejudicam células saudáveis, o que causa efeitos colaterais e toxicidade. Algumas moléculas, por exemplo peptídeos, possuem a capacidade de interagir com proteínas de membrana de células cancerígenas, atuando diretamente nestas células. Estes peptídeos podem ser obtidos a partir da hidrólise de diferentes fontes de proteínas com a utilização de peptidases de origem microbiana. O objetivo do presente estudo foi produzir e purificar peptidases de dois fungos, Eupenicillium javanicum e Myceliophthora thermophila, realizar ensaios de caracterização bioquímica e eficiência catalítica destas enzimas, aplica las na obtenção de peptídeos bioativos a partir de proteínas do leite, ovo e gelatina, e avaliar a atividade antioxidante (in vitro) e atividade antitumoral (in vitro e in vivo) destes peptídeos. Foram produzidas e purificadas duas peptidases, uma metalopeptidase (E. javanicum) e uma serinopeptidase (M. thermophila), o ensaio de cinética enzimática mostrou maior eficiência catalítica na utilização de substratos com alanina na posição P\'2 e tirosina na posição P\'1 da cadeia polipeptídica, respectivamente para cada uma das enzimas. Os peptídeos, produzidos a partir de caseína, apresentaram maior atividade de sequestro de radicais e de quelar ferro. Peptídeos de soro de leite e gelatina inibiram o crescimento de células tumorais de câncer oral e melanoma (in vitro). Peptídeos de soro de leite produzidos por ambas as peptidases reduziram o volume tumoral (células Cal27) em camundongos imunodepriminidos. Ensaios proteômicos destes tumores, com comparação entre grupos tratados e sem tratamento, mostraram que algumas vias envolvidas com a apoptose podem estar envolvidas na redução do volume dos tumores do camundongos tratados com peptídeos obtidos de soro de leite / The cancer is a disease responsible to the higher levels of mortality and morbity around the world. This disease is related to many factors, as environment, nutrition, genetic, virus infection and life style.The complexity of this disease increases the research of new treatments. Currently, the medicines damage both, normal and cancer cells, it promotes side effects and toxicity. Some molecules present specificity and bind to proteins from membranes of cancer cells, some examples are peptides. Peptides can be obtained from proteins by hydrolisys with microrbial proteases. The aim of this study was to produce and purify two proteases from fungi, Eupenicillium javanicum and Myceliophthora thermophila. Biochemical characterization and kinetic assays of these enzymes were evaluated. And then, the proteases were applied on obtention of peptides from milk, egg and gelatin proteins, and the antioxidant (in vitro) and antitumoral activity (in vitro e in vivo) of these peptides were evaluated. The purified enzymes belong to metalo (E. javanicum) and serine (M. thermophila) protease classes, the kinetic assay showed higher catalytic efficiency with tyrosine at P\'1 position and alanine at P\'2 position of polypeptide chain of substrate, to metalo and serine protease, respectively. The peptides from casein presented capacity to scavenge free radicals and to quelate iron. Peptides derived from whey and gelatin inhibited the grown of oral cancer and melanoma cells (in vitro). Peptides obtained from whey decreased the tumor volume of immunosupressed mice. Proteomic assays of these tumors, when compared treatment and control group, showed that peptides can be envolved in some apoptosys pathway and it influences the tumor volume, cosequently, it is decreased on treatment with peptides derived from milk whey

Listeria monocytogenes est une bactérie pathogène impliquée dans la toxi-infection alimentaire à l’origine de la listeriose, une maladie peu fréquente mais avec un taux de mortalité de 25 % chez l’homme. Cette bactérie est capable de former un biofilm lui permettant de mieux résister aux stress environnementaux ainsi qu’aux traitements de décontamination. Une nouvelle stratégie d’analyse génomique a été développée et a permis de cibler des systèmes de sécrétion et des protéines potentiellement impliqués dans la formation de biofilm. L’inactivation de la voie SecA2 entraîne la formation d’un biofilm aérien et par conséquent fragile. Ce morphotype est capable de croître de façon sessile à 20°C sur du polystyrène alors que ce n’est pas le cas pour la souche sauvage. De nouvelles protéines sécrétées de façon SecA2 dépendante ont été identifiées par l’étude de l’exoprotéome du mutant ΔsecA2 en comparaison avec celui de la souche sauvage. Le rôle des lipoprotéines dans la formation de biofilm ainsi que leur maturation par les peptidases signal de type II, LspA et LspB, a également été abordé. La combinaison d'une analyse de l’expression des gènes codant les lipoprotéines au cours de la formation de biofilm avec l’analyse génomique basé sur le sécrétome a permis de cibler trois lipoprotéines, dont LpeA qui serait impliquée dans les phases tardives de formation de biofilm. Enfin, l’importance majeure de LspA dans la maturation des lipoprotéines, a été mise en évidence par l’étude de l’exoprotéome des doubles mutant ΔlgtΔlspA et ΔlgtΔlspB en comparaison avec celui de Δlgt. / Listeria monocytogenes is a foodborne pathogenic bacteria responsible for listeriosis, a rare but high mortality rate disease in humans (25 %). This bacterium can form biofilm allowing a better resistance to environmental stresses as well as decontamination treatments. A new strategy for genomic analysis was developed and allowed to target secretion systems and proteins potentially involved in biofilm formation. Inactivation of the SecA2 pathway leads to the formation of an aerial and fragile biofilm. This morphotype is able to grow in a sessile mode at 20 °C on polystyrene whereas this is not the case for the wild type strain. New proteins secreted in a SecA2 manner were identified by comparing the ΔsecA2 exoproteome to the one of the wild type. The role of lipoproteins in biofilm formation and their maturation by the signal peptidase II, LpsA and LspB, was also tackled. Combining expression analysis of genes encoding lipoproteins during biofilm formation with genomic analysis based on the secretome allowed targeting three lipoproteins, including LpeA, which appeared to be involved in the later stages of biofilm formation. Finally, the importance of LspA in the maturation of lipoproteins,was highlighted by comparing of the double mutant ΔlgtΔlspA and ΔlgtΔlspB exoproteomes to the one of Δlgt.

Diante da busca por abordagens mais sustentáveis para o controle de insetos, os inibidores de peptidases de plantas surgem como uma ferramenta promissora para a proteção de culturas via obtenção de plantas transgênicas. Efeitos nocivos da ingestão de inibidores de peptidases de soja (IPS) sobre o desenvolvimento de Diatraea saccharalis já foram reportados em trabalhos anteriores, entretanto, esses efeitos não foram estudados em nível molecular para essa espécie. Esse trabalho teve como objetivos identificar e analisar a expressão gênica e a atividade de serino peptidases intestinais de D. saccharalis em resposta à ingestão de um concentrado ativo de inibidores de peptidases de soja, relacionando essas informações com a presença ou não de algum mecanismo adaptativo desse inseto em resposta à ingestão desses inibidores. Para isso, foi obtido o transcriptoma intestinal de lagartas de D. saccharalis no quinto ínstar do desenvolvimento, submetidas à ingestão crônica de IPS. Em seguida foram identificadas as sequências correspondentes a serino peptidases do tipo tripsinas e quimotripsinas nesse transcriptoma, as quais foram utilizadas para o estudo da expressão gênica relativa por RT-PCR quantitativo, em resposta à ingestão aguda (por 24 e 48 horas) e crônica e de 0,5% (m/v) de um concentrado ativo de IPS por lagartas de D. saccharalis no terceiro e no quinto ínstares do desenvolvimento larval. As mesmas sequências foram utilizadas para a proposição de filogenias, sendo comparadas inclusive com sequências de serino peptidases de Spodoptera frugiperda identificadas em outro estudo paralelo. Ensaios de atividade tríptica e quimotríptica foram realizados utilizando substratos específicos (BApNA e SApNA) para determinar o efeito da ingestão de IPS sobre a atividade enzimática e finalmente, a integridade e a atividade inibitória do IPS foram analisadas após sua passagem pelo trato digestório das lagartas. Os resultados obtidos permitiram concluir que, nas condições experimentais empregadas nesse estudo, as lagartas de D. saccharalis não foram capazes de modular a expressão gênica das serino peptidases em resposta à ingestão crônica ou aguda de IPS. Os resultados de atividade tríptica e quimotríptica em função da ingestão de IPS podem sugerir um sinergismo na ação dessas enzimas em lagartas do quinto instar. Não foram detectadas diferenças na atividade de tripsinas e quimotripsinas em lagartas do terceiro ínstar em função da ingestão de IPS. A separação eletroforética das proteínas das fezes de lagartas permitiu a visualização de uma banda com massa molecular em torno de 20 kDa possivelmente correspondente ao inibidor do tipo Kunitz presente em soja que, juntamente com os dados de atividade antitríptica das fezes, indicam que D. saccharalis não é capaz de hidrolisar esse inibidor como um mecanismo de adaptação à sua presença na dieta. / Given the importance of search for more sustainable approaches for pest control, plant peptidases inhibitors emerge as a promising tool for the protection of crops by obtaining transgenic plants. Harmful effects of soybean peptidases inhibitors (SPI) intake by Diatraea saccharalis on its development were already reported in previous studies, however, these effects have not been studied at the molecular level for this specie. This study aimed to identify and analyze the gene expression and the gut serine peptidases activity of D. saccharalis in response to the intake of an active extract of soybean peptidases inhibitors. These informations were related to the presence or absence of some adaptive mechanism of this insect in response to these inhibitors. The gut transcriptome of larvae of D. saccharalis in the fifth developmental instar was obtained, undergoing chronic intake of IPS. Then, sequences of serino peptidases like trypsin and chymotrypsin were identified and used for gene expression studies on a real-time PCR in response to acute (for 24 and 48 hours) and chronic intake of 0.5 % (w/v) of SPI active extract by larvae of D. saccharalis in the third and fifth instars of larval development. The same sequences were used to propose phylogenies, including comparisons with sequences of Spodoptera frugiperda serine peptidases identified in another parallel study. Tryptic and chymotryptic activity assays were performed using specific substrates (BApNA and SApNA) to determine the effect of the SPI intake on enzyme activity and finally, the integrity and the inhibitory activity of the SPI were analyzed after passing through the digestive tract of caterpillars. The results showed that under the experimental conditions employed in this study, the larvae of D. saccharalis were not able to modulate the gene expression of serine peptidases in response to acute or chronic SPI intake. The results of tryptic and chymotryptic activity due to the SPI intake can suggest a synergism in the action of these enzymes in larvae of the fifth developmental instar. SPI intake did not cause differences in enzymatic activity of third instar larvae. Electrophoretic separation of proteins from the feces of caterpillars enabled visualization of a band with a molecular mass around 20 kDa possibly corresponding to the Kunitz inhibitor present in soybean. The antitryptic activity of the feces indicates that D. saccharalis is not able to hydrolyze soybean peptidases inhibitor as a mechanism of adaptation to their presence in the diet.

Diante da busca por abordagens mais sustentáveis para o controle de insetos, os inibidores de peptidases de plantas surgem como uma ferramenta promissora para a proteção de culturas via obtenção de plantas transgênicas. Efeitos nocivos da ingestão de inibidores de peptidases de soja (IPS) sobre o desenvolvimento de Diatraea saccharalis já foram reportados em trabalhos anteriores, entretanto, esses efeitos não foram estudados em nível molecular para essa espécie. Esse trabalho teve como objetivos identificar e analisar a expressão gênica e a atividade de serino peptidases intestinais de D. saccharalis em resposta à ingestão de um concentrado ativo de inibidores de peptidases de soja, relacionando essas informações com a presença ou não de algum mecanismo adaptativo desse inseto em resposta à ingestão desses inibidores. Para isso, foi obtido o transcriptoma intestinal de lagartas de D. saccharalis no quinto ínstar do desenvolvimento, submetidas à ingestão crônica de IPS. Em seguida foram identificadas as sequências correspondentes a serino peptidases do tipo tripsinas e quimotripsinas nesse transcriptoma, as quais foram utilizadas para o estudo da expressão gênica relativa por RT-PCR quantitativo, em resposta à ingestão aguda (por 24 e 48 horas) e crônica e de 0,5% (m/v) de um concentrado ativo de IPS por lagartas de D. saccharalis no terceiro e no quinto ínstares do desenvolvimento larval. As mesmas sequências foram utilizadas para a proposição de filogenias, sendo comparadas inclusive com sequências de serino peptidases de Spodoptera frugiperda identificadas em outro estudo paralelo. Ensaios de atividade tríptica e quimotríptica foram realizados utilizando substratos específicos (BApNA e SApNA) para determinar o efeito da ingestão de IPS sobre a atividade enzimática e finalmente, a integridade e a atividade inibitória do IPS foram analisadas após sua passagem pelo trato digestório das lagartas. Os resultados obtidos permitiram concluir que, nas condições experimentais empregadas nesse estudo, as lagartas de D. saccharalis não foram capazes de modular a expressão gênica das serino peptidases em resposta à ingestão crônica ou aguda de IPS. Os resultados de atividade tríptica e quimotríptica em função da ingestão de IPS podem sugerir um sinergismo na ação dessas enzimas em lagartas do quinto instar. Não foram detectadas diferenças na atividade de tripsinas e quimotripsinas em lagartas do terceiro ínstar em função da ingestão de IPS. A separação eletroforética das proteínas das fezes de lagartas permitiu a visualização de uma banda com massa molecular em torno de 20 kDa possivelmente correspondente ao inibidor do tipo Kunitz presente em soja que, juntamente com os dados de atividade antitríptica das fezes, indicam que D. saccharalis não é capaz de hidrolisar esse inibidor como um mecanismo de adaptação à sua presença na dieta. / Given the importance of search for more sustainable approaches for pest control, plant peptidases inhibitors emerge as a promising tool for the protection of crops by obtaining transgenic plants. Harmful effects of soybean peptidases inhibitors (SPI) intake by Diatraea saccharalis on its development were already reported in previous studies, however, these effects have not been studied at the molecular level for this specie. This study aimed to identify and analyze the gene expression and the gut serine peptidases activity of D. saccharalis in response to the intake of an active extract of soybean peptidases inhibitors. These informations were related to the presence or absence of some adaptive mechanism of this insect in response to these inhibitors. The gut transcriptome of larvae of D. saccharalis in the fifth developmental instar was obtained, undergoing chronic intake of IPS. Then, sequences of serino peptidases like trypsin and chymotrypsin were identified and used for gene expression studies on a real-time PCR in response to acute (for 24 and 48 hours) and chronic intake of 0.5 % (w/v) of SPI active extract by larvae of D. saccharalis in the third and fifth instars of larval development. The same sequences were used to propose phylogenies, including comparisons with sequences of Spodoptera frugiperda serine peptidases identified in another parallel study. Tryptic and chymotryptic activity assays were performed using specific substrates (BApNA and SApNA) to determine the effect of the SPI intake on enzyme activity and finally, the integrity and the inhibitory activity of the SPI were analyzed after passing through the digestive tract of caterpillars. The results showed that under the experimental conditions employed in this study, the larvae of D. saccharalis were not able to modulate the gene expression of serine peptidases in response to acute or chronic SPI intake. The results of tryptic and chymotryptic activity due to the SPI intake can suggest a synergism in the action of these enzymes in larvae of the fifth developmental instar. SPI intake did not cause differences in enzymatic activity of third instar larvae. Electrophoretic separation of proteins from the feces of caterpillars enabled visualization of a band with a molecular mass around 20 kDa possibly corresponding to the Kunitz inhibitor present in soybean. The antitryptic activity of the feces indicates that D. saccharalis is not able to hydrolyze soybean peptidases inhibitor as a mechanism of adaptation to their presence in the diet.

A descoberta de aminopeptidase regulada por insulina (IRAP), a qual hidrolisa peptídeos como ocitocina e vasopressina e é receptora de angiotensina IV, destaca a importância do estudo do envolvimento de peptidases na função endócrina do adipócito. Estudos recentes detectaram alterações das atividades de aminopeptidase neutra e de dipeptidil peptidase IV (DPPIV) no plasma e no hipotálamo e hipocampo na obesidade induzida por glutamato monossódico (MSG). A presente tese propôs (i) a existência de atividades aminopeptidásicas ácida (APA), básica (APB), neutra insensível (APM) e sensível à puromicina (PSA), metionil (MetAP) e DPPIV, além da já conhecida (leucil (LAP)/cistil (CAP)/IRAP), nas frações de membrana plasmática (FM) e de alta (HDM) e baixa (LDM) densidade microssomal de adipócitos isolados do depósito de gordura retroperitoneal; (ii) que suas atividades catalíticas, expressões gênicas e tráfego subcelular seriam diferenciados entre obesos induzidos por MSG, submetidos ou não à privação alimentar e em animais controle sadios, submetidos ou não a privação alimentar; (iii) e influenciadas por insulina, angiotensina II, angiotensina IV e vasopressina. A existência de todas essas aminopeptidases no adipócito foi demonstrada, sendo a APM a que apresenta maior Vmax e maior eficiência catalítica e a APA a maior afinidade. Os animais obesos apresentaram aumento do diâmetro médio dos adipócitos e aumento do lipócrito, caracterizando hipertrofia adipocítica, enquanto os controles privados de alimento tiveram um aumento no número de adipócitos e aumento no lipócrito, caracterizando hiperplasia adipocítica. Pela primeira vez, um perfil variado de atividades aminopeptidásicas distribuídas em diferentes compartimentos subcelulares do adipócito é evidenciado juntamente com a demonstração de diferenças no padrão de distribuição destas atividades entre os ratos obesos e sadios, privados ou não de alimento. Dentre as novas aminopeptidases detectadas no adipócito não há nenhuma com a característica clássica de IRAP. No geral, as alterações das atividades catalíticas nas diferentes situações sob estudo mostram o envolvimento dessas novas aminopeptidases na regulação endócrina do balanço energético (provavelmente via ação hidrolítica sobre angiotensina II e vasopressina) sob modulação por angiotensina IV (APB, APM, DPPIV, LAP/IRAP, MetAP e PSA em animais controle sadios e APB em animais controle privados de alimento), angiotensina II (APB e PSA nos animais obesos) e vasopressina (APB nos animais obesos privados de alimento; e influenciadas em seu tráfego subcelular por angiotensina II (CAP, DPPIV e LAP/IRAP) e angiotensina IV (LAP/IRAP). O tráfego subcelular da conhecida atividade CAP/IRAP mostrou-se suscetível à insulina e vasopressina / The discovery of insulin-regulated aminopeptidase (IRAP), which hydrolyzes peptides such as oxytocin and vasopressin and is an angiotensin IV receptor, highlights the importance of the involvement of peptidases in the endocrine function of adipocyte. Recent studies have detected changes in aminopeptidase activities of neutral aminopeptidase and dipeptidyl peptidase IV (DPPIV) in the plasma and in the hypothalamus and hippocampus of rats with obesity induced by monosodium glutamate (MSG). The present thesis proposes (i) the existence of acid (APA), basic (APB), neutral insensitive (APM) and puromycin sensitive (PSA) aminopeptidases, methionyl aminopeptidase (MetAP) and dipeptidyl peptidase IV (DPPIV), besides the well-known cystyl (CAP) / leucine aminopeptidase (LAP) / IRAP) in plasma membrane (MF) and in high (HDM) and low (LDM) density microsomes of isolated adipocytes from retroperitoneal fat pad; (ii) that their catalytic activities, gene expression and subcellular trafficking were different among MSG-induced obese and healthy control rats (food deprived or not); (iii) and influenced by insulin, angiotensin II and IV, and vasopressin. The existence of all these adypocite aminopeptidases was demonstrated. APM has a highest Vmax and catalytic efficiency, while APA has a highest substrate affinity. The obese animals have increased mean diameter of adipocytes and lipocrit, characterizing hypertrophy, while the food deprived rats had an increased number of adipocytes and lipocrit, characterizing hyperplasia. For the first time, a profile of varied aminopeptidases activities distributed in different subcellular compartments of adipocyte is evidenced together with the demonstration of differences in the distribution pattern of these activities among the obese and healthy rats, food deprived or not. Among these novel aminopeptidases detected in adipocytes there is no one with the classical characteristic of IRAP. In general, changes on catalytic activities in these different situations show the involvement of these novel aminopeptidases in the endocrine regulation of energy balance (probably via hydrolytic action on angiotensin II and vasopressin) under modulation by angiotensin IV (APB, APM, DPPIV, LAP/IRAP, MetAP and PSA in healthy animals and APB in food deprived healthy animals), by angiotensin II (APB and PSA in obese) and by vasopressin (APB in food deprived obese animais); and under influence of by angiotensin II (CAP, DPPIV, LAP/IRAP) and angiotensin IV (LAP/IRAP) on their subcellular trafficking. Subcellular trafficking of the well-known CAP/IRAP was susceptible to insulin and vasopressin