Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências da Saúde. Programa de Pós-Graduação em Farmácia / Made available in DSpace on 2012-10-18T11:27:09Z (GMT). No. of bitstreams: 0Bitstream added on 2014-09-25T19:50:11Z : No. of bitstreams: 1 212338.pdf: 4712219 bytes, checksum: 37ecbf3efee2db3e8936617867688f98 (MD5)

La aplicación de la PCR al diagnóstico de las enfermedades infecciosas vienesiendo una realidad en los últimos años. No obstante, su aplicación como instrumentodiagnóstico rutinario en los laboratorios clínicos requiere de la adecuación de la técnica alas características peculiares de estos laboratorios que necesitan procesar un elevadonúmero de muestras y dar respuesta en el menor tiempo posible a múltiples situacionesclínicas.El objeto de este estudio es encontrar y evaluar un diseño de diagnóstico por PCRque permita conjugar las ventajas de las técnicas de amplificación con las necesidades ycaracterísticas de un laboratorio clínico.Con esta finalidad hemos escogido una serie de patologías infecciosas queconsideramos importantes y frecuentes en medio hospitalario (infecciones respiratorias,tuberculosis, infecciones bacterianas del SNC, infecciones en inmunodeprimidos), asícomo otras patologías menos frecuentes pero cuyo diagnóstico está cubiertodeficitariamente por la Microbiología tradicional. Sobre este tipo de pacientes hemosaplicado y evaluado la PCR como técnica diagnóstica utilizando aquellas metodologías yequipamientos que se adaptan mejor a las características de un laboratorio clínico.Los resultados obtenidos demuestran que la PCR, en el nivel de desarrollo en quese encuentra actualmente, mejora en todos los casos el diagnóstico obtenido por losmétodos clásicos, aporta en ocasiones un método diagnóstico alternativo mucho mássencillo y rápido que aquellos, ofrece los resultados en un tiempo útil para el clínico ytodo ello puede conseguirse sin alterar la actividad rutinaria del laboratorio ni lospresupuestos ordinarios del mismo.

Orientador: Hiroshi Aoyama / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-23T19:18:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Juca_MarilenaBezerra_D.pdf: 9583247 bytes, checksum: 3c650d200ba2b5d69b14e0c0c77e75a9 (MD5) Previous issue date: 1998 / Resumo: O bloqueio da replicação retroviral é realizado principalmente através da inibição da transcriptase reversa. Novobiocina, brometo de etídeo, tetrametil brometo de etídeo, os alcalóides metoximetilvoacalotina, laurifolina e erisodina e o composto platínico Pt(BCP)(CBDCA) inibiram a atividade DNA polimerase da transcriptase reversa de vírus de mieloblastose de aves (TR de AMV). Independentemente da matriz utilizada: DNA ativado, poli(rA)(dT)12 e poli(rC)(dG), 0,5 mM de novobiocina inibiu 50% da atividade enzimática (IC50). O valor de IC50 para DNA polimerase a era o mesmo obtido para transcriptase reversa, significando que a droga não era específica para a enzima viral. A inibição por brometo de etídeo dependia do grupo substituinte na posição 2' do açúcar, onde a substituição de OH por Fluor no derivado poliadenílico como matriz, tornava a reação catalisada por transcriptase reversa menos susceptível à ação deste inibidor. Este padrão de inibição também foi observado com o composto platínico Pt(BCP)(CBDCA). Tanto para brometo de etídeo quanto para o seu análogo tetrametil brometo de etídeo, inibições mais eficientes foram obtidas quando se utilizou análogos de poli(rA)(dT)12 como matrizes. A eficiência da inibição pelos derivados etídeos era dependente da matriz poli(rA)(dT)12, poli(dAFI)(dT)12, poli(Am)(dT)12, poli(dA)(dT)12 e do cátion divalente (Mg2+, Mn2+, C02+) utilizado. O efeito inibitório do alcalóide metoximetilvoacalotina foi alterado pela natureza da matriz-iniciador tendo-se obtido os seguintes valores de IC50, 5,0; 3,5 e 1,0 mM para poli(rA)(dT)12, DNA ativado e poli(rC)(dG)12, respectivamente. O alcalóide laurifolina inibiu consideravelmente a TR de AMV mas não houve alterações significativas quando a matriz-iniciador poli(rA)(dT)12 foi substituida por poli(dAFI)(dT)12 como também quando Mg2+ foi substituido por Mn2+. Laurifolina é um inibidor não competitivo e, provavelmente, liga-se à enzima com alta afinidade (Ki = 0,66 µM). Laurifolina é, portanto, um efetivo inibidor da TR de AMV e um promissor agente antiretroviral. O alcalóide erisodina apresentou uma inibição mais apreciável na reação de TR dirigida por poli(rA)(dT)12. DMSO ativou a TR de AMV até a concentração de 4%. A maiores concentrações, este solvente inibiu a enzima em presença de poli(rA)(dT)12 e DNA ativado. Com poli(dAFI)(dT)12 esta ativação alcançou um máximo à 20% de DMSO, inibindo a maiores concentrações. O efeito ativador do DMSO pode estar relacionado com o decréscimo do valor de Km de 9,1µg/mI na ausência do solvente para 3,3 µg/rnl na presença do solvente. DMSO não protegeu a TR da inativação durante quatro horas a 0°C. Oito compostos platínicos foram anaIizados. Pt(BCP)(CBDCA) inibiu consideravelmente a enzima tendo discriminado a atividade DNA polimerase RNA-dependente (RDDP) da atividade DNA polimerase DNA-dependente (DDDP). Análises cinéticas revelaram que o tipo de inibição da TR de AMV para os compostos estudados era não competitiva, com exceção do alcalóide erisodina e do composto platínico Pt(BCP)(CBDCA) que apresentaram uma inibição competitiva em relação a poli(rA)(dT)12 e dTTP, respectivamente / Abstract: The blockage of retroviral replication is performed mainly through the reverse transcriptase inhibition. Novobiocin, ethidium bromide, tetramethyl ethidium bromide, the alkaloids methoxymethylvoachalotine, laurifoline, erisodine, and the platinum compound Pt(BCP)(CBDCA) inhibited the DNA polymerase activity of avian myeloblastosis virus reverse transcriptase (AMV RT). lndependently ofthe template used: activated DNA, poly(rA)(dT)12 and poly(rC)(dG)12, 0.5 mM novobiocin inhibited 50% of the enzyme activity (IC50). This drug was not specific for the viral enzyme since the IC50 value for DNA polymerase a was similar to that obtained for reverse transcriptase. The inhibition ofRT by ethidium bromide depended on the 2' -substituent in the sugar moiety, where the substitution of OR by fluorine on the template polyadenilic acid (poly A), became the reaction catalyzed by reverse transcriptase less sensitive to the action of this inhibitor. A similar pattem of the inhibition also was observed with the platinum compound Pt(BCP)(CBDCA). Ethidium bromide and its analog tetramethyl ethidium bromide more efficiently inhibited the reaction, when poly(A) analogs were used as templates. The efficiency of inhibition for the ethidium derivates was dependent on the templates poly(rA)(dT)12, poly(dAFI)(dT)12, poly(Am)(dT)12, poly(dA)(dT)12 and on the divalent cations (Mg2+, Mn2+, Co2+) utilized. The inhibitory effect by the alkaloid methoxymethylvoachalotine was also template-primer dependent and the following IC50 values were obtained: 5.0; 3.5 and 1.0 mM for poly(rA)(dT)12, activated DNA and poly(rC)(dG)12, respectively. The alkaloid laurifoline considerably inhibited the AMV RT but there were no significative differences when the template-primer poly(rA)(dT)12 was substituted for poly(dAFl)(dT)12 and when Mg2+ was substituted for Mn2+. Laurifoline was a non-competitive inhibitor and, probably binds to the enzyme with high affinity (Ki = 0.66 µM). Therefore, laurifoline, an effective inhibitor for the AMV R T, could be a promising antiretroviral agent. The aIkaloid erisodine showed a more appreciable inhibition on the poly(rA)(dT)12-directed RT reaction. DMSO activated the AMV RT at concentrations up to 4%. At higher concentrations, this solvent inhibited the enzyme in the presence of poly(rA)(dT)12 or activated DNA. With poly(dAFl)(dT)12 this activation reached a maximum at 20% DMSO, inhibiting at higher concentrations. The activator effect of DMSO could be related to a decrease in the Km value from 9.1µg/mI in the absence to 3.3 in the presence of the solvent. DMSO did not protect the RT from inactivation, during four hours, at 0°C. From eight platinum compounds analyzed, Pt(BCP)(CBDCA) considerably inhibited the enzyme activity, discriminating the RNA- from the DNA-dependent DNA polymerase activities. Kinetic analysis reveled that, with the exception of the alkaloid erisodine and the platinum compound Pt(BCP)(CBDCA) that presented competitive inhibitions relation to poly(rA)(dT)12 and dTTP, respectively, the inhibitions of the AMV RT by the other compounds studied in this work were of the non-competitive type / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Ciências Biológicas

Tese (livre docencia) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-18T01:30:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Aoyama_Hiroshi_LD.pdf: 2543438 bytes, checksum: 566b31a0eee0dc208eb769e82e13509e (MD5) Previous issue date: 1985 / Resumo: Este trabalho contem alguns estudos fisico-quimicos de DNA polimerases dependentes, de RNA. Poliaminas, em presença de Mg2+, exercem um efeito ativador nas reações catalisadas por transcripta-se reversa de virus de mieloblastose de aves, mas não por DNA polimerase a de Xenopus laevis. Derivados de nucleotídeos e polinucleotídeos foram descritos como substratos e inibidores de transcriptase reversa. dCflTP pode ser incorporado parcialmente no DNA sintetisadqo por transcriptase reversa e por DNA polimerases celulares a e ?. Análogos de poli A e poli C, com substituintes 2'-fluor e 2'-O-metil, podem ser utilizados como matrizes de síntese de DNA catalisada por transcriptase reversa, em presença de Mg2+ ou Mn2+. O papel do Mn2+ na síntese de DNA e discutido neste trabalho. Diferentes compostos foram utilizados como inibidores de sintese de DNA. O antibiótico novobiocina diminui a formação do complexo entre Trp transcriptase reversa e o tRNA iniciador, ligando-se irreversivelmente à enzima. (dCfl)n é um inibidor de transcriptase reversa utilizando-se DNA ativado ou RNA 70 S como matrizes naturais e (dA)n ou (rA)n como matrizes sintéticas. Nas mesmas condições nenhum efeito é verificado nas reações catalisadas por DNA polimerase a . As reações de transcriptase reversa em presença de (dAfl)n.(dT)12 como matriz-iniciador são resistentes à ação de (dCfl)n e de outros polinucleotídeos inibidores como (rU)n e (rI)n. Entretanto, tais reações são inibidas por outros compostos como brometo de etideo, tetrametil brometo de etídeo, berenil e N-etilmaleiimida. DNA polimerase A de gérmen de trigo apresenta características de uma DNA polimerase dependente de RNA. Como a transcriptase reversa, a DNA polimerase A reconhece (rA)n com uma eficiência maior em presença de Mg2+, e é inibida por glicerol e actinomicina D. O reconhecimento de matrizes naturais do tipo RNA somente se verifica utilizando-se desoxinucleosídeos trifosfato de alta atividade específica. O processo do reverso da transcrição pode ser observado também em virus de DNA. DNA polimerases purificadas de folhas infectadas pelo vírus do mosaico da couve-flor reconhecera com eficiência (rA)n, (rC)n, (Cm)n como matrizes sintéticas; são resistentes à ação de afidicolina e são inibidas por brometo de etídeo. / Abstract: This work reports some physico-chemical studies on the RNA-dependent DNA polymerase. In the presence of Mg2+, poliamines have an activating effect on the reactions catalyzed by avian myeloblastosis virus reverse transcriptase, but not on those catllyzed by Xenopus laevis DNA polymerase a. Derivatives of nucleotides and polynucleotides have been described as substrates or inhibitors of reverse transcriptase. dCflTP could be partially incorporated in the DNA synthesized by reverse transcriptase and by cellular DNA polymerases a and ?. Poly A and poly C analogues, with 2'-fluoro and 2'-O-methyl as substituents, could be utilized as templates for the DNA synthesis catalyzed by reverse transcriptase, in the presence of Mg2+ or Mn2+, The role of Mn2+ on the DNA synthesis is discussed in this work. The antibiotic novobiocin reduces the complex formation between reverse transcriptase and the Trp primer tRNA binding irreversibly to the enzyme. It has been observed that (dCfl)n was an inhibitor of reverse transcriptase by using activated DNA or 70 S RNA as natural templates and (dA)n or (rA)n as synthetic templates. At the same conditions no effect was verified on the reactions catalyzed by DNA polymerase a. Reverse transcriptase reactions directed by (dAf1)n.(dT)12 as template-primer are resistant to (dCfl)n and to other inhibitor polynucleotides like (rU)n and (rI)n. However, these reactions were inhibited by other compounds like ethidium bromide, tetramethyl ethidium bromide, berenil and N-ethylmaleimide. Wheat germ DNA polymerase A has shown some RNA-dependent DNA polymerase characteristics. Like reverse transcriptase, DNA polymerase A could recognize (rA)n better in the presence of Mg2+ and was inhibited by glycerol and actinomycin D. RNA natural templates could be copied only when high specific activity deoxy-nucleoside triphosphate was used. The reverse of the transcription can also be observed in DNA virus. Synthetic templates like (rA)n, (rC)n, (Cm)n were efficiently recognized by DNA polymerases purified from cauliflower mosaic virus infected leaves; it has been observed that these enzymes were resistant to aphidicolin and inhibited by ethidium bromide. / Tese (livre docencia) - Univer / Livre-Docente em Ciencias Biologicas

Orientador: Jose Luiz Pereira / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-07-21T02:30:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Bonetti_FabianaBertoni_M.pdf: 3667680 bytes, checksum: 8accb9a84edb9bec7db89cbf798700d0 (MD5) Previous issue date: 1996 / Resumo: Um total de 26 linhagens enterotoxigênicas de Staphylococcus aureus foram caracterizadas utilizando-se os perfis de fragmentos de DNA gerados pela técnica de RAPD por Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) e os perfis eletroforéticos de proteínas totais obtidos por eletroforese em gel de poliacrilamida contendo SDS (SDS-P AGE). Dezessete linhagens foram isoladas de leite cru de diferentes fazendas do estado de São Paulo, e cinco foram provenientes de presunto adquirido em padarias da cidade de Campinas (SP). As quatro linhagens restantes foram as linhagens 772 (EEA), S6 (EEB), 1230 (EEC) e 1151 (EED) fornecidas pelo Food Research lnstitute - FRI, Madison, USA. Cinco primers compostos de 10 pares de bases foram utilizados para gerar os perfis de fragmentos de DNA, que variaram de 0.5 a 4.0 kb. As 26 linhagens fora;m agrupadas em 2 sub-grupos a um nível de 40% de similaridade, revelando uma variabilidade muito grande entre elas. O perfil eletroforético de proteínas totais permitiu discriminação visual das linhagens, que foram agrupadas em 2 sub-grupos a um nível de similaridade de 90 a 100%. Os resultados deste trabalho revelaram não haver correlação entre as características obtidas pelas duas técnicas (RAPD e SDS-P AGE) e a produção de toxinas. / Abstract: A total of 26 enterotoxigenic strains of Staphylococcus aureus were characterized by random amplification of polymorphic DNA (RAPD) profiles using polymerase chain reaction (PCR), and by whole-cell protein patterns using sodiurn dodecyl sulfate-polyacrilamide gel electrophoresis (SDS¬P AGE). Seventeen strains were isolated from raw milk, obtained from several farms in the same geographic location in the state of São Paulo, and five strains were isolated from ham bought in different bakeries from Campinas (SP) city. The other four strains were 772 (SEA), S6 (SEB), 1230 (SEC) and 1151 (SED) provided by Food Research Institute- FRI, Madison, USA. Five primers, each one of 10 bp were used to generate the RAPD profiles. The molecular size of the fragments ranged of 0.5 to 4.0 kb. The 26 strains were clustered into two sub-groups at the 400/0 similarity level, this showing a great variability among them. Protein patterns allowed visual discrimination of strains, which were clustered into two sub-groups at the 90 to 100% similarity level. In this study, the results revealed that there is no correlation between the characteristics obtained in these two techniques (RAPD and SDS-P AGE) and the toxin production. / Mestrado / Mestre em Ciência de Alimentos

Neste trabalho desvendamos o papel das DNA polimerases dinB e dnaE2 em C. crescentus na mutagênese espontânea usando dois marcadores moleculares xylbla e CItet. Observamos que as taxas de mutação dos marcadores não variam significativamente entre dinB, dnaE2 e parental, coincidindo com os resultados prévios com o gene rpoB. As trocas de bases, tanto no gene cI, como em xylR, há um predomínio de mutações ATCG, como observado em rpoB, e diferente da região PxylX em xylbla. O gene xylR apresenta um hotspot que promove a inserção de uma citosina após a base 230. Neste marcador observamos que a presença de pequenas deleções (frameshifts-1) de uma base na cepa selvagem e dnaE2. Esse tipo de mutação não está presente na linhagem dinB. Esses resultados sugerem um papel importante de dinB na formação de deleções (frameshifts-1) in vivo em C. crescentus. Também observou-se que o agente 4-NQO não induz mutagênese em C. crescentus, ao contrário de E. coli. Também observamos pouca eficiência da atividade de uracila glicosilase em C. crescentus quando comparada com E. coli. / In this work we analyzed the role of DNA polymerases dinB and dnaE2 in spontaneous mutagenesis in C. crescentus, using two molecular markers: xylbla and Cltet. Our studies show that there is no significant difference in mutation rates in both markers between dinB, dnaE2 and wild type; this agrees with previous results using rpoB gene. Here, we report that there is a predominance of ATGC transitions in either cl gene or xylR, which was also shown in rpoB; however, this differs in PxylX region of xylbla. We also observed that xylR presents a mutation hotspot that promotes cytosine insertion after base 230.The presence of small one-base deletions (frameshifts-1) in wild typecbut ells, this type of mutation does not occur in the dinB strain. These results suggest an important role for dinB in the formation of deletions (frameshifts-1) in vivo in C. crescentus. We also saw that 4-NQO agent does not induce mutagenesis in C. crescentus, as it does in E. coli. Finally, the results demonstrate a poor efficiency in UDG activity in C. crescentus, when compared to E. coli.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Farmácia, Florianópolis, 2010 / Made available in DSpace on 2012-10-25T03:26:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 279884.pdf: 7471394 bytes, checksum: 49ecffa5cacc5208c3b1840fdef5866c (MD5) / A resistência a múltiplas drogas é uma das maiores causas para a falha do tratamento das leucemias agudas (LA). A resistência adquirida ou intrínseca a múltiplas drogas (MDR) depende de muitas variáveis biológicas e é principalmente caracterizada pela resistência cruzada a uma ampla variedade de fármacos não relacionados estrutural e funcionalmente. Vários mecanismos podem estar envolvidos no fenômeno MDR, como o mecanismo de efluxo de drogas através da membrana plasmática e as alterações nos mecanismos que regulam a morte celular por apoptose. Assim, o objetivo desse trabalho foi analisar o perfil de expressão das proteínas relacionadas à resistência a múltiplas drogas (ABCB1, ABCC1 e LRP) e à apoptose (Bcl-2) em células blásticas de pacientes com leucemia aguda (LA), ao diagnóstico, atendidos pelo Serviço de Hematologia do Hospital Universitário da Universidade Federal de Santa Catarina (HU-UFSC) e pelo Serviço de Oncologia do Hospital Infantil Joana de Gusmão (HI-Florianópolis) no período de Janeiro de 2008 a Dezembro de 2009. Para tanto, as células blásticas dos adultos e crianças com LA foram separadas por gradiente de densidade com Ficoll-Hypaque e a expressão dos genes e das proteínas de resistência foram avaliadas por RT-PCR semiquantitativo e citometria de fluxo, respectivamente. A média da expressão relativa de todas as amostras foi utilizada como ponto de corte para superexpressão. Tanto os pacientes adultos quanto as crianças apresentam uma ampla variedade de expressão para as proteínas estudadas. Os pacientes adultos com LA apresentaram correlação significativa entre a expressão dos genes abcb1 e lrp e a expressão das proteínas ABCB1 e ABCC1, ABCB1 e Bcl-2, e ABCC1 e Bcl-2 e nos pacientes pediátricos com LA não houve correlação significativa entre os níveis de expressão de dos genes e proteínas estudados. Nos pacientes adultos com LA, houve correlação positiva entre a expressão do gene abcb1 e a idade dos pacientes, e a concentração de LDH, enquanto nos pacientes pediátricos com LA, houve correlação positiva entre a expressão do gene abcc1 e a expressão de CD34, entre a expressão da proteína LRP e a idade, e entre a expressão da proteína ABCB1 e a leucometria ao diagnóstico. Esses resultados sugerem que a análise da expressão gênica de abcb1 está mais relacionada com um pior prognóstico nos pacientes adultos com LA, enquanto que nos pacientes com LA infantil, é a expressão conjunta das proteínas ABCB1, ABCC1 e LRP que parece estar relacionada com um pior prognóstico. Além disso, os resultados também indicam que a determinação do perfil de expressão da ABCB1, ABCC1 e LRP pelo método do RT-PCR semiquantitativo é mais significativa nos casos de LA em adultos e a determinação do perfil de expressão dessas proteínas por citometria de fluxo é mais significativa nas LAs em crianças

Submitted by Alessandra Portugal (alessandradf@ioc.fiocruz.br) on 2013-09-24T19:54:24Z No. of bitstreams: 1 DANIELA BANDEIRA BRANCANTE MACHADO.pdf: 2047398 bytes, checksum: 1cec6e270d15258ed364f6eda08606e9 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-09-24T19:54:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DANIELA BANDEIRA BRANCANTE MACHADO.pdf: 2047398 bytes, checksum: 1cec6e270d15258ed364f6eda08606e9 (MD5) Previous issue date: 2012 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Vírus Sincicial Respiratório (VSR) humano pertence à família Paramyxoviridae sendo o principal patógeno causador de infecções do trato respiratório inferior, em crianças menores de cinco anos, em todo o mundo. Esse vírus infecta aproximadamente 90% das crianças menores de dois anos e embora há mais de 20 anos o desenvolvimento de uma vacina tenha sido estudado, ainda não há nenhuma eficiente e segura. O VSR é classificado em grupos A e B, com uma variabilidade, entre eles, em torno de 50% de aminoácidos da proteína G. Existem diferentes genótipos dentro de cada grupo que também são identificados pela proteína G. Essa proteína, que tem de 282 a 319 aminoácidos dependendo do grupo, é uma glicoproteína que promove a adsorção do vírus à célula. A variabilidade está concentrada no ectodomínio, que consiste em duas regiões variáveis separados por uma região conservada, presente em ambos os grupos. O VSR possui uma enzima RNA polimerase que catalisa a reação RNA polimerase RNA dependente (RpRd) e é alvo de ação do antiviral ribavirina. A maior subunidade dessa enzima é a proteína L que apresenta seis blocos conservados identificados de I a VI, flanqueados por sequências variáveis. Nos blocos II e III encontramos os sítios de ligação de RNA genômico e o sitio ativo da polimerase viral, respectivamente. O objetivo desse estudo foi identificar os genótipos de VRS, bem como sua diversidade genética no que diz respeito aos genes G e L, em crianças menores de cinco anos com infecções respiratórias. Para isso, realizamos um estudo retrospectivo no qual aspirado de nasofaringe positivo para VSR pelas metodologias de Imunofluorescência Indireta ou RT-PCR dos estados do Rio de Janeiro (2006 a 2010) e do Rio Grande do Sul (2009) foram utilizados. Os últimos dois terços do gene G foram sequenciados em 125 amostras, nas quais 74 eram VSR A e 51 amostras eram VSR B. Enquanto para o gene L, foram sequenciados os blocos II e III de 28 amostras. Observamos que a maioria das amostras do grupo A pertencem ao genótipo GA2 e apenas três ao genótipo GA5, enquanto no grupo B a maioria das amostras era do genótipo BA e cinco amostras do genótipo GB3. Identificamos diversos polimorfismos no gene G; enquanto no gene L, os blocos II e III, amplamente conservados, os polimorfismos foram sinônimos na sequência de nucleotídeos. / Respiratory Syncytial Virus (RSV) belongs to the family Paramyxoviridae human being the main causative pathogen of lower respiratory tract infections in children under five years worldwide. This virus infects approximately 90% of children under two years and although there are more than 20 years developing a vaccine has been studied, there is still no effective and safe. RSV is classified into groups A and B, with variability between them, around 50% amino acid protein G. Different genotypes within each group are also identified by protein G. This protein, which has 282 to 319 amino acids depending on the group, is a glycoprotein that promotes the adsorption of the virus to the cell. The variability is concentrated in the ectodomain, which consists of two variable regions separated by a conserved region present in both groups. RSV has an RNA polymerase enzyme that catalyzes the reaction RNA dependent RNA polymerase (RpRd) and is the target of action of the antiviral ribavirin. The largest subunit of this enzyme is protein L which has six conserved blocks identified from I to VI, flanked by variable sequences. In blocks II and III we find the binding sites and active site genomic RNA viral polymerase, respectively. The aim of this study was to identify the genotypes of RSV, as well as their genetic diversity with respect to G and L genes in children under five years with respiratory infections. For this, we conducted a retrospective study in which nasopharyngeal aspirate positive for RSV by indirect immunofluorescence methods or RT-PCR in the states of Rio de Janeiro (2006-2010) and Rio Grande do Sul (2009) were used. The last two thirds of the G gene were sequenced in 125 samples in which 74 were RSV A and RSV B. 51 samples were As for the L gene, were sequenced blocks II and III of 28 samples. We note that most of the samples belong to group A genotype GA2 and only three genotype GA5, while in group B was most samples the genotype AB and five samples of genotype GB3. Identified several gene polymorphisms G, while the L gene, blocks II and III, largely preserved in the polymorphisms were synonymous nucleotide sequence.

Orientadores: Christine Hackel, Juergen K. V. Reichardt, Maricilda P. Mello / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-10T00:27:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ferraz_LucioFabioCaldas_D.pdf: 2604031 bytes, checksum: c313be68a5b9599e035866a8ee12ef8c (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: O hormônio androgênico di-hidrotestosterona (DHT) possui fundamental importância na diferenciação sexual masculina e no desenvolvimento e manutenção da próstata. Duas enzimas atuam diretamente na concentração deste andrógeno nas células: 1) com uma função anabólica, a enzima 5α-redutase tipo 2 (gene SRD5A2) é responsável pela síntese de DHT ao converter testosterona (T) em 5α-di-hidrotestosterona e 2) com uma função catabólica, a enzima 3β- hidroxi desydrogenase/Δ5-Δ4-isomerase de esteróides tipo 2 (gene HSD3B2) é responsável pela degradação do DHT, além de contribuir para síntese indireta de testosterona por uma via anabólica. Isto exposto, cenários distintos se apresentam considerando as atividades deficientes dessas enzimas: i) a deficiência congênita da enzima 5a-redutase tipo 2 conduz a uma forma específica de pseudohermafroditismo masculino (PHM) no qual a conversão de T em DHT está nula ou defeituosa, inviabilizando a virilização normal da genitália externa em indivíduos com cariótipo 46,XY e ii) em razão das propriedades bifuncionais da enzima 3β-HSD2, tanto na via de síntese quanto de degradação de andrógenos, sua deficiência congênita pode conduzir a quadros clínicos distintos de ambigüidade genital. No adulto, mutações somáticas que afetem sua atividade enzimática podem contribuir para a manifestação do câncer de próstata, pelo acúmulo do DHT. O presente trabalho aborda as duas enzimas esteroidogênicas envolvidas com o metabolismo da DHT, buscando caracterizar mutações germinativas e/ou somáticas que conduzem a deficiências enzimáticas relacionadas a diferentes condições clínicas. Com relação à deficiência em 5a-redutase tipo 2, investigou-se a presença de mutações germinativas no gene SRD5A2 em amostras de DNA 20 pacientes de sexo genético masculino com suspeita de deficiência em 5α-redutase tipo 2, pertencentes a 18 famílias brasileiras, por meio de sequenciamento direto dos produtos de PCR dos cinco exons do gene e de suas regiões flanqueadoras. Foram identificadas alterações moleculares em 18 desses pacientes, compreendendo tanto mutações não anteriormente referidas na literatura (G158R, del642T, 217_218insC e IVS3+1G>A), como mutações recorrentes já descritas em outros grupos étnicos ou em indivíduos de outras regiões geográficas. Os resultados detalhados, bem como a discussão, acham-se apresentados no Capítulo III.1, sob a forma de artigo publicado. (...continua) / Abstract: The androgenic hormone dihydrotestosterone (DHT) has fundamental relevance in normal male sexual differentiation and in prostate development and maintenance. Two enzymes act directly on the regulation of DHT concentration at cellular level: 1) with an anabolic function the steroid 5α-reductase type 2 enzyme (SRD5A2 gene) leads to DHT synthesis by converting testosterone (T) in 5α-dihydrotestosterone and 2) with a catabolic pathway the 3β-hydroxysteroid dehydrogenase/Δ5-Δ4-isomerase type 2 enzyme (HSD3B2 gene) is responsible for DHT degradation, besides contributing to indirect synthesis of testosterone in an anabolic pathway. Thus, different scenarios can be considered regarding the deficiencies in the activities of these enzymes: i) congenital steroid 5α-reductase type 2 enzyme deficiency leads to a specific form of male pseudohermaphroditism (MPH), where the conversion of T into DHT is defective or inexistent, preventing normal virilization of the external genitalia in individuals with a 46,XY karyotype; and ii) due to the bi-functional properties of the 3β-HSD2 enzyme, either at synthetic or degradation androgen pathways, its congenital deficiency can lead to distinct manifestations of genital ambiguity. Furthermore, in the adult, somatic mutations that affect 3β-HSD2 enzymatic activities could contribute to prostate cancer manifestation, due to DHT accumulation. The present work approaches these two steroidogenic enzymes involved with the DHT metabolism, aiming to characterize germinal and/or somatic mutations leading to enzymatic deficiencies related to different clinical conditions. Concerning the steroid 5α- reductase type 2 deficiency, we screened for germinal mutations on SRD5A2 gene in DNA samples of 20 patients from 18 Brazilian families with suspected SRD5A2 deficiency, by directly sequencing of the PCR products from the five exons and flanking regions of the gene. Molecular alterations were detected in 18 of these patients, comprising either mutations not previously reported in the literature (G158R, del642T, 217_218insC e IVS3+1G>A) as well as recurring mutations already described in other ethnical groups or in individuals from other geographical regions. The detailed results and corresponding discussion are presented at Chapter III.1, as a published paper. (¿to be continued) / Doutorado / Genetica Animal e Evolução / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

Orientador: Humberto de Araujo Rangel / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-22T00:14:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Passos_LuizAugustoCorrea_M.pdf: 4565119 bytes, checksum: d608dc3c2e23911864f8e44643485adf (MD5) Previous issue date: 1997 / Resumo: Importantes pesquisadores mostraram nas décadas de 30 e 40, que a constituição genética dos animais de experimentação, é fundamental para o estudo da resposta imune. Por esta razão, o uso de camundongo de mesma linhagem mantidos em diferentes laboratórios deve permitir a obtenção de resultados universais e que possam ser reproduzidos. Isto é possível apenas com linhagens padronizadas e monitoradas geneticamente, de forma que alterações no genoma provenientes de contaminações ou mutações, possam ser detectadas. A inexistência de linhagens certificadas e padronizadas do ponto de vista genético no país, exigiu o estabelecimento de novas colônias e de condições para a monitoração das linhagens utilizadas na pesquisa biomédica em geral e particularmente em imunologia. Para atingir este objetivo realizamos o presente trabalho que visou implantar a partir de linhagens certificadas: colônias de fundação mantidas com procedimentos operacionais padronizados; bando de embriões para perpetuação das características originais; banco de DNA para programas de monitoração genética. A partir da consolidação destas metodologias e utilizando a técnica de PCR na ampilificação de microsatélites polimórficos presentes em moléculas de DNA de alto peso molecular, foi realizada uma análise do perfil genético para as linhagens de camundongos CBA, BALB/c, C54BL/6, C3H]He e A/J, oriundas de cinco instituições que mantém programas de pesquisa na área de imunologia. Os resultados obtidos com os primers Crp, Igh-V, D3Mit49, D17Mit16, Igh, Ngfg, Plau e D16Mit5, mostraram que as linhagens CBA das instituições A e B e BALB/c da instituição D, apresentaram resultados diferentes dos animais oriundos do Instituto Pasteur utilizados como padrão. Os dados atestam a não identidade genérica para algumas das linhagens testadas e apontam para a necessidade de um levantamento nacional associado ao estabelecimento de programas de monitoramento periódico em colonias de biotérios brasileiros / Abstract: Not informed. / Mestrado / Imunologia / Mestre em Ciências Biológicas