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Les mécanismes moléculaires contrôlant les rythmes circadiens sont conservés parmi les organismes des différents règnes (plantes, animaux et champignons). Ils se composent de boucles de rétroaction où un complexe d’activation transcriptionnelle, l’hétérodimère CLK/CYC chez la drosophile, entraîne l'expression des répresseurs de son activité, les gènes et protéines PER et TIM chez la mouche. De manière importante, la période de l'oscillateur dépend en grande partie par des mécanismes post-transcriptionnels qui régulent l’accumulation et l'activité des composantes positifs et négatifs de la boucle. Bien que de nombreux partenaires d'interaction modifiant les composants d'horloge de base ont déjà pu être isolés, le schéma reste encore incomplet. Dans le cadre de la recherche de nouveaux composants de cette horloge, nous avons réalisé un crible comportemental basé sur l'expression ciblée de transgènes ARNi dirigés contre la moitié du génome de Drosophila melanogaster. Cinquante-quatre nouveaux gènes putatifs ont pu être identifiés. Au cours de ce travail, j'ai étudié le rôle de deux d’entre eux, sélectionnés pour les forts défauts comportementaux de l'expression de leur transgène ARNi. Le gène CG12082 de la drosophile est l’orthologue de l’Ubiquitin-specific protéase 5 (USP5) chez l’homme. La dérégulation d’Usp5 retarde les oscillations de la protéine PER dans les neurones d'horloge et allonge la période d'activité locomotrice des mouches. Chez les mouches ARNi Usp5, des formes à haut poids moléculaire des protéines PER et TIM s'accumulent pendant le matin, alors qu’elles sont normalement dégradées chez les contrôles. On a pu montrer que Usp5 participe directement à la dégradation de la protéine PER, indépendamment de TIM. En accord avec le rôle décrit pour l’orthologue humaine, Usp5 serait susceptible de contrôler la dégradation des protéines par son activité de démontage des chaînes libres de polyubiquitine présents dans la cellule, qui peuvent entrer en compétition avec les protéines ubiquitinylées pour la reconnaissance au niveau du protéasome, bloquant leur dégradation. La majorité des travaux ont porté sur un gène isolé au cours de notre crible, Strip, dont les fonctions étaient encore inconnues. Strip interagit avec Cka, une nouvelle sous-unité régulatrice de l’enzyme phosphatase PP2A. La dérégulation à la fois de Strip et/ou de Cka amène à des phénotypes comportementaux de période longue. D’un point de vue moléculaire, des formes hyper-phosphorylées de la protéine CLK s’accumulent dans la matinée quand Cka et/ou Strip sont perturbées. La dérégulation des activités générales de PP2A produit également une hyper-phosphorylation de CLK le matin, indiquant que, grâce à Cka/Strip, les complexes PP2A contrôlent la déphosphorylation de CLK à la fin du cycle. Il est connu que les formes hyper-phosphorylés de CLK sont transcriptionnellement inactives. En effet, la transcription des gènes tim et vrille, cibles de CLK, est fortement réduite dans les mouches ARNi Cka. En plus de PP2A/Cka, des complexes PP2A contenant une autre sous-unité régulatrice, Wdb, ont été montré pour déstabiliser CLK en culture des cellules (Kim et Edery, 2006). Nous montrons que la dérégulation de Wdb affecte la stabilité du CLK également dans la mouche adulte, sans toutefois induire aucun effet apparent sur sa phosphorylation. En conclusion, deux complexes PP2A différents agissent sur la protéine CLK : le complexe PP2A/Cka/Strip contrôle la déphosphorylation de CLK et sa réactivation, tandis que PP2A/Wdb affecte la stabilité de CLK indépendamment ou après PP2A/Cka. Ces résultats enrichissent l’étude de la régulation post-traductionnelle de la protéine CLK, qui était largement mal connue.Pour conclure, cette étude a permis de décrire deux nouveaux composants de la boucle moléculaire qui contrôle les rythmes circadiens chez la mouche du vinaigre, Drosophila melanogaster. / The molecular mechanism underlying circadian rhythms is conserved among organisms and consists of feedback loops where a transcriptional activating complex (the CLOCK (CLK)/CYCLE (CYC) heterodimer in Drosophila) drives the expression of the repressors of its activity (the period (per) and timeless (tim) genes and proteins in Drosophila). Importantly, the pace of the oscillator largely depends on post-transcriptional mechanisms that regulate the accumulation and activity of both the positive and negative components of the loop. A number of interacting partners that modify core clock components have already been isolated, but more are expected. Looking for new clock components, we set up a behavioral screen based on targeted expression of RNAi transgenes directed to half of the Drosophila genome. 54 putative new clock genes have been identified. Among them, some were independently reported to function within the fruit fly molecular clock, thus validating the screen. In this work, I investigated the circadian role of additional “positive” genes, selected for the strong behavioral defect induced by the expression of the corresponding RNAi. The CG12082 gene codes for the fruit fly ortholog of the human Ubiquitin-specific protease 5 (USP5). Downregulation of USP5 in clock cells lengthens the period of locomotor activity of flies as well as PER protein oscillations in clock neurons. High molecular weight forms of PER and TIM proteins accumulate during the morning after USP5 knockdown, while these forms are degraded in controls. In addition, TIM is not stabilized in the absence of PER, while PER still accumulate in the absence of TIM. Therefore, USP5 directly participates in the degradation of the PER protein and, later, of the TIM protein at the end of the cycle. Being a deubiquitinylase enzyme, USP5 may directly deubiquitinate PER. However, accordingly to the role described for the human ortholog, USP5 likely controls protein degradation through the disassembling of the unanchored polyubiquitin chains present in the cell that could compete with ubiquitinated-PER for proteasome recognition and subsequent breakdown.The majority of the work has focused on an unknown gene isolated in the screen, that, accordingly to the human homolog, we named STRIP. We show that STRIP interacts with Connector of Kinase to AP-1 (CKA), a novel regulatory subunit for the PP2A phosphatase holoenzyme, both in insect S2 cells and in fly head extracts. Downregulation of both STRIP and/or CKA causes long-period behavioral phenotypes and high molecular weight forms of the CLK protein to accumulate in the morning. Perturbation of general PP2A activities also produces hyper-phosphorylated CLK in the morning indicating that, through CKA/STRIP, PP2A complexes controls CLK dephosphorylation at the end of the cycle. Hyper-phosphorylated CLK forms are transcriptionally inactive. Accordingly, transcription of the tim and vrille (vri) CLK targets is strongly reduced in Cka-RNAi fly head extracts. PP2A complexes containing the Widerborst (WDB) regulatory subunits were already shown to affect CLK stability in insect S2 cells (Kim and Edery, 2006). We show that WDB downregulation also affects the stability of CLK in fly head extracts, but has no apparent effects on CLK phosphorylation. Therefore, we could describe two different PP2A complexes acting on the CLK protein: PP2A/CKA/STRIP complex controls CLK dephosphorylation and reactivation, while PP2A/WDB affects CLK stability independently or after PP2A/CKA functions. Moreover, STRIP, but not CKA, downregulation affects the stability of PER, indicating that STRIP possesses some functions unrelated to CKA. In conclusion, this work has allowed the isolation of new components of the Drosophila molecular clock. In particular, we give evidence for a double role for the PP2A phosphatase in modulating the activity and stability of the CLK protein, the regulation of which is not well understood yet.

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Le foie est un organe indispensable dans le contrôle de l'homéostasie énergétique du corps humain. En particulier, le métabolisme hépatique est crucial pour l'homéostasie glucidique et lipidique. Les voies cataboliques et anaboliques sont en équilibre constant et régulées de façon synergique en fonction de la disponibilité en nutriments et de la demande en énergie. La perturbation de cet équilibre, notamment en cas d'obésité, peut conduire à l'accumulation intra-hépatique de lipides, qui est une des causes principales de la survenue de l'insulino-résistance hépatique (IRH), conduisant à l'hyperglycémie chronique et au diabète de type 2 (DT2). La cellule eucaryote est une structure hautement compartimentée, et à ce titre la compartimentalisation des processus cataboliques et anaboliques est une part intégrante de la gestion des voies métaboliques. Dans cet ensemble, la mitochondrie est un organite clef, qui abrite l'oxydation des lipides, le cycle de l'acide citrique (CAC) et la respiration cellulaire. De cette manière, la fonction mitochondriale est un élément crucial dans le maintien de l'état énergétique et d'oxydation-réduction de la cellule dans une gamme physiologique, ainsi que dans la régulation de l'activité du métabolisme du glucose et des lipides pour l'homéostasie du corps entier. La fonction mitochondriale est directement régulée par son interaction avec le réticulum endoplasmique (RE) via des zones de proximité entre les organites appelées Mitochondria-Associated-Endoplasmic-Reticulum-Membranes ou MAM. Dans ce contexte, j'ai participé au cours de mon travail de thèse à une étude qui a montré l'importance des interactions mitochondrie-RE dans la signalisation de l'insuline et mise en lumière la perturbation des MAM comme acteur principal dans l'IRH. De plus, j'ai étudié la régulation des MAM dans le contexte physiologique de la transition nutritionnelle dans le foie sain et insulino-résistant (IR) / The liver is an essential organ in the control of energetic homeostasis of the human body. Particularly, hepatic metabolism is crucial for glucose and lipid homeostasis. Catabolism and anabolism of both substrates are in constant equilibrium and synergically regulated in regard of nutrient availability and energetic demand. Disruption of this equilibrium, especially in the case of obesity, can lead to hepatic accumulation of lipids, which is a major cause of hepatic insulin resistance (HIR) leading to chronic hyperglycaemia and type 2 diabetes (T2D). The eukaryotic cell is a highly compartmented structure, and in this respect compartmentation of anabolic and catabolic processes is an integral part of managing metabolic pathways together. In this context, the mitochondrion is a key organelle, housing oxidation of lipids, the tricarboxylic acid (TCA) cycle and cellular respiration. In this way, mitochondrial function is a crucial element in maintaining energetic and reductionoxidation state of the cell within physiological ranges, as well in regulating the proper activity of glucose and lipid metabolism for the all body homeostasis. Mitochondrial function is directly regulated by its interaction with the endoplasmic reticulum (ER) via proximity points between the organelles called Mitochondria-Associated-ER-Membranes (MAM). In this context I have participated during my Ph.D. in a work that has shown the importance of mitochondria-ER interactions in insulin signalling and highlighted MAM disruption as a main actor in HIR. Furthermore, I have studied the regulation of MAM in the physiological context of nutritional transition in the healthy and insulin resistant (IR) liver. Particularly, we have shown that MAM disruption induces impaired insulin signalling, while their reinforcement protects against its appearance and restore insulin sensitivity in lipid-induced IR condition. Moreover, we have pointed out a consistent decrease of MAM quantity in the IR liver of ob/ob, high-fat high-sucrose diet (HFHSD) and Cyclophilin D - knock-out (CypD-KO) mice

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Chez Saccharomyces cerevisiae, les souches mutantes pour Rrd1, une protéine qui possède une activité de peptidyl prolyl cis/trans isomérase, montrent une résistance marquée à la rapamycine et sont sensibles au 4-nitroquinoline 1-oxide, un agent causant des dommages à l’ADN. PTPA, l’homologue de Rrd1 chez les mammifères, est reconnu en tant qu’activateur de protéine phosphatase 2A. Notre laboratoire a précédemment démontré que la surexpression de PTPA mène à l’apoptose de façon indépendante des protéines phosphatase 2A. La fonction moléculaire de Rrd1/PTPA était encore largement inconnue au départ de mon projet de doctorat. Mes recherches ont d’abord montré que Rrd1 est associé à la chromatine ainsi qu’à l’ARN polymérase II. L’analyse in vitro et in vivo par dichroïsme circulaire a révélé que Rrd1 est responsable de changements au niveau de la structure du domaine C-terminal de la grande sous-unité de l’ARN polymérase II, Rpb1, en réponse à la rapamycine et au 4-nitroquinoline 1-oxide. Nous avons également démontré que Rrd1 est requis pour modifier l’occupation de l’ARN polymérase II sur des gènes répondant à un traitement à la rapamycine. Finalement, nous avons montré que suite à un traitement avec la rapamycine, Rrd1 médie la dégradation de l’ARN polymérase II et que ce mécanisme est indépendant de l’ubiquitine. La dernière partie de mon projet était d’acquérir une meilleure connaissance de la fonction de PTPA, l’homologue de Rrd1 chez les mammifères. Nos résultats montrent que le «knockdown» de PTPA n’affecte pas la sensibilité des cellules à différentes drogues telles que la rapamycine, le 4-nitroquinoline 1-oxide ou le peroxyde d’hydrogène (H2O2). Nous avons également tenté d’identifier des partenaires protéiques pour PTPA grâce à la méthode TAP, mais nous ne sommes pas parvenus à identifier de partenaires stables. Nous avons démontré que la surexpression de la protéine PTPA catalytiquement inactive n’induisait pas l’apoptose indiquant que l’activité de PTPA est requise pour produire cet effet. Finalement, nous avons tenté d’étudier PTPA dans un modèle de souris. Dans un premier lieu, nous avons déterminé que PTPA était exprimé surtout au niveau des tissus suivants : la moelle osseuse, le thymus et le cerveau. Nous avons également généré avec succès plusieurs souris chimères dans le but de créer une souris «knockout» pour PTPA, mais l’allèle mutante ne s’est pas transférée au niveau des cellules germinales. Mes résultats ainsi que ceux obtenus par mon laboratoire sur la levure suggèrent un rôle général pour Rrd1 au niveau de la régulation des gènes. La question demeure toujours toutefois à savoir si PTPA peut effectuer un rôle similaire chez les mammifères et une vision différente pour déterminer la fonction de cette protéine sera requise pour adresser adéquatement cette question dans le futur. / In Saccharomyces cerevisiae, mutants devoid of Rrd1, a protein possessing in vitro peptidyl prolyl cis/trans isomerase activity, display striking resistance to rapamycin and show sensitivity to the DNA damaging agent 4-nitroquinoline 1-oxide. PTPA, the mammalian homolog of Rrd1, has been shown to activate protein phosphatase 2A. Our laboratory previously found that overexpression of PTPA leads to apoptosis independently of PP2A. At the outset of my thesis work, the molecular function of Rrd1/PTPA was largely unknown. My work has shown that Rrd1 is associated with the chromatin and interacts with RNA polymerase II. In vitro and in vivo analysis with circular dichroism revealed that Rrd1 mediates structural changes of the C-terminal domain of the large subunit of RNA pol II, Rpb1, in response to rapamycin and 4-nitroquinoline 1-oxide. Consistent with this, we demonstrated that Rrd1 is required to alter RNA pol II occupancy on rapamycin responsive genes. We also showed that upon rapamycin exposure Rrd1 mediates the degradation of RNA polymerase II and that this mechanism is ubiquitin-independent. Another part of my work was to gain insight into the function of PTPA, the mammalian counterpart of Rrd1. PTPA knockdown did not affect sensitivity to rapamycin, 4-nitroquinoline 1-oxide or H2O2. We also attempted to find protein interaction partners for PTPA using tandem affinity purification, but no stable partners for PTPA were found. We also demonstrated that overexpression of a catalytically inactive PTPA mutant did not induce apoptosis, indicating that PTPA activity is required to produce this effect. Finally, we attempted to study PTPA in a mouse model. We first determined that PTPA was expressed in a tissue-specific manner and was most abundant in bone marrow, thymus and brain. We pursued creation of a knockout mouse and successfully generated chimeras, but the mutated allele was not transmitted to the germline. My data and other data from our laboratory regarding the yeast work suggest a general role for Rrd1 in regulation of gene transcription. Whether PTPA has a similar function in mammalian cells remains unknown, and a different vision of what the protein does in mammalian cells will be required to adequately address this question in the future.

<p>Viruses modulate biosynthetic machineries of the host cell for a rapid and efficient virus replication. One important way of modulating protein activity in eukaryotic cells is by reversible phosphorylation. In this thesis we have studied adenovirus and vaccinia virus, two DNA viruses with different replication stategies. Adenovirus replicates and assembles new virions in the nucleus, requiring the host cell transcription and splicing machinieries, whereas vaccinia virus replicates in the cytoplasm, only requiring the cellular translation machinery for its replication. </p><p>Adenovirus uses alternative RNA splicing to produce its proteins. We have shown that adenovirus takes over the cellular splicing machinery by modulating the activity of the essential cellular SR family of splicing factors. Vaccinia virus, that does not use RNA splicing, was shown to completely inactivate SR proteins as splicing regulatory factors. SR proteins are highly phosphorylated, a modification which is important for their activity as regulators of cellular pre-mRNA splicing. We have found that reversible phosphorylation of SR proteins is one mechanism to regulate alternative RNA splicing. We have demonstrated that adenovirus and vaccinia virus induce SR protein dephosphorylation, which inhibit their activity as splicing repressor and splicing activator proteins. We further showed that the adenovirus E4-ORF4 protein, which binds to the cellular protein phosphatase 2A, induced dephosphorylation of a specific SR protein, ASF/SF2, and that this mechanism was important for regulation of adenovirus alternative RNA splicing.</p><p>Inhibition of cellular pre-mRNA splicing results in a block in nuclear- to cytoplasmic transport of cellular mRNAs, ensuring free access of viral mRNAs to the translation machinery. We propose that SR protein dephosphorylation may be a general viral mechanism by which mammalian viruses take control over host cell gene expression.</p>

Viruses modulate biosynthetic machineries of the host cell for a rapid and efficient virus replication. One important way of modulating protein activity in eukaryotic cells is by reversible phosphorylation. In this thesis we have studied adenovirus and vaccinia virus, two DNA viruses with different replication stategies. Adenovirus replicates and assembles new virions in the nucleus, requiring the host cell transcription and splicing machinieries, whereas vaccinia virus replicates in the cytoplasm, only requiring the cellular translation machinery for its replication. Adenovirus uses alternative RNA splicing to produce its proteins. We have shown that adenovirus takes over the cellular splicing machinery by modulating the activity of the essential cellular SR family of splicing factors. Vaccinia virus, that does not use RNA splicing, was shown to completely inactivate SR proteins as splicing regulatory factors. SR proteins are highly phosphorylated, a modification which is important for their activity as regulators of cellular pre-mRNA splicing. We have found that reversible phosphorylation of SR proteins is one mechanism to regulate alternative RNA splicing. We have demonstrated that adenovirus and vaccinia virus induce SR protein dephosphorylation, which inhibit their activity as splicing repressor and splicing activator proteins. We further showed that the adenovirus E4-ORF4 protein, which binds to the cellular protein phosphatase 2A, induced dephosphorylation of a specific SR protein, ASF/SF2, and that this mechanism was important for regulation of adenovirus alternative RNA splicing. Inhibition of cellular pre-mRNA splicing results in a block in nuclear- to cytoplasmic transport of cellular mRNAs, ensuring free access of viral mRNAs to the translation machinery. We propose that SR protein dephosphorylation may be a general viral mechanism by which mammalian viruses take control over host cell gene expression.