Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Le chloroacétaldéhyde (CAA), un des principaux produits du métabolisme hépatique de l'ifosfamide (IFO), est considéré comme responsable de la néphrotoxicité de ce médicament. Les mécanismes exacts de cette néphrotoxicité ne sont pas complètement élucidés. Dans la première partie de cette étude, nous avons essayé de préciser les mécanismes physiopathologiques de la toxicité du CAA sur un modèle de tranches de cortex rénal de rat, puis, dans la deuxième partie, nous avons recherché un effet anticancéreux éventuel du CAA sur des cellules de cancer du sein humain (MCF-7). La néphrotoxicité du CAA, utilisé à des concentrations proches de celles mesurées chez les patients traités par l'IFO, soit 0 - 75 µM, s'est manifestée par une chute d'ATP et du glutathion ainsi que par une inhibition du métabolisme du lactate. Certaines enzymes de la néoglucogenèse, notamment la glyceraldéhyde 3-phosphate déshydrogénase, ont été inhibées par le CAA. Le complexe I de la chaîne respiratoire mitochondriale ainsi que l'oxydation du lactate ont été également inhibées par le toxique. D'autre part, le CAA (10 et 25 µM) a inhibé la prolifération des cellules MCF-7 sans que cette inhibition soit accompagnée d'une chute d'ATP cellulaire. Le transport cellulaire et le métabolisme du glucose ainsi que certaines enzymes de la glycolyse ont été également inhibés par le CAA. Parmi celles-ci, l'hexokinase semble être l'enzyme qui catalyse l'étape limitante de la voie de la glycolyse. En conclusion, le CAA est bien impliqué dans les mécanismes de la néphrotoxicité de l'IFO, mais de plus, il pourrait, via l'inhibition de la glycolyse, contribuer à l'effet thérapeutique de l'IFO.

Les phospholipases A2 constituent une superfamille de protéines comprenant au moins onze phospholipases A2 sécrétées (sPLA2) et douze phospholipases A2 intracellulaires. Ces protéines catalysent l'hydrolyse des phospholipides en position sn-2, libérant un acide gras et un lysophospholipide. Elles contrôlent ainsi la production d'une variété de médiateurs lipidiques qui sont importants pour de multiples fonctions cellulaires dans différents contextes physiologiques ou physiopathologiques (maladies inflammatoires et cancer). La sPLA2 de groupe X a été clonée au laboratoire en 1997 et possède des propriétés moléculaires uniques. Son ARN messager est présent dans différents tissus, mais semble peu régulé par des stimuli proinflammatoires. L'enzyme est unique dans sa capacité à libérer des médiateurs lipidiques à partir des phospholipides cellulaires ou des lipoprotéines et possède aussi des propriétés antimicrobiennes variées. Un élément clé de la régulation fonctionnelle de la sPLA2 de groupe X est vraisemblablement lié à la présence d'un propeptide dans sa partie N-terminale. Le lieu de la maturation protéolytique de la sPLA2 de groupe X (dans la cellule avant sécrétion ou à l'extérieur après sécrétion du proenzyme), les protéases impliquées et la régulation de cette maturation dans des conditions physiologiques ou physiopathologiques sont inconnus. Le travail de cette thèse a permis de mieux comprendre comment peut s'effectuer la maturation de la sPLA2 de groupe X et quels sont ses rôles physiologiques et physiopathologiques. Concernant la maturation, nos études in vitro sur protéines purifiées et en cellules transfectées (HEK293) ont permis de montrer qu'une protéase de type furine contribue de façon majeure à l'activation de l'enzyme, vraisemblablement au cours de sa sécrétion. Nos travaux suggèrent aussi qu'une maturation est possible par d'autres protéases et dans le milieu extracellulaire comme par exemple dans les cellules LOVO. Nous avons aussi tenté de mettre en évidence cette maturation dans des tissus murins dans certaines conditions physiologiques et physiopathologiques. Nous avons notamment trouvé que la sPLA2-X était la sPLA2 majeure présente dans l'acrosome des spermatozoïdes. Enfin nous avons observé un polymorphisme présent dans le propeptide de la sPLA2 humaine qui conduit à la formation d'une protéine inactive et rapidement dégradée. Dans la deuxième partie de cette thèse, nous avons montré que la forme active de la sPLA2 de groupe X, mais pas son proenzyme était capable i) de stimuler la prolifération cellulaire dans un contexte de cancer colorectal, ii) d'exercer une action toxique contre le parasite de la malaria P.falciparum lors de l'infection de globules rouges humains, et iii) de contrôler la réaction acrosomique des spermatozoïdes de souris, avec un impact important sur le taux de fécondité dans des tests de fécondation in vitro.

Comment la taille d'un organisme est-elle régulée au cours du développement embryonnaire ? Quels sont les mécanismes génétiques à l'origine de l'arrêt de la prolifération pendant la croissance d'un organisme pluricellulaire ? Afin d'identifier des acteurs de la sortie du cycle cellulaire au cours du développement, mon travail s'est orienté sur l'étude de gènes suppresseurs de tumeurs pendant la croissance du toit optique (TO) du médaka Oryzias latipes. Le TO, structure dorsale du cerveau moyen des Vertébrés, est un modèle particulièrement adapté à l'étude de la régulation de la prolifération. Trois zones de la marge vers le centre du TO sont discernables : une zone périphérique de prolifération, une zone intermédiaire de cellules sortant du cycle cellulaire et une zone centrale de cellules différenciées. Un crible d'expression par hybridation In Situ a été réalisé et a permis d'identifier 28 gènes exprimés dans le TO, suggérant leur implication dans le contrôle de la sortie du cycle cellulaire au cours du développement. Dans le but de caractériser in vivo la fonction de gènes issus de ce crible, le gène BTG1 (B-cell Translocation Gene 1) et les membres de sa famille, ont été étudiés au cours du développement du médaka. J'ai mené des expériences fonctionnelles sur BTG1, permettant de mettre en évidence son rôle central pour la morphogenèse du système nerveux central. De plus, une autre partie de mon travail s'est penchée sur l'étude de l'expression des membres de la voie de signalisation Hippo, bien connue et caractérisée chez la drosophile et les Mammifères pour son rôle dans le contrôle de la taille des organes via une régulation de l'arrêt de la prolifération. A l'issu de notre travail, une fonction de la voie de signalisation Hippo dans la formation du TO et des somites a pu être mise en évidence au cours du développement du médaka.

L'endométriose concerne 8 à 10% des femmes en âge de procréer et est responsable de douleurs pelviennes chroniques et d'infertilité. Seule l'exérèse chirurgicale des lésions permet un traitement curatif de la maladie. Dans le cas de l'endométriose profonde avec atteinte rectale la chirurgie est extensive et associée à une morbidité significative. Les traitements médicaux reposent sur une hormonothérapie visant à bloquer la fonction ovarienne dont l'effet n'est que suspensif et transitoire. Il n'existe à ce jour aucun traitement ciblant les mécanismes à l'origine de la maladie. L'objectif de notre travail était d'explorer différents mécanismes potentiellement impliqués dans le développement de la maladie et d'identifier des molécules capables d'intervenir sur ces mécanismes. Dans un premier temps nous avons exploré le phénotype hyperprolifératif des cellules endométriosiques profondes et cherché un lien avec différentes voies métaboliques impliquées dans la prolifération cellulaire telles que le stress oxydant, la voie ERK et la voie Akt. Dans un deuxième temps, nous avons exploré le recrutement des cellules endométriales au sein de la cavité péritonéale au travers de l'interaction CXCR4-CXCL12. Des cultures cellulaires ont été réalisées à partir de prélèvements humains de nodules endométriosiques profonds, d'endomètre eutopique et d'endomètre sain. Des lames histologiques ont été préparées à partir de nodules endométriosiques profonds. Des prélèvements de liquide péritonéal de femmes endométriosiques et de témoins ont été congelés. La prolifération cellulaire a été étudiée par incorporation de thymidine tritiée. La production des FRO a été évaluée par spectrofluorimétrie. La voie ERK a été évaluée par western blot, ELISA et immunohistochimie. La voie Akt été évaluée par western blot et immunohistochimie. Nous avons montré un phénotype hyperprolifératif des cellules endométriosiques profondes en rapport avec une activation de la voie ERK par le biais du stress oxydant et à une activation de la voie Akt. Nous avons montré qu'un anti-oxydant (NAC), un inhibiteur de protéines kinases (A771726), un inhibiteur de Raf (sorafenib), un inhibiteur de mTOR (temsirolimus), un agoniste des cannabinoïdes (WIN 55212-2) et un anti-métabolite (5-FU) pouvaient contôler la prolifération des cellules endométriosiques profondes in vitro et la progression de nodules endométriosiques profonds implantés dans des souris Nudes. L'interaction CXCR4-CXCL12 a été étudiée par western blot, analyse de migration, cytométrie de flux et ELISA. Nous avons montré une attraction spécifique des cellules endométriosiques profondes sur-exprimant le CXCR4 par la chimiokine CXCL12 présente en quantité accrue dans le liquide péritonéal des femmes endométriosiques. En conclusion, nous avons montré que le traitement médical de l'endométriose pouvait être non hormonal et que le stress oxydant, la voie ERK et la voie Akt constituaient de nouvelles pistes thérapeutiques à évaluer dans le cadre d'essais cliniques. Nous avons également montré comment la modification constitutive des cellules de l'endomètre eutopique pouvait favoriser leur recrutement dans la cavité péritonéale.

La thèse intitulée Structures de biopolymères pour la reconstruction de tissus biologiques, structurée en 4 chapitres, présente la possibilité d'obtenir des structures biopolymériques qui peuvent être utilisées dans la reconstruction des tissus, notamment dans la reconstruction des tissus osseux. Les objectifs spécifiques suivants ont été définis et suivis dans les chapitres 2, 3 et 4: 1) L'obtention de structures basées sur le PHA et des fibres naturelles, pour leur utilisation médicale - films, fibres, structures compactes et/ou poreuses, 2) Modification physique ou chimique des structures obtenues pour améliorer leur biocompatibilité, 3) Caractérisation biologique in vitro et in vivo des matériaux; 4) Etude de l'influence des métaux sur la minéralisation du tissu osseux. Le Chapitre I résume les biomatériaux utilisés en génie tissulaire basé sur la littérature. Le Chapitre II présente les différentes structures biopolymériques étudiées: films, microparticules, fibres, tubes et structures microporeuses et l'évaluation des propriétés physiques, chimiques et mécaniques des PHA et fibres naturelles et une étude sur la porosité en utilisant le microCT. Le chapitre III traite de l'influence de la porosité sur l'adhésion cellulaire des films de PHA, une étude in vitro et le comportement in vivo des fibres de PHBV. La dernière partie inclut une étude sur la modification des fibres de fibroïne et de cellulose, pour améliorer leur minéralisation. Le chapitre IV traite l'influence de l'aluminium sur la minéralisation osseuse. Cette étude a été motivée par les conclusions alarmantes des effets nocifs de l'aluminium sur la minéralisation osseuse. La dernière section contient des observations finales et des perspectives.

La stérilisation des espèces aquacoles est recherchée en aquaculture pour remédier aux problèmes de reproduction intempestive et risques de pollution génétique de la reproduction des poissons d'élevage échappés avec des espèces endémiques. Nous avons cherché à caractériser certains des mécanismes mis en jeu lors d'une stérilisation induite par de fortes températures chez une espèce de poissons thermosensible d'intérêt majeur en aquaculture, le tilapia du Nil, Oreochromis niloticus. L'effet d'une température élevée de 37°C sur le développement gonadique a été étudié pendant la différenciation sexuelle chez des alevins et pendant la maturation sexuelle chez des juvéniles, provenant de descendances mixtes (XXXY) et monosexes femelles (XX) /mâles (XY). L'analyse immunohistochimique de la protéine vasa montre que des traitements à 37°C provoquent une diminution du nombre de cellules germinales (CG) qui résulte d'une augmentation du taux d'apoptose et/ou d'une réduction du taux de prolifération de ces cellules, aboutissant à une stérilité partielle et transitoire ou complète et permanente. L'expression du gène vasa, marqueur des CG, est inhibée dans les gonades des poissons traités à 37°C pendant un minimum de 60 jours ; ceci est corrélé avec la réduction du nombre de CG dans ces gonades. La baisse du niveau d'expression des gènes cyp19a1a et amh, respectivement marqueurs de cellules somatiques femelles et mâles, suggère que la température de 37°C affecte également le nombre ou la fonctionnalité des cellules de la granulosa chez les femelles et de Sertoli chez les mâles. Un traitement de 60 jours est nécessaire pour induire de tels effets et semble impacter préférentiellement les gonades femelles. Ce travail confirme que les fortes températures induisent une réduction du nombre de CGs, en modifiant la balance entre les taux d'apoptose et de prolifération cellulaire, conduisant à des stérilités partielles ou totales. / The sterilization of farmed fishes is searched in aquaculture to remedy in the problems of inconvenient reproduction and risk of genetic pollution of reproduction of escaped farmed fishes into the natural environment with endemic species. We characterized some of the mechanisms involved during induced-sterilization by high temperatures in the Nile tilapia, Oreochromis niloticus, a thermosensitive species of major interest in fish farming. The effect of 37°C-elevated temperature on gonadal development was studied during sexual differentiation in fry and during sexual maturation in juvenile, from mix-sexed (XX/XY), all-genetic female (XX) and male (XY) progenies. The immunochemistry analysis of vasa protein shows that 37°C-treatment causes germ cell (CGs) decrease, resulting from an increase of apoptosis rate and/or reduction of cell proliferation, leading to partial and transitory or complete and permanent sterilization.This work confirms that high temperatures induce a decrease of germ cell number, modifying the balance between rates of cell apoptosis and cell proliferation, leading to partial or complete sterilization.The expression profile of vasa gene, marker of germ cells, is inhibited in gonads of fish treated at least during 60 days at 37°C ; that is correlated with the reduction of germ cell number. The reduction of expression levels of cyp19a1a and amh genes, respectively markers of female and male somatic cells, suggests that the 37°C-temperature also affects the number or function of granulosa cells in females and Sertoli cells in males. A treatment of 60 days is necessary to induce such effects and seems to impact preferentially female gonads.

La protéine cIAP1 (cellular Inhibitor of Apoptosis Protein-1) de la famille des IAP (Inhibitor of Apoptosis Protein) est une E3 ubiquitine ligase qui présente des propriétés oncogéniques. Notre équipe s’intéresse aux processus permettant la différenciation des monocytes en macrophages. Au cours de la différenciation de nombreux modèles cellulaires (macrophages, cellules dendritiques, cellules épithéliales du colon, cellules souches hématopoïetiques, cardiomyocytes), cIAP1 sort du noyau pour se relocaliser dans le cytoplasme. La plupart des fonctions connues de cIAP1 sont liées à sa localisation cytoplasmique où elle est un régulateur important des voies de signalisation des récepteurs du TNFα et de NF-κB. Lors de la différenciation macrophagique, nous avons montré que cIAP1, une fois dans le cytoplasme, induit la dégradation de TRAF-2, un adaptateur moléculaire impliqué dans la transduction du signal des voies des récepteurs du TNFα et de NF-κB. Cette dégradation bloque la voie canonique de NF-κB et est essentielle à la différenciation terminale des monocytes en macrophages qui nécessite une activation transitoire de cette voie de signalisation. Cependant, cIAP1 est principalement exprimée dans le noyau de différents types cellulaires ce qui n’est pas en accord avec son rôle dans la signalisation cellulaire. Mon objectif a donc consisté à identifier les fonctions nucléaires de cIAP1 dans des cellules prolifératives ou lors de la différenciation macrophagique. Mon travail de thèse a permis d’identifier un rôle de cIAP1 dans la prolifération cellulaire. cIAP1 interagit avec le facteur de transcription E2F1 et favorise son recrutement sur les promoteurs des Cycline E et A impliquées dans les transitions G1/S et G2 du cycle cellulaire, ce qui augmente l’expression des transcrits et des protéines de ces deux cibles. Il semblerait que par cette activité, cIAP1 régule la prolifération des cellules et soit important dans l’équilibre entre la prolifération et la différenciation, deux mécanismes cellulaires étroitement liés. / The inhibitor of apoptosis protein cIAP1 (cellular inhibitor of apoptosis protein-1) from the IAP family (Inhibitor of Apoptosis Protein) is an E3 ubiquitin ligase that displays oncogenic properties. Our team is interested in the mecanisms that allow macrophagic differentiation from monocytes. cIAP1 is relocalised from the nucleus to the cytoplasm during the differentiation of many kind of cellular models (macrophages, dendritic cells, colon epithelial cells, hematopoietic stem cells, cardiomyocytes). The well-known functions of cIAP1 are associated with its cytoplasmic localisation, where it regulates the TNFα receptors and NF-κB signalling pathways. During macrophage differentiation, we show that cIAP1, once it is in cytoplasm, induces TRAF-2 degradation, a molecular adaptator of the TNFα receptors family and NF-κB signalling pathways. This degradation blocks the canonical pathway of NF-κB and is essential for the terminal differentiation into macrophages that needs a transitory activation of this pathway. However, cIAP1 is mainly expressed in the nucleus on many cell types which is not in accordance with its cell signalling activity. My objective was to investigate the nuclear function of cIAP1 in proliferative cells or during macrophage differentiation. My work identifies a function of cIAP1 in proliferation regulation. cIAP1 interacts with E2F1 transcription factor and favors its recruitment on Cyclins E and A promoters, both involved in G1/S and G2 phases of the cell cycle, which leads to high level of transcript and protein expression of these two targets. It seems that cIAP1 regulates the cellular proliferation and is important for the balance between proliferation and differentiation, two mechanisms tightly connected in cells.

Les gliomes sont des tumeurs qui seforment par prolifération anormale de cellules dansle tissu cérébral. La dangerosité de ces tumeursréside dans le fait que la plupart des gliomes sontinvasifs : les cellules tumorales migrent dans le tissusain autour de la tumeur. Ces cellules tumoralesisolées provoquent des récidives quasi systématiquesaprès traitement (chirurgie, chimiothérapie,radiothérapie), rendant ces tumeurs incurablesactuellement et conduisant au décès du patient. Il estimportant d'associer des études fondamentales pourmieux comprendre leur évolution dès l'origine et desétudes plus appliquées en développant de nouveauxsubstrats pour reproduire in vitro leur évolution. Lescellules progénitrices des oligodendrocytes (OPC)représentent la plus grande population de cellules enprolifération et la plus largement distribuée dans lecerveau adulte, ce qui en fait un suspect idéal del’origine des gliomes. A partir de donnéesexpérimentales de la littérature sur la dynamique invivo de ces cellules, un modèle mathématiquereproduisant cette dynamique dans un tissu sain a étédéveloppé.Ce modèle montre également que les OPC pourraientêtre à l’origine de toutes les formes de gliomerencontrées aussi bien de bas grade que de hautgrade. Par ailleurs, l’approche expérimentale utiliséevisait à développer un substrat de culture cellulaireadapté à l’étude des gliomes in vitro. Ainsi, unhydrogel biocompatible, minimaliste et contrôlable aété élaboré. Celui-ci mime l’élasticité de la matriceextracellulaire (MEC) cérébrale avec une rigidité del’ordre de 200 Pa et l’effet adhésif des molécules dela MEC impliqué dans l’adhésion et la proliférationdes cellules tumorales. Grâce à ses propriétés,l’hydrogel favorise la survie de près de 90% desmodèles cellulaires de gliome utilisés dans notreétude et supporte la croissance en trois dimensionsd’agrégats multicellulaires semblables à lamorphologie de micro-tumeurs in vivo. Le modèled’hydrogel est donc validé pour favoriser la viabilitéet la prolifération cellulaires. Les perspectives detravail futures porteront sur l'optimisation de sacomposition pour mimer de manière encore plusréaliste la croissance tumorale in vivo. / Gliomas are brain tumors arising fromanomalous cell proliferation into the brain tissue.The hazard of these tumors resides in their invasiveability : tumor cells migrate into the healthy tissuesurrounding the tumor. These isolated cells causequasi systematic recurrences after treatment(surgery, chemotherapy, radiotherapy) making thesetumors currently incurable and leading to patientdeath. Hence, it is important to associatefundamental studies for better understanding of theirevolution from their origin with more appliedstudies developing new substrates for reproducingtheir evolution in vitro. Oligodendrocyte progenitorcells (OPC) are the most widely spread proliferatingpopulation in the adult brain, which makes them themain suspect of causing gliomas origin. Fromexperimental data in the literature about in vivodynamic of OPC, a mathematical model that depictsthis dynamic into a healthy tissue has beendeveloped.This model also shows that OPC could be at theorigin of all glioma forms from low to high grade.Furthermore, the experimental approach used aimedat designing a cell culture substrate adapted toglioma studies in vitro. Thus, a biocompatible,minimalistic and controllable hydrogel has beenperformed. It mimics brain extracellular matrix(ECM) elasticity around 200 Pa and the adhesiveeffect of ECM molecules involved in tumor celladhesion and proliferation. Due to these properties,the hydrogel contributes to around 90% of gliomacell models survival used in our study and promotesmulticellular aggregates growth in three dimensionsthat look like in vivo microtumors morphology. Thishydrogel model is thus validated for cell viabilityand proliferation. Future works will be devoted tothe optimization of its composition for bettermimicking of tumor growth in vivo in a morerealistic manner.