Protein-protein interactions are essential in biological processes and thus, they have become very promising therapeutic targets. Nevertheless, the artificial modulation of protein complexes remains a challenge. Since most work to date has been focused on the inhibition of protein-protein interactions, there is little precedent on the design of molecules which can induce, stabilize or recover the oligomerization state of proteins. In this context, the system comprised of the tetramerization domain of protein p53 (p53TD) and its oncogenic mutants with defective oligomerization properties is an outstanding case of study for the design and evaluation of molecules which can recover the tetrameric structure. Through a collaboration with Prof. Javier de Mendoza, a family of para-guanidinomethyl-calix[4]arenes able to interact simultaneously with the four monomers of the p53 tetramerization domain was rationally designed; hence, the interaction with these compounds would stabilize the whole tetrameric assembly. In order to evaluate experimentally said calix[4]arenes, three natural oncogenic mutants of the p53TD with defective assembly abilities were biosynthesized. Namely, they are: G334V, R337H and L344P. Once synthesized and purified the calix[4]arenes compounds, their molecular recognition properties were tested through a battery of biophysical techniques, including nuclear magnetic resonances (on both the protein and the ligand), circular dichroism, differential scanning calorimetry, crystallography, mass spectrometry and chemical cross-linking. The results clearly show that these calix[4]arenes interact with the proteins as intended and, the most important, they can thermally and kinetically stabilize the tetrameric state. These results are the perfect evidence of the proof-of-concept initially sought: a little synthetic ligand can stabilize the oligomeric state of proteins which are structurally defective. In addition, the study of several ligands with different functionalizations provides further understanding about the basis of molecular recognition events. On the one hand, the guanidinium group has a vital role for high affinity interactions. On the other hand, structural flexibility, in both the protein and the ligand, enables the molecules to adopt the optimal conformation for the tightest interaction, thereby underscoring the ambiguous and unpredictable role of the entropy in interaction processes. / Las interacciones proteína-proteína son esenciales en muchos procesos biológicos y por ello resultan dianas terapéuticas muy prometedoras. Sin embargo, modular artificialmente complejos proteicos resulta todavía un gran reto. Hasta la fecha, los esfuerzos se han dirigido básicamente hacia la inhibición de interacciones proteína-proteína; pocos precedentes describen el diseño de moléculas que puedan inducir, estabilizar o recuperar el estado oligomérico de proteínas. En relación a lo último, el sistema formado por el dominio de tetramerización de la proteína p53 (p53TD) y sus mutantes oncogénicos con oligomerización defectuosa representa un excelente modelo para el diseño y la evaluación de moléculas que puedan recuperar el estado tetramérico nativo.En colaboración con el Prof. Javier de Mendoza, se diseñaron racionalmente compuestos para-guanidinometil-calix[4]arenos capaces de interaccionar con simultáneamente con las cuatros unidades que estructuran el dominio de tetramerización de p53, de tal modo que podrían estabilizar el estado oligomérico de la proteína. Para la evaluación experimental de dichos ligandos calix[4]arenos, se biosintetizaron tres mutantes naturales de p53TD con tetramerización defectuosa: G334V, encontrado en cánceres de pulmón; R337H, asociado al carcinoma adrenocortical infantil; y L344P, asociado al síndrome Li-Fraumeni.Tras la síntesis y purificación de los compuestos guanidinometil-calix[4]arenos, sus capacidades de interacción con las proteínas se estudiaron por técnicas biofísicas, que incluyen resonancia magnética nuclear (sobre la proteína y sobre el ligando), dicroismo circular, calorimetría diferencial de barrido, calorimetría isotérmica de titulación, cristalografía, espectrometría de masas y entrecruzamiento químico. Los resultados muestran claramente que los calix[4]arenos pueden interaccionar con las proteínas tal y como se habían diseñado; en consecuencia, estos ligandos son capaces de estabilizar térmica y cinéticamente las proteínas mutantes, recuperando así su estado tetramérico.Estos resultados son la perfecta prueba del concepto inicialmente planteado: un pequeño ligando sintético diseñado puede estabilizar el estado oligomérico de proteínas estructuralmente defectuosas. El estudio de varios ligandos con diferentes grupos funcionales también pone de manifiesto otros fenómenos de particular relevancia en el campo del reconocimiento de superficies proteicas. Por una parte, el grupo guanidinio tiene un papel clave para la afinidad de la interacción. Por otra parte, la flexibilidad estructural de ambos componentes: la proteína y el ligando, permite que se establezcan interacciones más estrechas y fuertes, lo que refleja el papel tan ambiguo e impredecible de la entropía en procesos de interacción.

Fragmentos de DNA que contiene características estructurales encontrados en Ser /Thr proteínas fosfatasas fueron amplificados mediante la reacción en cadena de la polimerasa a partir de DNA genómico de levadura. La amplificación se llevó a cabo mediante el uso de oligonucleótidos degenerados correspondientes a secuencias conservadas en las proteínas fosfatasas de tipo 1, 2A y 2B. Un fragmento de amplificación de 215 pares de bases se utilizó para un rastrear una biblioteca de DNA genómico seleccionada por tamaño. Se identificó un clon positivo que se aisló y secuenció. La secuencia de nucleótidos revela un ORF de 2076 pares de bases que codifica una proteína de 692 aminoácidos, a la que hemos denominado Ppz1. La mitad carboxi-terminal de esta proteína está estructuralmente relacionada con la fosfatasa de tipo 1, mientras que la mitad amino-terminal de la mitad de la proteína no está relacionada con las secuencias encontradas en otras proteínas fosfatasas. Esta región es muy rica en residuos de Ser y presenta un elevado número de aminoácidos básicos. Este producto génico representa una nueva clase de proteína fosfatasa en base a su singular estructura. El gen PPZ1, que está situado en el cromosoma XIII, se transcribe como un mRNA de aproximadamente 2,7 kilobases, y se ha encontrado que su cantidad aumenta de 3 a 4 veces a lo largo del cultivo. Hemos generado anticuerpos contra Ppz1 e identificado el producto génico de PPZ1 por análisis de inmunoblot a partir de extractos celulares como una proteína de 75-kDa. La cantidad de la proteína inmunoreactiva aumentó en las células que llevaban varias copias del gen. La interrupción del gen a dado lugar a células viables, sin detectarse cambios fenotípicos, lo que indica que el gen PPZ1 no es esencial para el crecimiento. Los experimentos de Southern blot preliminares en condiciones de baja estringencia han puesto de manifiesto la existencia de una secuencia genómica relacionada con PPZ1, a la que denominamos PPZ2. / DNA fragments containing structural characteristics found in Ser/Thr protein phosphatases were amplified by polymerase chain reaction from yeast genomic DNA. Amplification was carried out by using degenerate oligonucleotides encoding conserved sequences found in type 1, 2A, and 2B phosphatases. A 215-base pair amplification fragment was used to screen a size-selected library of genomic DNA. A positive clone was isolated and sequenced. Its nucleotide sequence reveals a 2076-base pair ORF encoding a 692-aminoacid protein that we called Ppz1. The carboxy-terminal half of this protein is structurally related to type I phosphatases, whereas the amino-terminal half of the protein is unrelated to sequences found in other protein phosphatases. This region is very rich in Ser residues and presents a high number of basic amino acids. Therefore, the gene product, on the basis of its unique structure would represent a novel class of protein phosphatase. The PPZ1 gene, which is located at chromosome XIII, is transcribed as an mRNA of about 2.7 kilobases and the amount of message has been found to increase 3- to 4- fold during the culture. We raised antibodies against Ppz1 and identified the PPZ1 gene product by immunoblot analysis of cell extracts as a 75-kDa protein. The amount of the immunoreactive protein was increased in cells carrying multiple copies of the gene. Disruption of the gene resulted in viable cells, with no detectable phenotypic change, indicating that the gene is not essential for growth. Preliminary Southern blot experiments at low stringency revealed the existence of a genomic sequence related to PPZ1 that we called PPZ2.

Aquest treball consta d'una part principal, on hem estudiat les causes o factors que intervenen en la nucleomorfogènesi espermàtica de dues espècies de cefalòpodes: el decàpode Sepia officinalis i l'octòpode Octopus vulgaris. També consta d'una segona part que l'exposem en forma d'annex, on hem fet uns experiments concrets sobre l'anàlisi i estructura del gen la proteïna phi0, una proteïna específica de l'espermatozoide que interacciona i organitza el genoma de l'Equinoderm Holothuria tubulosa. Hem fet una reexaminació exhaustiva del procés de condensació de la cromatina i nucleomorfogènesi espermàtica de Sepia officinalis i Octopus vulgaris (Apts. IV.1.2 i IV.2.2 respectivament).Hem estudiat i caracteritzat amb detall les proteïnes de la gònada de Sepia officinalis (Apt. IV.1.2b.4),i també mitjançant la generació d'anticossos específics contra dues d'aquestes proteïnes gonadals, hem dut a terme un estudi immunològic que ens ha permès saber quina és la composició de proteïnes de les diferents estructures que adopta la cromatina espermiogènica. Aquests estudis ens han ajudat a comprendre millor la transició proteica que experimenta nucli de l'espermàtida durant l'espermiogènesi de Sepia officinalis.Per altra banda, amb l'objectiu principal de conèixer la naturalesa del tipus d'unió que hem observat en Octopus vulgaris entre la MNP (Matriu Nuclear Polar) i la cromatina, hem iniciat uns estudis preliminars per estudiar-ne les seves propietats fisico-químiques. (Apt. IV.2.2d)Finalment, en la discussió d'aquesta primera part, fem un anàlisi de quina ha estat l'evolució del nucli espermàtic en els cefalòpodes: Sepia officinalis -> Octopus vulgaris -> Eledone.També, amb l'objectiu de corroborar si la proteïna phi0 d'Holothuria tubulosa té el seu propi gen o bé és resultat d'una modificació post-traduccional del gen de la histona H1, hem analitzat l'ARNm de phi0 mitjançant la tècnica de RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends) (Annex I).

The study of chromatin structure in several simple sperm models of increasing complexity was performed. Species demonstrating different types of sperm nuclear protein transitions and structural changes in spermatic chromatin during spermiogenesis were selected as models for comparison: "H" (non-histone proteins are removed), "H->P" (protamine displaces histones), and "H->Pp->P" (precursor protamine displaces histones, and subsequently is converted into the mature protamine). This study has an evolutionary focus, in which a primitive sperm model is identified, from which more complex models may have risen during evolution. The final sperm characteristics achieved are considered to be caused by the changes the immature sperm cell undergoes during the process of spermiogenesis, and are correlated to an adaptation to the fertilization biology of each species. A broader understanding of the variety of sperm shapes, their chemical variability, and the spermatic chromatin condensation patterns pertaining to species of these simple spermiogenic models has been achieved. In this study, the diversity in sperm characteristics is extrapolated to the function the sperm cell has to pass on its genetic material to achieve fertilization of the egg of its own species.For three different models using four marine species, protein transitions, chromatin condensation, and acetylation patterns were described during spermiogeneis. Specifically, changes in chromatin architecture and its protein complement was extensively studied using mainly transmission electron microscopy, inmunocytochemistry using anti-histone, anti-precursor protamine, and anti-acetyl group antibodies, as well as high resolution polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) and western blotting. A model of specialized sperm chromatin (crustacean type) has been included in this study, since for decades this type of chromatin has remained poorly understood. Crustacean type sperm, once believed to have nuclei void of basic DNA-associated proteins, was found to contain histones, and is considered a derivation of the "H" model. Three species of brachyuran crabs from two different families were used to compositionally and ultrastructurally study this unusually decondensed mature sperm chromatin. Characterization of the histones from these sperm using HPLC and amino acid analysis confirm that the basic proteins extracted from sperm of these crabs are indeed typical and canonical histones, though some appear modified by post-translational modifications such as acetylation, which has never before been described in mature sperm. Additionally, in Maja brachydactyla, histones H3 and H2B appear in stoichiometric amounts different to what would be found in somatic chromatin. By performing micrococcal nuclease digestions, the presence of nucleosomes (or nucleosome-like particles) in the sperm of these species was confirmed, and demonstrated that histones are found interacting with the sperm DNA. Further, the histone/DNA ratio was evaluated in two Cancer species, and it was determined that these sperm only contain slightly over half the amount of basic protein per DNA unit compared to other sperm types. These results concerning the composition of the crustacean-type sperm chromatin help to explain its decondensed nature.

Els receptors d'adenosina són receptors acoblats a proteïna G classificats en A1, A2A, A2B i A3 en funció del grau d'afinitat pel seu agonista endogen, l'adenosina. Els receptors A1 i A3 interaccionen amb l'adenilat ciclasa (AC) inhibint la seva activitat i els receptors A2A I A2B activant-la. El receptor d'adenosina A1 (A1R) té un paper clàssicament neuroprotector mentre que el receptor A2A (A2AR) està associat a neurotoxicitat, dany neuronal i mort cel·lular. Les malalties neurodegeneratives són un conjunt de patologies que presenten dèficit cognitiu o alteracions motores en funció del tipus neuronal que degenera i que, bioquímicament s'anomenen proteïnopaties, perquè acumulen agregats proteics.L'objectiu d'aquest estudi ha estat l'anàlisi dels nivells d'expressió dels receptors d'adenosina en la malaltia de grans argiròfils (AGD), la malaltia d'Alzheimer (AD) i la malaltia de Parkinson (PD). En aquest punt, hem descrit un increment dels receptors A1R en l'hipocamp de pacients amb AGD i un increment dels receptors A1R i A2AR en el còrtex frontal de pacients amb AD des de estadiatges preclínics. Paral·lelament s'ha detectat un augment dels receptors A2AR en el nucli estriat de pacients amb PD que encara no han rebut tractament farmacològic. Altres autors havien descrit increments del receptor tot i que sempre associat a tractaments de llarga durada amb Levodopa (L-Dopa). A partir d'aquest resultat i per tal de conèixer el mecanisme molecular implicat en l'increment patològic del receptor vam afrontar el segon objectiu del treball: l'estudi de la regulació transcripcional del gen ADORA2A, gen que codifica pel receptor A2AR.Es va estudiar el percentatge de metilació de l'extrem 5'UTR del gen ADORA2A, tant en línies cel·lulars com en l'estriat de pacients amb PD i el paper de dos factors de transcripció, ZBP-89 i Yin-yang 1(YY1), en l'increment patològic del receptor. La metilació de l'ADN és un dels principals mecanismes de repressió de l'expressió gènica. Hem demostrat que el percentatge de metilació en l'extrem 5'UTR del gen ADORA2A controla els nivells d'ARNm del receptor en línies cel·lulars tot i que no hem observat canvis en el percentatge de metilació en el nucli estriat de pacients amb PD respecte els pacients controls. A més, hem demostrat, per primera vegada, que els factors de transcripció ZBP-89 i YY1 actuen com activador i repressor, respectivament, del receptor A2AR en les cèl·lules SHSY-5Y. En els pacients de PD no s'han observat canvis en l'expressió del ZBP-89 però sí, un increment tant a nivell d' ARNm com de proteïna del YY1. Conjuntament, per microscopia confocal, hem observat que YY1 està localitzat tant als nuclis de les cèl·lules positives com negatives pel receptor A2AR. En conclusió, el percentatge de metilació no varia en les regions analitzades entre controls i patològics. Tot i així, hem demostrat un increment patològic de YY1 en pacients amb PD i, com que està descrit que els nivells d'AMPc controlen l'expressió del factor de transcripció, ens permet proposar la hipótesis per la qual un increment de YY1 pot representar un mecanisme de regulació retrògrada del A2AR per tal de reduir-ne els nivells a PD. / Adenosine is a nucleoside distributed throughout the entire organism as an intermediary metabolite. At the extracellular level, adenosine plays multiple physiologic roles, interacting with specific receptors: A1, A2A, A2B and A3. Adenosine receptors A1 and A2B have been related in neuroprotective role and adenosine activity through A2 receptors (A2ARs) can give rise to neurotoxicity, neuronal damage and cellular death. In this work we have devolve two main points. First of all we characterized the adenosine receptor expression levels in neurodegenerative disease: Argirofilic grains disease (AGD), Alzheimer disease (AD) and Parkinson disease (PD). We described an increase of A1R in hippocampus of patients with AGD, increased levels of A1 and A2A in frontal cortex of patients with AD in early stages. We observed an increase of de A2A levels in striatum in PD patients with any treatment at all. Trying to know the molecular reason of the pathological expression levels of A2A R we studied the percent of methylation of 5'UTR of ADORA2A which codifies by A2aR in cell lines and in post-mortem tissue of patients of PD. We conclude that DNA methylation plays a role in a constitutive A2AR cell surface level, but no changes were observed comparing PD patients and controls. By the other hand, we studied the role of two transcription factors ZBP-89 and Yin-yang 1 (YY1) in the A2AR expression level. We conclude ZBP-89 active and YY1 repress the expression of the receptor in SHSY-5Y lines.

Els objectius d'aquesta tesi van ser plantejats per tal d'aprofundir en l'estudi de la implicació de la proteïna p27(kip1) en processos de tumorogènesi i metàstasi, donat que els nivells baixos de p27(kip1) son cosiderats un factor de mal pronòstic en els càncers humans. Així doncs, els objectius proposats pel desenvolupament d'aquest treball són els següents: · Identificació de noves proteïnes d'unió a p27(kip1)· Caracterització funcional de les noves interaccions amb p27(kip1)· Implicació d'aquestes noves funcions de p27(kip1) amb el cicle cel·lular i càncer.

D'acord amb el comitè de nomenclatura gènica (HGNC) de l'organització del genoma humà (HUGO), es defineix com a proteïna HERC tota aquella proteïna que conté com a mínim i de forma conjunta un domini HECT i un domini RCC1 like (RLD) en la seva seqüència. En l'actualitat s'han identificat 6 membres per aquesta família de proteïnes d'entre les quals la proteïna HERC1 és la primera que es va identificar i el membre fundador de la família. La identificació d'aquesta proteïna va tenir lloc mitjançant la búsqueda de seqüències oncogèniques humanes a partir de cèl·lules de càncer de mama, i tot i que s'ha observat la seva sobrexpressió en diferents càncers, i que s'ha descrit la seva interacció amb difererents proteïnes involucrades amb processos de tràfic de membrana, a dia d'avui no es coneix encara quina es la seva funció fisiològica. L'objectiu principal d'aquesta tesi ha estat l'estudi del paper de la proteïna HERC1 en la via de senyalització de mTOR. Amb l'objectiu de facilitar aquest estudi vàrem idear en primer lloc un sistema per a l'estudi de proteïnes gegants per PAGE/SDS que al mateix temps ens permetés l'anàlisi de proteïnes amb pesos moleculars menors en un sol gel. Aquest sistema el vàrem anomenar LAG gel (Low Acrylamide Gradient gel), i consisteix en un gel que combina de forma contínua un gel de poliacrilamida de baix percentatge d'acrilamida (4%) i una proporció menor de l'habitual d'acrilamida:bisacrilamida (80:1) (que permet l'entrada de les proteïnes gegants al gel) amb un gel en gradient del 6 al 15% amb una proporció acrilamida/bisacrilamida de 40:1. Hem comprobat que aquest sistema permet separar proteïnes des de 5 KDa fins a proteïnes gegants en únic gel, amb els avantatges que això comporta pel que fa al estalvi de temps i de reactius. A l'any 2006, en col·laboració amb el nostre laboratori, es va descriure que HERC1 interacciona amb la tuberina (TSC2), una proteïna que juntament amb l'hamarina (TSC1) forma el complex de l'esclerosi tuberosa (TSC). Aquest complex actua com a regulador negatiu de la via de senyalització de mTOR, estimulant l'activitat GTPasa de Rheb a través del domini GAP de TSC2. En aquest treball hem comprovat que HERC1 s'associa als dos components de l'esclerosi tuberosa (tuberina i hamartina) estabilitzant aquest complex. A més a més, hem observat com aquesta interacció té lloc en menor grau amb els mutants de TSC2 identificats en pacients d'esclerosi tuberosa R611Q i R905Q, és independent de la inhibició de la via de señalización de mTOR induïda por dejuni o de la seva activació mitjançant aminoàcids o insulina. En canvi, tot i aquestes interaccions, HERC1 no sembla participar en la fosforilació de proteïnes involucrades en la via de mTOR com les p70 S6K, 4EBP1, Akt o S6, ni tampoc en la regulació del procés de l'autofàgia. En canvi, si que afecta a un altre procés mTOR dependent com és la biogénesi de ribosomes. En aquest sentit hem pogut comprovar mitjançant experiments de silenciació del gen d'HERC1 que la disminució dels nivells d'HERC1 provoca disminucions significatives dels nivells d'ADN ribosomal 18S així com de l'actividad del promotor d'aquest gen.La realització d'experiments d'activació amb aminoàcids per a l'estudi del paper de la proteïna HERC1 en la via de senyalització de mTOR ens va permetre observar que el tractament amb aminoàcids indueix la fosforilació de una proteïna de 80-90 KDa, però no de la isoforma p70 de la S6K1. Aquesta observació ens va portar a l'estudi de l'activació de la p70 S6K1 en resposta a aminoàcids, observant que en respuesta a aquests nutrients es produeix l'activació de les proteïnes quinasa activades por MAPKs (MKs), RSK y MSK. A més a més, hem vist que l'activació d'ambdues quinases té lloc en resposta a la activació de les MAPKs, Erk o p38, a través d'un mecanisme compensatori en el qual quan la Erk es troba inhibida, l'activació de la RSK i MSK té lloc a través de p38 i viceversa. / According to the Human Genome Organization (HUGO) Gene Nomenclature Committee (HGNC), HERC proteins are defined as those proteins containing both RLD and HECT domains in their amino acid sequence. Currently, six HERC proteins have been identified. The physiological role of HERC1, the founding member of the family, still remains to be clarified. The main objective for this thesis has been the study of HERC1 role in the mTOR signalling pathway. First, we created a new system to study giant and smaller proteins by means of PAGE/SDS in a unique gel. We called it LAG gel (Low Acrylamide Gradient gel) and is formed by the combination of a low percentage acrylamide gel (4% and a ratio Acrylamide/Bisacrylamide 80:1) and a gradient gel (6-15%, A/B 80:1). This system permits to analyze simultaneously giant and smaller proteins in a unique gel obtaining good separation ressolutions for all proteins and to save time and reactants. It's been described that HERC1 is able to interact with TSC2 (tuberin), a protein which together with TSC1 (hamartin) constitutes the tuberous sclerosis complex (TSC). This complex acts as a negative regulator of the mTOR signalling pathway through the stimulation of Rheb GTPase activity by TSC2 GAP domain. We have proved that HERC1 interacts with both TSC members (tuberin and hamartin) stabilizing it. Furthermore, we have observed that this interaction is lower with TSC2 mutants identified from tuberous sclerosis patients, R611Q and R905Q and is independent of mTOR signalling pathway inhibition by starving or activation by aminoacids or insulin. Despite these interactions, HERC1 isn't involved in the phosphorylation of some mTOR signalling pathway proteins such as p70 S6K, 4EBP1, Akt, S6, nor in the regulation of Autophagy. However, HERC1 is involved in the mTOR dependent process of ribosome biogenesis. We have proved that the HERC1 gene knock down causes a significant decrease of the 18S ribosomal DNA as well as a reduction of the activity of the promoter of this gene.The performance of activation assays with aminoacids in the study of the HERC1 role in the mTOR signalling pathway permitted us to observe that this cell treatment induce the phosphorylation of a 90 KDa protein and a 110 KDa protein, but not the p70 isoform of S6K1. We have seen that these 90 and 110 KDa bands correspond to the kinases activated by MAPKs (MKs), RSK and MSK. Furthermore, we have proved that the activation of both kinases takes place in response of the activation of the MAPKs, Erk or p38 through a compensatory mechanish in which when Erk is not active, the RSK and MSK activation is induced by p38 and viceversa.

The assessment of the electrical properties of biomolecules at the nanoscale becomes necessary for gathering previous basic knowledge and for the control of the biosensor fabrication. I developed instrumentation, protocols, and theoretical frameworks for the nanoscale electrical characterization of biomolecules by AFM. Two novel types of AFM electrical characterizations were developed: electron transport through the biomolecules and dielectric polarization of the biomolecules (each one requires different instrumentation, protocols and theory). I succeeded in obtaining important electrical information on individual biomolecules with implications in electrical biosensor fabrication.KEY WORDS: AFM, Protein, Electrical, Biosensor

L'ATP és una molècula molt carregada elèctricament important per a l'obtenció de l'energia necessària per l'activitat cel·lular. A més a més, també actua com a molècula de senyalització cel·lular. Normalment, la secreció controlada d'ATP té lloc a través de l'exocitosi de grànuls o vesícules. Tot i això, en algunes cèl·lules, altres mecanismes poden controlar l'alliberació d'ATP. En aquesta tesi s'han estudiat dos d'aquests mecanismes: l'alliberació d'ATP a través de la proteïna CD39 i l'alliberació d'ATP a través de connexines.La CD39, o NTPDasa 1, és una proteïna que hidrolitza nucleòtids trifosfat i difosfat fins a nucleòtids monofosfat. Resultats anteriors del nostre laboratori suggerien que, aplicant polsos hiperpolaritzants en la membrana dels oòcits de Xenopus, l'ectoenzim NTPDasa1 podia esdevenir permeable per l'ATP. Continuant amb l'estudi d'aquesta proteïna, es va voler determinar també si estava relacionada amb l'alliberació d'ATP induïda per estrès hipertònic descrita en oòcits. Per portar a terme aquests estudis, era necessari aconseguir un oligonucleòtid antisentit contra la CD39 dels oòcits de Xenopus. Per tant, el nostre primer objectiu va ser sintetitzar i validar aquest oligonucleòtid, per tal de poder-lo utilitzar posteriorment a l'hora de fer els experiments. Mitjançant el disseny de dos oligonucleòtids antisentit per dita proteïna es va mesurar l'alliberació d'ATP en grups d'oòcits injectats amb els oligonucleòtids i en grups control, després de ser sotmesos a un xoc hiperosmòtic. Al mateix temps, per a comprovar l'efectivitat dels oligonucleòtids injectats, es va mesurar l'activitat ATPàsica en aquests oòcits. Es va observar com l'antisentit per la CD39 reduïa de manera significativa l'alliberació d'ATP i el corrent iònic després de 13 minuts d'exposició hipertònica.Els hemicanals, formats per connexines, és un altre dels possibles mecanismes de regulació de l'alliberació d'ATP. En les gap junctions, les connexines uneixen el citoplasma de dues cèl·lules adjacents establint un canal intercel·lular que permet el pas d'ions i molècules més petites d'1 KDa. Es va estudiar aquest mecanisme en oòcits de Xenopus, estudiant la Cx38, un tipus específic de connexina endògena dels oòcits, i la Cx32, expressada en els oòcits de manera heteròloga. En els experiments amb la Cx38, vam observar que solucions lliures d'ions divalents activaven un corrent d'entrada en els oòcits que era inhibit per octanol i àcid flufenàmic, dos inhibidors de les gap junctions. Aquest corrent sensible a calci, depenia de l'expressió de Cx38: disminuïa en oòcits injectats amb un oligonucleòtid antisentit per la Cx38 (ASCx38) i augmentava en oòcits que sobrexpressaven la Cx38. A més, l'activació dels hemicanals de Cx38 induïa l'alliberació d'ATP, la qual era inhibida per l'àcid flufenàmic, l'octanol i l'ASCx38 i augmentada en la sobrexpressió de Cx38. Aquests resultats suggerien que l'activació dels hemicanals era responsable de l'alliberació d'ATP en els oòcits de Xenopus.D'altra banda, vam investigar l'alliberació d'ATP a través dels hemicanals formats per Cx32 expressada en oòcits. Aquesta proteïna s'expressa en la majoria d'òrgans humans, però, particularment, mutacions de la Cx32 en les cèl·lules de Schwann produeixen la malaltia de Charcot-Marie-Tooth lligada al cromosoma X (CMTX). En oòcits que expressen la Cx32, vam combinar l'ús de tècniques de fixació de voltatge per registrar els corrents iònics generats pels hemicanals i la reacció bioluminiscent de la luciferina-luciferasa per mesurar l'alliberació d'ATP. Els hemicanals formats per la Cx32 eren estimulats mitjançant polsos despolaritzants generant un corrent iònic de sortida. Després de l'estimulació, en el període de repolarització, hi havia un corrent de cua que coincidia amb el moment d'alliberació d'ATP. L'àrea d'aquest corrent tenia una relació lineal amb la quantitat d'ATP alliberada. El conjunt de resultats d'aquesta tesi ens suggereixen que, tant les connexines com la CD39, participen en l'alliberació d'ATP a través de la membrana plasmàtica. / ATP is an electrically charged molecule required to obtain the energy necessary for cellular activity; in addition, it is an intercellular signaling molecule. Usually, the controlled secretion of ATP occurs through the exocytosis of granules and vesicles. However, in some cells, other mechanisms control ATP release. Two of these mechanisms have been studied in this thesis: ATP release through CD39 and ATP release through connexin hemichannels. CD39, or NTPDasa 1, is a protein that hydrolyze nucleotide triphosphates and nucleotide diphosphates to nucleotide monophosfates. To study its relationship with ATP release we have synthetized an antisense oligonucleotide against Xenopus oocyte CD39. Our results indicate that the antisense against CD39 significanty reduce ATP release and also the ionic current due to the activation of CD39 by hypertonic solution. It has been suggested that hemichannels, formed by connexins, may be an alternative pathway for ATP release. In gap junctions, connexins link the cytoplasm of two adjacent cells by establishing an intercellular channel. We have investigated the release of ATP from Xenopus oocytes through hemichannels formed by connexin 38 (Cx38), an endogenous, specific type of connexin, and by connexin32 (Cx32) heterologously expressed in Xenopus oocytes. In Xenopus oocytes, calcium-free solution reversibly activates an inward current that is inhibited by octanol and flufenamic acid. This calcium-sensitive current depends on Cx38 expression: it's decreased in oocytes injected with an antisense oligonucleotide against Cx38 (ASCx38) and is increased in oocytes overexpressing Cx38. Moreover, the activation of Cx38 also induce the release of ATP, which is inhibited by flufenamic acid, octanol and ASCx38 and increased by Cx38 overexpression. Connexin 32 is expressed in most of human organs but, particularly, Cx32 mutations present in Schwann cells produce X-linked Charcot-Marie-Tooth disease. In oocytes expressing Cx32, application of depolarizing pulses to positive potentials induce outward hemichannel currents that become inward during the repolarization phase. The release of ATP occurred during the repolarization period and the amount of ATP released correlate with the area of the tail current.

In the present thesis we have explored different factors that impede accurate quantitative description of non-covalent protein-protein and protein-ligand interactions and design of new potent and specific binders from the scratch. Firstly, we addressed the role of solvent in the mechanism of non-covalent interactions. Secondly, we tackled the question about the intrinsic conformational flexibility of the protein molecules and the part it plays in weak interactions between proteins. In the first part of the thesis we studied the interactions of vascular endothelial growth factor (VEGF) protein with five cyclic peptides in solution and gas phase. The results showed that affinities of five ligands to VEGF in solution and gas phase are ranked in inversed order. That is, the that has the highest affinity in solution (as shown by chemical shift perturbation NMR and isothermal titration calorimetry) forms the weakest complex with VEGF in gas phase, and vice versa. We compared gas-phase and solution binding affinities of of five peptides and made qualitative conclusions about the role of the solvent in protein-ligand interactions. In order to obtain more quantitative information about the gas-phase behavior of non-covalent complexes we have developed a combined experimental/theoretical approach to study the energetics of collisional activation of the ion prior to dissociation. We applied developed strategy to model CID in traveling wave ion guide (TWIG) collision cell. We validated the model on the CID of leu-enkephalin peptide and then applied developed strategy to five non-covalent protein-peptide complexes and found activation energies of their dissociation reactions. Next we applied ESI native MS to study the allosteric interactions between the molecular chaperonin GroEL and ATP. The obtained data allowed to construct a scheme of conformational transition of GroEL upon binding of ATP and distinguish between two different cooperativity models, providing strong arguments in favor of Monod-Wyman-Changeux (MWC) model. Finally, be studied the backbone dynamics of VEGF with a combination of NMR relaxation and all-atom force-field based normal mode analysis (NMA). We showed that combination of experimental and computational approach allows to identify flexible zones with higher level of confidence. We also found out that residues, that are involved VEGF-receptor interactions, reside in or close to the flexible zones, suggesting the critical role conformational plasticity plays in the non-covalent protein-protein interactions. / Las biomoléculas de los organismos vivos realizan sus funciones principalmente a través de interacciones débiles reversibles entre ellas. La transducción de señal, la replicación de ADN/ARN, otros procesos enzimáticos y, virtualmente, cualquier otro proceso involucrado en las funciones vitales de cualquier organismo vivo (de las simples amebas, al complejo ser humano), requiere que las moléculas “hablen” entre ellas. Dicho lenguaje se basa en interacciones no covalentes. La flexibilidad conformacional es una propiedad esencial de las grandes biomoléculas, y muchas de las funciones desempeñadas por proteínas se basan en su capacidad para cambiar de conformación en respuesta a un factor externo. Geométricamente hablando, la presencia de flexibilidad en una proteína obstaculiza el diseño racional de medicamentos porque posibilita la existencia de un número muy elevado de conformaciones de dicha proteína. Por este motivo, cualquier información sobre la flexibilidad de una proteína es sumamente valiosa para la comprensión de PPI y PLI y para el diseño racional de medicamentos. Los capítulos 1-3 de la presente tesis versan sobre la solvatación, mientras que la flexibilidad se estudiara en el capitulo 4.