L'objectiu general d'aquest treball és el d'aprofundir en l'estudi de les sinucleïnopaties, principalment a nivell bioquímic, en les interaccions de l'alfa-sinucleïna amb altres proteïnes del cervell humà per tal d'estudiar l'efecte de la unió en aquestes patologies. També hem volgut comprovar la similitud de les sinucleïnopaties humanes amb un model animal transgènic per a la forma humana mutada de l'alfa-sinucleïna. D'altra banda i també relacionat amb aquestes neurodegenarions, s'ha estudiat de quina manera resultaven afectats diferents marcadors de l'estrès oxidatiu, que se sap juga un important paper en el desenvolupament d'aquestes patologies. Mitjançant estudis d'immunoprecipitació i de pull-down en cervell humà s'ha trobat interacció de l'alfa-sinucleïna amb les proteïnes sinàptiques rab3a i rabfilina a córtex de la sinucleïnopatia anomenada Demència amb cossos de Lewy (DLBD), i no en cervells control. Donada la interacció anòmala amb aquestes proteïnes sinàptiques podem afirmar que a DLBDs la transmissió sinàptica es troba alterada, i una de les causes és la interacció anòmala de l'alfa-sinucleïna amb rab3a i rabfilina. Aquest tipus d'interacció també s'ha estudiat a l'MSA o Atròfia Sistèmica Múltiple, una sinucleïnopatia que té afectat sobretot el cerebel, i no el córtex, com les DLBDs. Doncs, tot i estar classificada com a sinucleïnopatia a part, hem observat la mateixa interacció anòmala tan a cerebel com escorça de pacients d'MSA, suggerint-se un mecanisme comú de neurodegeneració per a totes les sinucleïnopaties. Paral.lelament també hem estudiat la via de transducció glutamatèrgica a pacients amb DLBDs, i s'ha trobat que en condicions normals exiteix interacció de l'alfa-sinucleïna amb un efector del receptors metabotròpics del glutmat tipus I, com és la PLC-beta-1. Al mateix temps, i a través d'estudis de solubilitat, s'han observat canvis en la solubilitat de PLC-beta-1 en aquestes patologies, tal com succeeix amb l'alfa-sinucleïna.Quan s'han estudiat marcadors d'estrès oxidatiu per una forma primerenca de la malaltia de Parkinson s'han trobat alterats a córtex d'aquest pacients, quan la patología, en els primers estadis només es detecta fins ara a substància negra. Per tant, l'estrès oxidatiu a córtex d'una forma pre-clínica de la malaltia de Parkinson, ja té un paper en el desenvolupament d'estadis posterior de la malaltia, com podrien ser les DLBDs. / The aim of this work is to study alpha-synuclein interactions in human brain to deep on the knowledge of a group of neurodegenerative diseases called synucleinopathies in which alpha-synuclein accumulates in the form of Lewy bodies. In human cortex we found alpha-synuclein interactions with the synaptic proteins rab3a and rabphilin in Dementia with Lewy Bodies (DLBDs) patients, and not in control brains. This interaction is corroborated in transgenic mice expressing human A30P human mutated alpha-synuclein. When a different synucleipathy , like Multiple Systemic Atrophy (MSA), is studied we found the same anomalous interaction even different areas were affected, cerebellum vs cortex in the case of MSA and DLBDs, indicating a common neurodegenerative mechanism for the synucleinopathies group. Also in DLBDs we studied the glutamatergic signal transduction pathway immunoprecipitating alpha-synuclein from brain cortex and we found that PLC-beta-1, an effector of the metabotropic glutamate receptors (mGLuR1) binds to alpha-synuclein only in control conditions and not in DLBDs. At the same time PLC-beta-1 showed changes in solubility like alpha-synuclein in DLBDs. So, the results presented here indicate a kind of relation between alpha-synuclein and PLC-beta-1 in DLBDs which damage can affect the mGLuR1 transduction pathway which is altered in cortex from DLBDs.The other factor studied in this work is the oxidative stress effect in brain cortex from early stages Parkinson's disease (PD) patients. We found an increase of the oxidative stress markers used in this work indicating that oxidative stress in cortex from PD patients starts at early stages in human cortex, even though in early stages only the substantia nigra seems to be affected. This markers of oxidative stress were also studied in Alzheimer's disease (AD) obtaining similar results. Finally another point of this work is the study of the Amyloid Precursor Protein (A-beta-PP) mRNA isoforms in human cortex from DLBDs. We found a relative increase of the isoforms contained the Kunitz Protease Inhibitor, implicating A-beta-PP the isoforms processing in the developing of DLBDs

DE LA TESIS:El DAG es esencial para formar los intermediarios de transporte que se dirigen a la membrana plasmática. Sin embargo, no existen evidencias de su posible participación en las etapas tempranas de la vía secretora. Por tanto, nos centramos en averiguar la implicación del DAG en el transporte de proteínas en la zona del ER/Golgi. Para ello, utilizamos una variedad de fármacos conocidos que inhiben las enzimas responsables de la producción del DAG. Nuestros datos indican que el DAG está implicado en la formación de vesículas COPI en el compartimento temprano del Golgi, concretamente en el proceso de fisión, a través del reclutamiento de ArfGAP1. Posteriormente, estudiamos si la LPP3 (PAP2b) era una de las enzimas responsables de controlar los niveles necesarios de DAG en el cis-Golgi para la formación de las vesículas COPI y la regulación del transporte retrógrado. Para determinar el papel de la LPP3 en la regulación de los niveles de DAG y en la organización y transporte asociado a este compartimento seguimos dos estrategias experimentales: ARN de interferencia para disminuir la expresión de la LPP3 y vectores de expresión para aumentarla. Los resultados sugieren que la LPP3 regula la producción de DAG en las membranas de Golgi y, además, que participa en la organización estructural y funcional del complejo de Golgi, al menos en el transporte retrógrado.Paralelamente, estudiamos si la PKC epsilon era un efector del DAG en el Golgi implicado en la formación de las vesículas COPI. El DAG actúa como un segundo mensajero modulando la localización y la actividad enzimática de ciertas proteínas citoplasmáticas en el Golgi. Estas proteínas tienen un dominio de unión a DAG (dominio C1) que le permite su interacción directa con este lípido y así regular diferentes procesos asociados al Golgi. La PKD se recluta al TGN a través de su unión con el DAG y resulta esencial para la formación de intermediarios de transporte en el TGN. Teniendo en cuenta que la PKC epsilon interacciona con el coatómero, pensamos que podría ser un buen candidato para regular el transporte ER/Golgi de forma similar a la que PKD realiza en el TGN. Nuestros resultados muestran que la PKC epsilon se recluta en el Golgi de manera dependiente de DAG, pero no parece participar en el transporte retrógrado en la zona endoplasmático /complejo de Golgi.

Las proteínas de la superfamilia Ras son pequeñas proteínas G monoméricas de pesos moleculares de entre 20 y 40 kDa que actúan como interruptores moleculares regulando el inicio, duración y finalización de una gran variedad de funciones celulares (Takai, Yoshimi et al. 2001). Esta superfamilia comprende más de 150 proteínas (Fig. 1) con homólogos encontrados en Drosophila, C.Elegans, S. cerevisiae, Dictyostelium y en plantas. Las proteínas Ras más conocidas y estudiadas, H, N y K-Ras, son los miembros fundadores de esta gran familia, la cual se divide en 5 subfamilias en base a similitudes en la secuencia y funcionalidad de las proteínas que las componen: Ras, Rho, Rab, Ran y Arf (Fig. 2) (Wennerberg, Krister et al. 2005) Además de compartir una estructura parecida, todas estas proteínas tienen unas características generales comunes: tienen capacidad de unir nucleótidos de guanina (GTP o GDP), poseen actividad GTPasa intrínseca y necesitan estar unidas a sistemas de membrana para realizar su función.Las GTPasas de la superfamilia Ras funcionan como interruptores moleculares regulados por la unión al nucleótido GTP o GDP. Existen unas secuencias consensus, llamadas "G box", comunes a todas las proteínas de la superfamilia Ras, en el extremo N-terminal (Takai, Yoshimi et al. 2001). Estas secuencias son las responsables para la interacción con GDP o GTP y para la actividad GTPasa.Estas pequeñas GTPasas tienen una elevada afinidad por el GDP y el GTP y presentan baja actividad GTPasa intrínseca. El ciclo GDP/GTP está controlado por dos tipos de proteínas reguladoras: Las proteínas intercambiadoras de nucleótidos "GEFs" (Guanine-nucleotide-exchange factors) promueven la formación de la forma activa de la GTPasa unida a GTP (Schmidt, Anja and Hall, Alan 2002) (Mitin, N. et al. 2005) y las proteínas "GAPs" (GTPase-activating proteins) aceleran la hidrólisis del GTP y por tanto aceleran la formación de la forma inactiva de la GTPasa unida a GDP(Bernards, Andre and Settleman, Jeffrey 2005). Las GTPasas de una misma rama de la superfamilia pueden compartir o no diferentes GEFs y GAPs. Las GTPasas de ramas diferentes presentan diferentes GAPs y GEFs en cuanto estructura pero que, mecanísticamente son similares.El que la GTPasa esté unida a GTP o GDP comporta dos conformaciones similares pero muy distintas en dos regiones muy concretas de la proteína: la Switch I y la Switch II. El cambio conformacional de la proteína unida a GTP posee una elevada afinidad por los efectores. Estos cambios en el Switch I y II son los que permiten a las proteínas reguladoras, GAPs y GEFs y, a las efectoras, sensar el nucleótido al que la GTPasa se encuentra unido. Las proteínas Arf y las proteínas Ran tienen secuencias en el extremo amino y carboxi terminal respectivamente, que también sufren unos cambios conformacionales significativos al estar unidas a GTP o GDP. En general las GTPasas son activas cuando se encuentran unidas a GTP, pero, para las proteínas Rab, Arf y Ran el estar unidas a GDP comporta también unas determinadas funciones específicas.La presente tesis se concentra en dos objetivos: el primero, determinar el dominio de unión de K-Ras a Calmodulina, y el segundo, investigar cómo afecta esta interacción a la funcionalidad de K-Ras

Els transportadors del sistema L faciliten el moviment d'aminoàcids grans i neutres a través de les membranes cel·lulars. Fins el moment es coneixien 3 proteïnes capaces d'induir aquesta activitat de transport: LAT1, LAT2 i LAT3. En aquets treball s'ha identificat LAT4, un nou transportador d'aminoàcids de la família SLC43 que guarda un 57% i un 30% d'identitat amb LAT3 i EEG1, els altres dos membres de la família. La proteïna es glicosila i arriba a la membrana plasmàtica de les cèl·lules HeLa i dels oòcits de Xenopus laevis quan es sobreexpressa. El RNA missatger de LAT4 s'expressa majoritàriament a placenta, intestí i ronyó. Més concretament, mitjançant hibridació in situ, hem detectat el missatger de LAT4 a cèl·lules dels túbuls distals i dels conductes col·lectors del ronyó, i a les cèl·lules de la cripta i la base de l'enteròcit a l'intestí prim. L'expressió de LAT4 en oòcits de Xenopus laevis indueix una activitat de transport d'aminoàcids neutres i grans; sodi, clorur i pH independent i que s'inhibeix per l'anàleg d'aminoàcids no metabolitzable BCH. Aquestes propietats concorden amb el subsistema prèviament descrit L2 i afegeixen un quart transportador responsable de l'activitat del sistema L. L'activitat de transport induïda, no és transestimulable, i possiblement es tracti d'un mecanisme de difusió facilitada. El transport induït per LAT4 mostra una cinètica de dos components, on les constants d'afinitat són de 4,7+/-0,5 mM i 178+/-29 mil.limicres pel component de baixa i alta afinitat, respectivament. L'agent alquilant de grups sulfidrils, N-etilmaleïmida (NEM) inhibeix parcialment l'activitat de transport induïda per LAT4 i efecte específicament el component de baixa afinitat. A més a més, hem identificat el mutant LAT4 S297A insensible al pretractament amb NEM. Al model cel·lular de ronyó PCT, es detecta una activitat de transport de baixa afinitat a la cara basolateral compatible amb la descrita per LAT4.EEG1, el tercer membre de la família SLC43, es glicosila i expressat en sistemes heteròlegs arriba a la membrana plasmàtica de la cèl·lula, però no indueix activitat de transport pels aminoàcids assajats. El RNA missatger de EEG1 es detecta majoritàriament a cor, fetge, i en menor grau a ronyó, pulmó i placenta, tant en teixits humans com de ratolí. S'ha generat un anticòs contra la proteïna que permet la seva detecció a ronyó, intestí i pulmó amb diferents patrons de glicosilació. També s'ha generat un model murí amb EEG1 mutat, mitjançant l'exposició a l'agent altament mutagènic etilnitrosurea (ENU). La mutació puntual detectada, introdueix un codó stop prematur concretament a la posició de la tirosina 221, que trunca la proteïna aproximadament a la meitat. Els ratolins homozigots per la mutació són viables, fèrtils i segueixen una herència mendeliana. No existeixen diferències pel que fa al pes dels animals mutants i control. No hiperexcreten aminoàcids en orina, ni tenen nivells elevats d'aminoàcids en sang. Presenten alteracions histopatològiques al ronyó i al fetge. Suggerim que EEG1 no té un paper rellevant en la reabsorció renal d'aminoàcids sense descartar una possible compensació per altres transportadors. / System L amino acid transporters mediate the movement of bulky neutral amino acids across cell membranes. Until now, three proteins that induce system L activity have been identified: LAT1, LAT2 and LAT3. In the present study we identify a new cDNA, designated LAT4, which also mediates system L activity when expressed in Xenopus laevis oocytes. Human LAT4 exhibits 57% identity to human LAT3 and 30% to EEG1. LAT4 protein is glycosylated and reaches plasma membrane in HeLa cells and Xenopus oocytes when LAT4 is overexpressed. LAT4 mRNA is expressed mainly in placenta, small intestine and kidney. In situ hybridization experiments show that LAT4 mRNA is restricted to the epithelial cells of distal tubule and the collecting duct in the kidney and in the cells of the crypt in the intestine. Like LAT3, the amino acid transport activity induced by LAT4 is sodium-, chloride- and pH-independent, is not trans-stimulated, and shows two kinetic components. The low affinity component of LAT4 induced activity is sensitive to the sulfhydryl-specific reagent N-ethylmaleimide (NEM) but not that with high affinity. Mutation in LAT4 of the SLC43 conserved S 297 to A abolishes sensitivity to NEM.EEG1, the third member of SLC43 is glycosylated and when is expressed in heterologous system it reaches the plasma membrane. EEG1 mRNA is expressed mainly in heart and liver, but also is present in kidney, lung and placenta. We generated an antibody able to recognize EEG1 from kidney, small intestine and lung with different patterns of glycosylation. We also generated an EEG1 mutated mouse model caused by the chemical mutagen N-ethyl-N-nitrosurea (ENU) which introduced a point mutation resulting in a truncated protein in amino acid position 221. The homozygous mutant mice were born at normal Mendelian ratios when intercrossing between the heterozygous mice, indicating that there was no embryonic mortality in the mutant animals. Homozygous mice do not hyperexcrete any amino acid in urine and no high level of amino acids in plasma were found. Histopathological studies of the kidney and liver reveal damage alterations in both tissues.

ANTECEDENTSEl coneixement de Ies diferents activitats de transport d'aminoàcids prové de l'anàlisi del transport d'aquests en cèl.lules o vesícules de membrana provinents del teixit que es vol analitzar. A causa de la presència escassa d'aquestes proteïnes en la membrana i també la seva baixa estabilitat, conèixer la proteïna responsable de la funció per una estratègia clàssica de purificació-reconstitució presenta moltes dificultats. A més, és possible que algunes entitats de transport estiguin formades per diferents polipèptids amb propietats fisicoquímiques diferents, i encara és més difícil poder arribar a tenir una fracció totalment pura del transportador analitzat. Davant d'aquestes dificultats, l'expressió funcional en oòcits de "Xenopus" representa una estratègia altemativa per a l'aïllament molecular de proteïnes implicades en el transport d'aminoàcids, sempre que les seves activitats siguin detectables en expressar-les en l'oòcit.D'aquesta forma, el nostre grup va expressar activitat independent de Na+ de transport d'aminoàcids injectant en oòcits poli(A)+ de ronyó de conill. Aquesta activitat de transport era d'especificitat àmplia per a aminoàcids neutres i bàsics, i era saturable amb una K(m) al voltant de 0.6 mM. El missatger responsable d'aquesta activitat tenia una mida entre 1.8 i 2.4 kb (evidenciat per separació del poli(A)+ per mida en gradients de sacarosa i injecció de les diferents fraccions en l'oòcit). Amb aquestes evidències, el nostre grup, en col.laboració amb el grup del professor Heini Murer, va clonar per expressió funcional un cDNA que en expressar-se en oòcits induïa la mateixa activitat que es veia en injectar el poli(A)+ de ronyó. A més, l'activitat d'aquest poli(A)+ s'inhibia en incubar aquest amb un oligo antisentit generat a partir de la seqüència d'aquest cDNA. Aquesta proteïna es va anomenar rBAT ("related to b(0,+) amina acid transport activity"), ja que l'activitat que induïa en oòcits era molt similar a la descrita en blastòcits de ratoli (b(0,+) per Van Winkle. La diferencia que hi havia entre aquestes dues activitats era que rBAT també induïa transport de cistina. Independentment, dos grups diferents van clonar la mateixa proteïna de rata. El transport induït per rBAT en oòcits de "Xenopus" era saturable, amb K(m) per a aminoàcids bàsics i cistina entre 50-100 mil.limicres i variable per a aminoàcids neutres que depenen del grup radical: l'afinitat era més alta quan més gran era el grup radical. Així, a per aminoàcids com la L-leucina la K(m) era de l'ordre de mil.limicres, per a altres com ara la L-alanina, de l'ordre de mM i, finalment l'L-glicina no era transportada. Aquesta activitat de transport no és estereoselectiva, els D-aminoàcids es transporten d'igual forma que els L-aminoàcids.Per tranferència Northem es va analitzar l'expressió de l'RNA missatger. En condicions d'alta astringència, el cDNA d'l'BAT hibrida amb transcrits de 2.2 i 3.8 kb presents en ronyó i mucosa intestinal. Aquestes diferències de mida es deuen a diferències en poliadenilació, fet que es va demostrar posteriorment en clonar-se el cDNA de 3.8 kb emprant també expressió funcional. En condicions de baixa astringència hi ha presència de senyal en cervell (3.8 i 5.4 kb) i en fetge (2.2 kb). Es pensa que deuen ser transcrits homòlegs però no idèntics, ja que no són protegits en un assaig de protecció a RNAases fent servir una sonda d'rBAT de rata. La seqüència d'aminoàcids deduïda a partir de la seqüència de nucleòtids permetia predir una proteïna de 677 aminoàcids amb un pes molecular de 78 kD. A partir de l'anàlisi d'hidrofobicitat i estudis fets amb sistemes de traducció "in Vitro" es va suggerir que la proteïna rBAT seria una glicoproteïna de membrana de tipus II (el domini N-terminal seria citosòlic) amb un únic domini transmembrana. El grup de S. Tate va estudiar més tard la topologia de la proteïna rBAT mitjançant anticossos policlonals dirigits contra diferents parts de la proteïna i, així, va deduir la presència de 4 dominis transmembrana, i que els extrems N i C-terminal són citosòlics. Aquest tipus d'estructura no era usual per als transportadors de membrana descrits fins a aquell moment, fet que va fer plantejar la qüestió de si aquesta proteïna era un transportador per si mateix, un activador de sistemes de transport endògens en l'oòcit, o si formava part d'un complex heterooligomèric amb proteïnes ja presents en l'oòcit.En mirar el banc de dades de gens clonats, es va trobar que el domini extraceI.lular presentava una homologia alta amb una família d'enzims relacionats amb el catabolisme dels sucres. En canvi, la proteïna rBAT no presenta aquesta activitat, ja que presenta una mutació en un residu implicat en el centre actiu de reconeixement dels sucres. A més, es va trobar que rBAT presentava un 30% d'identitat i un 50% de similitud amb la cadena pesada de l'antigen 4F2 (4F2hc). L'antigen 4F2 (també anomenat CD98) és no heterodimer format per una proteïna glicosilada de 85 kD (4F2hc) que havia estat clonada fent servir l'anticòs monoclonal anti-eD98, unit covalentment per ponts disulfurs a una proteïna d'uns 40 kD altament hidrofòbica, no gIicosilada i que no s'havia pogut microseqüenciar. Es desconeixia la funció que tenia 4F2hc, només s'havia suggerit la seva implicació en el cicle cel.lular, ja que és un marcador de proliferació i també se l'havia implicat en la modulació dels nivells intracel.lulars de calci.Sorprenentment, en injectar 4F2hc en l'oòcit, es va observar un increment d'una activitat de transport descrita per Rosa Devés com y(+)L en eritròcits. Aquesta activitat es caracteritza per una inducció de transport d'aminoàcids dibàsics de fomm independent de sodi i neutres de forma dependent de sodi. S'ha demostrat que l'efecte del sodi sobre el transport d'aminoàcids neutres consisteix en la reducció de l'afinitat en unes 50 vegades. La predicció d'estructura de 4F2hc deduïda a partir de la seqüència d'aminoàcids era la d'una proteïna amb un únic domini transmembrana, fet que va plantejar els mateixos dubtes que amb la proteïna rBAT respecte a quina era l'entitat molecular responsable del transport.En analitzar en més detall la seqüència d'aminoàcids de les dues proteïnes es va observar que hi havia un residu de cisteïna, just després del primer domini transmembrana que estava conservat en ambdues proteïnes. Es va hipotetitzar que aquest residu seria el responsable de la formació d'un pont disulfur amb la possible subunitat lleugera de la qual no es coneixia la seqüència.D'aquesta forma es van identificar dues proteïnes, rBAT i 4F2hc, com una nova família de proteïnes implicades en el transport d'aminoàcids. En aquell moment, i a causa del fet que l'BAT induïa transport de cistina en oòcits, es va plantejar la hipòtesi que rBAT fos un gen candidat per a la cistinúria. La cistinúria és una malaltia autosòmica recessiva que presenta com a fenotip bioquímic la hiperexcreció d'aminoàcids bàsics i cistina. A causa de la solubilitat baixa de la cistina, aquesta precipita formant càlculs renals. Per demostrar aquesta hipòtesi, s'havien de trobar nous fets experimentals que estiguessin d'acord amb totes les alteracions descrites per a aquesta malaltia. Així, es va estudiar la localització subcel.lular i l'expressió durant el desenvolupament de la proteïna rBAT. Es va demostrar que la proteïna l'BAT es localitza en el domini apical del túbul proximal S3 i que la seva expressió era postnatal. Aquests fets coincidien amb el que es coneixia del transport de cistina i del lloc on residia el defecte causant de la cistinúria. D'aquesta forma, tots els fets apuntaven a rBAT com a gen candidat.Com a primer pas per detenninar si aquesta hipòtesi era certa, el nostre grup va aïllar i caracteritzar el cDNA corresponent a l'rBAT humà i es va iniciar la recerca de mutacions (principalment de tipus puntual) mitjançant la tècnica coneguda com SSCP en la seqüència codificant del gen d'individus cistinúrics. Així, es van descobrir 6 mutacions puntuals, entre les quals destacava la mutació Met461Thr, per trobar-se en homozigosi. Per mutagènesi dirigida es va construir un cDNA de rBAT humà amb aquesta mutació i es va analitzar funcionalment en oòcits. Es va observar que aquest mutant presentava un defecte en el transport mesurat tres dics després de la injecció, fet que reafirmava la implicació d'rBAT en la cistinúria. Sorprenentment, en realitzar el transport sis dies després de la injecció es va veure que no hi havia diferències respecte a la proteïna salvatge. Per poder explicar aquest comportament de manera més detallada i reafirmar de manera més forta la implicació d'rBAT en la cistinúria, vaig construir i analitzar el mutant Met467Lys, resultats que explico més endavant en l'apartat de "resultats".Aixi i tot, nos resultats obtinguts pel grup d'A Busch a Tübingen, en coI.laboració amb el nostre grup, van suscitar gran controvèrsia. Aquests resultats demostraven que l'activitat induïda per rBAT estava d'acord amb un intercanviador d'aminoàcids. Diferents grups van publicar que no podien comprendre com un intercanviador podria servir com a mecanisme de reabsorció d'aminoàcids. A més, cal recordar, que el fenotip de la cistinúria consisteix en la hiperexcreció d'aminoàcids bàsics i cistina, mentre que rBAT també indueix transport d'aminoàcids neutres. L'explicació d'aquest interrogant ha estat també un dels objectius de la meva tesi.Un detall important i no comentat fins ara és que la cistinúria és una malaltia heterogènia. S'han descrit tres tipus de cistinúria basant-se en les concentracions d'aminoàcids bàsics i cistina en homozigots i heterozigots per a la malaltia i en funció de l'absorció intestinal.El nostre grup va observar quc hi havia famílies on no hi havia una cosegregació entre el locus rBAT i la cistinúria, fet que plantejava la possibilitat que la cistinúria fos una malaltia deguda a mutacions en diferents gens, Una anàlisi més precisa del fenotip d'aquestes famílies va permetre dir que els tipus II i III de cistinúria no són causats per mutacions en rBAT. Quins podrien ser aquests altres gens candidats de cistinúria? Un possible candidat seria un altre transportador de cistina que estigués en els segments S1 i S2 del túbul renal. En aquesta línia, Segal, el 1977, va detectar fent servir vesicules apicals de ronyó de rata dos components de transport de cistina: un d'afinitat alta i capacitat baixa compartit amb aminoàcids bàsics (que podria correspondre a l'activitat deguda a rBAn i no altre d'afinitat baixa (K., =0.93 mM) i capacitat alta. A més, per estudis de microperfusió en túbuls aïllats, Vòlkl i Silbemagl van demostrar que al voltant del 90% de la cistina infosa pel túbul era reabsorbida pel túbul contornejat distal i que aquesta reabsorció era inhibida per fenilalanina a una concentració de 10 mM. Així, el gen o els gens responsables d'aquest sistema de transport podrien ser també gens de cistinúria. Un altre gen candidat seria la possible subunitat lleugera, que igual que per a la proteïna 4F2hc estaria lligada a rBAT per ponts disulfur. Quines evidències hi ha sobre la presència d'aquesta subunitat?:1. Si es fan experiments de transferència western fent servir un anticòs dirigit contra la proteïna rBAT amb membranes de ronyó, el pes que es detecta és diferent en funció de la presència o no d'agents reductors. Així, en absència d'agents reductors es detecten bandes de 125 kD de mobilitat electroforètica i de més alt pes molecular, mentre que la seva movilitat en presència d'agents reductors és de 94 kD. En tractar amb endoglicosidasa F aquesta banda de 94 kD passa a tenir una mobilitat que està d'acord amb el pes molecular deduït a partir de la seqüència d'aminoàcids. Per experiments de transferència western en gels de dues dimensions (primera dimensió no reductora, segona dimensió reductora) i per experiments de "crosslinking" amb reducció posterior, s'ha observat que la banda de 94 kD forma part d'aquest complex. Malauradament, no s'ha pogut immunoprecipitar aquest complex com s'havia fet en el cas de l'antigen 4F2, que demostrava directament que aquestes dues proteïnes interaccionen directament.2. L'expressió de la proteïna rBAT en cèl.lules heteròlogues (COS, MDCK) no suposa cap activitat de transport: la proteïna o no arriba a la membrana o si hi arriba no indueix cap activitat de transport. En aquestes cèl.lules transfectades no s'han detectat per transferència western aquestes bandes de pes molecular més alt (125 kD).3. Ens podem preguntar llavors si podem detectar aquests complexos de pes molecular més alt en l'oòcít de "Xenopus". En condicions no reductores s'ha observat una lIeugera banda de 125 kD (en comparació amb la intensilat de la banda de 94 kD), banda que s'ha postulat que seria homòloga a la detectada en membranes de ronyó.Així, totes aquestes evidències experimentals estan a favor d'un model on la proteïna rBAT estaria associada a una altra proteïna ("subunitat lleugera") mitjançant ponts disulfur. Aquesta possible proteïna seria, doncs, un altre gen candidat de cistinúria.OBJECTIUSTenint en compte els antecedents descrits en l'apartat anterior es van plantejar els següents tres objectius inicials:1. Reafirmar la implicació d'rBAT en la malaltia cistinúria construint per mutagènesi dirigida cDNA d'rBAT que continguessin alteracions en la seqüència d'aminoàcids.Així es va construir el mutant Met467Lys i es va caracteritzar en oòcits l'activitat induïda per intentar explicar el possible defecte que patien pacients cistinúrics que tinguessin la proteïna rBAT amb aquesta alteració.2. Intentar comprendre els mecanismes dc reabsorció d'aminoàcids bàsics i cistina partint de les activitats induïdes per rBAT i 4F2hc en l'oócit de "Xenopus". D'aquesta manera també es volia comprendre com alteracions en l'activitat b(0,+) induïda per rBAT podrien explicar el fenotip cistinúric.3. Estudiar el paper de les proteïnes rBAT i 4F2hc com a components i/o activadors dels sistemes de transport b(0,+) i (+)L respectivament.Es volia detenninar primer quina era l'estructura del transportador per poder identificar més tard quina era l'entitat molecular responsable del transport i aixi entendre com aquestes dues proteïnes (la cadena lleugera i la cadena pesada) interaccionaven entre si.CONCLUSIONS1. Es reafirma la implicació del gen rBAT en la cistinúria de tipus 1. Dues de les mutacions trobades en pacients cistinúrics, Met467Lys i Met46TThr, no són completament funcionals a causa d'un problema en el trànsit cap a la membrana plasmàtica.2. El transportador b(0,+) funciona com un intercanviador obligatori d'aminoàcids amb estequiometria 1:1. En aquesta tesi hem vist que el potencial de membrana i l'intercanvi amb aminoàcids neutres són les principals forçes que penneten acumular aminoàcids. Aquest mecanisme explica completament el fenotip de la cistinúria de tipus I. El transportador y(+)L també funciona com un intercanviadar d'aminoàcids, però de forma asimètrica ja que únicament permet la sortida d'aminoàcids bàsics, a causa probablement de les baixes concentracions de sodi intracel·lulars.3. Els transportadors b(0,+) i y(+)L formen part d'una gran família de transportadors heteromultimèrics constituïts per dues subunitats: una subunitat llengera (LAT-l, LAT-2, ascAT, y(+)LAT-l, y(+)LAT-2, XCAT, b(0,+)AT, etc) responsable de l'especificitat de substracte, i una subunitat pesada (4F2he, rBAT), necessària per a l'expressió en superfície de la subunitat lleugera. Aquestes dues proternes interaccionen a través d'un pont disulfur entre 2 residus de cisteïna que estan altament conservats. A part d'aquesta interacció covalent, són necessàries altres interaccions entre altres dominis com ara l'extrem C-terminal d'rBAT. Així, rBAT determina propietats funcionals del transportador b(0,+).4. La mutació L334R trobada en un pacient espanyol amb LPI i la mutació V170M trobada en pacients jueus amb cistinúria de tipus no-I, provoquen un defecte en la funció de la proteïna y(+)LAT-1 i b(0,+)AT, respectivament.5. S'ha identificat una nova família de transportadors lisosomals formada per 3 membres, MfP, LyCAT i LyMAT. LyCAT funciona com un transportador lisosomal d'aminoàcids bàsics, mentre que LyMAT funciona com un transportador lisosomat de múltiples aminoàcids. El domini C-terminal d'aquestes proteïnes en determina la locaIització subcel·lular. Estudis posteriors permetran implicar el transportador Iisosomal LyCAT en la regulació de la síntesi de NO en macròfags, com permeten suggerir les dades obtingudes en la present tesi. / l. It is reaffirmed the implication of the gene rBAT in the type I cystinuria. Two of the mutations found in cystinuric patients, Met467Lys and Met467Thr, are not thoroughly functional due to a problem in the travel toward the plasma membrane.2. The carriers b(0,+) operates as a obligatory exchanger of amino acids with 1: 1 stoichiometry. In this thesis, we have seen that the membrane potential and the exchange with neutral amino acids are the principal forces that permit to accumulate amino acids. This mechanism fully explains the phenotype of the type I cystinuria. The carrier y(+)L also operates as an exchanger of amino acids, but in a asymmetrical way, since solely permits the exit of basic amino acids, because probably of the lower intracellular sodium concentrations.3. The carriers b(0,+) and y(+)L form part or a great heteromultimerics carriers family constituted by two subunits: a light subunit (LAT-l, LAT-2, ascAT, y(+)LAT-I, y(+)LAT-2, XCAT, b(0,+)AT, ... ) responsible for the substrate specificity and a heavy subunit (4F2hc, rBAT) necessary for the expression in surface or the light subunit. These two proteins interact to through a disulfur bridge between two residues of cisteine that are highly preserved. In addition to this covalent interaction, they are necessary other domains as the extreme C-terminal of rBAT. Then, rBAT it determines functional properties or the transporter.4. The mutation L334R found in a Spanish patient with LPI and the mutation Vl70M found in Jewish patients with non-type I cystinuria provoke a defect in the function of the proteins y(+)LAT-I and b(0,+)AT, respectively.5. It has been identified a new family of lysosomal carriers formed by 3 members: MTP, LyCAT and LyMAT. LyCAT operates as a lysosomal carrier of basic amino acids, while LyMAT operates as a Iysosomal carrier of multiples amino acids. The C-terminal domain or these proteins determines their subcelular localization. Subsequent studies will alIow to imply the Iysosomal carrier LyCAT, in the regulation of the synthesis of NO in macrophages, as permit to suggest the data obtained in the present thesis.

El presente trabajo de tesis doctoral se ha centrado en la determinación de la función fisiológica de la proteína desacopladora mitocondrial UCP3 en relación con la apoptosis y las especies reactivas de oxígeno (ROS). UCP3 es un miembro de la familia de transportadores mitocondriales que se expresa preferencialmente en el músculo esquelético. UCP3 es una proteína homóloga a la termogenina o proteína desacopladota UCP1. Ésta se expresa exclusivamente en tejido adiposo marrón dónde desempeña una función esencial en la termogénesis adaptativa, desacoplando la respiración mitocondrial de la fosforilación oxidativa con la consiguiente generación de calor. Así, como homólogo de la termogenina UCP3 podría desarrollar una actividad desacoplante mitocondrial influenciando el metabolismo energético celular, sin embargo su función biológica exacta continúa siendo fruto de controversia. En un primer trabajo, demostramos como la expresión ectópica de UCP3 en células de riñón humanas (293 HEK) mediante un sistema de expresión inducible sensible a tetraciclina, es consistente con un papel desacoplante mitocondrial de la proteína en la mitocondria de estas células. Observamos que la expresión de UCP3 no induce apoptosis directamente pero incrementa la sensibilidad a un agente inductor de apoptosis dependiente de vías de activación mitocondriales como es la staurosporina. Además, la inducción de UCP3 amuenta la sensibilidad del MPTP (mitochondrial transition pore) al calcio, facilitando la apertura del poro lo que se considera un evento crucial en la apoptosis dependiente de regulación mitocondrial. Estos datos sugieren una función de UCP3 en la regulación de la actividad del MPTP y sugieren que la presencia de UCP3 en la mitocondria sensibiliza a las células a los estímulos pro-apoptóticos que dependen de vías mitocondriales. Tras la obtención de los mencionados resultados, procedimos a inducir la expresión ectópica de UCP3 in vivo utilizando vectores adenovíricos dirigidos al hígado de ratón. El hígado normal no expresa ninguna proteína desacoplante y constituye por tanto un entorno ideal para determinar la función de UCP3. Resultados preliminares sugieren que la expresión ectópica de UCP3 no altera significativamente a parámetros metabólicos como la producción de ROS, aunque hallamos una estimulación de la apertura del MPTP en respuesta al calcio. Estos resultados procedentes de los estudios in vivo corroboran nuestros resultados previos obtenidos en líneas celulares en cultivo.Se cree que las proteínas desacoplantes podrían controlar la producción de ROS gracias a su capacidad para promover un desacoplamiento suave en la membrana mitocondrial interna. Hemos estudiado la función de UCP3 en su entorno natural de expresión, la célula del músculo esquelético, concretamente en lo que hace referencia a la muerte celular programada o apoptosis y las especies reactivas de oxígeno. Se demuestra que la expresión e UCP3 en miotubos no disminuye la producción de ROS, sino que incluso se incrementa en respuesta a un agente inductor de ROS como es la staurosporina. Igualmente, encontramos una sobreestimulación de la producción de ROS en respuesta a elevadas concentraciones de ácidos grasos, una situación en la que se estimula la expresión y actividad de las proteínas desacoplantes. Las ceramidas son productos secundarios del acúmulo de ácidos grasos capaces de inhibir la actividad de la cadena respiratoria mitocondrial. Los desacoplantes químicos pueden incrementar la producción de ROS en aquéllas situaciones en que la cadena respiratoria se encuentra inhibida. Pensamos que la sobre-inducción de ROS que observamos en presencia de UCP3 se deba a la acción conjunta de la proteína las ceramidas sobre la actividad respiratoria. Concluimos que UCP3 se comporta en los miotubos de forma compatible con una actividad desacoplante, promoviendo una sensibilización a la producción de ROS en respuesta a ciertos estímulos de estrés, como pueden ser un agente pro-apoptótico o elevadas concentraciones de ácidos grasos. Además, UCP3 promueve una sensibilización de la célula a la muerte programada inducida por estímulos dependientes de regulación mitocondrial. El análisis de la función de UCP3 en su entorno natural de expresión, el músculo esquelético, supuso además una profunda caracterización del comportamiento de la célula muscular ante los estímulos pro-apoptóticos. / My work of thesis has been focused on determining the role of mitochondrial uncoupling protein 3 (UCP3) in relation to apoptosis and reactive oxygen species (ROS). The mitochondrial uncoupling protein-3 is a member of the mitochondrial carrier protein family that is preferentially expressed in skeletal muscle. As a homologue of the thermogenic brown fat uncoupling protein-1, it possesses a mitochondrial uncoupling activity and thus can influence cell energy metabolism but its exact biological function remains unclear. We have previously proved that the induced expression of uncoupling protein-3 in the mitochondria of 293 cells using a tetracycline-inducible system was in agreement with its expected physiological behavior as an uncoupling protein (UCP). We observed that Uncoupling protein-3 expression did not cause apoptosis per se but increased the responsiveness of the cells to a mitochondrial apoptotic stimulus such as staurosporine, an apoptosis-inducer dependant on mitochondrial pathways. Moreover, the induction of uncoupling protein-3 increased the sensitivity of mitochondria to open the permeability transition pore (MPTP) in response to calcium, a well-known inducer of its opening which is a critical event in mitochondrial-driven apoptosis. This suggested for first time a role for UCP3 in cthe regulation of this channel activity. We could conclude that the presence of uncoupling protein-3 in mitochondria sensitizes cells to apoptotic stimuli involving mitochondrial pathways. Then, we induced in vivo ectopic expression of UCP3 in the liver of mice, using an adenoviral vector. Although preliminary, our results suggest that ectopic UCP3 expression is not significantly affecting to metabolic parameters or ROS production, but it is, as it happened in 293 cells, enhancing sensitivity of MPTP to its opening, corroborating our previous results. We are now characterizing the biochemical behaviour of UCP3 in the liver to finish a manuscript compelling all these results.Uncoupling proteins are thought to control ROS production due to their capacity to promote a mild uncoupling of the inner mitochondrial membrane. We have been studying UCP3 function in its natural environment of expression, the skeletal muscle cell. We have proved that UCP3 expression in myotubes does not decrease ROS production even in response to ROS-inducing agents such as staurosporine. In fact, it promotes enhanced ROS production in response to high fatty acid concentration. Ceramides are secondary products of fatty acid accumulation and can inhibit respiratory chain activity. Chemical uncouplers are known to increase ROS production in situations in which respiratory chain is inhibited. We are therefore currently exploring the possibility that ROS over-production could be due to the overlapping action of ceramides and UCP3.As a whole, we have demonstrated an involvement of UCP3 in apoptosis regulation and in the modulation of ROS production besides of performing a deep characterization of apoptosis responsiveness within skeletal muscle cell.

Els adenovirus oncolítics són una estratègia molt prometedora pel tractament del càncer, però l'augment de la seva potència i dispersió intratumoral és imprescindible per tal que aquests vectors presentin una eficàcia òptima pel seu ús en humans. Una estratègia molt prometedora per tal d'augmentar l'eficàcia dels adenovirus oncolítics és la inserció de transgens terapèutics en el genoma adenoviral. En aquest treball es presenta la generació i evaluació d'adenovirus oncolítcs armats amb dos transgens diferents: les glicoproteïnes fusogèniques de membrana (FMG) per una banda, i la hialuronidasa PH20 per l'altre. Les FMG són altament citotoxiques per les cèl·lules tumorals degut a la seva capacitat de fusionar les cèl·lules en grans sincitis multinucleats. En aquest treball hem generat dos adenovirus fusogenics salvatges: l'AdwtRGD-F, que expressa la proteïna F del paramixovirus SV5 i l'AdwtRGD-GALV que expressa la proteïna de l'envolta del virus de la leucèmia de gibbó (GALV). L'expressió de la proteïna F pel virus AdwtRGD-F va resultar en la formació de sincitis petits, però la fusió induïda per la proteïna F no va ser capaç d'augmentar la potència de l'adenovirus AdwtRGD-F. En canvi, l'expressió de la proteïna GALV pel virus AdwtRGD-GALV va resultar en la formació de grans sincitis i en la millora de la potència citotòxica de l'adenovirus in vitro. A continuació, el gen de la glicoproteïna GALV va ser inclós en el genoma d'un adenovirus de replicació selectiva de tumor: l'ICOVIR5. Per tal d'insertar el gen de la glicoproteïna GALV en el genoma de l'ICOVIR5 sense afectar la capacitat d'encapcidació de l'adenovirus vam eliminar una part del genoma d'aquest virus (els ORFS 1,2 i 3 de la regió E4) per tal de generar l'ICOVIR9dE4. L'expressió de la glicoproteïna GALV per part de l'ICOVIR9dE4 va augmentar significativament la capacitat citotòxica del virus respecte l'ICOVIR5 in vitro. Tot i això, les diferents modificacions realitzades en l'ICOVIR9dE4 van resultar en una disminució de la producció viral i en una potència antitumoral in vivo molt similar a la presentada per l'ICOVIR5. A continuació, vam insertar el gen de la glicoproteïna GALV en el genoma de l'ICOVIR15 (un adenovirus oncolític molt similar a l'ICOVIR5 però amb un genoma més curt) per tal de generar l'ICOVIR16. La inserció del gen GALV en l'ICOVIR16 no va requerir l'eliminació de cap gen viral. In vitro, l'adenovirus fusogènic ICOVIR16 va presentar una elevada capacitat citotòxica i una producció viral similar a la de l'ICOVIR15. In vivo, l'administració d'ICOVIR16 (tan per via intratumoral com sistèmica) va controlar el creixement tumoral més eficientment que l'adenovirus control en tots els models tumorals analitzats. Per una altra banda, per tal que l'adenovirus sigui capaç d'eliminar la totalitat de la massa tumoral es necessari que el virus sigui capaç de distribuir-se eficientment pel tumor. En aquest treball hem analitzat si l'eliminació de la matriu extracel·lular mitjançant l'enzim hialuronidasa facilita la dispersió d'adenovirus oncolítics. Primer vam demostrar que la coadministració intratumoral de hialuronidasa soluble i un adenovirus oncolític en tumors xenografts de ratolí millora l'activitat antitumoral de l'adenovirus oncolític en monoteràpia. A continuació, vam construir l'adenovirus AdwtRGD-PH20, un adenovirus salvatge que expressa una forma soluble de la hialuronidasa testicular PH20. L'administració de l'AdwtRGD-PH20 a ratolins amb tumors de melanoma humà va resultar en la degradació de l'àcid hialurònic present en el tumor, una millor distribució del virus per la massa tumoral i la regressió de tots els tumors tractats. Finalment, vam insertar el cDNA de la hialuronidasa PH20 en el genoma de l'adenovirus oncolític ICOVIR15 per generar l'adenovirus ICOVIR17. L'ICOVIR17 va demostrar una millor eficàcia i distribució antitumoral que l'ICOVIR15 després de ser administrat via intratumoral o sistèmica en ratolins amb tumors humans preestablerts. Els resultats obtinguts en aquesta tesi indiquen que els adenovirus ICOVIR16 i ICOVIR17 són bons candidats per ser analitzats en assajos clínics de fase I. / Oncolytic adenoviruses hold considerable promise for treating solid tumors, although the potency and spread of the virus needs improvement if its full clinical potential is to be realized. On the one hand, we tested here whether the insertion of the gene encoding the gibbon ape leukemia virus envelope (GALV) glycoprotein into the genome of a replication competent adenovirus is able to increase adenovirus potency. The GALV glycoprotein efficiently kills tumor cells by inducing fusion of neighboring cells to form multinucleated syncytia. The in vitro characterization of the fusogenic adenovirus (AdwtRGD-GALV) showed that this virus can induce massive syncytia formation, leading to a significantly increased tumor cytotoxicity compared with a nonfusogenic virus. Next, the GALV gene was inserted into an oncolytic adenovirus which selectively kills pRb pathway-defective tumor cells. The antitumoral activity of the oncolytic adenovirus expressing GALV (ICOVIR-16) was compared to that of the parental virus ICOVIR-15 in nude mice with pre-established human tumors. GALV expression greatly improved the antitumor efficacy of ICOVIR16. When injected directly to the tumor, ICOVIR16 induced tumor regression in 70% of treated tumors, whereas only 30% of tumors treated with ICOVIR15 regressed. When injected systemically, ICOVIR16 showed a greater reduction in tumor progression that was significant compared with the parental virus, ICOVIR15. On the other hand, we tested whether the expression of hyaluronidase, an enzyme which dissociates the extracellular matrix, could enhance the intratumoral distribution of an oncolytic adenovirus and improve its therapeutic activity. As a proof of concept, we demonstrated that intratumoral coadministration of hyaluronidase in nude mice bearing tumor xenografts improves the antitumor activity of an oncolytic adenovirus. Next, we constructed a replication competent adenovirus (AdwtRGD-PH20) and an oncolytic adenovirus (ICOVIR17) expressing a soluble form of the human sperm hyaluronidase (PH20). The antitumoral activity of both adenoviruses expressing PH20 was compared to that of the parental viruses AdwtRGD and ICOVIR-15. Both AdwtRGD-PH20 and ICOVIR-17 showed more antitumor efficacy following intratumoral administration in mice with pre-established tumors, along with an improved spread of the virus within the tumor mass. Importantly, a single intravenous dose of ICOVIR-17 induced tumor regression in 60% of treated tumors. Our results indicate that ICOVIR-16 and ICOVIR-17 are promising candidates for clinical testing.

A) INTRODUCCIÓ:Membres de la superfamilía de TGF-β regulen una varietat de processos biològics, com inhibició del creixement, diferenciació, formació del patró embriònic i inducció d'apoptosi. Aquest lligants secretats s'uneixen i activen uns receptors serin/threonin quinasa tipus I i II. Aquests receptors activats fosforilen i activen unes proteïnes SMADs intracel·lulars, les quals transloquen a nucli regulant l'exprressió de gens diana. A més, al TGF-beta se li ha atribuit un paper com a factor proangiogènic "in vivo". "In vitro", s'ha observat que TGF-beta inhibeix la proliferació de les cèl·lules endotelials en cultius de dues dimensions, però que indueix la formació de capilars quan les cèl·lules endotelials es cultiven en tres dimensions dins de gels de col·làgen.A partir de cèl·lules endotelials cultivades en tres dimensions es va generar una col·lecció de cDNAs, en absència (condicions basals) o en presència de TGF durant un tractament de 4 hores. Posteriorment, aquests gens es van seqüenciar i analitzar per Northern Blot en cèl·lules endotelials en condicions basals i tractades amb TGF-β. Mitjançant aquesta tècnica es va aconseguir aïllar gens induïts o reprimits per TGF-β. Entre aquests gens induïts es va trobar la F-box28.Una de les vies de degradació de proteïnes més comú és la via de la ubiquitina/proteasoma. Aquesta via està formada per tres enzims: l'E1, que és l'encarregat d'activar les molècules d'ubiquitina; l'E2, que és l'enzim conjugador de les molècules d'ubiquitina;, i les E3 ubiquitines lligases, la funció principal de les quals és la de reconèixer el substrat específic que serà ubiquitinat, i degradat posteriorment pel complexe del proteasoma. Dins de la família d'E3 ubiquitines lligases trobem el complex tipus SCF. Aquest complex proteic està format per quatre subunitats molt ben conservades: Cul1, Rbx1, Skp1 y una proteïna F-box. Rbx1 y Cul1 formen un centro catalític que participa en el reclutament d'E2. La proteïna F-box és qui reconeix específicament el substrat diana i l'uneix. Finalment, Skp1, és una proteïna adaptadora, la funció de la qual és la de unir la F-box a Cul1.En aquest treball, ens hem plantejat l'estudi d'una nova E3 ubiquitina lligasa, la F-box28, que es va identificar en un primer moment com un gen estimulat per TGF-β1 en cèl·lules endotelials 1G11. Aquest treball planteja la caracterizació d'aquesta proteïna, així com la identificació de la seva funció en relació a l'acció de TGF-β.B) OBJECTIUS1) Estudi de l'expressió d'F-box28 i la seva localització cel·lular.2) Estudi de la F-box28 com a E3 ubiquitina lligasa, de la seva regulació i de la seva vida mitja.3) Estudi de les possibles funcions d'F-box28 i la seva implicació en la regulació del cicle cel·lular.4) Estudi dels possibles substrats candidats de la F-box28.C) RESULTATS1) La proteïna identificada per PCR-substractiva com a F-box28 és una nova proteïna que pertany al complex E3 ubiquitina lligasa tipus SCF, ja que hem vist que interacciona con les proteïnes Cul1 y Skp1.2) La F-box28 presenta una expressió baixa en estat basal i la seva expressió és induïda pel factor TGF-β1, a nivell d'mRNA i de proteïna, en cèl·lules endotelials 1G11 i en cèl·lules HeLa.3) La F-box28 és una proteïna de localització nuclear gràcies a una seqüència NLS en el seu extrem C-terminal.4) La F-box28 és una proteïna inestable de 4-5 hores de vida mitja que és regulada a través del proteasoma. 5) La sobreexpressió d'F-box28 en cèl·lules HeLa causa una parada parcial en la fase G1 del cicle cel·lular. Aquest efecte requereix la seva localització nuclear i podria ser mediat per la seva interacció amb la ciclina A i la disminució dels nivells d'aquesta. / THESIS SUMMARY:"F-BOX28 CHARACTERIZATION: A NEW E3 UBIQUITIN LIGASE IMPLICATED IN THE CELL CYCLE REGULATION"A) INTRODUCTIONProteins are targeted for degradation by the ubiquitin/proteasome pathway by covalent modification that requires the coordinated reactions of three enzymes: the ubiquitin ligase which is referred to as an E3, and operates in conjunction with an E1 ubiquitin-activating enzyme and an E2 ubiquitin-conjugating enzyme. There is one major E1 enzyme, shared by all ubiquitin ligases, which uses ATP to activate ubiquitin for conjugation and transfers it to an E2 enzyme. The E2 enzyme interacts with a specific E3 partner and transfers the ubiquitin to the target protein. The E3, which may be a multi-protein complex, is, in general, responsible for targeting ubiquitination to specific substrate proteins.There are different ubiquitin ligase complexes involved in recognition and ubiquitination of specific target proteins. One of these is the SCF complex. SCF contains three core subunits, and a number of less critical components: the F-box, which recognizes specifically the target protein; Skp1 that is a bridging protein and is essential in the recognition and binding of the F-box; Cul1 that forms the major structural scaffold of the SCF complex; and Rbx1 which participate in the transferral of the ubiquitin to the target protein. The SCF complex has important roles in the ubiquitination of proteins involved in the cell cycle as well as having a role in the marking various other cellular proteins for destruction.In the present work we have studied a new E3 ubiquitin ligase, F-box28, which was identified as an stimulated gene by TGF-β1 in 1G11 endothelial cells. In this study we determine the characterization of F-box28 and their possible role regarding to TGF-β1.B) OBJECTIVES1) Expression study of F-box28 and their cellular localization.2) Study of F-box28 as an E3 ubiquitin ligase, their regulation and stability.3) Functional study of F-box28 and its role regarding regulation of cell cycle.4) Study of the F-box28 substrates.C) RESULTS1) F-box28 is a new protein that belongs to the ubiquitin ligase complex SCF.2) F-box28 mRNA and protein responds to TGF-β1 stimulation in 1G11 endothelial and HeLa cells.3) F-box28 is a nuclear protein with a NLS sequence in their C-terminal end. 4) F-box protein has an average life of 4-5 hours and it is regulated through the proteasome complex.5) The F-box28 overexpression in HeLa cells induce a partial G1 cell cycle arrest. This effect requires their nuclear localization and it could be mediated through their interaction with cyclin A and the decrease levels of this cyclin.

Les glutaredoxines són tiol oxidoreductases que regulen l'estat redox dels grups sulfidril de les proteïnes. Al llevat Saccharomyces cerevisiae Grx1 i Grx2 són glutaredoxines ditiòliques localitzades al citosol, mentres que Grx3, Grx4 i Grx5 són monotiòliques. Grx5 es localitza a la matriu mitocondrial i participa en la síntesi de centres ferro/sofre (Fe/S). Quan és absent, enzims amb centres Fe/S com l'aconitasa són inactives, no hi ha creixement en condicions respiratòries, hi ha acumulació de ferro intracel.lular i es produeix una oxidació constitutiva de proteïnes. Grx5 conté un domini tioredoxina simple. En canvi, Grx3 i Grx4 posseeixen un domini de tipus tioredoxina unit al domini glutaredoxina. Aquestes darreres dues proteïnes es localitzen al nucli, éssent el domini tioredoxina necessari per aquesta localització. S'ha utilitzat el mutant nul grx5 com model de cèl·lules que manifesten un estrés oxidatiu endògen constitutiu (oposat a les situacions on l'estrés és provocat per un estímul extern) per tal d'estudiar el transcriptoma cel·lular en les esmentades condicions. Així, s'ha observat que: (i) s'indueixen principalment gens del reguló Aft1 involucrats en la captació i utilització de ferro, i (ii) es reprimeix l'expressió de gens implicats en el metabolisme respiratori depenents del regulador Hap4. Aquest darrer efecte és suprimit per la sobreexpressió de HAP4, de manera que la inhibició del metabolisme respiratori en condicions moderadament oxidants podria constituir una resposta protectora per part de les cèl.lules del llevat. Utilitzant una construcció capaç d'internalitzar proteïnes a la mitocondria mitjançant la senyal de localització mitocondrial de Grx5, s'ha demostrat que les glutaredoxines ditiòliques de S. cerevisiae no poden rescatar els defectes d'un mutant grx5, mentres que les monotiòliques Grx3 i Grx4 sí que ho fan quan són adreçades a la matriu mitocondrial. Això demostra que les glutaredoxines ditiòliques són funcionalment divergents de les monotiòliques, però que aquestes darreres poden intercanviar les seues activitats biològiques entre elles quan s'eliminen les barreres dels compartiments cel.lulars. La conservació funcional entre glutaredoxines monotiòliques s'extén al llarg de l'escala evolutiva, ja que els defectes del mutant grx5 de S. cerevisiae són també suprimits per altres proteïnes de la mateixa família com són Grx4 de Escherichia coli, GrxC de Synechocystis sp. i les respectives proteïnes homòlogues de pollastre i de cèl.lules humanes. / Las glutaredoxinas son tiol oxidoreductasas que regulan el estado redox de los grupos sulfidrilo de las proteínas. En la levadura Saccharomyces cerevisiae Grx1 y Grx2 son glutaredoxinas ditiólicas localizadas en el citosol, mientras que Grx3, Grx4 y Grx5 son monotiólicas. Grx5 se localiza en la matriz mitocondrial y está involucrada en la síntesis de centros hierro/azufre (Fe/S). En su ausencia, enzimas con centros Fe/S como la aconitasa son inactivas, no hay crecimiento en condiciones respiratorias, hay acumulación de hierro intracelular y se produce una oxidación constitutiva de proteínas. Mientras que Grx5 contiene un dominio glutaredoxina simple, Grx3 y Grx4 poseen un domino tipo tioredoxina fusionado al dominio glutaredoxina. Estas dos últimas proteínas se localizan en el núcleo, siendo el dominio tioredoxina necesario para tal localización. Se ha utilizado el mutante nulo grx5 como modelo de células que manifiestan un estrés oxidativo endógeno constitutivo (opuesto a las situaciones de estrés provocadas por un estímulo externo) para estudiar el transcriptoma celular en dichas condiciones. Se ha observado que: (i) se inducen principalmente genes del regulón Aft1 involucrados en la captación y utilización de hierro, y (ii) se reprime la expresión de genes implicados en el metabolismo respiratorio dependientes del regulador Hap4. Este último efecto es suprimido por la sobreexpresión de HAP4, de modo que la inhibición del metabolismo respiratorio durante condiciones moderadamente oxidantes podría constituir una respuesta protectora por parte de las células de la levadura. Utilizando una construcción capaz de internalizar proteínas en la mitocondria gracias a la señal de localización mitocondrial de Grx5, se ha demostrado que las glutaredoxinas ditiólicas de S. cerevisiae no son capaces de rescatar los defectos de un mutante grx5, en tanto que las monotiólicas Grx3 y Grx4 sí lo hacen cuando son dirigidas a la matriz mitocondrial. Ello demuestra que las glutaredoxinas ditiólicas son funcionalmente divergentes de las monotiólicas, pero que estas últimas pueden intercambiar entre ellas sus actividades biológicas cuando se sobrepasan las barreras compartimentales. La conservación funcional entre glutaredoxinas monotiólicas se extiende a lo largo de toda la escala evolutiva, dado que los defectos del mutante grx5 de S. cerevisiae son también suprimidos por otras proteínas de la misma familia como son Grx4 de Escherichia coli, GrxC de Synechocystis sp. y las respectivas proteínas homólogas de pollo y de células humanas. / Monothiol glutaredoxins are thiol oxidoreductases that regulate the redox state of sulfhydryl groups in proteins. In the yeast Saccharomyces cerevisiae Grx1 and Grx2 are dithiol glutaredoxins located at the cytosol, while Grx3, Grx4 and Grx5 are monothiol ones. Grx5 is located at the mitochondrial matrix and is involved in the synthesis of iron/sulfur (Fe/S) centers. In its absence, enzymes with Fe/S centers such as aconitase are inactive, there is no growth in respiratory conditions, iron is accumulated inside the cells and a constitutive oxidation of proteins occurs. While Grx5 contains a single glutaredoxin domain, Grx3 and Grx4 have a thioredoxin type domain fused to the glutaredoxin domain. These two proteins are located at the nucleus, the thioredoxin domain being necessary for such location. The null grx5 mutant has been used as a model for cells that display constitutive endogenous oxidative stress (as opposed to situations where the stress is caused by external stimulus), in order to study the cell transcriptome in such conditions. Thus, it has been observed that: (i) there is a general induction of the Aft1 regulon genes involved in iron uptake and utilization, and (ii) there is a repression of genes required for respiratory metabolism that depend on the Hap4 regulator. This latter effect is suppressed by the overexpression of HAP4. It is proposed that inhibition of respiratory metabolism during moderately oxidative conditions would constitute a protective response by the yeast cells. By using a genetic construction that is able to internalize proteins into the mitochondria by means of the mitochondrial targeting sequence of Grx5, it has been demonstrated that the S. cerevisiae monothiol glutaredoxins are unable to rescue the defects of a grx5 mutant, while the monothiol ones Grx3 and Grx4 rescue such defects when internalized into the mitochondrial matrix. This fact demonstrates that dithiol glutaredoxins are functionally divergent from monothiol ones, but these latter can interchange their biological activities when the compartment barriers are surpassed. Functional conservation among monothiol glutaredoxins extends along the evolutive scale, since the defects of the grx5 mutant of S. cerevisiae are also suppressed by other proteins of the same family such as Grx4 of Escherichia coli, GrxC of Synechocystis sp. and the respective homologues of chicken and human cells.

El present treball es basa en l'estudi del efecte de dues proteïnes identificades com antagonistes de la mort induïda pel receptor Fas, FAIM i FLIP, en el sistema nerviós. Malgrat que totes dues molècules promouen el creixement neurític, existeixen diferències mecanístiques que es detallaran de forma separada. Inicialment, hem procedit a la caracterització de la proteïna FAIM (Fas Apoptosis Inhibitory Molecule), de la qual n'existeixen dues úniques referències, en la bibliografia. Hem demostrat que l'expressió forçada de FAIM no protegeix les neurones de la retirada de factors tròfics, però exerceix una clara acció promotora del creixement neurític en els diversos sistemes neuronals estudiats. D'una banda, l'expressió forçada de FAIM incrementa la longitud i el grau d'arborització de les neurites induïts pel factor de creixement nerviós (NGF), tant en la línia cel·lular PC12 com en cultius primaris de neurones del gangli cervical superior (SCG). Per altra banda, si es redueixen els nivells endògens de FAIM mitjançant la tècnica del ARN d'interferència, el creixement neurític induït pel NGF es veu dràsticament afectat de forma negativa en els dos models cel·lulars utilitzats. L'expressió exògena de FAIM promou l'activació de la via NF-κB, mentre que el bloqueig d'aquesta via, mitjançant la transfecció d'una forma mutada d'IκBα no degradable o bé usant neurones corticals de ratolins nuls que manquen de la subunitat p65 de NF-κB, evita el creixement neurític promogut per NGF. L'efecte estimulador del creixement neurític també pot ser bloquejat per la inhibició de la via de Ras/ERK. Finalment, hem demostrat que FAIM interacciona amb els dos receptors de la neurotrofina NGF, p75NTR i TrkA, d'una forma depenent de lligand. Aquests resultats revelen una nova funció de FAIM com promotor de creixement neurític mitjançant un mecanisme depenent de NF-κB. En el cas de FLIP, s'ha descrit la seva funció com inhibidor endogen de la apoptosi induïda per Fas, però, també s'ha vist implicat en promoció de proliferació. El treball descriu per primera vegada una funció, fins ara desconeguda, de FLIP en el sistema nerviós. FLIP s'expressa en motoneurones, en neurones SCGs i cèl·lules PC12. Malgrat això, la seva expressió forçada, només pot protegir el cultiu de motoneurones de ratolí de la mort cel·lular induïda per la retirada de factors tròfics. De totes maneres, aquesta expressió augmenta de forma considerable el creixement neurític en els tres models després de l'estímul neurotròfic apropiat per a cadascun d'ells. De forma interessant, i sense excepció, la reducció dels nivells endògens de FLIP inhibeix la neuritogènesis en aquests models. Les vies intracel·lulars regulades per FLIP impliquen tant ERK com NF-κB. L'expressió forçada de FLIP promou un increment en la seva activitat, mentre que la reducció de la seva expressió provoca una disminució d'aquesta, després de l'estímul de NGF en cèl·lules PC12. Finalment, es demostra que FLIP interacciona amb el receptor del NGF, TrkA d'una manera depenent d'estímul. Aquests resultats revelen una nova funció neuritogènica de FLIP a través d'un mecanisme que implica l'activació de les vies MAPK/ERK i NF-κB, i que no està relacionada amb la seva clàssica funció antiapoptòtica. / El presente trabajo se basa en el estudio del efecto de dos proteínas identificadas como antagonistas de la muerte inducida por el receptor de muerte Fas, FAIM y FLIP, en el sistema nervioso. Para ello, y pese a que comparten el fenotipo de promoción del crecimiento neurítico, existen diferencias mecanísticas que detallaremos de forma separada. Inicialmente, caracterizamos la proteína FAIM (Fas Apoptosis Inhibitory Molecule), de la cual existen dos únicas referencias en la bibliografía. Hemos demostrado que la expresión forzada de FAIM no protege las neuronas de la retirada de suporte trófico, pero ejerce una clara acción promotora del crecimiento neurítico en los diversos sistemas neuronales estudiados. Por una parte, la expresión forzada de FAIM incrementa la longitud y el grado de arborización de las neuritas inducidos por el factor de crecimiento nervioso (NGF), tanto en línea celular PC12 como en cultivos primarios de neuronas del ganglio cervical superior (SCG). Por otra parte, si se reducen los niveles endógenos de FAIM mediante la técnica del ARN de interferencia, se disminuye el crecimiento neurítico en dichas células. La expresión forzada de FAIM promueve la activación de la vía NF-κB, mientras que el bloqueo de esta vía, mediante la transfección de una forma mutada de IκBα no degradable o bien usando neuronas corticales de ratones nulos que carecen de la subunidad p65 de NF-κB, previene el crecimiento neurítico promovido por NGF. El efecto estimulador del crecimiento neurítico también puede ser bloqueado por la inhibición de la vía de Ras/ERK. Finalmente, demostramos que FAIM interacciona con los dos receptores de la neurotrofina NGF, p75NTR y TrkA, de una forma dependiente de ligando. Estos resultados revelan una nueva función de FAIM como promotor de crecimiento neurítico mediante un mecanismo dependiente de NF-κB. En el caso de FLIP, se ha descrito su función como inhibidor endógeno de la apoptosis mediada por Fas, pero, también se ha visto implicado en promoción de proliferación. El trabajo describe por primera vez una función, hasta ahora desconocida, de FLIP en el sistema nervioso. FLIP se expresa en motoneuronas, en neuronas SCGs y células PC12, aunque su expresión forzada, únicamente protege de la muerte celular inducida por la retirada de factores tróficos en motoneuronas. De todos modos, dicha expresión aumenta de forma considerable el crecimiento neurítico en los tres modelos, después del estímulo neurotrófico apropiado. De forma interesante, y sin excepción, la reducción de los niveles endógenos de FLIP inhibe la neuritogénesis en estos modelos. Las vías intracelulares reguladas por FLIP implican tanto ERK como NF-κB. La expresión forzada de FLIP promueve un incremento en su actividad, mientras que la reducción de su expresión provoca una disminución de ésta, después de un estímulo de NGF en células PC12. Finalmente, demostramos que FLIP interacciona con el receptor del NGF, TrkA de una manera dependiente de estímulo. Estos resultados revelan una nueva función para FLIP, la neuritogénesis, a través de un mecanismo que implica la activación de las vías Ras/ERK y NF-κB, y que no está relacionada con su clásica función antiapoptótica. / The present work studies the effect of two proteins identified as Fas-induced cell death antagonists, FAIM and FLIP, in the nervous system. Although they share the neuritogenesis promoting effect, there are mechanistical differences that will be detailed separately. Fas apoptosis inhibitory molecule (FAIM) is a protein identified as an antagonist of Fas-induced cell death. We show here that FAIM over expression fails to rescue neurons from trophic factor deprivation, but exerts a marked neurite growth -promoting action in different neuronal systems. Whereas FAIM over expression greatly enhanced neurite outgrowth from PC12 cells and sympathetic neurons grown with nerve growth factor (NGF), reduction of endogenous FAIM levels by RNAi decreased neurite outgrowth in these cells. FAIM over expression promoted NF-κB activation, and blocking this activation by using a super repressor IκBα or by carrying out experiments using cortical neurons from mice that lack the p65 NF-κB subunit prevented FAIM-induced neurite outgrowth. The effect of FAIM on neurite outgrowth was also blocked by inhibition of the Ras-ERK pathway. Finally, we show that FAIM interacts with both TrkA and p75NTR NGF receptors in a ligand-dependent manner. These results reveal a new function of FAIM in promoting neurite outgrowth by a mechanism involving activation of the Ras-ERK pathway and NF-κB. Cellular FLIP (c-FLIP) is an endogenous inhibitor of the signaling pathway triggered by Fas activation implicated in apoptosis as well as in proliferation processes. Here, we demonstrate for the first time an unexpected role of FLIP in the nervous system. FLIP is expressed in motoneurons, SCGs and PC12 cells. However, its over expression is only able to protect mouse isolated motoneurons from growth factor deprivation-induced cell death. Whereas FLIP over expression greatly enhanced neurite outgrowth in the three neuronal models after appropriate neurotrophin stimuli, reduction of endogenous FLIP levels by RNAi decreased neuritogenesis in these cells. The intracellular signals regulated by FLIP implicate both ERK and NF-κB pathways. Over expression of FLIP promotes an increased activity, whereas its downregulation provokes a reduction after NGF stimulus in PC12 cells. Finally, we demonstrate that FLIP interacts with TrkA receptor in a NGF dependent manner. These results reveal a new function of FLIP in neuritogenesis by a mechanism involving activation of Ras/ERK pathway and NF-κB that can be separated from its classical antiapoptotic function.