A fi d'analitzar la contribució de la regió C-terminal proposada com a iniciadora del plegament (CFIS 106-118) a l'estabilitat de l'RNasa A, els residus alifàtics d'aquesta regió es van substituir, mitjançant mutagènesi dirigida, per altres residus en els quals la cadena lateral alifàtica era rogressivament escurçada. La major part de les substitucions projectades suposaven delecions no disruptives de grups metil(è). A més, es va reemplaçar la Tyr115 per un Trp, de manera que, potencialment, s'introduïa una única sonda fluorescent, no desestabilitzant, per tal de seguir els canvis conformacionals que es poguessin generar en la regió durant el procés de legament/desplegament de la proteïna. Tant els paràmetres cinètics, com els espectres d'FTIR i CD, determinats per cadascuna de les ribonucleases variants, indiquen que els reemplaçaments aminoacídics efectuats presenten, en general, poc o cap efecte en l'estructura nativa i en l'activitat de l'enzim. Es va emprar l'espectroscòpia d'absorció a l'ultraviolat de quarta derivada, la fluorescència (per la variant amb Trp) i l'espectroscòpia d'infraroig per transformada de Fourier, per tal de seguir i caracteritzar, en condicions d'equilibri, les transicions conformacionals de cada variant en funció de la pressió i de la temperatura. Els resultats es van comparar amb els que es van obtenir per la proteïna salvatge. Per determinar més a fons les característiques del procés de desplegament de la variant Y115W, les transicions de desnaturalització induïdes per urea d'aquesta variant i de la proteïna salvatge, van ésser examinades per mitjà d'electroforesi en gradient d'urea i espectroscòpia de fluorescència. Curiosament, els canvis conformacionals que resulten de la desnaturalització per pressió són molt semblants als que s'obtenen per temperatura. Enfront d'un augment gradual tant de pressió com de temperatura, l'estructura terciària i els elements d'estructura secundària de les proteïnes estudiades es perden de manera conjunta i reversible. Aquestes variacions estructurals que es promouen descriuen un procés de desplegament molt cooperatiu i en dos estats. Atès que ambdues tècniques (UV i FTIR) utilitzen cadascuna un règim de concentració proteica molt diferent, els resultats indiquen que el procés de desplegament per pressió i per temperatura és intramolecular. Els resultats obtinguts suggereixen que la hidrofobicitat i el volum de les cadenes laterals del CFIS, juntament amb les interaccions de van der Waals entre elements d'estructura secundària intervenen de manera molt notable en l'estabilització de la proteïna. Entre els diferents aminoàcids alifàtics que pertanyen al CFIS C-terminal, la Val108 és el residu més important per tal de preservar la integritat estructural de l'estat natiu. Els reemplaçaments en aquesta posició causen petites alteracions conformacionals i una gran desestabilització de la proteïna (per exemple, el punt mig de la transició de desnaturalització per pressió i per temperatura de la variant V108G disminueix uns 592 MPa i 25ºC, respectivament, respecte a la proteïna salvatge). D'acord amb els resultats obtinguts, la variant Y115W ofereix una sonda útil per tal de seguir la cinètica de plegament/desplegament de l'RNasa A. / Para analizar la contribución de la región C-terminal propuesta como iniciadora del plegamiento (CFIS 106-118) en la estabilidad de la RNasa A, los residuos alifáticos de esta región fueron sustituidos, mediante mutagénesis dirigida, por otros residuos en los cuales la cadena lateral alifática era progresivamente recortada. La mayor parte de las sustituciones proyectadas suponían deleciones no disruptivas de grupos metilo(eno). Además, se reemplazó la Tyr115 por un Trp, de forma que, potencialmente, se introducía una única sonda fluorescente, no desestabilizadora, para seguir los cambios conformacionales que se pudieran generar en la región durante el proceso de plegamiento/desplegamiento de la proteína. Tanto los parámetros cinéticos, como los espectros de FTIR y CD, determinados para cada una de las ribonucleasas variantes, indican que las sustituciones aminoacídicas efectuadas presentan, en general, poco o ningún efecto en la estructura nativa y en la actividad de la enzima. Se utilizó la espectroscopia de absorción ultravioleta de cuarta derivada, la fluorescencia (para la variante con Trp) y la espectroscopia de infrarrojo por transformada de Fourier, para seguir y caracterizar, en condiciones de equilibrio, las transiciones conformacionales de cada variante en función de la presión y de la temperatura. Los resultados se compararon con los que se obtuvieron por la proteína salvaje. Para determinar más a fondo las características del proceso de desplegamiento de la variante Y115W, las transiciones de desnaturalización inducidas por urea de esta variante y de la proteína salvaje, fueron examinadas mediante electroforesis en gradiente de urea y espectroscopia de fluorescencia. Curiosamente, los cambios conformacionales que resultan de la desnaturalización por presión son muy parecidas a los que se obtuvieron por temperatura. Enfrente de un aumento gradual tanto de presión como de temperatura, la estructura terciaria i los elementos de estructura secundaria de las proteínas estudiadas se pierden de forma conjunta y reversible. Estas variaciones estructurales que se promueven describen un proceso de desplegamiento muy cooperativo y en dos estados. Dado que las dos técnicas (UV y FTIR) utilizan cada una un régimen de concentración proteica muy diferente, los resultados indican que el proceso de desplegamiento por presión y por temperatura es intramolecular. Los resultados obtenidos sugieren que la hidrofobicidad y el volumen de las cadenas laterales del CFIS, junto con las interacciones de van der Waals entre elementos de estructura secundaria intervienen de forma muy notable en la estabilización de la proteína. Entre los diferentes aminoácidos alifáticos que pertenecen al CFIS C-terminal, la Val108 es el residuo más importante para preservar la integridad estructural del estado nativo. Las sustituciones en esta posición causan pequeñas alteraciones conformacionales y una gran desestabilización de la proteína (por ejemplo, el punto medio de la transición de desnaturalización por presión y por temperatura de la variante V108G disminuye unos 592 MPa y 25ºC, respectivamente, respecto a la proteína salvaje). De acuerdo con los resultados obtenidos, la variante Y115W ofrece una sonda útil para seguir la cinética de plegamiento/desplegamiento de la RNasa A. / To analyze the contribution of the postulated carboxy terminal chain-folding initiation site (CFIS 106-118) on ribonuclease A stability, the aliphatic side chains in this region were progressively truncated using site-directed mutagenesis. Most amino acid substitutions were designed to be non-disruptive deletions of methyl and methylene groups. In addition, replacement of Tyr 115 with Trp was designed for its potential as a unique and non-destabilizing fluorescent label of conformational changes local to the region. Steady-state kinetic parameters for the enzyme reaction, FTIR and CD spectra of each RNase A variant indicate that amino acid replacements performed in this region have, in general, little or no effect on the native structure and function of the enzyme. Fourth derivative UV absorbance, fluorescence (for the Trp variant) and Fourier transform infrared spectroscopy were used to detect and characterize the conformational transitions of each variant, as a function of both pressure and temperature. The results were compared with those presented for the wild-type protein. To further determine the unfolding properties of the Y115W variant, the unfolding transitions induced by urea of RNase A wild-type and Y115W variant, were examined by urea gradient gel electrophoresis and fluorescence spectroscopy. Interestingly, conformational changes resulting from pressure denaturation do not differ considerably from those obtained during temperature treatment. Simple two- state, reversible unfolding transitions were observed, suggesting that the disruption of tertiary and secondary structure of each protein at high pressure or temperature is strongly cooperative. Spectral changes occur at about the same values using both low- and high-protein concentration regime techniques, indicating that the observed unfolding events are intramolecular, and that breakdown of the tertiary and secondary structures occurs concomitantly. The results obtained reveal that hydrophobicity and volume of the CFIS side chains, together with van der Waals interactions between secondary structural elements play an important role in stabilizing the protein. Among the aliphatic amino acids belonging to the C-terminal CFIS, V108 is the most critical residue. Replacements performed in this site cause small conformational differences in the native state, and a dramatic destabilization of the protein (i.e. the pressure and temperature midpoint denaturation values of the V108G variant decrease by 592 MPa and by 25ºC, respectively, relative to the wild-type RNase A). According to the results obtained in the current study, the Y115W labeled variant offers a useful probe for the folding/unfolding kinetics.

El enzima hidroxi-3-metil-glutaril coenzima A reductasa (HMG-CoA reductasa) es el principal enzima regulador de la vía de síntesis del colesterol. Al igual que otros muchos enzimas, éste intercambia sus estados inactivo o activo por fosforilación / desfosforilación reversible, dependiendo su nivel de actividad del grado de fosforilación. En estudios "in vitro" se ha demostrado que en el mecanismo de fosforilación reversible intervienen HMG-CoA reductasa quinasas y HMG-CoA reductasa fosfatasas, tanto de origen microsomal como citosólico.Nuestro objetivo ha sido profundizar en la caracterización y purificación de las protein fosfatasas localizadas en microsomas de hígado de rata, en especial la actividad fosfatasa, que a lo largo de este trabajo denominaremos HMG-CoA reductasa fosfatasa M, ya que presenta un comportamiento cromatográfico que la diferencia de otras protein fosfatasas descritas.Los resultados obtenidos en el subfraccionamiento celular, en el fraccionamiento cromatográfico y la caracterización enzimática de la actividad HMG-CoA reductasa fosfatasa apoyan las siguientes conclusiones:1.- El estado nutricional de las ratas no modifica la actividad total HMG-CoA reductasa fosfatasa presente en el sobrenadante postrnitocondrial de hígado. La actividad no se ve modificada por ayuno prolongado ni por la administración de glucagon.2.- El tratamiento con glucagon determina la redistribución de la actividad, la actividad HMG-CoA reductasa fosfatasa asociada a microsomas disminuye significativamente.3.- El subfraccionamiento por centrifugación a 100.000 xg del sobrenadante postmitocondrial, obtenido de ratas alimentas, provoca la precipitación de una parte (aproximadamente el 15%) de la actividad HMG-CoA reductasa fosfatasa inicial. Esta actividad se distribuye a partes iguales entre microsomas y precipitado de glucógeno.4.- La actividad presente en microsomas no se debe a contaminación por proteínas de origen citosólicas.5.- La actividad presente es microsomas no se debe a contaminación por proteínas procedentes del precipitado glucógeno-proteico ya que: a) tiene afinidad por el glucógeno; b) las pautas de solubilización son distintas para microsomas y glucógeno; c) cuando se intenta la purificación de la actividad HMG-CoA reductasa fosfatasa a partir de glucógeno siguiendo la misma metodología que la empleada para la HMG-CoA reductasa fosfatasa M se pone de manifiesto un comportamiento cromatográfico diferenciador entre las muestras procedentes de glucógeno y las de microsomas.6.- La distribución de PrP sobre sustrato HMG-CoA reductasa, tras la centrifugación en un gradiente de sacarosa permite concluir que existe una actividad localizada en rnicrosomas.7.- La actividad presente en microsomas puede solubilizarse con tratamientos suaves (detergentes no aniónicos a baja concentración o tratamiento con sales a baja molaridad) sin que queden cantidades significativas en el precipitado final, lo que indica que la proteína responsable de la actividad fosfatasa no es una proteína intrínseca de membrana.8.- En microsomas están presentes tres actividades proteína fosfatasa sobre sustrato HMG-CoA reductasa: PrP 1, PrP 2A y PrP 2C. No se detecta actividad PrP 2B en microsomas.9.- Se purifica la actividad HMG-CoA reductasa fosfatasa M a partir de microsomas solubilizados con detergente. La preparación final presenta un peso molecular aparente de 85 kDa en gel filtración.10.- La actividad HMG-CoA reductasa fosfatasa M en presencia de 0.5 M KCl se disocia produciendo dos subunidades: una con actividad catalítica que presenta un peso molecular de aproximadamente 55 kDa, tanto en gel filtración como en geles de acrilamida/SDS y otra de menor peso molecular que es la subunidad de anclaje al retículo endoplasmático.11.- El enzima HMG-CoA reductasa fosfatasa M no es específico para el sustrato HMG-CoA reductasa. De forma inversa el sustrato HMG-CoA reductasa puede ser desfosforilado por las cuatro serin protein fosfatasas hasta ahora descritas: PrP 1, 2A, 28 y 2C.12.- La actividad HMG-CoA reductasa fosfatasa M se clasifica como PrP 1, al ser inhibida por el inhibidor 2 y al mismo tiempo no ser activable por protamina. Son necesarias para su inhibición mayores concentraciones que las descritas para la PrP 1 citosólica.13.- La rotura del holoenzima de 85 kDa, o de la subunidad de 55 kDa, por precipitación con acetona o por proteolísis controlada con tripsina, provoca la aparición de una actividad protein fosfatasa de peso molecular en cromatografía de gel filtración de 35-37 kDa.14.- La obtención del fragmento de 35-37 kDa conlleva en todas las ocasiones pérdida de la actividad HMG-CoA reductasa fosfatasa que no se recupera por tratamientos posteriores.15.- Vistas las conclusiones anteriores, el enzima HMG-CoA reductasa fosfatasa M, purificado y parcialmente caracterizado a partir de microsomas de hígado de rata, tiene un comportamiento que lo distingue de otras PrP descritas. Es de origen microsomal y no se debe a contaminación por glucógeno o citesol. Está constituido por una subunidad de anclaje y otra con actividad catalítica. En su constitución no interviene el modulador o inhibidor 2 si bien lo reconoce y es inhibida por él. / 3-Hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A (HMG-CoA) reductase (E.C. 1.1.1.34) the main rate limiting enzyme for synthesis of cholesterol and isoprenoids, has been shown to be regulated by covalent modification. AMP-activated reductase kinasa inactivates and phosporylates HMG-CoA reductase. Inactivated, homogeneous P-labelled HMG-CoA reductase is reactivated in vitro by rat liver protein phospatases with a concomitant release of P bound to serin residues. HMG-CoA reductase phosphatise activity present in the post-mithocondrial supernatant partially sedimented (13%) into the particulate fraction upon centrifugation at high speed. The sedimented activity was distributed in a similargrade level between the microsomal membranes (7%) and the gIycogen pellet (6%). The phosphatase activity associated to the endoplasmic reticulum was not due to glycogen contamination. The whole HMG-CoA reductase phospatase activity present in microsomal membranes can be isolated with either 0,1% Triton X-100 or 0.5 M KCI of which it is concluded that this activity is not associated to membrane as a integral protein. By using standard enzymatic methods can be characterized three protein phosphatase activities in the detergent solubilized microsomal membranes: type 1, 2A and 2C, but not type 2B. The purified protein HMG-CoA reductase phosphatase microsomal PrP-M characterized as type 1 requires higher concentrations of inhibitor-2 than the rabbit muscle cytosolic type 1 protein phosphatase. PrPn was not affected by the protein inhibitor that inhibits PrP type 2A activity when HMG-CoA reductase is the substrate. A model of the microsolnal PrP type-1 is presented, deduced by the molecular masses observed after solubilization either by Triton X-100 or 0.5 M KCI, and by the trypsin treatment.

El comportament escumant d'un vi escumós (cava, champagne, etc) vé determinat, sobretot, per l'efecte dels diferents compostos amb propietats tensioactives presents en el propi vi i la seva capacitat per a estabilitzar o desestabilitzar les interfases líquid-gas de les bombolles. En el present treball es posa de manifest l'efecte favorable dels col·loides del vi (proteïnes, glicoproteïnes i polisacàrids) en l'expressió de les característiques escumants, així com també l'efecte negatiu que semblen exercir determinats ácids grassos.Durant el procés d'elaboració d'un vi escumós, qualsevol intervenció o transformació que suposi una alteració de la composició química podrá alterar-ne també el comportament escumant. En aquest sentit, s'ha volgut estudiar quin és l'efecte dels diferents productes utilitzats en la clarificació del vi i en el tiratge sobre l'escuma i la seva relació amb els canvis que provoquen en la concentració col·loidal del vi. Davant la diversitat de clarificants disponibles en el mercat, el nostre objetiu ha estat poder ajudar a l'elaborador a prendre una decisió en el moment d'escollir entre un o altre productes disponibles. S'ha proposat, a més, l'ús de nous additius (escorces de llevat i col·loides procedents de les pells de raïm o de la fermentació d'un medi sintètic) per tal de millorar la qualitat de l'escuma d'aquests vins.En relació amb la presa d'escuma (segona fermentació alcohòlica) es mostra també que l'efecte de la soca de llevat sobre les característiques escumants és un criteri addicional a tenir en compte en el moment de la seva selecció. Finalment, s'han posat de manifest els canvis que es dónen en la concentració de diferents fraccions de col·loides durant la criança del vi escumós (conservació en contacte amb els llevats) com a conseqüència de l'autòlisi, així com també el seu efecte sobre les característiques escumants. / Le comportement moussant d'un vin effervescent (cava, champagne, etc) est déterminé surtout par l'effet des différentes molécules présentes dans le vin qui ont des propriétés tensioactives et par leur capacité pour stabiliser ou non les interfaces gaz-liquide des bulles. Dans ce travail, on constate l'effet favorable des colloïdes du vin (protéines, glycoprotéines et polysaccharides) vis-à-vis de l'expression des caractéristiques moussantes, ainsi que de l'effet negatif de certains acides gras.Concernant le procès d'élaboration d'un vin mousseux, toute intervention ou transformation qui puisse altérer leur composition chimique pourra aussi modifier le comportement moussant. En ce sens, on a étudié quel était l'effet des différents produits utilisés pour la clarification du vin et l'effet des adjuvants de tirage sur les caractéristiques de la mousse et leur relation avec les changements provoqués sur la concentration des colloïdes du vin. Face à la quantité et diversité des produits de clarification disponibles sur le marché, nous nous sommes fixés comme objectif de pouvoir aider l'élaborateur à choisir entre l'un ou l'autre produit. De plus, on a proposé l'utilisation de nouveaux additifs (écorces de levures et colloïdes extraits des pellicules des baies de raisin ou provenant de la fermentation d'un milieu synthétique) afin d'améliorer la qualité de la mousse des vins effervescents.En ce qui concerne la prise de mousse (deuxième fermentation alcoolique) on a aussi constaté l'importance du choix de la souche de levure sur les caractéristiques moussantes du vin; il s'agit donc d'un critère additionnel que l'on doit considérer lors de la sélection de ces levures. Finalement on a montré quels étaient les changements qui se produisaient sur la concentration des différentes fractions de colloïdes pendant le viellissement des vins effervescents sur lattes (conservation du vin en contact avec les levures) à cause de l'autolyse, ainsi comme leur effet sur les caractéristiques moussantes. / The foaming ability of a sparkling wine is conditioned by different tensioactive products and their capacity to stabilise or not the bubble's gas-liquid interphase. The present study proves the positive effect of wine colloids on foaming expression as well as the negative effects of some fatty acids. During sparkling wine making, any change that may modify the chemical composition will change the foaming ability. We have studied the effect of different compounds used for wine fining and tirage on the foam and their relation to changes in wine colloid concentration. Facing the broad diversity of these products available to wine maker, our goal is to provide decision tools for its election. Some new additives are proposed for foam improvement (inactivated yeasts and colloids coming from grape skin or fermented synthetic medium). As for the prise de mousse (second alcoholic fermentation), the yeast strain is an additional parameter to be considered. Finally, the changes during ageing in contact with yeast lees affect both the colloid composition of wine, and thus the foaming ability. / El comportamiento espumante de un vino espumoso (cava, champagne, etc) viene determinado, sobretodo, por el efecto de los diferentes compuestos con propiedades tensioactivas presentes en el propio vino y su capacidad para estabilizar o desestabilizar las interfases líquido-gas de las burbujas. En el presente trabajo se pone de manifiesto el efecto favorable de los coloides del vino (proteínas, glicoproteínas y polisacáridos) en la expresión de las características espumantes, así como el efecto negativo que parecen ejercer determinados ácidos grasos.Durante el proceso de elaboración de un vino espumoso, cualquier intervención o transformación que suponga una alteración de la composición química podrá alterar también su comportamiento espumante. En este sentido se ha querido estudiar cual es el efecto de los diferentes productos utilizados en la clarificación del vino y en el tiraje sobre la espuma y su relación con los cambios que provocan en la concentración coloidal del vino. Ante la diversidad de clarificantes disponibles en el mercado, nuestro objetivo ha sido poder ayudar al elaborador a tomar una decisión en el momento de escoger entre uno u otro producto disponibles. Se ha propuesto además el uso de nuevos productos (cortezas de levadura y coloides procedentes de la piel de las uvas o de la fermentación de un medio sintético) para mejorar la calidad de la espuma de estos vinos.En relación con la toma de espuma (segunda fermentación alcohólica) se muestra también que el efecto de la cepa de levadura sobre las características espumantes es un criterio adicional a tener en cuenta en el momento de su selección. Finalmente, se han puesto de manifiesto los cambios que tienen lugar en la concentración de diferentes fracciones de coloides durante la crianza del vino espumoso (conservación en contacto con las levaduras) como consecuencia de la autólisis, así como su efecto sobre las características espumantes.

L'objectiu del treball d'investigació és observar els efectes del tractaments per alta pressió isostàtica en llet de cabra, especialment aquells referents a modificacions en l'estat de les proteïnes sèriques, caseïnes i estructura micel.lar de les caseïnes. Els tractaments efectuats (fins 500 MPa a 20 o 45 ºC) es comparen amb els efectes dels tractaments tèrmics sobre la fracció proteica de la llet.Les conclusions extretes en el treball indiquen que la sensibilitat a l'agregació de les proteïnes sèriques caprines, utilitzant cromatografia en gel, és diferent segons si es tracta de processament tèrmic de pasteurització o per alta pressió. En el primer cas, l'ordre de sensibilitat és: immunoglobulines > seralbúmina > b-lactoglobulina > a-lactalbúmina. En pressuritzar, però, l'ordre és: b-lactoglobulina > immunoglobulines > seralbúmina > a-lactalbúmina.Així mateix, s'observa que el patró d'agregació de la b-lactoglobulina és diferent en sotmetre la llet a alta pressió o a calor. En el primer cas, es descriuen per primera vegada la formació d'agregats solubles, formats únicament per b-lactoglobulina si el tractament es fa a 25 ºC, o amb molècules de a-lactalbúmina si es fa a 50 ºC. La quantitat i el pes molecular dels agregats depenen de la pressió i temperatura de tractament. La pressurització de la llet de cabra provoca la modificació de l'estructura de la micel·la de caseïna. En tractaments a 20 ºC, es produeix una disgregació amb la formació posterior de cadenes de submicel·les. La disminució de la mida micel·lar depèn de la pressió de tractament a 20 ºC. A 45 ºC i 300-400 MPa, apareixen estructures caseíniques de gran diàmetre, amb una proporció molt baixa de k-caseïna i de proteïnes sèriques. En augmentar la pressió de tractament, aquestes estructures no són observades per microscopia electrònica. El tipus de complex caseínic resultant de la pressurització de la llet de cabra a 20 o 45 ºC depèn d'un equilibri entre la facilitat de formació d'enllaços hidrofòbics, potenciats per l'exposició de grups hidròfobs cap a la fase aquosa, i la presència de calci iònic en la fase soluble de la llet. La intensitat amb què actuen aquests paràmetres depèn de la temperatura de tractament.En tots els tractaments assajats, es comprova que les concentracions de fòsfor i calci total en el lactoserum obtingut per ultracentrifugació de la llet pressuritzada estan directament relacionades amb la quantitat de caseïna del mateix lactoserum, per la qual cosa podem assumir que es troben amb algun tipus d'associació.L'anàlisi per cromatografia en gel de les proteïnes sèriques en lactoserum acidificat a pH 4,6, en posar en evidència la formació d'agregats de proteïna sèrica específics dels tractaments per alta pressió, es mostra com un mètode vàlid per a detectar el tipus de tractament aplicat a la llet i, per tant, per a ser utilitzat com a indicador dels tractaments per alta pressió. / The aim of the research work is to know the effect of high-pressure treatments on goat's milk, and, in particular, on whey proteins, casein and casein micelles. The pressurisation treatments (up to 500 MPa at 20 or 45 ºC), are compared with the effect of thermal treatment on the same milk compounds.The conclusions of the work show that there are different sensibilities to the aggregation due pressure or thermal treatments for the different whey proteins. For thermal treatment, the more easy aggregated protein is immunoglobulin > seralbumin > b-lactoglobulin > a-lactalbumin. However, on pressure treatments, the degree of aggregation follows the order: b-lactoglobulin > immunoglobulin > seralbumin > a-lactalbumin.Moreover, the pattern of aggregation of the b-lactoglobulin is different for thermal or pressure treatments. On the firs case, we describe the apparition of soluble aggregates, just composed by b-lactoglobulin if the pressure treatment is carried out at 25 ºC, or mixed with a-lactalbumin if the pressurisation is at 50 ºC. The amount and size of the aggregates depend on the pressure and temperature of the treatment.The pressurisation of goat's milk causes modifications on micelle structure. If the pressurisation is carried out at 20 ºC, the micelle breaks on small particles that tend to form chains. At 45 ºC and 300-400 MPa, the casein aggregate to form great structures with a very low proportion of k-casein and whey proteins. However, if the pressure is increased, these structures are not observed by electronic microscopy.The kind of casein aggregate that appears after pressurisation is related to the make up of hydrophobic links, that are promoted by the exposition of hydrophobic parts of the protein to the water phase, and to the action of ionic calcium on the watery phase of the milk.The phosphor and calcium concentration on lactoserum obtained by ultracentrifugation of pressurised milk, were directly related to the amount of casein concentration on the same lactoserum, and therefore, it is concluded that these substances are associated by the pressurisation.

Los linfocitos T (LT) son activados cuando reconocen a través de su TCR el péptido antigénico presentado por el MHC. Esta es la primera señal y ha de ser amplificada para una correcta activación de los LT. Esta amplificación es realizada por parejas ligando-receptor con función co-estimuladora, como B7-CD28, que dan la llamada segunda señal. La zona de contacto entre el LT y la célula presentadota (APC) se denominada sinapsis inmunitaria (SI), y las moléculas accesorias y de señalización se van reorganizando formando una estructura denominada Complejo Supramolecular de Asociación o SMAC. CD6 pertenece a la superfamilia de receptores con dominios ricos en cisteínas tipo Scavenger (SRCR, Scavenger Receptors Cistein Rich). Tradicionalmente ha sido descrito como un receptor con función co-estimuladora pero el mecanismo por el que realiza esta función no es conocido. Este trabajo de tesis doctoral pretende ampliar los escasos conocimientos existentes sobre esta proteína. 1. Estudio de posibles asociaciones de CD6 con otros receptores linfocitarios:Mediante estudios bioquímicos (co-inmunoprecipitación) y de biología celular (FRET y modulación) hemos detectado la asociación física de CD6 a CD5 y al complejo CD3/TCR y proponemos una posible asociación a otras dos moléculas con función de adhesión como son CD44 e ICAM-3. 2. Implicación de CD6 y CD5 en los procesos de activación linfocitaria:Los receptores CD5 y CD6, así como el ligando de CD6 (ALCAM), son reclutados a la zona central de la SI. También describimos el reclutamiento de CD6 a los rafts.La presencia de la proteína recombinante soluble (rs) CD6 (rsCD6), a diferencia de rsCD5, produjo una inhibición de la proporción de SI madura. En estudios de proliferación de PBLs con diferentes estímulos también tanto rsCD6 como rsCD5 demostraron capacidad inhibitoria de forma dosis dependiente de ciertos estímulos. Por tanto la interacción de CD5 y CD6 a sus respectivos ligandos es importante para la correcta activación de los LT, demostrando estas proteínas tener capacidad inmunomoduladora. 3. Posibles asociaciones realizadas por la región citoplasmática de CD6:Mediante ensayos de doble híbrido detectamos la asociación de la región más C-terminal de CD6 a la proteína adaptadora syntenin-1. Syntenin-1 contiene una zona N-terminal seguida de dos dominios PDZ en tándem y fue descrita por primera vez por su interacción con syndecan. Nuestros resultados demostraron que en la interacción CD6-syntenin-1 participan los dos dominios PDZ de syntenin-1 así como los aa más C-terminales de CD6. También esta interacción la demostramos en PBLs humanas así como el acúmulo de syntenin-1 en la zona central de la SI. CONCLUSIONES1- CD6 está físicamente asociado a CD5, lo cual sugiere que estos dos receptores pueden formar una unidad funcional compartiendo señales similares o complementarias.2- CD6 está físicamente asociado al complejo CD3/TCR de forma independiente a CD5. Esta asociación convierte a CD6 en un co-receptor de este complejo y lo capacita para modular las señales mediadas por él.3- CD6 y su ligando se acumulan en la zona central de la SI co-localizando con CD5 y el complejo CD3/TCR. Esta localización está de acuerdo con su capacidad potencial de modular la activación linfocitaria.4- La región intracelular de CD6 interacciona con syntenin-1, una proteína con dominios PDZ. La demostración de la presencia de syntenin-1 en la zona central de la SI sugiere que esta proteína funciona como una proteína adaptadora permitiendo la unión de CD6 al citoesqueleto o a proteínas señalizadoras durante la formación y/o maduración de la SI.5- La forma recombinante soluble CD6 (rsCD6) ha demostrado tener capacidad inmunomoduladora. Esto demuestra la relevancia de las interacciones mediadas por este receptor en los procesos de activación linfocitaria y plantea la su posible utilidad terapéutica. / T cell activation needs the interaction of co-stimulatory molecules with their ligands presented by the APC. CD6 is a co-stimulatory molecule which exact function is not well known. For all that is the object of this doctoral thesis.1- Study of the interactions of CD6 with other lymphocitary receptors:Biochemical (co-immunoprecipitation) and cell biological studies (FRET and modulation) showed physical association of CD6 to CD5 and to the CD3/TCR complex and we proposed a possible association to others molecules with adhesion function like CD44 and ICAM-3. 2. CD6 and CD5 implication on the lymphocitary activation process:Our results demonstrated that the CD5 and CD6 receptors, and the CD6 ligand (ALCAM), accumulated at the central zone of the immunological synapse (IS). Soluble forms of these proteins showed immunomodulatory capacity.3- Study of interactions thought the CD6 cytoplasmic region:By two-hybrid assays we detected the association of the most C-terminal region of CD6 with the adaptor protein syntenin-1 with a tandem of PDZ domains. Our results showed that in the interaction CD6-Syntenin-1 were implicated both syntenin-1´s PDZ domains and the four amino acids most C-terminals of CD6. Syntenin-1 also accumulated at the central zone of the IS. CONCLUSIONS: 1- CD6 is physically associated to CD5. This suggest that both receptors can form a functional unit shearing similar or complementary signals.2- CD6 is physically associated to the CD3/TCR complex, independently of CD5. This association converts CD6 in a CD3/TCR co-receptor with capacity of modulate its signals.3- CD6 and its ligand (ALCAM) accumulate at the central zone od the IS, co-localizing with CD5 and the CD3/TCR complex. This association agrees with its potential capacity of modulate the lymphocitary activity.4- The intracellular region of CD6 interacts with syntenin-1, a protein with PDZ domains. The demonstration of the presence of syntenin-1 at the central zone of the IS suggests that this protein functions as an adaptor protein allowing the union of CD6 to the citoskelleton or to signalling proteins during the formation and/or maturation of the IS.5- The soluble form of CD6 has immunomodulatory capacity. This demonstrate the relevance of the CD6 mediated interactions during the lymphocitary activation process and propose its possible therapeutic utility.

L'estudi realitzat ha estat la identificació i caracterització de proteïnes de la matriu nuclear, concretament d'una proteïna de 55 KD (p55) associada a la fase replicativa de l'ADN durant la proliferació cel.lular.La matriu nuclear és una estructura obtinguda després d'una extracció de cromatina i components solubles de nuclis amats. Durant els últims anys s'ha implicat a la matriu nuclear en importants funcions com són: l'organització i replicació de l'ADN, la transcripció i l'acció hormonal (1, 2, 3, 4, 5, 6). Nombroses evidències desvetllen la importància dels components de la matriu nuclear en la regulació de la síntesi de l'ADN i la proliferació cel.lular, com l'increment d'expressió de molts oncogens, que codifiquen proteïnes nuclears les quals s'associen a l'activació proliferativa de diversos tipus cel.lulars normals (7, 8, 9, 10). També s'ha descrit l'increment de moltes altres proteïnes, incloent la calmodulina, proteïnes acceptores de calmodulina (11) i distins enzims replicatius com l'ADN polimerasa a, l'ADN primasa, la 3'-5'-exonucleasa, l'ARNasa H i l'ADN metilasa, les quals s'associen a la matriu nuclear dels hepatòcits durant la fase replicativa de la regeneració (12).Totes aquestes dades suggereixen que la síntesi de certes proteïnes i la seva associació amb la matriu nuclear pot ésser un procés important per a la regulació de la replicació de l'ADN i la proliferació cel.lular en general.El treball desenvolupat s'ha centrat en la identificació d'una proteïna de 55 KDa (p55) associada a la matriu nuclear, que incrementa paral.lelament a l'inici de la síntesi d'ADN durant la regeneració hepàtica després d'una hepatectomia parcial (13). L'hepatectomia parcial ha estat el model emprat per l'estudi dels canvis proteics associats a la matriu nuclear dependents de les distintes fases dels cicle ceLlular.El fet de que la p55 incrementes paral.lelament a la síntesi d'ADN suggería que fos una proteïna relacionada directament amb la replicació de l'ADN.A causa de l'interès que representa l'estudi dels processos i factors que intervenen en el desenvolupament de la síntesi d'ADN i posterior divisió cel.lular, i atès que es desconeixen les proteïnes que forment part o intervenen en l'estructura interna de la matriu nuclear, l'objectiu d'aquest estudi ha estat la caracterització de la p55. Per tal propòsit s'ha purificat i s'han produït anticossos policlonals contra la p55, amb els quals s'han realitzat estudis immunocitoquímics que han desvetllat la localització nuclear d'aquesta proteïna en el teixit hepàtic regenerant.A partir de la seqüència parcial d'aminoàcids, s'ha obtingut que la p55 presenta una granhomologia amb les queratines, concretament amb la queratina núm. 8.Atès que les queratines són proteïnes de la família de filaments intermedis, descrits comconstituents dels citoesquelet cel.lular i per tant la seva localització és citoplasmàtica i no nuclear, com en el cas de la p55, es plantejaren estudis paral.lels emprant anticossos contra la p55 i contra les queratines.Els estudis realitzats a nivell bioquímic, en teixit hepàtic, semblen indicar que la p55 detectada en la matriu nuclear es tracta de la queratina 8. Ja que el patró de les dues proteïnes és el mateix tant a nivell d'electroforesi bidimensional, com a nivell de fosforil.laciò in vitro i mitjançant immunotransferències emprant els anticossos esmentats anteriorment.Com a conclusió d'aquests resultats es podria afirmar, tal com hem indicat, que les duesproteïnes són la mateixa, si no fos pels resultats obtinguts en els estudis immunocitoquímics emprant l'anticossos anti-p55 i anti-queratines, en els quals s'ha comprovat que la queratina presenta distribució citoplasmàtica i la p55 nuclear.Posteriorment, s'inicià l'estudi de la p55 en distintes línies cel.lulars en cultiu, per poder generalitzar i comprovar els resultats obtinguts en el teixit hepàtic regenerant.S'ha utilitzat la línia cel.lular NRK 44F (cèl.lules normals no epitelials de ronyó de rata).Aquestes cèl.lules resultaven un model d'estudi interessant i comparable amb el de la regeneració hepàtica post-hepatectomia parcial, ja que presenten la capacitat d'ésser activades i sincronitzades en les distintes fases del cicle cel.lular.S'ha analitzat, mitjançant tècniques immunocitoquímiques, la presència de la p55 en aquestes cèl.lules en diferents fases del cicle cel.lular i s'ha observat que, al igual que en el fetge, la p55 es detecta exclusivament en el nucli de les cèl.lules NRK en fase S. L'ànalisi bioquímica ens indica que el patró electroforètic bidimensional de la proteïna detectada en les cèl.lules NRK, és similar al de la p55 de les cèl.lules hepàtiques. Presenta una forma majoritària i distintes isoformes d'igual pes molecular, degudes a diferents graus de fosforil.lació. En canvi, el pes molecular de la proteïna detectada per l'anticòs anti-p55 en aquestes cèl.lules no és de 55 KOa, si no de 62 KOa.Pel que fa a la correlació que hi ha entre la p55 i la citoqueratina 8 en les cèl.lules hepàtiques, és interessant indicar que les cèl.lules NRK 44F no són cèl.lules d'origen epitelial (tipus cel.lular que presenta típicament queratines com a components dels filaments intermedis), són fibroblasts, i aquests presenten vimentina com a component dels filaments intermedis.S'ha comprovat, mitjançant estudis immunocitoquímics i per immunotransferència la composició dels filaments intermedis de les cèl.lules NRK, emprant els anticossos antiqueratina i anti-vimentina. Ja que és conegut que alguns tipus cel.lulars que contenen un únic tipus de filament intermedi, a l'adaptar-se a les condicions de cultiu o degut a factors tumorals (en el cas de línies tumorals), expressen nous tipus de filaments intermedis que coexisteixen amb els originals.Els resultats obtinguts han estat els esperats. Les cèl.lules NRK no presenten queratines, únicament presenten vimentina.També s'ha caracteritzat la p55 en altres tipus cel.lulars com són: les cèl.lules HeLa (cèl.lules d'adenocarcinoma humà), MOCK (cèl.lules epitelials de ronyó de gos), BRL (cèl.lules d'hepatocarcinoma de rata) i cèl.lules 3T3 NIH (fibroblasts de ratolí). En totes aquestes cèl.lules, l'anticòs anti-p55 presenta localització exclusivament nuclear. En canvi s'han observat diferències respecte a la proteïna detectada. En les cèl.lules HeLa i MDCK l'anticòs anti-p55 detecta específicament una proteïna de 55 KOa, igual que en les cèl.lules hepàtiques. Una altra característica comú entre aquestes cèl.lules i les del fetge és que presenten queratines i concretament la queratina 8, com component dels filaments intermedis.En les cèl.lules 3T3 NIH, l'anticòs anti-p55 detecta una proteïna de 60-62 KOa. Aquest resultat coincideix amb l'obtingut en les cèl.lules NRK. Cal destacar que ambdós tipus de cèl.lules són fibroblasts i presenten vimentina com component dels filaments intermedis.Així doncs podem indicar que l'anticòs anti-p55 detecta una proteïna de localització nuclear independentment del tipus cel.lular que es tracti. En canvi en les cèl.lules d'origen epitelial o que contenen queratina 8, la proteïna detectada per l'anticòs presenta 55 KOa de pes molecular i en els fibroblasts o cèl.lules que no contenen queratina la proteïna detectada presenta entre 60-62 KOa.S'ha intentat esbrinar si la proteïna de 62 KOa detectada en els fibroblasts presenta alguna correlació amb la vimentina, com és el cas de la p55 i la queratina 8 en el fetge. Però, a més de presentar distint pes molecular, ja que la vimentina té un pes molecular de 57 KOa, presenten diferent patró electroforètic, així com tampoc s'ha observat que l'anticòs antivimentina reconegui la p55, ni l'anticòs anti-p55 la vimentina, contràriament al que s'observava amb la p55 i la queratina 8 en el fetge.CONCLUSIONS:Com a conclusió final podem dir que la proteïna detectada per l'anticòs anti-p55, encara que no presenti sempre una correlació amb el tipus de filament intermedi típic del tipus cel.lular en estudi, té relació amb els filaments intermedis degut a la seqüència d'aminoàcids que presenta. La proteïna identificada es pot considerar una proteïna estructural de la matriu nuclear implicada en la segregació dels cromosomes durant la divisió cel.lular, ja que els estudis immunocitoquímics realitzats en cèl.lules en mitosi, emprant l'anticòs anti-p55, ens mostren una reacció associada als cromosomes i a vegades seguint el mateix patró que el fus mitòtic.BIBLIOGRAFIA:1- Nelson, W.G.; K.J. Barrack and O.S. Cotfey. 1986. Ann. Rev. Biophys. Chem. 15: 457475.2- Pardoll, O.M.; B. Volgestein and O.S. Coffey. 1980. Cell 19: 527-536.3- Smith, H.C. and R. Berezney. 1982. Biochemestry 21: 6751-6761.4- Smith, H.C. and R. Berezney. 1983. Biochemestry 22: 3042-3046.5- Jackson, O.A. and P.R. Cook. 1986. EMBO J. 5: 1403-1410.6- Berezney, R. and O.S. Cotfey. 1975. Science 189: 291-293.7- Kelly, K.; B.H. Cochram, Ch.O. Stiles and P.Leder. 1983. Cell 35: 603-610.8- Thompson, C.B.; P.B. Challoner, P.E. Neiman and M. Groudine. 1986. Nature 319: 374380.9- Greenberg, M.E. and E.B. Ziff. 1984. Nature 311: 433-438.10- Thompson, N.L.; J.E. Mead, lo Braun. M. Goyette, P.R. Shank and N. Fausto. 1986.Caneer. Res. 46: 3111-3117.11- Serratosa, J.; M.J. Pujol, O. Baehs and E. Carafoli. 1988. 8ioehem. 8iophys. Res.Commun. 150: 1162-1169.12- Tubo, R.A. and R. Berezney. 1987. J. 8iol. Chem. 262: 1148-1154.13- Higgins, G.M. and R.M. Anderson. 1931. Mreh. Pathol. 12: 186-202. / We have identified a protein (p55) with a molecular weight of 55 KDa and pI of 6.2, which was strongly increased in the nuclear matrix of rat liver cells during proliferative activation. This protein is highly insoluble since it could not be solubilized either by detergents or by alkaline extraction. We have obtained three partial amino acid sequences which revealed that p55 has a high homology with cytoqueratins. Polyclonal antibodies raised against p55 were used to carry out Western blot and immunocytochemical studies which indicated that p55 was localized only in the nuclei, specifically in the nuclear matrix. Autoradiographic experiments revealed that not all the cells presenting an increase in p55 incorporated (3H)thymidine, indicating that this protein is not related to DNA replication. Immunocytochemical studies also revealed that during mitosis p55 is localized surrounding the chromosomes and associated with the mitotic apparatus, suggesting that p55 is involved in the separation of chromosomes during cell division.In order to identify the presence of p55 in different cells types, we have also analyzed the antibody against the p55 in NRK (normal rat kidney) cells.Immunocytochemical studies in synchronic NRK cells revealed that the antibody is located specifically in the nuclei of replicative NRK cells. Western blot analysis of NRK cells showed that the protein detected in NRK cells has 62 KDa and 5.2-5.4 pi value. By western blot studies, we have also found that the protein (p62) is present at the same level in different phases of cell cycle, suggesting that the specific reaction detected by imunocytochemistry in replicative cells is due to increase of antigen accessibility or a change of protein conformation.Immunocytochemical studies in others culture cells, HeLa (human cervical adenocarcinome), NIH 3T3 fibroblasts, MDCK (Madin-Darby canine kidney) cells and BRL (rat hepatocarcinome), confirm the nuclear reaction of the antibody.We also show that the protein detected by the antibody from nuclear matrix liver cells is located in the nuclear matrix in all tested cells after extraction of "in vitro" nuclear matrix fraction.Thus, the NRK cells are fibroblasts and their do not have cytokeratins, we can conclude that the antibody against the nuclear matrix from rat liver cells detect a specific protein of nuclear matrix and from all the results we can also suggest that the protein detected would be related with intermediate filaments proteins.

La proteína ykbA de "Bacillus subtilis", purificada y reconstituida en proteoliposomas (PLs), presenta actividad de intercambio de L-serina, L-threonina y L-aminoácidos aromáticos. Por ello la renombramos como SteT (Serine/threonine exchanger Transporter). Los estudios cinéticos de la actividad de SteT son compatibles con un mecanismo secuencial de intercambio. SteT se agrupa filogenéticamente dentro de la familia LAT. Por todo ello, SteT es el primer homólogo procariota de la familia LAT que ha sido identificado y caracterizado. Proponemos SteT como modelo procariota para el estudio funcional y estructural de la familia LAT.Los estudios estructurales de SteT mediante electroforesis no desnaturalizante y TEM con tinción negativa y con criofractura en PLs indican que el intercambiador es funcional como monómero. SteT tiene apariencia de donut elíptico con diámetros exteriores de ~6 y ~7 nm. El residuo C291 en el segmento transmembrana (TM) VIII de SteT es la única diana de inactivación por MTSET y de activación por DTT. El sustrato L-serina protege de la inactivación por MTSET. Por tanto, el sustrato bloquea directamente o provoca un cambio conformacional que bloquea la accesibilidad de MTSET al residuo. El segmento TM VIII presenta dos caras funcionalmente diferenciables con periodicidad de hélice α. Una cara está formada por los residuos I285, I288, L292, K295 y F299 que mutados a cisteína muestran inhibición por MTSET y son insensibles a DTT. La otra cara, adyacente a la anterior, está formada por los residuos S287, G290, G294 y S298 que mutados a cisteína muestran activación por DTT y son insensibles a MTSET. Los residuos I284 y C291 poseen características de ambas ya que se inactivan por MTSET y se activan por DTT. DTT activa ~20 veces SteT cysless G294C en PLs, muy probablemente incrementado la Vmáx sin afectar la KM aparente. Esta activación es protegible por el sustrato L-serina con una EC50 similar a su KM aparente. Por tanto, el sustrato bloquea directamente o provoca un cambio conformacional que bloquea la accesibilidad de DTT al residuo. La mutación K295C, tanto en su entorno cysless como wt, genera un transportador ~50 y ~260 veces más rápido que SteT y SteT cysless respectivamente. La mutación K295G provoca un efecto muy inferior y la mutación K295L rinde un transportador inactivo. Estos datos sugieren que no hay una relación directa entre el tamaño de la cadena lateral en la posición 295 y la actividad de SteT, si no que la presencia de cisteína es la causante del aumento de actividad.Los residuos I285 y K295 parecen presentar interacción con la cadena lateral del sustrato ya que las mutaciones I285C y K295C producen un cambio dramático en el patrón de cis-inhibición. En estos mutantes la mayoría de los aminoácidos estudiados inhiben ampliamente el transporte de L-serina, con la excepción de L-prolina, L-hidroxiprolina, L-glutamato y glicina. En este sentido, SteT cysless K295C presenta un claro cambio de especificidad de sustrato ya que, a diferencia de SteT, transporta L-arginina. El hecho de que I285 y K295 disten ~16 Å indicaría la existencia de al menos dos lugares de unión independientes de la cadena lateral del sustrato, contradiciendo el modelo de "Alternating access". / ykbA, a "Bacillus subtilis" protein was purified and reconstituted in proteoliposomes (PLs) showing a L-serine, L-threonine and aromatic L-aminoacids exchange activity. We rename it as SteT (Serine/threonine exchanger Transporter). The kinetic studies of SteT activity are compatible with a sequential mechanism of exchange. SteT belongs philogenetically to LAT family, so SteT is the first prokaryotic member of LAT family that has been identified and characterized. The structural studies of SteT using native electrophoresis, negative staining and freeze fracture TEM in PLs show that it is functional as monomer. SteT looks like an elliptic donut with external diameters of ~6 and ~7 nm. The residue C291, located in the transmembrane segment (TM) VIII of SteT, is the unique target of inactivation by MTSET and of activaction by DTT. L-serine protects the MTSET inactivation. The TM segment VIII has two differentiable faces with α-helix periodicity. One is formed by I285, I288, L292, K295 and F299. These residues mutated to cysteine show MTSET inhibition and DTT insensitivity. The other, adjacent to the first, is formed by S287, G290, G294 and S298. These residues mutated to cysteine show DTT activation and MTSET insensitivity. The residues I284 and C291 have MTSET inhibition and DTT activation. DTT activates ~20 fold SteT cysless G294C in PLs. This activation is protected by L-serine with an EC50 similar to its apparent KM. The mutation K295C, in cysless and wt environments, causes a transporter ~50 and ~260 fold faster than SteT and SteT cysless respectively. The mutation K295G causes a lower effect and the mutation K295L yields and inactive transporter. These data suggest that the presence of cysteine is the cause of increased activity. The residues I285 and K295 seem to have interaction with the substrate's side chain because the I285C and K295C mutations cause a dramatic change in the cis-inhibition pattern. In this sense, SteT cysless K295C shows a clear change of substrate specificity because it transports L-arginine despite SteT. I285 and K295 are ~16 Å away, indicating the existente of at least two independent binding sites for the substrate side chain, contradicting the Alternating access model.

La major part del treball està enfocat en l'estudi de les proteïnes nuclears bàsiques espermàtiques, també anomenades protamines.Les protamines són proteïnes que tenen la funció de compactar el DNA espermàtic nuclear per a mantenir-lo en un volum reduït. L'estudi d'aquestes proteïnes ens dóna un idea sobre quins són els minims requeriments per interaccionar amb el DNA, com s'estructura la cromatina espermàtica, etc. Un dels aspectes més interessants és la extraordinària variabilitat evolutiva que presenten. Les protamines són el grup de proteïnes més heterogeni que cumpleixen una mateixa funció.Els resultats de l'estructura primària d'aquestes molècules i el seu estudi tant dins del seu context taxonòmic com biològic, ens dóna un millor coneixement de l'evolució de les proteïnes.CAPÍTOL III.A. Eledone cirrhosaEl grup dels Cefalòpodes presenta fonamentalment dos grans grups: els decàpodes (sèpies i calamars) i els pops.Eledone cirrhosa és un pop que pertany a la família Octopodidae. En aquest primer capítol hem estudiat el procés de nucleomorfogènesi de l'espermatozoide, així com la protamina que s'encarrega de mantenir la forma tan rígida i espiralitzada del nucli. L'aspecte més interessant és l'estadi on l'espermàtida presenta un nucli allargat, amb una cromatina condensada i secció cilíndrica, nucli doblegat diverses vegades, i envoltat per una sèrie de microtúbuls amb una disposició molt estreta vers al nucli. Aquests microtúbuls entren en contracció i exerceixen unes forces en el nucli de tal manera que el posen recte i al mateix temps l'espiralitzen. Destaca la presència d'una estructura que anomenen "complexe periacrosomal" que podria ser un centre de reorganització d'aquests microtúbuls.S'han purificat nuclis espermàtics i s'ha vist que el DNA està compactat per una sola protamina. Aquesta proteïna s'ha purificat i seqüenciat, i s'ha vist que és una proteïna extraordinàriament rica en cisteïna, aminoàcid que forma ponts disulfurs de manera que estabilitza la forma espiral del nucli i el manté rígid.S'han fet experiments de detecció dels ponts disulfur tant en cues com en nuclis espermàtics, mitjançant el marcatge amb MMNA, i s'ha demostrat que són aquests enllaços covalents els que procuren la rigidesa al nucli.CAPÍTOL III.B. Octopus vulgarisQuan es va estudiar el contingut proteic nuclear d' Eledone cirrhosa, només es coneixien, a més a més, les protamines de les sèpies i calamars. Així doncs, varem decidir estudiar el què passava en un altre pop, Octopus vulgaris, espècie que pertanya a la mateixa família que l'anterior.Tot i la pròxima posició taxonòmica, les protamines d'.O. vulgaris presenten una estructura primària més propera als decàpodes que a E. cirrhosa.A l'igual que ocorre amb els decàpodes, les protamines d' O. vulgaris provenen de molècules precursores, arribant-se a trobar restes de precursors en l'espermatozoide madur. A més a més, les protamines d'aquest pop comparteixen més similarituds amb les protamines de les sèpies i calamars que amb l'altre pop, particularment l'elevada basicitat representada per només l'arginina i la seva organització en clusters. Entre els resultats obtinguts en aquesta part és important resaltar el fet de l'enorme simplicitat que la protamina principal d' O. vulgaris presenta, constituïda per només tres tipus d'aminoàcids diferents, i organitzada en clusters del tipus (GRn)m, proteïna que es troba fosforilada en la gònada i es defosforila en l'epidídim.Comparació entre les protamines dels CefalòpodesHem comparat les protamines dels cefalòpodes conegudes per així millor poder entendre el tipus d'evolució que han seguit. Suggerim tres tipus de canvis de tipus evolutiu per les protamines dels cefalòpodes:- Petits canvis en la molècula (mutacions puntuals, petits indels, etc). Aquests canvis s'expliquen en les protamines dels decàpodes, on es mostra que totes dues protamines són homòlogues, presentant un orígen comú, on el gen ancestral es va duplicar i posteriorment cada còpia es va modificar experimentant petites mutacions a nivell de proteïna.- Canvis importants que continuen respectant el model d'organització de la molècula. Aquest canvis es mostren quan es comparen les protamines dels decàpodes amb les protamines d'O. vulgaris. Encara que no es pot garantir una homologia (origen comú) per totes elles, sí que presenten una organització molt similar.- Canvis repentins que afecten a tota la protamina i per tant canvien al complert el model molecular d'organització. És el que s'ha pogut observar en la divergència de la protamina d'Eledone respecte les protamines d'Octopus i respecte les protamines dels decàpodes. Aquesta divergència està associada amb canvis a diferents nivells, corn la forma nuclear, l'estructura i forma de l'espermatozoide, el tipus de fecundació, etc. La protamina d'E. cirrhosa no és homòloga amb la resta de protamines dels cefalòpodes. És un model nou de protamina que ha aparegut simultàniament amb un nou model d'espermatozoide.CAPÍTOL III.C. Murex brandarisEn aquest treball hem completat l'estudi de caracterització de les protamines del cenogastròpode Murex brandaris , i d'aquesta manera hem pogut fer una comparació més exhaustiva pel que fa referència a les protamines dels arqueogastròpodes, mol.luscs amb fecundació externa (vers la fecundació interna dels cenogastròpodes).CAPÍTOL III.D. Subordre GasterosteoideiEl grup de peixos ossis Gasterosteiformes representa un grup que ha sofert una ràpida evolució. L'espècie ancestral d'aquest grup era marina, i a causa d'una desglaciació soferta a finals del Pleistocè es van formar bona part dels llacs de la Columbia Britànica (Canadà), donant-se una invasió d'algunes formes marines cap aquests nous nitxos ecològics lliures, espècies que van sofrir una ràpida especiació/ adaptació.Hem pogut comparar diferents poblacions que pertanyen a una mateixa espècie, diferents espècies que pertanyen a un mateix gènere, diferents gèneres que pertanyen a una mateixa família, i diferents famílies que pertanyen a un mateix subordre, i això ens ha permés arribar a la conclusió de que l'ancestre de la protamina dels Gasterosteiformes podria tenir un origen comú a la protamina ancestral de l'ordre Perciformes, protamina típica de peixos ossis.CAPÍTOL III.E. Dicentrarchus labraxEn aquest darrer apartat hem fet un estudi preliminar de l'activitat descondensadora present en l'oòcit de l'espècie D. labrax front l'espermatozoide de la mateixa espècie un cop s'ha donat la fecundació.Els resultats mostren que existeix una activitat de desplaçament de la protamina nuclear espermàtica quan es fan incubacions amb extractes d'oòcits, inflant-se la cromatina espermàtica. Aquesta activitat és possiblement atribuïble a diverses proteïnes presents en l'oòcit, i no només a una sola (nucleoplasmina). Aquestes proteïnes, però, s'han de caracteritzar i s'ha de fer un estudi més profund del tema.CAPÍTOL IV. DISCUSSIÓProposem que les proteïnes espermàtiques bàsiques (protamines) s'han de considerar almenys, dintre de tres nivells d'organització diferents, on la selecció natural actuaria sobre cadascun d'ells, impedint, afavorint o provocant diferents tipus de canvis. Aquests tres nivells d'organització serien:- Nivell molecular: interacció DNA-SNBP. Aquest és el nivell més simple on sempre s'han estudiat les protamines a nivell evolutiu. Petits canvis es donen per millorar la interacció de la protamina amb el DNA, canvis que poden ser neutres. Quan es comparen les estructures primàries que han sofert una divergència evolutiva, es pot establir una relació d'homologia.- Nucli espermàtic considerat com a una identitat. De vegades ocorre que entre dues espècies properes es dóna un canvi en la forma del nucli espermàtic. En aquest cas és el nucli el que rep la pressió de la selección natural, pressió que afecta indirectament a la protamina present en e1 nucli. La protamina canvia per tal de permetre la nova forma nuclear.- L'espermatozoide senser com a una unitat irreductible. El cas d'E. cirrhosa ens dóna un exemple d'aquest nivell. L'aparició, disposició, activitat i destrucció dels microtúbuls que actuen al llarg de l'espermiogènesi d'aqueste espècie, juntament amb d'altres processos, ha de seguir un control coordinat juntament amb la síntesi d'una protamina, la seva entrada al nucli, interacció amb el DNA i el control final de la formación dels enllaços disulfur. Cadascun de tots aquests aconteixements porta a l'aparició d'un tipus nou d'espermatozoide, processos que només tenen sentit si es donen en el seu context biològic. La selecció natural ha actuat sobre l'espermatozoide sencer, sobre tota la cèl.lula sensera com si fos un únic nivell d'organització.Analitzem també cinc mecanismes principals que permeten els canvis en la evolució de les protamines, i finalment discutim alguns casos particulars de protamines riques en cisteïna i protamines que provenen de molècules precursores. / The main objective of our work has been to examine some protamines which are special cases to study for the better understanding of the chemist and the ways which protamines have evolved.The study of the spermiogenesis and the protamine of the octopus "Eledone cirhosa" has allowed us to understand some of the cellular processes that module the final shape of the sperm nucleus, and the need of a disteine rich protamine. The protamines of another octopus have also been studied ("Octopus vulgaris"), in order to establish the main characteristics of the evolved changes in the protamine model of the cephalopod molluscs.The final primary structure of the protamines of "Murex brandaris" cenogastropod has been established. "M. brandaris" protamines apparently are not homologous to their ancestral protamines (those of Archaeogastropods), and may have arisen from the multiplication of an ancestral minigen. The protamines are synthesized as precursors, which suffer a large number of small N-terminus deletions that take place at the same time as the chromatin condensation process.On the other hand, we have studied a group of bony fishes that has had a very fast evolution: "Gasterosteoidei" suborder. We have chosen this group of fish as well as the geographical region (British Columbia, Canada) for the following reasons: The ancestral species of "Gasterosteus" were exclusively sea forms and remained invariable for 5-6 millions years.However, at the end of the Pliocene an invasion took place into the recently formed lakes. When sea forms invaded the lakes, they found a high variety of free ecological niches that caused the species "G. aculeatus" to evolve quickly. Subsequently, in a short period of time, a hundred new species appeared. Due to the fact that we are in front of a group of quick evolution and because of the knowledge of bony fish protamines, we decided to study the primary structure of 4 protamines belonging to different populations.To finish, we have also studied the removing activity of the sperm chromatin by "Dicentrarchus labrax" oocytes, being a preliminary study of the descondensating activity of the sperm chromatin present inside the oocytes of a species not studied at present.

L'interès de l'estudi de la regulació dels gens de proteïnes de reserva de cereals prové del fet que són gens específics de llavor, amb una expressió lligada al desenvolupament del gra, i molts d'ells mostren una gran eficiència transcripcional. Els patrons d'expressió d'aquests gens suggereixen l'existència de complexes reguladors constituïts per diferents activadors transcripcionals que reconeixen els elements en cis- implicats en la seva expressió. Tot i els nombrosos estudis fets, els mecanismes moleculars implicats es coneixen poc. A blat de moro, el nostre model d'estudi, les proteïnes de reserva s'acumulen majoritàriament a l'endosperma i, en menor mesura, a l'embrió. A endosperma s'acumulen les zeïnes (les prolamines de blat de moro), mentre que a embrió trobem globulines i oleosines. Tant les zeïnes com les globulines s'acumulen en orgànuls derivats del reticle endoplasmàtic anomenats cossos proteics, mentre que les oleosines s'acumulen en cossos lipídics. L'interès del nostre grup se centra en el gen gamma-Z, que codifica per una proteïna de reserva d'endosperma, la gamma-zeïna. El gen gamma-Z està present en una o dues còpies per genoma haploide i, en canvi, el seu producte representa fins al 15% del contingut proteic del gra, suggerint una fina regulació gènica.L'objectiu general d'aquest treball era caracteritzar nous factors de transcripció implicats en la regulació de l'expressió del gen gamma-Z i altres factors reguladors de l'expressió de gens de proteïnes de reserva no específics d'endosperma però també lligats al desenvolupament de la llavor.Els objectius concrets així com els resultats obtinguts es descriuen breument a continuació:1) Caracterització funcional del factor proteic PBF com a regulador positiu del gen gamma-Z. Identificació del domini activador de PBF. PBF és un activador transcripcional del promotor del gen gamma-Z i volíem caracteritzar el domini responsable d'aquesta funció mitjançant estudis d'activació per expressió transitòria en endospermes joves de blat de moro. Aquests estudis van revelar que el domini activador de PBF es localitza en el seu domini C-terminal, però que l'activitat d'aquest factor proteic depèn de la seva capacitat d'unió al DNA. 2) Recerca de nous factors de transcripció responsables de l'expressió del gen gamma-Z i implicats en el reconeixement de seqüències presents a la regió proximal del seu promotor: clonatge del gen GAMYB de blat de moro i estudis d'immunolocalització. Caracterització d'aquest factor com a regulador transcripcional del gen gamma-Z. El gen ZmGAMYB codifica per un factor de transcripció de tipus Myb R2R3, que s'uneix de forma específica a la caixa AACA del promotor del gen gamma-Z i que és capaç d'activar l'expressió d'aquest gen a partir del seu promotor. ZmGAMYB s'expressa específicament a endosperma de blat de moro en desenvolupament, coincidint amb el patró d'expressió de PBF i concordant amb la possibilitat de que reguli l'expressió del gen de la gamma-zeïna. El factor mGAMYB s'acumula a les capes més superficials d'aquest teixit (aleurona i subaleurona).3) Recerca de nous factors de transcripció implicats en l'expressió de gens de proteïnes de reserva no específiques d'endosperma: clonatge del gen FUSCA3 de blat de moro, estudis d'immunolocalització a gra de blat de moro i posterior caracterització d'aquest factor.El gen ZmFUSCA3 codifica per un factor de transcripció de tipus B3 i s'expressa majoritàriament a embrió de blat de moro en desenvolupament. El factor mFUSCA3 s'acumula massivament a l'aleurona i a l'embrió, suggerint que sigui un regulador de l'acumulació de productes de reserva en aquests teixits. FUSCA3 és capaç d'unir-se a la caixa RY-like present a la regió proximal del promotor del gen gamma-Z, tot i que de forma poc específica, però no és capaç d'activar l'expressió d'aquest gen a partir del seu promotor. / In cereals, major seed storage proteins are called prolamins and accumulate primarily in the endosperm. Prolamin genes are tissue specific and show high efficiency levels, suggesting tight genetic regulation. In maize, our model specie, prolamins are accumulated in ER derived structures called protein bodies, whereas other storage proteins such as globulins or oleosins accumulate in the aleurone layer and in the embryo. The interest of our group resides in the gamma-zein, an endosperm specific storage protein, which constitutes the 15% of the proteic content of the grain, whereas its gen is present in only one or two copies per haploid genome. The object of the present work was to characterize new transcription factors implicated in seed storage gene expression linked to grain development, especially those involved in gamma-Z gene expression. Specific objectives as well as results achieved are briefly described bellow. 1) Functional characterization of PBF as a positive regulator of gamma-Z gen. PBF is a transcriptional activator of gamma-Z gene and its activation domain is located in the C-terminal region of the protein, but its activity depends on its binding to DNA.2) New transcription factors involved in gamma-Z gene expression: cloning of GAMYB gene in maize and immunolocazation assays. Characterization of this factor as a transcriptional regulator of gamma-Z gene.ZmGAMYB encodes a Myb R2R3 transcription factor that specifically binds to the AACA box of the gamma-Z gene promoter and activates gamma-zein expression from this promoter. ZmGAMYB is specifically expressed in maize developing endosperm, as other gamma-Z regulators do. The proteic factor accumulates in the more superficial layers of this tissue (aleurone and subaleurone).3) New transcription factors related to seed storage gene expression: cloning of FUSCA3 gene in maize, immunolocazation assays and characterization of this factor.ZmFUSCA3 encodes a B3 transcription factor highly expressed in maize developing embryo. The proteic factor accumulates massively in the aleurone layer as well as in the embryo, suggesting a regulatory role in seed storage products accumulation in these tissues. FUSCA3 binds RY-like motives of the gamma-Z gene promoter, with weak specificity, but does not activate expression from this promoter.

La Tesi Doctoral porta per títol "CONTROL DE PROTEÏNES REGULADORES DE L'APOPTOSI EN CÈL·LULES LEUCÈMIQUES", i ha estat realitzada a la Unitat de Bioquímica del Departament de Ciències Fisiològiques II de la Universitat de Barcelona. Hem estudiat el control de la regulació de diferents proteïnes encarregades de regular el procés d'apoptosi. S'ha estudiat la regulació de dos gens de la família de Bcl-2, un d'antiapoptòtic com mcl-1, i un de proapoptòtic, com bim.S'ha estudiat la regulació a nivell transcripcional i a nivell traduccional d'mcl-1 a la línia limfocitaria Jurkat, derivada d'una leucèmia aguda de cèl·lules T, durant l'apoptosi induïda per les drogues estaurosporina i aspirina. Ambdues drogues redueixen els nivells de la proteïna Mcl-1, tant per vies dependents com per vies independents de l'activació de caspases, ja que l'inhibidor general de caspases Z-VAD.fmk només protegeix parcialment el descens de la proteïna induït per les dues drogues d'estudi. El tractament amb estaurosporina també redueix els nivells de missatger d'mcl-1, de manera paral·lela a la reducció dels nivells de proteïna, i dependent de l'activació de les caspases, suggerint que aquesta droga inhibeix la transcripció del gen, a més de tenir altres efectes a nivell post-transcripcional caspasa-independents. El tractament amb aspirina en canvi no te cap efecte a nivell de regulació transcripcional, però sembla afectar la taxa de síntesi proteica de la cèl·lula. Hem determinat que aquesta droga afectaria la síntesi proteica de la cèl·lula per vies dependents i independents de l'activació de les caspases, on sembla tenir importància la fosforilació del factor eIF2-alfa, determinant que es dóna un pic transitori de fosforilació d'aquests factor al poc d'iniciar-se el tractament. També hem determinat que durant l'apoptosi induïda per aspirina es produeix una aturada de la síntesi proteica que afectaria de forma general a tots els gens cel·lulars amb una traducció CAP-dependent, mentre que alguns gens regulats a nivell traduccional per elements IRES, com XIAP, podrien escapar d'aquesta inhibició. Els resultats obtinguts amb els tractaments amb ciclohexinida, que redueix els nivells de la proteïna Mcl-1 sense afectar la viabilitat de les cèl·lules, ens permeten afirmar que la caiguda d'Mcl-1 pot ser necessària, però no suficient per induir l'apoptosi a les cèl·lules Jurkat. Aquest estudi ha estat publicat amb el títol: "Transcriptional and translational control of Mcl-1 during apoptosis. Iglesias-Serret D, Pique M, Gil J, Pons G, Lopez JM. Arch Biochem Biophys. 2003 Sep 15;417(2):141-52".També hem estudiat les insercions descrites al promotor d'mcl-1 a les cèl·lules B de pacients amb leucèmia limfàtica crònica de cèl·lules B (LLC-B). S'ha descrit que aquestes insercions són exclusives de pacients amb LLC-B (es troben en un 30%), que indueixen a augments de missatger i proteïna, correlacionant amb un mal pronòstic, una progressió més ràpida de la malaltia i una supervivència més baixa dels malalts. Els resultats obtinguts en aquests estudi demostren que la presència de les insercions no es exclusiva ni de les cèl·lules B ni dels malalts de LLC-B, tractant-se d'un polimorfisme present a la població general. Aquests resultats han estat acceptats per a ser publicats a la revista "Journal of the Nacional Cancer Institute".També hem estudiat la regulació del gen proapoptòtic bim de la família de Bcl-2, durant l'apoptosi induïda per diferents drogues en les cèl·lules de LLC-B i durant la supervivència induïda per diferents factors. Hem estudiat les isoformes majoritàries d'aquest gen i la regulació d'aquestes a nivell transcripcional i traduccional, així com les vies implicades en la seva fosforilació, important pel control dels seus nivells. Una part de la Tesi també s'ha dedicat a estudiar la regió 5'-no traduida (5'-UTR) i el promotor del gen antiapoptòtic XIAP, de la família de les IAPs, on hem intentat mapar l'inici de transcripció del gen i caracteritzar la regió promotora. Aquests estudis no han tingut un resultat satisfactori, i els resultats no són concloents. / The name of the thesis is "Control of apoptotic regulatory proteins in leukaemic cells". In this study we analyzed the regulation of two Bcl-2 family genes, an antiapoptotic member, mcl-1, an proapoptotic member, bim.We have studied the transcriptional and translational regulation of the mcl-1 gene during apoptosis induced by staurosporine and aspirin in Jurkat T cells. Both drugs reduced the levels of Mcl-1 protein in Jurkat cells. The caspase inhibitor Z-VAD.fmk and the proteasome inhibitor MG132 reduced Mcl-1 decay, indicating that both caspase and proteasome-dependent pathways are involved in the regulation of Mcl-1. Treatment with cycloheximide, at doses that inhibit protein synthesis without affecting cell viability, also induced Mcl-1 protein decay, suggesting that the Mcl-1 disappearance might be necessary but not sufficient for the induction of apoptosis by staurosporine and aspirin. Different patterns of transcriptional and translational control during apoptosis emerge depending on the stimulus although translational shutdown seems to be a common point during apoptosis. We analyzed the short sequence insertions in the Mcl-1 promoter of B-cell chronic lymphocytic leukemia (B-CLL) samples and confirmed their presence in samples from patients of our hospital. Surprisingly, when we analyzed genomic DNA from normal lymphocytes (10 control subjects) and from mouth epithelial cells (10 additional healthy individuals) we also found the presence of the same insertions. Moreover, different allelic combinations for this polymorphism were present in all kind of samples. As the frequency of the 3 alleles was almost equal in all B-CLL and normal cells we concluded that these Mcl-1 insertions represent hereditary polymorphisms that likely do not predispose to chronic lymphocytic leukaemia and their significance in the pathogenesis of B-CLL should be re-evaluated. We investigated the effect of several drugs used in the therapy of B-CLL and different survival factors on BIM isoforms levels, and the signal transduction pathways involved in the control of BIM. Only the glucocorticoid dexametasone, a potent proapoptotic drug for B-CLL cells, induced an increase of BIM levels. The survival factors TPA and SDF-1 induced the phosphorilation of the two major isoforms of BIM, and the subsequent degradation of BIMEL isoform by the proteasome pathway, suggesting that this could be one of the survival mechanisms induced by these factors in B-CLL cells. We also studied the 5'-UTR of the antiapoptotic gene XIAP, but the results have not been conclusive.