EN CATALÀ :Les proteïnes morfogenètiques òssies (BMPs) són membres de la superfamília del TGF-beta i s'ha demostrat que participen en la determinació i especificació de varis teixits i òrgans durant el desenvolupament dels vertebrats i que regulen la proliferació, l'apoptosi i la diferenciació de múltiples tipus cel·lulars. Les BMPs van ser originàriament identificades per a la seva habilitat d'induir la formació ectòpica d'os i entre ells, BMP-2, -4 and -7 resulten essencials perquè tingui lloc un adequat desenvolupament ossi. Les BMPs també s'ha descrit que participen en el control de la migració cel·lular durant la morfogènesis embrionària. Malgrat s'han publicat alguns treballs en relació a la participació de BMPs en la regulació de la migració de progenitors mesenquimals i osteoblasts, els mecanismes moleculars mitjançant els quals les BMPs regulen aquests processos són poc coneguts. Tenint en compte aquests precedents, ens varem proposar estudiar la participació de BMP-2 en la regulació de la migració de les cèl·lules mioblàstiques C2C12. Els resultats presentats en aquest treball demostren que BMP-2 indueix la migració cel·lular quimiotàctica en cèl·lules C2C12. Les evidències experimentals que ens permeten arribar a aquesta conclusió són: i) l'anàlisi de la migració cel·lular mitjançant l'assaig de ferida indica que en presència de BMP-2 la ferida és repoblada més eficientment i que aquest efecte és independent de la síntesis proteica de novo i de la proliferació cel·lular; ii) els resultats obtinguts en l'aproximació experimental basada en l'ús de la Càmera de Boyden mostren que la migració induïda per BMP-2 té caràcter quimiotàctic a favor de gradient de concentració. Tenint en compte que la resposta inicial de la cèl·lula a un agent quimiotàctic consisteix en la polarització i extensió de protrusions en la direcció de la migració, es va analitzar posteriorment l'efecte de BMP-2 en la organització del citoesquelet d'actina. El resultats mostraven que BMP-2 induïa la formació d'acumulacions d'actina cortical, i que es tractava d'un efecte ràpid, transitori i que tenia lloc en diferents tipus cel·lulars, independentment de la distribució basal dels seus filaments d'actina. En relació a l'estudi dels mecanismes moleculars implicats en els efectes de BMP-2 en la dinàmica del citoesquelet d'actina i la migració cel·lular, els resultats obtinguts demostren que BMP-2 regula aquests efectes a través de l'activació de vies de senyalització que involucren Cdc42, PI3K i p38MAPK, que estan implicades en la regulació de proteïnes que tenen un impacte directe sobre la polimerització d'actina. Concretament, BMP-2 indueix l'activació de Cdc42 i la isoforma α de PI3K de manera paral·lela i independent, i ambdues rutes estan implicades en la regulació de l'activitat de varis membres de la família de proteïnes PAK, que alhora regulen la LIMK1, proteïna implicada en el control de la polimerització dels filaments d'actina a través de la fosforilació de la cofilina. Per altra banda, l'activitat de la MAPK p38α també resulta imprescindible en la regulació de la dinàmica del citoesquelet d'actina i la migració cel·lular dependent de BMP-2, a través d'una via de senyalització que involucra la quinasa MK2 i hsp27, proteïna que té la capacitat de regular directament la polimerització dels filaments d'actina. En conjunt, les dades presentades suggereixen noves vies de senyalització activades en resposta BMP-2 que relacionen els receptors de membrana amb la dinàmica del citoesquelet d'actina i la migració cel·lular. / The main focus of the research is to study in depth the effects of Bone Morphogenetic Protein 2 (BMP-2) in the actin cytoskeleton reorganization and cell migration, as well as the study of the signalling pathways implicated in these effects.BMPs have been shown to participate in the patterning and specification of several tissues and organs during vertebrate development and to regulate cell growth, apoptosis and differentiation in different cell types. We have reported that exposure of C2C12 cells to BMP-2 leads to an increase in cell migration and a rapid rearrangement of the actin filaments into cortical protrusions. These effects required independent and parallel activation of the Cdc42 small GTPase, the α-isoform of the PI3K and the p38α MAPK. Furthermore, we demonstrate that BMP-2 activates different group I and II PAK isoforms as well as LIMK1, and that these activations measured by either kinase activity or with antibodies against phosphorylations at their activation loops, were abolished by blocking PI3K and Cdc42 signalling pathways. Moreover, we have described that BMP-2 induces MK2 and hsp27 activation in a p38-dependent manner and that both proteins are implicated in the effects of BMP-2 on cell migration. Altogether, these findings suggest that Cdc42, PI3K and p38 signals emanated from BMP receptors are involved into specific regulation of actin assembly and cell migration. We are at the moment studying the possible relationship between Cdc42/PI3K-PAK-LIMK1 and p38-MK2-hsp27 pathways. Preliminary results suggest that these pathways are independent; however we are still working on it.

La via d'integritat cel·lular o via Pkc1-MAP quinasa de Saccharomyces cerevisiae té un paper central en els mecanismes de resposta cel·lular enfront de diferents estressos ambientals, com són: l'estrès tèrmic, l'estrès hipoosmòtic o qualsevol estrès que afecti a la paret cel·lular. En aquest treball de tesi doctoral es demostra que aquesta via de transducció de senyal també està implicada en la supervivència iadaptació enfront els efectes de l'estrès oxidatiu.Hem observat que les proteïnes Pkc1 i Rom2 són essencials per a la supervivència cel·lular enfront de l'estrès oxidatiu generat per dos agents (peròxid d'hidrogen i diamida). A més, el citoesquelet d'actina és una de les dianes d'acció del peròxid d'hidrogen i de la diamida; aquests dos agents provoquen una despolarització del citoesquelet d'actina amb el conseqüent efecte en morfogènesi i viabilitat. Aquest fenomen succeeix de forma independent de les proteïnes de la via d'integritat cel·lular.Per altra banda, perquè el citoesquelet d'actina es repolaritzi com a resposta d'agents oxidants, són necessàries les proteïnes Mtl1, Rom2 i Pkc1, totes elles són elements que constitueixen la via d'integritat cel·lular.La diamida indueix la formació de ponts disulfur a les proteïnes de la superfície cel·lular. Aquest fet provoca canvis estructurals en la cèl·lula que, en darrer terme,causen l'activació de la via d'integritat cel·lular. Els nostres estudis han permès assignar una funció al receptor de la paret cel·lular Mtl1, com un sensor d'estrès oxidatiu en superfície i part integrant de la via Pkc1-MAP quinasa.El peròxid d'hidrogen afecta essencialment una funció cel·lular relacionada amb els últims estadis de secreció i la morfogènesi cel·lular. A més, observem dos funcions essencials de la proteïna Pkc1 com a resposta al tractament amb peròxid d'hidrogen: i)Pkc1 regula la biogènesi de ribosomes com a resposta als problemes en secreció que provoca l'agent oxidant. Així mateix, la inhibició de la transcripció de gens ribosomals es du a terme depenent d'un citoesquelet en polimerització activa, ii) Pkc1 indueix la restauració dels cables d'actina i també de la morfogènesi i polaritat cel·lular a través de l'activació de la profilina Pfy1. / La vía de integridad celular o vía Pkc1-MAP quinasa de Saccharomyces cerevisiae posee un papel central en los mecanismos de respuesta celular frente a diferentes estreses ambientales, como son: el estrés térmico, el estrés hipoosmótico o cualquier estrés que afecte a la pared celular. En esta tesis doctoral se demuestra que esta vía de transducción de señal también está implicada en la supervivencia y adaptación frente a los efectos del estrés oxidativo.Hemos observado que las proteínas Pkc1 y Rom2 son esenciales para la supervivencia celular frente al estrés oxidativo mediado por dos agentes (peróxido de hidrógeno y diamida). Además, el citoesqueleto de actina es una de las dianas de acción del peróxido de hidrógeno y de la diamida, ambos agentes median la despolarización del citoesqueleto de actina con el consecuente efecto en morfogénesis y viabilidad. Este fenómeno ocurre de manera independiente de las proteínas de la vía de integridad celular. Sin embargo, para que el citoesqueleto de actina repolarice en respuesta a agentes oxidantes se requieren las proteínas Mtl1, Rom2 y Pkc1, todas ellas elementosconstituyentes de la vía de integridad celular.La diamida induce la formación de puentes disulfuro en las proteínas de la superficie celular, lo que provoca cambios estructurales en la misma, que en última instancia, causan la activación de la vía de integridad celular. Nuestros estudios han permitido asignar una función al receptor de pared celular Mtl1, como sensor de estrés oxidativo en superficie, y parte integrante de la vía Pkc1-MAP quinasa.El peróxido de hidrógeno afecta esencialmente a una función celular relacionada con los últimos estadios de secreción y con la morfogénesis celular. Además observamos dos funciones esenciales de la proteína Pkc1 en respuesta al tratamiento con peróxido de hidrógeno: i) Pkc1 regula la biogénesis de ribosomas en respuesta a los problemas en secreción provocado por el agente oxidante. Además, la inhibición de latrascripción de genes ribosomales se lleva a cabo dependiendo de un citoesqueleto en polimerización activa, ii) Pkc1 induce la restauración de los cables de actina y con ello de la morfogénesis y polaridad celular a través de la activación de la profilina Pfy1. / The cell integrity pathway or Pkc1-MAP kinase pathway of Saccharomyces cerevisiae plays a central role in the cellular responses against different environmental stresses, such as: heat shock, hipoosmotic shock, starvation stresses, all of them affect the cell wall. This study shows that this transductional pathway is also involved in the survival and the adaptation of the cell against the affects of oxidative stress.We have observed that the proteins Pkc1 and Rom2 are essential for cell survival against oxidative stress caused by two agents: hydrogen peroxide and diamide. In addition, the actin cytoskeleton is one of the targets of both hydrogen peroxide and diamide, these agents cause depolarization of the actin cytoskeleton with a detrimental effect in cell morphogenesis and viability. This occurs independently on the cell integrity pathway proteins. However, for the actin cytoskeleton to repolarize in response to oxidant agents, the cells need the proteins Mtl1, Rom2 and Pkc1, all of them constitute the cell integrity pathway.Diamide causes the formation of disulphide bridges in the cell surface proteins, which provokes structural changes in the cell surface, and which finally induces the activation of the cell integrity pathway. In our investigation we have been able to assign a function to the cell wall receptor Mtl1, as a sensor of surface oxidative stress and an integral part of the Pkc1-MAP kinase pathway.Hydrogen peroxide affects primarily a cellular function related to the last stages of vesicular secretion. We also observe two essential functions of the protein Pkc1 in response to the treatment with hydrogen peroxide: i) Pkc1 regulates ribosomal biogenesis in response to problems in secretion, caused by the oxidant agent. The occurrence of the inhibition of ribosomal genes transcription is dependent on the active polymerization of the actin cytoskeleton, ii) Pkc1 induces the restoration of actin cables then promoting the restauration of cellular polarity and morphogenetic mechanisms through the activation of Pfy1 profilin.

La concentració de proteïnes dels vins blancs és de l'ordre de miligrams per litre. Aquestes proteïnes presenten en el vi càrrega elèctrica positiva degut a que tenen un punt isoelèctric superior al pH del vi. Aquesta càrrega les fa reaccionar amb les substàncies carregades negativament en el vi, especialment polifenols i alguns clarificants addicionats. Aquestes proteïnes influeixen negativament en la qualitat dels vins degut a la tendència a precipitar i produir enterboliments però confereix al vi propietats positives pel que respecta a la estabilització de l'escuma en els vins escumosos i a la influència sobre la volatilitat de les molècules responsables de la aroma dels vins blancs, augmentant llur permanència. El treball realitzat ha consistit en la posta a punt d'un mètode de separació de les proteïnes dels vins per mitjà de tècniques de cromatografia en columna a baixes pressions, coneguda com FPLC. Aquest mètode te una gran precisió i repetibilitat. Així es poden separar les proteïnes del vi en una proteïna de 60 kDa i un nombre variable en una franja de 20 a 30 kDa, que presenten diferent càrrega elèctrica. La fracció de inferior massa molecular presenta un perfil de separació segons la carrega elèctrica diferent per las cinc varietats viníferes estudiades: chardonnay, pinot noir, macabeu, xarel.lo i parellada. S'observa una disminució de la concentració de proteïna durant el procés de vinificació que afecta a totes les fraccions separades; no obstant aquesta davallada és major a les fraccions de 20 a 30 kDa de més càrrega elèctrica positiva, el que s'explica per una més gran reactivitat en front als compostos amb carrega negativa en el vi. S'ha estudiat la influència del temps de contacte amb els baixos fins de fermentació sobre les diferents fraccions de proteïnes sense observar cap variació significativa pel fraccionament estudiat. Al llarg de la maduració s'ha detectat un increment de la concentració de proteïna a la fracció de baixa massa molecular, mentre que la fracció de 60 kDa es manté en concentracions similars en el període estudiat. D'aquesta fracció de 20 a 30 kDa s'ha constatat un increment més gran de les proteïnes amb menys càrrega elèctrica. Després d'analitzar el fraccionament de la fracció de 20 a 30 kDa per bescanvi catiònic de les cinc varietats viníferes durant dos anys s'han observat perfils característics per cada varietat vinífera que permeten classificar-les en funció de les fraccions obtingudes, el que fa pensar en una possible eina per la caracterització varietal. / Proteins are present in white wines in small amounts (a few milligrams per litre). These proteins have a positive electric charge because their isoelectric point is higher than the pH of the wine. This charge makes them react with the negatively-charged substances in the wine, particularly polyphenols or fining agents. These proteins have a negative effect on the wine quality due to their tendency to precipitate and produce cloudiness but they are also positive because they stabilize the foam in sparkling wines and increase the permanence of the molecules responsible for the aroma of white wines.The study consisted of establishing a method for separating proteins from wines using column chromatography techniques at low pressures known as FPLC. This method has high precision and repeatability. Thus the proteins in wine can be separated into a protein of 60 kDa and a variable number of proteins ranging from 20 to 30 kDa, which have different electrical charges. The fraction with the lowest molecular weight has a separation profile which depends on the electrical charge for the five grape varieties studied: Chardonnay, Pinot Noir, Macabeo, Xarel·lo and Parellada.The protein concentration decreases during the vinification process in all the separated fractions. However, this decrease is more pronounced in the fractions from 20 to 30 kDa which had larger positive charges because they react more to the negatively-charged compounds in the wine. The effect of the contact time between the low fermentation fines and the different protein fractions was studied but no significant variation in the fractioning studied was observed. Throughout the maturation the protein concentration was seen to increase in the low molecular weight fraction, while the concentration of the 60 kDa fraction hardly changed. In the 20 to 30 kDa fraction there was a greater increase in proteins with less electrical charge. The fractioning of the 20 to 30 kDa fraction by cationic exchange of the five grape varieties was analyzed for two years and characteristic profiles were observed for each variety which enables them to be classified according to the fractions obtained. This suggests that it may be a possible tool for characterizing varieties.

En aquest treball es caracteritzen les proteïnes espermàtiques bàsiques (PEB) que condensen el DNA de l'espermatozoide de diferents grups de deuteròstoms, tant procordats (tunicats o urocordats i cefalocordats) com vertebrats (agnats, peixos cartilaginosos i peixos ossis), fent especial èmfasi en el cas dels peixos ossis. L'objecte d'aquesta anàlisi ha estat l'intent d'obtenir més informació sobre l'evolució molecular de les PEB en els deuteròstoms, ja que no hi havia informació fins al moment referent als urocordats, cefalocordats i agnats.Concretament, dins dels tunicats s'han estudiat extensivament dues espècies del gènere Styela (classe Ascidiacea) així com 7 espècies més pertanyents també a aquesta classe i una pertanyent a la classe Thaliacea. Els resultats mostren que la PEB característica dels ascidiads és la proteïna que hem anomenat PI, apareixent en el gènere Styela una proteïna específica adicional P2. Aquestes proteïnes (PI, P2), malgrat ser totes dues altament bàsiques (50-70%), presenten característiques diferents tant en la mida, mobilitat electroforètica, composició i estructura. L'estudi de la PI à'Styela alicata mostra que es tracta d'una proteïna relacionada amb la histona HI o proteïnes afins; així presenta un nucli resistent a la tripsina la composició aminoacídica del qual és molt similar al d'aquesta família de proteïnes. Igualment, l'estudi de la seqüència parcial d'aquesta proteïna (extrem N-terminal, zona globular central i part de l'extrem C-terminal) mostra una estreta relació entre ambdós tipus de proteïnes. Una peculiaritat de la PI és el presentar un braç Nterminal extraordinàriament reduït, consistent només en dues arginines. Per la seva banda, la P2 es mostra com una molècula més especialitzada, de mida menor, menor diversitat aminoacídica i major basicitat (per un major acúmul d'Arg). La composició de la P2 recorda molt la de la PI, fet que fa pensar en un possible origen d'aquesta proteïna a partir de la PI.L'única espècie estudiada d'entre els cefalocordats, Branchiostoma floridae, mostra al nucli del seu espermatozoide una proteïna molt especialitzada que substitueix pràcticament la totalitat de les histones al llarg de l'espermiogènesi. Aquesta proteïna consta només de 6 tipus diferents d'aminoàcids destacant-ne els aminoàcids bàsics (24.7% de Lys, 25.3% d'Arg). Hem estudiat la seqüència aminoacídica parcial de l'extrem N-terminal d'aquesta proteïna descobrint la presència del motiu alternant Arg-Ser (que es troba també en altres PEB de grups no relacionats).Durant l'espermiogènesi de Petromyzon marinus (agnat cefalaspidomorf) les histones no es veuen substituïdes per cap altra proteïna específica de l'espermatozoide sinó que es mantenen com a úniques proteïnes responsables de la condensació de la cromatina del nucli espermàtic.Dins dels peixos cartilaginosos, hem estudiat les PEB d'Hydrolagus colliei (condricti de la línia dels holocèfals) i hem vist que malgrat el "model" de contingut de proteïnes espermàtiques bàsiques és el mateix (una proteïna no queratinosa més dues de queratinoses), les característiques de les molècules en sí difereixen substancialment. Així, l'estudi de la seqüència parcial de la proteïna no queratinosa R3 d'aquesta espècie mostra diferències importants respecte a la corresponent proteïna trobada als elasmobranquis i amb la protamina típica dels peixos ossis, amb qui sovint se l'ha relacionada.Entre els osteïctis hem estudiat les PEB de 32 espècies representants de 24 famílies corresponents a 9 ordres diferents de teleostis. Es disposa de la caracterització electroferètica de totes, l'anàlisi composicional de 16, i s'han estudiat les estructures primàries de dues espècies més. En aquest grup hem trobat una gran varietat de continguts de proteïnes espermàtiques bàsiques: a) protamines típiques; b) histones sense cap altra proteïna addicional; c) histones somàtiques amb un increment de l'Hi; d) histones amb proteïnes específiques addicionals; e) proteïnes específiques diferents de les protamines típiques (però que també substitueixen les histones). La distribució d'aquests diferents tipus de continguts no mostra una relació amb la classificació filogenètica de les espècies implicades (no obstant, el model de PEB presentat és consistent dins de cada família). Tenint en compte aquesta distribució, així com consideracions de tipus funcional, es discuteixen les posibles explicacions d'aquesta "esporadicitat" observada.Hem seqüenciat les PEB de dos peixos representants dels dos casos generals de substitució de les histones al nucli espermàtic que hem trobat. Així, hem seqüenciat completament la PEB de Dicentrarchus labrax (protamina típica) i parcialment la de Mullus surmuletus (proteïna específica de l'espermatozoide diferent de les protamines típiques). Aquesta última proteïna es mostra relacionada amb la família de les histones HI o afins. Així, consta d'uns extrems N i C-terminals enriquits en aminoàcids bàsics i una zona central resistent a la tripsina on s'acumulen els residus hidrofòbics. Tant l'anàlisi de la seva estructura primària parcial (extrem N-terminal, zona globular i part de l'extrem C-terminal) com de l'estructura secundària predida mostren una gran similitud amb les corresponents de les histones HI, especialment en la zona globular central, que és el domini més conservat en les His.Hem classificat les diferents PEB trobades als grups estudiats en dos tipus generals de molècules: a) proteïnes relacionades amb histones (generalment l'Hi); i b) proteïnes especialitzades. Les primeres correspondrien a molècules grans amb una zona més hidrofòbica resistent a la tripsinització, i un o dos extrems molt bàsics i no resistents (ex. PI dels ascidiacis, PEB del Mullus ï altres proteïnes específiques addicionals trobades en peixos ossis). Les molècules que anomenem especialitzades correspondrien a proteïnes menors i amb baixa proporció o sense aminoàcids hidrofòbics, sent l'Arg i la Lys els aminoàcids que constitueixen la major part de la molècula (ex. P2 d'Sty ela, P de l'amfiox, R3 d'H. colliei, protamines típiques dels peixos ossis).No sembla existir una relació d'homologia entre les proteïnes bàsiques del nucli de l'espermatozoide trobades en cada un dels grups de deuteròstoms estudiats sinó que més aviat es tracta de solucions a un mateix problema adoptades amb independència (encara que per camins similars en alguns casos).

En la presente tesis doctoral se ha desarrollado una nueva estrategia de química combinatoria para la modificación de la hélice alfa C-terminal del dominio B de la proteína A de Staphylococcus Aureus, extensible a la modificación de otras proteínas naturales. La metodología se basa en la síntesis de quimiotecas "one-bead-one-compound" de análogos de este péptido y su evaluación mediante un ensayo de fluorescencia, el cual es capaz de revelar las unidades de resina que contienen un compuesto activo al volverlas fluorescentes. La identidad de los péptidos contenidos en estas unidades de resina se revela por secuenciación por MALDI-TOF PSD.La metodología desarrollada ha sido probada con éxito sobre una quimioteca de 300 candidatos generada por permutación de cuatro de los aminoácidos de la hélice C-terminal del dominio B. El trabajo con esta quimioteca ha permitido identificar dos péptidos capaces de sustituir esta hélice natural para dar lugar a la formación de nuevos "dominios B" más estables y activos.

1) "Diseño, síntesis y caracterización de inhibidores de la fusión de VIH-1 análogos del péptido C34 de gp41 con D aminoácido"En el proceso de fusión del virus del VIH-1 a la célula diana intervienen las proteínas de la cubierta viral gp120 y gp41. La gp120 al interaccionar con el receptor CD4 y co-receptores sufre un cambio conformacional que enseguida causa cambios en la estructura de gp41. Esta proteína sufre una reorganización que conduce al acercamiento entre la región N-terminal y la región C-terminal de gp41 aproximando las membranas celular y viral entre si. El péptido C34 tiene buenas propiedades como inhibidor de la fusión viral y forma complejos estables con el péptido N36 derivado de la región N-terminal de gp41. En este capítulo se discute el efecto de cambiar la quiralidad del péptido C34 total o parcialmente, para aumentar la estabilidad de este péptido frente a proteasas. Mientras los péptidos derivados de C34 con todo-D aminoácidos fueron incapaces de inhibir la fusión del VIH-1. Los péptidos heteroquirales, especialmente el péptido M3C34, son capaces de formar complejos estables con N36 e inhibir la fusión.2) "Identificación de complejos heteroquirales entre péptidos todo-D y el fragmento N-terminal del dominio de B de la proteína A de Staphyloccus aureus"La proteína A es un factor patogénico encontrado en la superficie del Staphylococcus aureus. Esta proteína es capaz de unirse al fragmento cristalizable de las inmunoglobulinas G. El dominio B, un trímero de hélices antiparalelas, es uno de los cinco dominios responsables de este reconocimiento. Péptidos derivados de la región N-terminal de este dominio no tienen una estructura estable en disolución. Sin embargo, la presencia de la de péptidos correspondientes a la región C-terminal del dominio forman complejos que aumentan el contenido helicoidal del sistema. En este capitulo se diseñó una quimioteca OBOC (del ingles "one bead one compound") de 4096 péptidos con aminoácidos D derivados de la secuencia de la hélice C-terminal el domino B, con el objetivo de identificar péptidos todo-D capaces de interactuar con el fragmento N-terminal del domino B y de formar complejos no covalentes heteroquirales. 3) "Síntesis, caracterización estructural y evaluación de la interacción con inmunoglobulina G de nuevos análogos del dominio B de la proteína A de Staphylococcus aureus"Los fragmentos correspondientes a la hélice C-terminal y región N-terminal del domino B de la proteína A de Staphylococcus. aureus forman complejos que aumentan la helicidad del sistema. En nuestro grupo se identificaron dos péptidos derivados de la hélice C-terminal del dominio B que forman complejos con el fragmento N-terminal con mutaciones en los residuos Ser 44 y Leu 47. En esta parte se describe la caracterización estructural y evaluación de la actividad de los complejos no covalentes formados entre estos péptidos y el fragmento N-terminal del dominio B y los dominios enteros. Después de comprobar que el fragmento N-terminal interaccionaba con los análogos no naturales de la hélice C-terminal se sintetizaron los dos dominios análogos con las modificaciones encontradas en la región C-terminal (Ser44Phe Leu47Lys y Ser44Phe Leu47Val). El análisis de estructura por dicroísmo circular reveló que los análogos mostraban estructura helicoidal y eran térmicamente estables. Por resonancia de plasmon superficial se encontró que los análogos se unían a inmunoglobulina de conejo y al fragmento cristalizable de las inmunoglobulinas humano con una afinidad similar, aunque con cambios en las cinéticas de asociación y disociación. La información estructural de cada residuo se analizó por medio de resonancia magnética nuclear. Este estudio mostró que los dominios análogos conservan tres regiones helicoidales y de acuerdo a los experimentos de intercambio H/D se pliegan de forma similar al dominio natural. / This thesis is divided in three parts. The first part is about the design, synthesis and characterization of new peptide inhibitors of the HIV-1 fusion derived of the C-terminal region of gp41. In the second part was described the design and synthesis of a library of all-D peptide derived of the C-terminal region of B domain of protein A of Staphylococcus aureus to identify all-D peptides which could interact with the N-terminal fragment of B domain to get heteroquiral non covalent complexes. The third part is about the synthesis, structural characterization and activity evaluation of two new analogues en B domain of protein A of Staphylococcus aureus with mutations in Ser44 and Leu47.

En les bactèries entèriques, les proteïnes de la família Hha/YmoA juguen un paper important en la regulació de l'expressió genica en resposta a factors ambientals. La proteïna Hha d'Escherichia coli fou identificada com a regulador de l'expressió de la toxina α-hemolisina. Ja ha estat prèviament descrit que la proteïna Hha interacciona amb la proteïna H-NS i que el complex nucleoproteic format és responsable de la termoregulació de l'expressió de l'operó hly d'E. Coli.També ha estat descrit que E. Coli i altres enterobactèries contenen una proteïna paràloga a H-NS, la proteïna StpA. Aquesta proteïna s'expressa molt poc en condicions normals, però s'indueix en mutants hns. La sobreexpressió de StpA suprimeix parcialment molts dels fenotips causats per la mutació hns.En aquesta tesi s'ha identificat en el genoma d'E.coli el gen ydgT, que codifica per a una proteïna amb elevada homologia amb proteïnes de la família Hha/YmoA. Aquesta nova proteïna paràloga a Hha (38% d'identitat i 68% de similitud), té un comportament similar a StpA en el context d'H-NS: es sobre-expressa en mutants hha i pot compensar, almenys parcialment, el fenotip hemolític provocat per la mutació hha.A mes també hem demostrat que la proteïna YdgT es capaç d'interaccionar tant amb H-NS com amb StpA, per tal de formar complexes hetero-dimèrics in vivo. En canvi, la proteïna YdgT no interacciona amb la seva proteïna paràloga Hha.En aquesta memòria també s'ha establert una xarxa de regulacions creuades entre les proteïnes Hha, YdgT, H-NS i StpA. Les mutacions hha i/o hha ydgT provoquen una disminució dels trànscrits d'hns i stpA. Ha estat analitzat l'efecte en el patró d'expressió proteica de les mutacions hha, ydgT i hha ydgT. Els resultats obtinguts mostren el fenotip pleiotròpic del doble mutant. Hem estat capaços de detectar diverses diferencies i hem identificat algunes de les proteïnes que mostren expressió diferencial entre les diferents soques estudiades: OmpA, OmpC, Triptofanasa, dTDP-L-ramnosa sintetasa, proteïna precursora de la proteïna periplasmàtica d'unió a D-ribosa. Aquestes proteïnes, entre d'altres funcions, juguen un paper important en la conjugació, osmo-regulació, formació de biofilms, formació de LPS i quimiotaxis, respectivament.

En bacteris entèrics, les proteïnes de la família Hha/YmoA estan implicades en la regulació de l'expressió gènica depenent factors ambientals. Ha estat descrit que la proteïna Hha d' Escherichia coli interacciona amb la proteïna H-NS formant un complex amb el DNA responsable de la termoregulació de l'expressió de l'operó hly d' E. coli. Altres proteïnes d'aquesta família, com YmoA i YdgT, també interaccionen amb la proteïna H-NS.La proteïna H-NS d' E. coli és una proteïna associada al nucleoide implicada en la regulació global de l'expressió gènica en funció de les condicions ambientals. H-NS es troba àmpliament distribuida entre bacteris Gram-negatius.El primer objectiu va ser determinar si la participació conjunta de les proteïnes Hha i H-NS era extensible a altres gens regulats per H-NS. Escollirerm l'operó bgl, silenciat per la proteïna H-NS. Mitjançant mesures de l'activitat i de la trasncripció de l'operó vam concloure que les proteïnes Hha i YdgT intervenen en el silenciament de l'operó bgl d'Escherichia coli.Es va analitzar la regulació de l'expressió gènica depenent de les proteïnes Hha i H-NS en diferents condicions d'osmolaritat per identificar les proteïnes diferencialment expressades. S'identificaren les proteïnes HdeA, l'expressió de la qual ja havia estat descrita com a regulada per H-NS; i HtrA, una proteasa sotmesa a osmoregulació. El complex Hha-H-NS és responsable de la repressió de l'expressió d'HtrA a baixa osmolaritat.En la seqüència completa del plàsmid R27 s'han identificat dos gens (orf182 i orf164) que codifiquen dues proteïnes homòlogues a Hha i H-NS, respectivament. Ja que la conjugació d'aquest plàsmid està sotmesa a termoregulació, i donat que les proteïnes Hha i H-NS estan implicades en la regulació de l'expressió gènica depenent de paràmetres ambientals, es va voler determinar: · A) el paper d'aquestes proteïnes, d'origen plasmídic i d'origen cromosòmic, en la regulació de la conjugació de R27,· B) i la intervenció de les proteïnes de codificació plasmídica en la fisiologia de la cèl·lula portadora del plàsmid. Es realitzaren estudis de la freqüència de conjugació del plàsmid, estudis de la transcripció dels gens de transferencia mitjançant microxips i RT-PCR, assaigs de retard en gel amb les proteïnes Hha i H-NS i observació de pilis per MET. Es va concloure que les proteïnes Hha i H-NS, tant de codificació plasmídica com cromosòmica, interven en la termoregulació de la conjugació del plàsmid, reprimint l'expressió dels gens de transferencia a elevada temperatura. En estudis de complementació s'observà que les proteïnes codificades als gens orf182 i orf164, compensen alguns fenotips causats per les mutacions dels gens hha i hns. Es va demostrar també la interacció in vitro de la proteïna H-NS plasmídica (ORF164) amb la proteïna Hha cromosòmica.Finalment, es va realitzar una anàlisi trancriptòmica de l'efecte de les mutacions hns i hha ydgT en el patró d'expressió gènica a Escherichia coli, per determinar quins gens estaven afectats en cada fons genètic i establir la relació entre la regulació per H-NS i per Hha/YdgT. La comparació dels patrons d'expressió entre la soca hns i la soca salvatge, han posat de manifest que un 7% dels gens d'E. coli presenten una alteració significativa de la seva expressió, i que un 68% dels casos corresponen a una sobreexpressió en la soca hns. L'analisi de l'expressió diferencial entre la soca hha ydgT i la soca hns demostra que la regulació de la soca hha ydgT segueix majoritàriment el mateix patró d'expressió que la soca salvatge. Es van identificar 22 gens amb expressió diferencial entre la soca hha ydgT i la soca salvatge, dels quals 18 presenten sobreexpressió en un fons genètic hha ydgT, i 12 coincideixen amb els gens regulats per H-NS. / In enteric bacteria, the proteins of Hha/YmoA family play an important role in regulation of gene expression in response to environmental signals. On another part, the nucleoid-associated protein H-NS is a relevant example of a global modulator. H-NS binds to Hha, and other proteins of Hha/YmoA family, to regulate gene expression depending on environmental conditions.The first goal was to determine if Hha and H-NS participate together regulating genes known as regulated by H-NS, like "bgl" operon silenced by H-NS, or other new genes in different osmolarity conditions. We conclude that Hha play a role in silencing "bgl" operon expression in "E. Coli" and that Hha-H-NS complex is responsible for the HtrA repression at low osmolarity.R27 plasmid code two proteins homologous to Hha and H-NS, respectively. Since R27 conjugation is thermoregulated, and given the fact that Hha and H-NS regulate gene expression depending on environmental parameters, we investigated the role of these proteins, in thermoregulation of R27 conjugation. We conclude that Hha and H-NS, of plasmidic and chromosomic origin, downregulate plasmid conjugation at high temperature. As well, we studied the intervention of Hha and H-NS R27 encoded proteins in the physiology of R27 host cells. We observed that these proteins compensate some of the phenotypes caused by hha and hns mutations.Finally, a transcriptomic analysis of the effect of the mutations "hns" and "hha ydgT" in "E. coli"i was carried out to establish the relationship between H-NS and Hha/YdgT regulation. The result showed that 7% of genes were affected by "hns" mutation and that 68% of these cases corresponds to an overexpression in hns strain. The analysis of "hha ydgT" strain demonstrates that its regulation follows mostly the same pattern of expression than the wild type strain, because "hha ydgT" mutations only affected 22 genes.

TrkA es va descobrir com a un oncogén producte de la fusió del seu domini tirosinakinasa (TK) amb la tropomiosina. Posteriorment, va augmentar el seu interès endescobrir-se que la proteïna nativa constituïa el receptor del factor de creixementnerviós (NGF).Es coneixen bé els esdeveniments que tenen lloc a partir de la unió del lligand alreceptor i que donen lloc a l'activació de les vies de senyalització de les MAPK yPI 3-K/Akt. Se sap que, in vivo, la internalització del receptor i el seu transportretrògrad també juguen un paper important per a l'efecte a llarg termini del NGF ique és un tret distintiu en relació a d'altres receptors de factors de creixement.L'activació del receptor també comporta un augment transitori de Ca2+intracel· lular. Per això ens vam plantejar l'estudi de la relació entre l'activació deTrkA i calmodulina (CaM), com a sensor dels nivells de Ca2+ intracel· lulars.En primer lloc vam observar una interacció directa i dependent de Ca2+ entre CaM ila meitat c-terminal del domini intracel· lular de TrkA. La primera part del treball secentra en caracteritzar aquesta interacció.Per veure l'efecte de la unió sobre Trk, vam utilitzar inhibidors de CaM. Aquestsno impedeixen la fosforilació de TrkA induïda per NGF, però sí comporten laproteòlisi del receptor donant lloc a un fragment amb activitat tirosina kinasaconstitutiva. Donada la ubiqüitat de CaM, i la seva importància en processos vitalsper a la cél· lula, el segon objectiu ha consistit en buscar el lloc d'unió a CaM deTrkA per així poder obtenir una construcció de Trk on es perdés la unió a CaM.Basant-nos en diverses evidències, ens vam centrar en la caracterització d'una regióque conté una Tyr fosforilable (Y701) i que forma part d'un motiud'internalització. L'última part del treball se centra en descriure les característiquesd'aquesta Tyr i la seva funció, que més enllà de la relació amb CaM, pot constituiruna fosforilació inhibitòria per l'activitat de Trk i un lloc de regulació negativa dela internalització. / TrkA se descubrió como un oncogén producto de la fusión de su dominio tirosinakinasa (TK) con la tropomiosina. Posteriormente, aumentó su interés trasdescubrirse que la proteína nativa constituía el receptor del factor de crecimientonervioso (NGF).Se conocen bien los acontecimientos que ocurren tras la unión del ligando alreceptor y que dan lugar a la activación de las vías de señalización de las MAPK yPI 3-K/Akt. Se sabe que, in vivo, la internalización del receptor y su transporteretrógrado también juegan un papel importante para el efecto a largo plazo delNGF y que es una característica distintiva de otros receptores de factores decrecimiento.La activación del receptor también conlleva un aumento transitorio de Ca2+intracelular. Por ello nos planteamos estudiar la relación entre la activación deTrkA y calmodulina (CaM), como sensor de los niveles de Ca2+ intracelulares.En primer lugar observamos una interacción directa y Ca2+ dependiente entre CaMy la mitad c-terminal del dominio intracelular de TrkA. La primera parte del trabajose centra en caracterizar esta interacción.Para ver el efecto de la unión sobre Trk, utilizamos inhibidores de CaM. Éstos noimpiden la fosforilación de TrkA inducida por NGF, pero sí conllevan la proteolisisdel receptor dando lugar a un fragmento con actividad tirosina kinasa constitutiva.Dada la ubicuidad de CaM y su importancia en procesos vitales para la célula, elsegundo objetivo consistió en buscar el sitio de unión a CaM de TrkA, para asípoder obtener una construcción de Trk en que se perdiera la unión a CaM.Basándonos en diversas evidencias, nos centramos en la caracterización de unaregión que contenía una Tyr fosforilable (Y701) y que además forma parte de unmotivo de internalización. La última parte del trabajo se centra en describir lascaracterísticas de dicha Tyr y su función,que más allá de la relación con CaM,puede constituir una fosforilación inhibitoria para la actividad de Trk y un lugar deregulación negativa de su internalización. / TrkA was discovered as an oncogen, product of the fusion of its Tyrosine kinasedomain with Tropomiosin. Later on, it was identified as the receptor for the Nervegrowth factor (NGF).The first steps in Trk signaling after ligand binding are well understood. And alsothe pathways leading to MAPKs and PI3K-Akt activation. But receptorinternalization and retrograde transport are also important for the long termsignaling of TrkA, giving raise to a differential regulation of Trk receptors amongother growth factor receptors.Receptor activation also induces an increase in intracellular calcium concentration.That's why we thought on studying the relationship between TrkA activation andcalmodulin (CaM), as a prototypical calcium sensor.First we described a direct and calcium-dependent interaction between CaM andthe c-terminal part of TrkA. The first part of this work consists on thecharacterization of this interaction.In order to check the effect of CaM binding on TrkA we used CaM inhibitors.NGF-induced TrkA fosforilation was not inhibited upon CaM inhibition, but Trkwas cleaved, leading to constitutively active fragments. CaM is ubiquous andnecessary for many cell processes, so the second objective has been to search forthe CaM binding domain on TrkA in order to generate a TrkA mutant defective inCaM binding.We mutated a region containing a phosphorylatable Tyrosine Y701 that constitutesa trafficking motif, as the putative binding site of CaM. The last part of this projectdeals with the characterization of the mutants, and their effect even regardless ofCaM binding. Its phosphorylation might inhibit Trk function, and the regionconstitutes a negative regulator of internalization.

ERA Biotech S.A. és una empresa que desenvolupa la seva pròpia tecnologia per a la producció de proteïnes i pèptids d’alt valor afegit. El mètode de producció i acumulació de proteïna recombinant es basa en el mecanisme natural d’acumulació de proteïnes de reserva de blat de moro (zeïnes) en orgànuls densos derivats de reticle endoplasmàtic anomenats cossos proteics. La tecnologia Zera® empra el domini ric en prolina de l’extrem N-terminal de la γ-zeïna per induir la formació de novo de cossos proteics heteròlegs en teixits i cèl•lules eucariotes. L’elevada densitat que presenten aquests orgànuls permet una recuperació i enriquiment de la proteïna de fusió d’interès, mitjançant tècniques d’homogeneïtzació i fraccionament cel•lular. Originàriament dissenyats per permetre la purificació per afinitat del proteïna d’interès, els elements de fusió també poden ajudar a mantenir l’estabilitat, el plegament i la solubilitat del producte. Malgrat tot, per a algunes aplicacions posteriors es requereix la producció de la proteïna nativa, amb el qual són necessàries etapes de proteòlisi mitjançant endoproteases específiques. En un context industrial l’addició d’una proteasa exògena suposa l’etapa més costosa en el procés de producció. A més, les condicions de processament poden arribar a interferir amb l’activitat biològica del component purificat. Un dels objectius principals de moltes empreses dedicades a la producció de proteïnes recombinants, tracta de cercar alternatives al processament convencional per addició de proteases exògenes. L’objectiu general d’aquest treball s’ha centrat en el desenvolupament i aplicació de dues estratègies de processament aplicades a proteïnes recombinants de fusió produïdes mitjançant la tecnologia Zera®, en diferents sistemes d’expressió. La primera aproximació ha consistit en la producció d’enteroquinasa bovina (EK), endoproteasa específica, mitjançant la tecnologia Zera®. La producció d’enteroquinasa pròpia evitaria l’adquisició comercial de la mateixa, amb el qual es reduirien els costos globals de producció. S’han dissenyat diferents construccions amb el domini catalític de l’enteroquinasa fusionat al domini Zera® per tal de permetre la seva acumulació en cossos proteics heteròlegs. Degut a la conformació catalítica que adopta, observàrem que el seu extrem N-terminal havia de romandre lliure per tal de mantenir la seva activitat proteolítica. La fusió del domini Zera® al extrem C-terminal d’EK va resultar incompatible amb la viabilitat de les cèl•lules de mamífer o del teixit foliar de tabac, indicant cert grau de citotoxicitat promogut per la proteasa activa. D’altra banda, el bloqueig de l’extrem N-terminal d’EK mitjançant la fusió del domini Zera®, requeria d’una etapa prèvia de processament per tal d’activar la proteasa in vitro. Els baixos nivells d’expressió assolits en cèl•lules de mamífer, juntament amb la baixa idoneïtat de l’estratègia, varen motivar l’exploració d’altres alternatives de processament. La segona aproximació descrita en aquest treball es basa en l’estudi de l’autoprocessament de proteïnes de fusió mitjançant inteïnes. Les inteïnes són elements proteics naturals capaços de promoure l’splicing de proteïnes a través d’una sèrie de reaccions que permeten la seva auto-excissió i la unió dels fragments que les flanquegen o exteïnes. Certes modificacions genètiques en residus clau de la seqüència de les inteïnes, han permès modular la seva activitat per permetre l’autoprocessament in vitro de forma controlable. S’ha estudiat l’aplicació de dos tipus diferents d’inteïnes induïbles per al processament de proteïnes de fusió Zera®, en cèl•lules de mamífer, en cèl•lules d’insecte, i en planta de tabac. El rendiment global del procés de producció de rhGH (com a proteïna model), fou analitzat i comparat emprant dos sistemes de processament diferents sobre la proteïna de fusió Zera® expressada en planta de tabac: el mediat per la inteïna MxeGyrA, i el de la proteasa comercial enteroquinasa. Tot i que els costos globals de producció de rhGH resultaren similars per ambdós processos, el rendiment de producció fou notòriament major en el procés emprant la inteïna. L’èxit de l’aplicació de les inteïnes a la tecnologia Zera®, ha comportat un avenç en el procés de downstream, facilitant de manera significativa la recuperació de la proteïna nativa d’interès. / ERA Biotech S.A. is a biotechnology company whose technology permits high-level production of recombinant proteins and peptides through application of the Zera® assembler peptide. The Zera® domain originates from a maize storage protein (gamma-zein), which naturally accumulates in maize grains in the form of dense protein bodies to elevated levels. The Zera® assembler peptide when fused to a protein of interest triggers the formation in vivo of protein bodies in eukaryotic cells, effectively converting the cells into dense storage organelles. Due to its physicochemical properties, the downstream steps and recovery of the recombinant proteins are extremely efficient. For some applications in the biopharmaceutical industry, fusion or affinity tags need to be cleaved off by site-specific endoproteases in order to recover the native target protein. At a manufacturing scale, the removal of the fusion tag is the most costly step in protein production (cost and specificity/efficiency issues), and can interfere with the biological activity of the purified component. Therefore novel cleavage options which permit specific, efficient and scalable protein production processes are required. In the present study we describe two different cleavage strategies that have been adopted for Zera® fusion proteins expressed in different host expression systems. The first approach was to produce a conventional site-specific endoprotease in house through Zera® technology. Different constructs were designed for the easy and active production of bovine enterokinase (EK) catalytic subunit in mammalian cells and transgenic tobacco plants. Active conformation of this protease was adopted when the N-terminus of the protein was free of any fusion tag, however, proteolytic activity of this protease resulted in cytotoxicity in both host cell systems tested. The fusion of the Zera® domain in the N-terminus of EK and its expression in mammalian cells resulted in the formation de novo of protein bodies accumulating the target fusion protein. Isolation of protein bodies and subsequent downstream steps for protein recovery were designed and set up for this new host system. For the EK activation, a cleavage step by another endoprotease was included, but the low expression levels achieved for this fusion protein, resulted in non-conlcusive data from the activity test. Considering the biochemical properties of this protease its recombinant production for large scale manufacturing results technically cost-unfriendly, so alternative cleavage methods were explored. The second approach described in the present work, consisted in the use and application of self-cleavable elements for the specific cleavage of Zera® fusion proteins. Inteins are naturally occurring protein elements capable of post-translational self-excission from a precursor protein through a process known as protein splicing. MxeGyrA and SspDnaB mini-inteins have been engineered to yield a controllable N-terminal and C-terminal autocleavage induced under certain controlled conditions. Both inteins have shown activity when fused to Zera® and to a protein of interest in mammalian cells (CHO), insect cells (Sf9) and transgenic tobacco plants. The success of the intein application to the Zera® technology has evolved into a faster and more user friendly downstream step leading to the recovery of a native protein of interest.