Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Farmacologia / Made available in DSpace on 2012-10-24T17:13:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 262349.pdf: 2339381 bytes, checksum: ecce9c0988315ad7cd38fc2cf24b85c3 (MD5) / Estudos recentes sugerem que o acúmulo de células gliais ativadas em áreas cerebrais importantes no controle cognitivo desempenha papel fundamental na [inflamação] associada à [doença de Alzheimer]. No entanto, os mecanismos que regulam o acúmulo destas células na doença ainda são pouco compreendidos. No presente estudo, o bloqueio genético da quimiocina MIP-1a ou do receptor CCR5 e o bloqueio farmacológico da enzima [PI3K?] foram utilizados para avaliar o envolvimento de [quimiocinas] e suas vias de sinalização nas alterações moleculares e comportamentais induzidas pelo peptídeo [Aß1-40]. Os dados do presente estudo demonstram que a injeção intracerebroventricular (i.c.v.) do peptídeo Aß1-40 resultou no aumento dos níveis de RNAm para a MIP-1a no hipocampo de camundongos, acompanhado por astrogliose e microgliose. De maneira importante, a deleção gênica da MIP-1a ou do CCR5 resultou em redução do acúmulo de células da glia ativadas induzido pelo Aß1-40 no hipocampo. O tratamento com o inibidor seletivo da PI3K?, AS605240, apresentou efeito semelhante sobre o número de células gliais ativadas no hipocampo. O bloqueio genético da MIP-1a ou do CCR5 e farmacológico da PI3K? também inibiu a inflamação induzida pelo Aß1-40 no hipocampo, como demonstrado pela redução da expressão das enzimas COX-2 e iNOS em camundongos com deleção gênica da MIP-1a ou do CCR5, ou da expressão da COX-2 em animais tratados com o AS605240. Todavia, tais efeitos ocorrem de maneira indireta, através da diminuição da migração celular, uma vez que macrófagos que não expressam CCR5, ou ainda macrófagos tratados com AS605240 apresentaram quimiotaxia reduzida, sem apresentar inibição da expressão de IL-1ß e TNF-a induzida pelo Aß1-40. Por fim, o dano sináptico e cognitivo induzido pelo Aß1-40 foi reduzido pela deleção gênica da MIP-1a ou do CCR5, ou pelo bloqueio farmacológico da PI3K?. Em conjunto, estes dados apontam a MIP-1a, o CCR5 e a PI3K? como importantes mediadores da inflamação e dos prejuízos cognitivos induzidos pelo Aß1-40, sugerindo que estas proteínas podem ser alvos terapêuticos potenciais no tratamento da doença de Alzheimer.

Tesis presentada a la Universidad de Chile para optar al grado académico de Magíster en Bioquímica en el área de especialización Toxicología y Diagnóstico Molecular y Memoria para optar al título profesional de Bioquímico / El recambio de elementos celulares en el tejido nervioso es sustentado por la existencia de una célula troncal neural, responsable del proceso de neurogénesis a través del cual se generan neuronas, astrocitos y oligodendrocitos. Recientemente se han identificado algunas quimioquinas con la capacidad de regular el proceso de neurogénesis a partir de una célula troncal neural. En particular, se ha descrito que la alfa-quimioquina CXCL12 y su receptor CXCR4 participan en el desarrollo de estructuras del sistema nervioso central y regulan procesos de proliferación y diferenciación en el cerebro adulto. Sin embargo, el rol que cumplen las alfaquimioquinas y específicamente la quimioquina CXCL12 y sus dos receptores CXCR4 y CXCR7 regulando capacidades funcionales de las células troncales neurales de la médula espinal, aún no está claro. Por lo anterior, esta tesis postula que “las alfa-quimioquinas regulan el proceso de diferenciación de células troncales neurales cultivadas como neuroesferas obtenidas de médula espinal de ratones”. Para evaluar esta hipótesis se utilizaron neuroesferas derivadas de la médula espinal de embriones en estadio E18,5. Se demostró que estas neuroesferas contenían células troncales neurales evaluando las capacidades de autorrenovación y diferenciación. En ellas se determinó que sólo estaba presente el RNA mensajero de la alfa-quimioquina CXCL12 y sus receptores y no el de CXCL1 y sus receptores mediante RT-PCR. De esta manera el estudio se focalizó en CXCL12 y sus receptores CXCR4 y CXCR7. Mediante inmunofluorescencia se detectaron estos receptores en neuroesferas luego de 4 días de diferenciación y se observó que estaban en las células troncales neurales. Finalmente se analizó el proceso de diferenciación, evaluando mediante inmunofluorescencia marcadores de linajes neurales. Se observó que CXCL12 favoreció la diferenciación astroglial sobre la neuronal, comparando la intensidad de fluorescencia de marcadores neurales como GFAP y beta-III-tubulina y que, aparentemente, tanto CXCR4 como CXCR7 participan en el proceso de diferenciación, deducido de los resultados conseguidos con el uso del antagonista de CXCR4, AMD3100. En consecuencia, es posible proponer a la quimioquina CXCL12 como un blanco terapéutico pudiendo bloquearla en casos de lesión a la médula espinal, donde ésta se ve aumentada, para así impedir que las células troncales endógenas se diferencien a astrocitos / The renewal of cells in nervous tissue is sustained by neural stem cells, which are responsible for the neurogenesis that originates neurons, astrocytes and oligodendrocytes. The mechanisms that regulate the functional capabilities of neural stem cells in the spinal cord are unknown. Recently, some chemokines have been identified as regulating factors of neurogenesis of neural stem cells. In particular, the CXCL12 alpha-chemokine and its receptor CXCR4 participate in the development of central nervous system structures and regulate proliferation and differentiation processes in the adult brain. However, the role of alphachemokines and specifically of CXCL12 and its receptors CXCR4 and CXCR7, on the regulation of functional properties of neural stem cells from spinal cord is not clear yet. With this background, this thesis postulates that “alpha-chemokines regulates the differentiation of neural stem cells cultured as neurospheres obtained from mouse spinal cord”. To evaluate this hypothesis, neurospheres from E18,5 mouse spinal cord were used. It was shown that the neurospheres had neural stem cells by assessing their self-renewal and differentiation capabilities. The presence of mRNA of alpha chemokines CXCL1 and CXCL12 and their receptors in neurospheres was evaluated by RT-PCR. Showing that neurospheres have CXCL12 and its receptors mRNA and not CXCL1 and its receptors mRNA. Therefore, the investigation continued with CXCL12 and its receptors CXCR4 and CXCR7. Both receptors were detected on neural stem cells by immunofluorescence after 4 days of differentiation. Finally, the process of differentiation was analyzed by immunofluorescence of neural markers. The comparison between GFAP and beta-III-tubulin fluorescence intensity indicates that CXCL12 promotes astroglial over neuronal differentiation. Apparently, inferred from the use of the CXCR4 antagonist AMD3100, both CXCR4 and CXCR7 participate in the differentiation of the neural stem cells from spinal cord. Given the results obtained in this thesis, it is possible to propose CXCL12 as a potential therapeutic target: blocking it to promote neuronal differentiation, for example, in cases of spinal cord injury, in which CXCL12 mRNA is increased; preventing differentiation of neural stem cells to astrocytes / FONDECYT; MINREB

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pos-Graduação em Farmacologia, Florianópolis, 2008. / Made available in DSpace on 2012-10-24T05:44:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 271599.pdf: 9768628 bytes, checksum: ac3442843a34970b9d196ca07b9b8959 (MD5) / Os neutrófilos são células importantes para a eliminação de patógenos, no entanto, o recrutamento excessivo dessas células pode levar a lesão tecidual. Essa migração é mediada pelas quimiocinas CXC, e seus receptores, CXCR1 e CXCR2 presentes nos neutrófilos. Dessa forma, a redução do influxo de células durante o processo inflamatório, através da inibição desses receptores, pode ser uma alternativa terapêutica apropriada para o tratamento de inúmeras doenças inflamatórias, como as doenças inflamatórias intestinais (IBD). O presente estudo buscou avaliar se o tratamento sistêmico curativo com antagonista seletivo para o receptor CXCR2, SB225002, era capaz de reduzir a inflamação intestinal, no modelo de colite induzida pelo TNBS em camundongos. O SB225002 (SB) ou dexametasona (DEX) (controle positivo) foram administrados 24 h após a indução da colite, de 12 em 12 horas por três dias. No terceiro dia após a indução da colite, os animais foram sacrificados e diferentes parâmetros inflamatórios foram avaliados. A administração do TNBS induziu danos macro e microscópicos no cólon dos animais, encurtamento e edema desse tecido, além de aumento do peso do baço, causando, em muitos casos, a morte dos animais. Os tratamentos com SB ou DEX reduziram de forma significativa todos os parâmetros analisados, demonstrando uma melhoria no quadro inflamatório. Alguns dos mecanismos envolvidos nos efeitos do SB também foram analisados. O tratamento sistêmico reduziu o influxo de neutrófilos, a atividade da enzima MPO, os níveis de IL-1ß e KC além da expressão das proteínas VEGF, iNOS e COX-2, no cólon dos animais. Adicionalmente, os níveis das citocinas antiinflamatórias IL-4 e IL-10 estavam aumentados no cólon de animais que receberam SB. Dessa forma, nossos resultados demonstraram que o bloqueio seletivo do receptor CXCR2, através da ação do antagonista SB, se mostrou eficaz em reduzir a inflamação colonica no modelo de colite induzida por TNBS, sugerindo que o SB é um potencial agente terapêutico para o tratamento das doenças inflamatórias intestinais.

FREITAS, T. H. Citocinas e quimiocinas como biomarcadores terapêuticos na depressão: revisão sistemática e meta-análise. 2017. 144 f. Tese (Doutorado em Ciências Médicas) - Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2017. / Submitted by Ivone Sousa (ppgcm.ufc@gmail.com) on 2017-06-22T15:05:47Z No. of bitstreams: 1 2017_tese_thf.pdf: 5178949 bytes, checksum: 404b00dd3aad8e639bb07fe942d21dd4 (MD5) / Approved for entry into archive by Erika Fernandes (erikaleitefernandes@gmail.com) on 2017-06-22T15:54:10Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_tese_thf.pdf: 5178949 bytes, checksum: 404b00dd3aad8e639bb07fe942d21dd4 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-22T15:54:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_tese_thf.pdf: 5178949 bytes, checksum: 404b00dd3aad8e639bb07fe942d21dd4 (MD5) Previous issue date: 2017-06-12 / Inflammatory Cytokines and chemokines as response biomarkers in major depression. Mounting evidence suggests that aberrations in immune-inflammatory pathways contribute to the pathophysiology of major depressive disorder (MDD), and individuals with MDD may have elevated levels of predominantly pro-inflammatory cytokines and C-reactive protein. In addition, previous meta-analyses suggest that antidepressant drug treatment may decrease peripheral levels of interleukin-1 beta (IL-1β) and IL-6. Recently, several new studies examining the effect of antidepressants on these cytokines have been published, and so we performed an up-dated meta-analysis of studies that measured peripheral levels of cytokines and chemokines during antidepressant treatment in patients with MDD. The PubMed/MEDLINE, EMBASE, and PsycInfo databases were searched from inception through March 9th, 2017. Forty-five studies met inclusion criteria (N=1517). Peripheral levels of IL-6, tumor necrosis factor alpha (TNF-α), IL-1β, IL-10, IL-2, IL-4, interferon-γ, IL-8, the C-C motif ligand 2 chemokine (CCL-2), CCL-3, IL-1 receptor antagonist, IL-13, IL-17, IL-5, IL-7, and the soluble IL-2 receptor were measured in at least three datasets and thus were meta-analyzed. Antidepressant treatment significantly decreased peripheral levels of IL-6 (Hedges g = -0.454, P < 0.001), TNF-α (g = -0.202), IL-10 (g = -0.566), and CCL-2 (g = -1.502). These findings indicate that antidepressants decrease several markers of peripheral inflammation. However, this meta-analysis did not provide evidence that reductions in peripheral inflammation are associated with antidepressant treatment response although few studies provided separate data for treatment responders and non-responders. / Um considerável corpo de evidência sugere que alterações em vias imuno-inflamatórias contribuem para a fisiopatologia do Transtorno Depressivo Maior (TDM), e indivíduos com TDM podem ter níveis elevados predominantemente de citocinas pró-inflamatórias. Metanálises prévias sugerem que o tratamento com fármacos antidepressivos pode diminuir o nível periférico de interleucina-1 beta (IL-1) e IL-6. Recentemente foram publicados muitos novos estudos examinando o efeito dos antidepressivos nestas citocinas e portanto foi realizada uma Metanálise de estudos que avaliaram os níveis periféricos de citocinas e quimiocinas durante tratamento antidepressivo em pacientes com TDM. As bases de dados PubMed/MEDLINE, EMBASE e PsychInfo foram utilizadas, buscando referencias do seu início até 09 de março de 2017. Quarenta e cinco estudos preencheram critérios de inclusão (N=1517). Os níveis periféricos de IL-6, Fator de necrose tumoral alfa (TNF-), IL-1, IL-10, IL-2, IL-4, interferon-, IL-8, ligante C-C de quimiocinas (CCL-2), CCL-3, antagonista do receptor de IL-1, IL-13, IL-17, IL-5, IL-7 e o receptor solúvel de IL-2 foram medidos em pelo menos três bancos de dados e então foram metanalisados. O tratamento antidepressivo reduziu significativamente os níveis de IL-6 (g de Hedge= -0,454, P< 0,001), TNF- (g= - 0,202), IL-10 (g=-0,566), e CCL-2 (g= -1,502). Estes achados indicam que o tratamento antidepressivo diminui vários marcadores periféricos de inflamação. Entretanto esta metanálise não forneceu evidências de que a redução nos níveis inflamatórios está associada com resposta terapêutica, embora uma pequena parcela de estudos separem respondedores de não-respondedores.

RODRIGUES, Naya Lúcia de Castro. Efeito imunomodulador de CXCL10 na infecção de macrófagos murinos por cepa de Leishmania braziliensis isolada de paciente refratário ao tratamento com antimônio. 2015. 70 f. Dissertação (Mestrado em Patologia) - Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2015. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2015-06-09T13:06:29Z No. of bitstreams: 1 2015_dis_nlcrodrigues.pdf: 1639310 bytes, checksum: 2551a905c5b85238b0070f3202c8c5ab (MD5) / Approved for entry into archive by denise santos(denise.santos@ufc.br) on 2015-06-09T13:11:12Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_dis_nlcrodrigues.pdf: 1639310 bytes, checksum: 2551a905c5b85238b0070f3202c8c5ab (MD5) / Made available in DSpace on 2015-06-09T13:11:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_dis_nlcrodrigues.pdf: 1639310 bytes, checksum: 2551a905c5b85238b0070f3202c8c5ab (MD5) Previous issue date: 2015 / Chemotherapy available for leishmaniasis is effective in many cases, however is still not satisfactory, presenting several inconveniences, one of them, resistance to antimony, which is a major current problems. Few studies using treatment with recombinant chemokines for leishmaniasis have been reported. The objective of this study was to evaluate the immunomodulatory effect in vitro of CXCL10 and its association with Glucantime for the infection of macrophages by Leishmania braziliensis strain refractory to treatment with antimony. For this, murine macrophages were infected with L. braziliensis and treated or not with CXCL10 (25, 50 e 100ng/mL), Glucantime (32mg/mL), and CXCL10+Glucantime [(25, 50 e 100ng/mL) + (32mg/mL)]. After 24 and 48h of infection were evaluated: parasitic load (macrophages infected count on coverslips stained), nitric oxide concentration (NO) and the pattern of the cytokines TNF-α, IL-12, IL-4, IL-10, and TGF-β in the culture supernatant. The results showed that the treatment with CXCL10 and CXCL10+Glucantime combination resulted in a significant reduction of the parasitic load, ranging from 70.5% to 95% and 92.4% and 95.0%, respectively, compared with the control untreated, while treatment with Glucantime decreased infection of macrophages to 74.0%. The reduction of the parasitic load was correlated with the increase of NO in all concentrations of CXCL10 (p <0.001). However, it was not observed the same dynamic when it was used to CXCL10+Glucantime association. TNF-α and IL-12 levels increased as a function of the concentration of CXCL10 in the first 24h, however, was inhibited when the infected macrophages were treated with Glucantime (p <0.05). The concentration of TNF-α was lower in cells treated with CXCL10+Glucantime than in those treated only with CXCL10 in both time periods. To the association CXCL10+Glucantime the IL-12 only induced a significant production within 24h when CXCL10 was used at a concentration of 100ng/ml (p <0.01). CXCL10 and association CXCL10+Glucantime treated cells showed a decrease of IL-4 concentration decreasing as the chemokine concentrations were higher (p <0.01) while treatment with Glucantime had a high production of this cytokine. In both times evaluated, treatment with CXCL10 induced IL-10 production at concentrations of 50ng/ml, and 100ng/ml, induced a 3-fold more IL-10 (p <0.001) when compared with antimony or with association CXCL10+Glucantime. TGF-β showed different behavior in the two time periods, an increase in the early hours, and fall in the past 48h. Glucantime induced TGF-β concentration higher than that induced by CXCL10. The association CXCL10+Glucantime showed increased production of TGF-β inverse of the concentration of CXCL10 used. In conclusion, in vitro treatment with CXCL10 induced a Th1 response profile (increase of TNF-α, and IL-12), controlling the intracellular parasitemia and modulation of the inflammatory response mediated by IL-10, in macrophages infected with L. braziliensis refractory to antimony. The Glucantime+CXCL10 association, although it has reduced parasitic load, not inducing a significant increase in nitric oxide, and showing a induction of TNF-α, IL-12 and reduction IL-4,. / A quimioterapia disponível para as leishmanioses é eficaz em muitos casos, contudo ainda não é satisfatória, apresentando várias inconveniências, uma delas, a resistência aos antimoniais, que é um dos grandes problemas atuais. Poucos estudos utilizando tratamento com quimiocinas recombinantes para as leishmanioses têm sido relatados. O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito imunomodulador in vitro de CXCL10 e sua associação com Glucantime na infecção de macrófagos por cepa de Leishmania braziliensis refratária ao tratamento com antimônio. Para isso, macrófagos murinos foram infectados com L. braziliensis e tratados ou não com CXCL10 (25, 50 e 100ng/mL), Glucantime (32mg/mL) e CXCL10+Glucantime [(25, 50 e 100ng/mL) + (32mg/mL)]. Após 24 e 48h de infecção, avaliou-se: carga parasitária (contagem de macrófagos infectados em lamínulas coradas), concentração de óxido nítrico (NO) e o padrão da citocinas TNF-α, IL-12, IL-4, IL-10 e TGF-β nos sobrenadantes das culturas. Os resultados mostraram que os tratamentos com CXCL10 e a associação CXCL10+Glucantime resultaram em uma significante redução da carga parasitária, variando entre 70,5% a 95% e 92,4% a 95,0%, respectivamente, quando comparado com o controle não tratado, enquanto o tratamento com Glucantime apresentou redução da infecção dos macrófagos de 74,0%. A redução da carga parasitária foi correlacionada com o aumento de NO em todas as concentrações de CXCL10 (p< 0,001). No entanto, não foi observada a mesma dinâmica quando utilizado a associação CXCL10+Glucantime. Os níveis de TNF-α e IL-12 aumentaram em função da concentração de CXCL10 nas primeiras 24h, no entanto, foi inibida quando os macrófagos parasitados foram tratados com Glucantime (p<0,05). A concentração de TNF-α foi menor nas células tratadas com CXCL10 + Glucantime do que naquelas tratadas somente com CXCL10 em ambos os tempos avaliados. Para IL-12 a assosciação CXCL10+Glucantime só induziu uma produção significante nas primeiras 24 h quando CXCL10 foi utilizado na concentração de 100ng/ml (p<0,01). As células tratadas com CXCL10 e associação CXCL10+Glucantime apresentaram uma redução da concentração de IL-4, diminuindo à medida que as concentrações da quimiocina foram maiores (p<0,01), enquanto o tratamento com Glucantime apresentou uma elevada produção desta citocina. Em ambos os tempos avaliados, o tratamento com CXCL10 induziu a produção de IL-10 nas concentrações de 50ng/mL e 100ng/mL, uma indução 3 vezes mais de IL-10 (p<0,001), quando comparado ao antimônio ou com a associação CXCL10+Glucantime. TGF-β mostrou comportamento diferente nos dois tempos avaliados, com aumento nas primeiras horas e queda nas últimas 48h. Glucantime induziu concentração de TGF-β superior àquela induzida por CXCL10. A associação CXCL10+ Glucantime apresentou produção elevada de TGF-β inversa à concentração de CXCL10 utilizada. Em conclusão, o tratamento in vitro com CXCL10 induziu um perfil de resposta Th1 (aumento de TNF-α e IL-12), com controle da parasitemia intracelular, e modulação da resposta inflamatória mediada por IL-10, em macrófagos infectados por L. braziliensis refratária ao antimônio. A associação Glucantime+CXCL10, embora tenha reduzido carga parasitária, não induzindo aumento significante de óxido nítrico, mostrando uma indução de TNF-α, IL-12 e reduzindo IL-4.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Farmacologia, Florianópolis, 2015. / Made available in DSpace on 2016-10-19T13:11:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 338130.pdf: 3346579 bytes, checksum: 5c2821cb48b674a2f31ee7b10d6dd8e2 (MD5) Previous issue date: 2015 / A dor crônica é um problema de saúde grave, que afeta milhões de pessoas por todo o mundo. No entanto, não há terapia farmacológica disponível para o tratamento adequado de pacientes com dor crônica. Estudos recentes fornecem evidências convincentes de que a neuroinflamação desempenha um papel fundamental na patogênese dador crônica. O objetivo deste estudo foi avaliar o possível envolvimento da quimioquina CXCL1 na patogênese da dor neuropática, utilizando para isso diferentes modelos experimentais. A injeção intraneural (i.n.)de CXCL1 em camundongos causou hiperalgesia mecânica e térmica (ao calor) de longa duração, associada com migração de neutrófilos para o local da injeção no nervo ciático. A depleção destas células, após o tratamento dos animais com vimblastina, reduziu a hiperalgesia mecânica induzida pela quimiocina. A administração da CXCL1 no nervo ciático de camundongos aumentou os níveis teciduais da interleucina 1?? (IL-1??), interleucina 6 (IL-6) e da quimiocina CCL2, mas não do fator de necrose tumoral ?? (TNF-??). A participação da CXCL1 no modelo de ligação parcial do nervo ciático (LPNC) também foi evidenciada, uma vez que após a lesão os níveis teciduais e a expressão do RNAm para a CXCL1 encontraram-se aumentados tantono nervo ciático quanto na medula espinhal de camundongos. Otratamento com anticorpo anti-CXCL1 no momento, ou 4 dias após aLPNC reduziu de maneira significante tanto a hiperalgesia mecânica como a térmica (ao calor). Além disso, a administração intratecal (i.t.)do anticorpo anti-CXCL1 foi eficaz em inibir a hiperalgesia mecânica induzida pela LPNC, sugerindo a participação central desta quimiocinano desenvolvimento da dor neuropática. Estendendo os resultados anteriores, foi demonstrado que a participação da CXCL1 nos mecanimos envolvidos na LPNC depende da migração de neutrófilos, bem como da liberação de mediadores inflamatórios, especialmente daIL-1?? e IL-6. Finalmente, avaliou-se o possível envolvimento da quimiocina CXCL1 em um modelo de dor neuropática não relacionadoa lesão direta de nervos, a neuropatia periférica induzida pelo paclitaxel (PTX), um quimioterápico de amplo uso clínico. A administração repetida de PTX induziu o aumento significativo da expressão do RNAm para CXCL1 tanto no GRD como na medula espinhal, bem como aumentou os níveis teciduais desta quimiocina na medula espinal. O tratamento sistêmico com o anticorpo anti-CXCL1, mas não o com antagonista do receptor CXCR2, reduziu a hiperalgesia mecânica instalada induzida pelo PTX. De modo relevante, o tratamento preventivo destas drogas quando administrados pela via intratecal inibiram de maneira significativa a hiperalgesia mecânica induzida pelo PTX. Estes resultados sugerem a participação da quimiocina CXCL1 e do seu receptor expressos na medula espinhal no desenvolvimento da neuropatia induzida pelo PTX. Ainda os mecanismos centrais envolvidos na hiperalgesia mecânica induzida pelo PTX parecem depender da ativação da via de sinalização PI3K/AKT, e não das enzimas PLC e PKC. Os resultados do presente estudo demonstraram que a quimiocina participa dos mecanismos envolvidos no estabelecimento e manutenção da dor crônica em modelos experimentais. Desta maneira, estratégias que contribuam para inibir a ação e/ou a liberação desta quimiocina poderiam constituir ferramentas terapêuticas importantes para o tratamento da dor neuropática em seres humanos.<br> / Abstract : Chronic pain is a rising health problem that is predicted to affect millions of people worldwide. However, there are so far no available pharmacotherapies providing satisfactory pain relief for patients with persistent pain. Recent studies provide compelling evidence that neuroinflammation plays a key role in the pathogenesis of chronic pain. In this study we sought to evaluate the involvement of chemokine CXCL1 in the pathogenesis of neuropathic pain in different experimental models. Intraneural injection (i.n.) of CXCL1 induced thermal and mechanical hyperalgesia in mice and caused neutrophil migration into the mouse sciatic nerve. Depletion of these cells in animals pre-treated with vinblastine significantly reduced the mechanical hyperalgesia induced by the chemokine. Administration of CXCL1 in the sciatic nerve of mice increased tissue levels of interleukin1ß (IL-1ß), interleukin 6 (IL-6) and chemokine CCL2, but not the tumor necrosis factor a (TNF-a). CXCL1 role in the partial ligation of the sciatic nerve (PLSN) model was also demonstrated since after surgery their tissue levels and CXCL1 mRNA expression increased in the sciatic nerve and spinal cord tissues. Treatment with anti-CXCL1 antibody at the moment or 4 days after surgery reduced mechanical and thermal hyperalgesia induced by PLSN. Furthermore, the intratecal (i.t.) injection of anti-CXCL1 antibody also inhibited mechanical hyperalgesia induced by PLSN, suggesting the central involvement of this chemokine in the development of neuropathic pain. The participation of the CXCL1 in the PLSN model also depends on neutrophils migration and release of inflammatory mediators such as IL-1ß and IL-6. Finally we evaluated the involvement of CXCL1 chemokine in a neuropathic pain model that was not dependent on direct nerve injuries, the neuropathic pain model induced by the chemotherapy paclitaxel (PTX). Repeated administration of PTX induced a significant increase in expression of CXCL1 mRNA in spinal cord and DRG, as well as increased the tissue levels of this chemokine in the spinal cord. Systemic treatment with anti-CXCL1 antibody, but not the CXCR2 receptor antagonist, reduced the installed mechanical hyperalgesia induced by PTX. Preventive treatment of these drugs when administered by intratecal route significantly inhibited the mechanical hyperalgesia induced by PTX. These results suggest the involvement of CXCL1 chemokine and its receptor expressed in the spinal cord in the development of neuropathy induced by PTX. Furthermore, central mechanisms involved in the mechanical hyperalgesia induced PTX appear to depend on activation of the PI3K/AKT signaling pathway, and independent of PLC and PKC enzymes activation. The results of this study demonstrated the role of CXCL1 in the establishment and maintenance of chronic pain in experimental models. Thus, strategies to inhibit the action and/or the release of this chemokine might be an important therapeutic tool for the treatment of neuropathic pain inhumans.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:26:19Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-08-04Bitstream added on 2014-06-13T18:54:35Z : No. of bitstreams: 1 falcaojunior_joa_me_botfm.pdf: 773288 bytes, checksum: f1ca4e53336a9ebe1facf54bc6aed560 (MD5) / O sistema imune, por meio da coordenação do funcionamento de várias células e proteínas, além de proteger contra infecções, atua na resposta do organismo contra células neoplásicas. As quimiocinas associam-se à modulação da resposta imune e apresentam importante papel na mediação do tráfego celular. O objetivo deste estudo é avaliar as quimiocinas, CCL2/MCP-1, CCL3/ MIP-1α, CCL4/MIP-1β, CCL5/RANTES e CXCL 8/IL-8 em mulheres com câncer epitelial de ovário (CEO). Métodos: Foram estudadas prospectivamente 16 pacientes com CEO e 18 pacientes sadias sem evidências de neoplasias malignas (grupo controle). As pacientes com CEO foram submetidas à laparotomia para citoredução. As dosagens das quimiocinas foram realizadas por meio da técnica de ensaio citofluorométrico com microesferas fluorescentes - Cytometric bead array (CBA) Foram utilizados os teste de Mann-Whitney e Kendall’s tau quando apropriados, sendo o valor de p<0,05 considerado significativo. Resultados: A idade das pacientes variou de 23 a 89 anos (58,7 + 2,3 anos). O estadiamento do tumor (FIGO) foi I em 4 casos (25%), III em 5 casos (31,3%) e estádio IV em 7 casos (43,8%). As dosagens séricas de CCL2/MCP-1 e CCL4/MIP-1β foram menores nas pacientes com CEO em comparação com o grupo controle (p=0,021 e p=0,031; respectivamente). Não houve diferença entre os grupos nos níveis de CCL3/ MIP-1α, CCL5/RANTES e CXCL 8/IL-8. O estadiamento tumoral não se associou com os níveis séricos das quimiocinas. A dosagem sérica de CA-125 não apresentou correlação com as quimiocinas estudadas. A resposta imune pode estar associada ao estabelecimento/manutenção do CEO e o estudo das quimiocinas pode ser um mecanismo para esta avaliação. / The dynamics of the host immune system enables defense against pathogenic agents and neoplasic cells through a wide range of mechanisms. Because chemokines are responsible for modulating the immune response in leukocyte migration processes to epithelial ovarian cancer (EOC)- affected tissues, we aimed to investigate CCL2/MCP-1, CCL3/ MIP-1 , CCL4/MIP-1 , CCL5/RANTES and CXCL 8/IL-8 in women with EOC. Methods: Sixteen patients diagnosed with EOC and 18 healthy women with no evidence of malign neoplasia (control group) aged from 23 to 89 years (mean SEM: 58.7+2.3 years) were included. The EOC patients underwent laparotomy and debulking surgery. Chemokines dosage assays were made using Cytometric bead array (CBA). Statistical analysis was performed using Mann-Whitney and Kendall’s tau, and p<0.05 was regarded as significant. Results: The tumor staging (FIGO) was classified into: I in 4 cases (25%), III in 5 cases (31.3%) and stage IV in 7 cases (43.8%). Sera chemokine dosage of CCL2/MCP-1 and CCL4/MIP-1 were lower in EOC patients compared to the control group (p=0,021 and p=0,031; respectively). No significant difference was observed in the levels of CCL3/ MIP-1 , CCL5/RANTES and CXCL 8/IL-8 between groups. No association between the chemokines analyzed and the epithelial ovarian cancer staging was found, and CA125 was not correlated with chemokine dosage. Conclusion: The establishment of epithelial ovarian cancer may be correlated with the host immune response dynamics, and the study of chemokines could be regarded as a valid diagnostic tool for evaluating the extent of the disease.

Magíster en Bioquímica Área de Especialización en Bioquímica de Proteínas y Biotecnología y optar al título de Bioquímico / Las hemocianinas de moluscos son enormes glicoproteínas que al ser inoculadas en mamíferos, generan una potente respuesta inmune del tipo Th1, caracterizada por la secreción de IFN-y. Es así que se han usado como carrier en el desarrollo de anticuerpos contra haptenos, como carrier/adyuvante en vacunas terapéuticas contra patógenos y cáncer y además, como inmunoestimulante no específico en la inmunoterapia del carcinoma superficial de vejiga. Sin embargo, los mecanismos inmunológicos involucrados en las etapas tempranas de la respuesta inmune anti-hemocianina, conducentes a sus notables propiedades inmunoestimulantes, son muy poco conocidos. Es así que ha sido escasamente abordado su efecto sobre las redes de comunicación coordinadas por citoquinas, las proteínas que median las interacciones entre las células del sistema inmune. Esta información, ampliará no solo el conocimiento básico para comprender los efectos inmunoestimulantes de las hemocianinas en mamíferos, sino que también contribuirá a nuevas aplicaciones. En esta tesis se propuso estudiar el efecto de tres hemocianinas sobre macrófagos peritoneales murinos, como modelo para entender la respuesta inmune innata que inducen en dichas células presentadoras de antígeno. Específicamente, se estudiaron la hemocianina clásica, originaria de California y conocida como KLH, obtenida de Megathura crenulata y dos descubiertas más recientemente que corresponde a CCH de Concholepas concholepas y FLH de Fissurella latimarginata, especies que habitan las costas de nuestro país. Se propuso que las hemocianinas al ser incorporadas por las células presentadoras de antígenos, inducen la expresión de citoquinas proinflamatorias, un evento fundamental para dar el inicio a una respuesta inmune. Para demostrarlo, cultivos in vitro de macrófagos peritoneales murinos, previamente caracterizados morfológicamente, fenotípicamente (F4/80+) y funcionalmente, fueron incubados con las distintas hemocianinas en concentraciones de hasta 1 mg/ml; LPS y medio de cultivo fueron usados como control positivo y negativo, respectivamente. Posteriormente, se estudió la correlación entre los niveles de mRNA y los niveles de proteína de un panel de citoquinas y quimioquinas proinflamatorias mediante dos tipos de PCR y ELISA, respectivamente. Los principales resultados demuestran que: 1. Las hemocianinas fueron fagocitadas por los macrófagos peritoneales cultivados in vitro. Sin embargo, FLH y KLH estimularon más tempranamente que CCH el aumento en la expresión de quimioquinas claves en la extravasación de leucocitos, tales como MIP-1α (CCL-3), KC (CXCL-1) y LIX (CXCL-5), las cuales son indicativas de un proceso inflamatorio agudo. 2. Las hemocianinas estimularon la expresión de IL-6, IL-12p40 y TNF-α en distintos tiempos e intensidades, como indican los resultados de RT-qPCR y ELISA, sugiriendo la inducción de mecanismos de señalización diferentes, cuya explicación es atribuible a las diferencias estructurales que presentan las hemocianinas entre ellas y especialmente, en aquellas que dicen relación con su composición de oligosacáridos. 3. Las hemocianinas muestran la inducción de un perfil inmunológico Th1 marcado, al mantener reguladas a la baja citoquinas claves de la respuesta Th2, como son IL-4, IL-5, IL-13, TGF-ß2. Finalmente, los resultados presentados en esta tesis permiten concluir que los macrófagos también participan en los mecanismos inmunológicos tempranos que acompañan el reconocimiento de las hemocianinas, induciendo un ambiente proinflamatorio que puede explicar sus notables propiedades inmunomoduladoras en los mamíferos / Molluskan hemocyanins are huge glycoproteinscapable of induce a potent Th1-dominant immune response, characterized by the secretion of IFN-y, when are inoculated in mammals. By this reason, they have been used as a carrier protein in the development of antibodies against pathogens and cancers and also, as non-specific immunostimulant in the immunotherapy of superficial bladder cancer. However, the immunological mechanisms involved in the early phases of the anti-hemocyanin immune response, that leads to its remarkable immunostimulatoryt effects, are scarcely known. Thus, it has been poorly addressed their effects on the communication network coordinated by cytokines, the proteins which mediate interactions between cells from the immune system. This information will allow expand the basic comprehension to understand its immunostimulatory effects, but also will contribute to new applications. In this thesis, we proposed to examine the effects of three hemocyanins on murine peritoneal macrophages, as a model for understanding the earliest immune responses induced by these antigen presenting cells (APC). Specifically, we studied the classical hemocyanin, native from California and obtained from Megathura crenulata, known as KLH and two recently discovered hemocyanins, CCH collected from Concholepas concholepas and FLH from Fissurella latimarginata, both species natives of our coasts. It was proposed that once hemocyanins are incorporated by APC, would induce the expression of proinflammatory cytokines, a key event in the initiation of an immune response. To demostrate this, in vitro cultures of murine peritoneal macrophages, previously characterized morphologically, phenotypically (F4/80+) and functionally, were incubated with hemocyanins in concentrations up to 1 mg/ml for different times; as positive and negative control, LPS and culture médium were used, respectively. Subsequently, we studied the correlation between mRNA and protein levels from a panel of proinflammatory cytokines and chemokines using two types of PCR and ELISA, respectively. The main results show that: 1. Hemocyanins were endocyted by peritoneal macrophages cultured in vitro, but only FLH and KLH and not CCH can induced an increased in the expression of key chemokines related to leukocyte extravasation, such as MIP-1α (CCL-3), KC (CXCL-1) and LIX (CXCL-5), wich are indicative of an acute inflammatory process. 2. Hemocyanins simulated the expression of IL-6, IL-12p40and TNF-α at different times and intensities, as indicated by the results of RT-qPCR and ELISA, suggesting different signaling pathways of induction, which can be explained by strutural differences between them, and specially those concerns to their oligosaccharides composition. 3. Hemocyanins showed induction of a Th1-dominant immune profile, maintaining downregulated key Th2 cytokines such as IL-4, IL-5, IL-13 and TGF-ß2. Finally, the results presented in this thesis, allow to conclude that macrophages are involved in the early phases of immunes recognition of hemocyanins, inducing a proinflammatory milieu that may explain its enhanced immunomodulatory properties in mammals / Fondecyt, Biosonda, Fucited

Trabajo de Investigación Requisito para optar al Título de Cirujano Dentista / Las periodontitis son un conjunto de enfermedades infecciosas cuya causa es la bio-película patogénica subgingival. Las bacterias que constituyen esta biopelícula pueden provocar daño directo a los tejidos de inserción periodontal; sin embargo, la destrucción de ellos es producida principalmente por la respuesta inmune desarrollada por el hospedero ante ellas. Durante esta respuesta inmunoinflamatoria, las quimioquinas, en particular las quimioquinas CC (CCLs), y sus receptores específicos (CCRs) definen la migración de células inmunológicas, por ejemplo los linfocitos T, y determinan, al menos en parte, el inicio, progresión y severidad de las periodontitis. En diversas enfermedades infecciosas, distintos patrones de CCLs y CCRs se expresan en los tejidos afectados y estos se asocian a la diferenciación y función de fenotipos de linfocitos T colaboradores (Th) particulares. Por ejemplo, en las lesiones periapicales consecutivas a necrosis pulpar séptica, un patrón con predominio de CCL5 y CCR5 se asocia a un fenotipo Th1 pro-inflamatorio y un patrón con predominio de CCL21 y CCR7 favorece una respuesta tipo Th17 osteodestructiva. En las periodontitis, aún no se ha descrito la asociación entre un patrón particular de CCLs y CCRs y la inflamación y osteo-destrucción que caracterizan a la enfermedad. Aggregatibacter actinomycetemcomitans es una bacteria que compone la bio-película patogénica subgingival de pacientes con periodontitis y uno de los principales factores de virulencia que expresa es el lipopolisacárido (LPS). Sobre la base de la variable inmunogenicidad de las distintas formas de LPS, en A. actinomycetemcomitans se describen distintos serotipos y entre ellos se especula que existen diferencias en su asociación a la enfermedad. Con el objeto de realizar una aproximación en la asociación entre los patrones de CCLs y CCRs característicos de los distintos fenotipos efectores de linfocitos Th y la patogenia de las periodontitis, en este trabajo de investigación se 4 analizó la expresión de distintos CCLs y CCRs en linfocitos T estimulados in vitro con los distintos serotipos de A. actinomycetemcomitans. En linfocitos T estimulados con el serotipo b, se detectó un incremento en los niveles de expresión de CCL3, CCL5, CCL20, CCL21, CCL28 y sus receptores CCR1, CCR2, CCR5, CCR6, CCR7 y CCR9, característicos de un patrón de respuesta tipo Th1 y Th17, en comparación a las células estimuladas con los serotipos a o c. Además, este incremento de expresión de CCLs y CCRs tipo Th1/Th17 se correlacionó positivamente con los niveles de expresión de los factores de transcripción T-bet y RORC2, determinantes de la diferenciación selectiva de estos fenotipos. En conclusión, el serotipo b de A. actinomycetemcomitans induce un incremento en los niveles de expresión de CCLs y CCRs asociados a los linfocitos Th1 y Th17.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Farmacologia, Florianópolis, 2013. / Made available in DSpace on 2014-08-06T17:35:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 324637.pdf: 1897248 bytes, checksum: b9dbb12df301eef47b15a90504d1db3d (MD5) Previous issue date: 2013 / A proposta do presente estudo foi avaliar a participação dos receptores CXCR2 e TRPV1 na cistite induzida por ciclofosfamida (CYP) em ratos. A CYP é um quimioterápico cujo principal efeito adverso é a urotoxicidade, caracterizada pelo desenvolvimento de cistite hemorrágica e fibrose da bexiga urinária. A administração sistêmica de CYP causou inflamação da bexiga urinária, disfunção do processo de micção e comportamento de dor visceral. A cistite induzida por CYP foi caracterizada por aumento do peso úmido da bexiga urinária, edema, hemorragia, infiltração de neutrófilos e dano urotelial. Além disso, ocorreu um aumento nos níveis de citocinas inflamatórias como a IL-1ß e o TNF-a. A presença de dor visceral foi evidenciada através do aumento do comportamento nociceptivo, bem como pela presença de hipersensibilidade mecânica referida avaliada na pata e na região abdominal A cistite induzida por CYP alterou os parâmetros urodinâmicos do processo de micção. Ainda, a cistite induzida por CYP induziu aumento nos níveis do RNAm dos receptores CXCR2 e TRPV1 na bexiga urinária. Ensaios de imunofluorescência revelaram um aumento na expressão dos receptores CXCR2 e TRPV1 na bexiga urinária, em especial no urotélio e fibras nervosas, e nos neurônios do GRD (gânglio da raiz dorsal) após o tratamento com CYP. O pré-tratamento dos animais com os antagonistas seletivos dos receptores CXCR2 (SB225002) e TRPV1 (SB366791) reduziu o edema e a hemorragia, o peso úmido, a infiltração de neutrófilos determinada através dos níveis de atividade da enzima mieloperoxidase (MPO), bem como os níveis das citocinas IL-1ß e TNF-a na inflamação da bexiga urinária. Curiosamente, os antagonistas SB225002 e SB366791, ou a combinação de ambos, reduziu significativamente os escores comportamentais nociceptivos e a hipersensibilidade mecânica na pata e na região abdominal, causados pela CYP. Além disso, o aumento dos níveis de RNAm dos receptores CXCR2 e TRPV1 na bexiga após a administração de CYP, foi inibido pelo pré-tratamento com o SB225002, SB366791 ou pela combinação de ambos os antagonistas. A disfunção da bexiga urinária, avaliada através de cistometria, foi evidenciada pelo aumento do número de contrações não associadas à micção (CNMs) e nas pressões vesicais e também pela redução da capacidade da bexiga, do volume de urina eliminado e da eficiência de esvaziamento vesical. O pré-tratamento com o antagonista SB225002 ou a sua combinação com SB366791, reduziu as pressões vesicais, enquanto que os antagonistas SB225002 e SB366791, administrados isoladamente ou a combinação de ambos, causaram um aumento da capacidade da bexiga, do volume eliminado e da eficiência de esvaziamento da bexiga urinária, além de reduzir o número de CNMs. Tomados em conjunto os resultados obtidos no presente estudo sugerem um potencial efeito benéfico dos antagonistas seletivos dos receptores CXCR2 e TRPV1 na inflamação, na dor e nas alterações funcionais da bexiga urinária após a cistite induzida pela CYP.<br> / Abstract : The purpose of this study was to evaluate the role of CXCR2 and TRPV1 receptors in the rat model of cyclophosphamide (CYP) induced cystitis. CYP is a chemotherapeutic agent that induces urotoxicity characterized by the development of hemorrhagic cystitis and urinary bladder fibrosis. Systemic administration of CYP induced bladder inflammation, voiding dysfunction and visceral pain behavior. CYP-induced cystitis was characterized by edema, hemorrhage, increased neutrophil infiltration, urothelial damage, increased bladder wet weight. Furthermore, there was an increase in the levels of inflammatory cytokines such as IL-1ß and TNF-a. Visceral pain was determined by the increase in the nociceptive behavior as well as mechanical hypersensitivity measured by von Frey filaments applied in the paw and abdominal area. CYP-induced cystitis altered bladder contractility and urodynamic parameters involved in voiding function. Also, CYP-induced cystitis increased the mRNA levels of CXCR2 and TRPV1 receptors in the urinary bladder. Immunofluorescence assays revealed an increase in the expression of CXCR2 and TRPV1 receptors in the urinary bladder, particular in the urothelium, and in DRG neurons (dorsal root ganglia) after CYP treatment. Pretreatment of animals with selective antagonists of CXCR2 (SB225002) and TRPV1 (SB366791) receptors significantly reduced the edema and hemorrhage, the bladder wet weight, neutrophil infiltration, myeloperoxidase activity (MPO) and the cytokines levels in the urinary bladder. Interestingly, the administration of the antagonists, SB225002 and SB36679, or the combination of both, significantly reduced the behavioral nociceptive scores and the mechanical hypersensitivity in the paw and in the abdominal area, caused by CYP. In addition, increased levels of CXCR2 and TRPV1 mRNA in the bladder after CYP administration, was inhibited by the pre-treatment with SB225002, SB366791 or the combination of both antagonists. The urinary bladder dysfunction was assessed by cystometry and determined by an increase in the number of non-voiding contractions (NVCs) and in bladder pressure and also by the reduction in bladder capacity, voided volume and bladder efficiency. Of note, the pretreatment with the antagonist SB225002 or its combination with SB366791 significantly reduced the bladder pressure, whereas the antagonists SB225002 and SB366791, administered alone or in combination resulted in an increased bladder capacity, voided volume and bladder efficiency, and reduced the number of NVCs. Taken together, these results indicate a potential role for CXCR2 and TRPV1 receptors antagonists in inflammation, pain and functional alterations in the bladder after CYP -induced cystitis.