Orientador: Maria Alice Rostom de Mello / Banca: Eliane Stevanato / Banca: Leonardo dos Reis Silveira / Banca: Fúlvia de Barros Manchado Gobatto / Banca: Rodrigo Ferreira de Moura / Resumo: Foi recentemente relatado que a creatina, em sistema de células isoladas, apresenta propriedades antioxidantes contra vários agentes oxidativos. Por sua vez, em concentrações fisiológicas, espécies reativas de oxigênio têm papel importante no aumento da captação muscular de glicose que ocorre durante o exercício e a creatina parece estimular a captação deste açúcar pelo músculo esquelético em resposta ao treinamento físico. Os efeitos metabólicos da suplementação com creatina têm sido frequentemente relatados em certos tipos de esforço, como exercícios intermitentes, de alta intensidade, curta duração e com períodos de recuperação muito curtos. Pouco se conhece a respeito dos efeitos da mesma sobre o desempenho físico em exercícios caráter aeróbio. Assim torna-se interessante avaliar o impacto da creatina sobre a modulação do estado redox no treinamento de caráter aeróbio e possíveis implicações para o metabolismo glicídico muscular e o condicionamento aeróbio. Dessa forma, o presente estudo foi delineado, principalmente, para avaliar o condicionamento aeróbio (Máxima Fase Estável de Lactato- MFEL), biomarcadores de peroxidação lipídica (substâncias que reagem ao ácido tiobarbitúrico- TBARs) e concentrações de peroxido de hidrogênio - H2O2, assim como indicadores da defesa antioxidante (atividade das enzimas superóxido dismustase- SOD, glutationa peroxidase- GSH-GPx catalase- CAT, glutationa reduzida - GSH e oxidada - GSSG) além de aspectos do metabolismo glicídico (captação e oxidação de glicose, síntese de glicogênio e produção de lactato) no músculo esquelético de ratos submetidos ao treinamento físico de caráter aeróbio e suplementados ou não com creatina, por período de oito... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: It was recently reported that creatine in isolated cell system, has antioxidant properties against various oxidative agents. In turn, at physiological concentrations, reactive oxygen species play an important role in increasing glucose uptake by muscles that occurs during exercise and creatine appears to stimulate the uptake of this sugar by skeletal muscle in response to exercise training. The metabolic effects of creatine supplementation have been reported frequently in certain types of exercise, such as intermittent, high-intensity, short duration and with very short recovery periods exercises. Little is known about the effects of creatine supplementation on the physical performance during aerobic exercises. So it is interesting to assess the impact of creatine on the redox state during aerobic exercise training and the possible implications for muscle aerobic glucose metabolism and aerobic fitness. Thus, the present study was designed mainly to assess aerobic fitness (Maximum Lactate Steady-MLSS), lipid peroxidation biomarkers (substances that react TBARs-thiobarbituric acid) and concentrations of hydrogen peroxide - H2O2, as well as antioxidant defense system (activity of the enzymes superoxide dismustase-SOD, glutathione peroxidase GSH-GPx-catalase-CAT, reduced glutathione - GSH and oxidized - GSSG), besides aspects of glucose metabolism (glucose uptake and oxidation, glycogen synthesis and lactate production) in skeletal muscle of rats submitted to aerobic exercise training, supplemented with creatine or not, for a period of eight weeks. Through different series of experiments it was found that: I) The administration of creatine, for different procedures, increased substrate in various body tissues (gastrocnemius muscle, liver and serum), but in different magnitudes, II) physical training by treadmill... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Orientador: Ercy Mara Cipulo Ramos / Banca: Francis Lopes Pacagnelli / Banca: Luis Alberto Gobbo / Resumo: É conhecido que o exercício físico é eficaz no processo de reabilitação de pacientes com doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC), porém o comportamento de variáveis funcionais e expressão inflamatória a partir de treinamento resistido com tubos elásticos com estes pacientes ainda não estão claros na literatura. Objetivos: Avaliar o comportamento da força, capacidade funcional, estresse muscular e expressão inflamatória entre um treinamento resistido realizado com tubos elásticos e em aparelhos de musculação em indivíduos com DPOC. Métodos: Foram avaliados 19 pacientes com DPOC, randomizados em dois grupos: treinamento resistido com tubos elásticos (GR1:n:9) e treinamento resistido com aparelhos de musculação (GR2:n:10). O treinamento foi realizado três vezes semana durante 12 semanas, com intensidade inicial de 2x15 repetições máximas(RM) progressiva até 4x6RM. Inicialmente foi realizada avaliação inicial e avaliação da função pulmonar. A mensuração da força muscular foi realizada por meio de dinamômetro digital; as coletas sanguíneas para análise da expressão inflamatória de TNF-α, IL-6 e PAI-I e das variáveis metabólicas glicose, triacilglicerol (TAG) e colesterol total foram realizadas nos momentos basal, seis semanas e 12 semanas ( 48 horas após a ultima sessão de treinamento); a capacidade funcional foi realizada por meio do Teste de Caminhada de Seis minutos (TC6) (basal e 12 semanas)e o estresse muscular por meio da mensuração de creatina quinase (CK) (basal, 24, 48 e 72 horas após protocolo) Resultados:Houveram ganhos significativos de força muscular e capacidade funcional em ambos os grupos, com ganhos relativos semelhantes... / Abstract: It is known that physical exercise is effective in the rehabilitation process of patients with chronic obstructive pulmonary disease (COPD), but the behavior of functional variables and inflammatory expression from resistance training with elastic tubing are not yet clear in the literature in these patients. Objective: To evaluate the strength, functional capacity, muscle stress and inflammatory expression between a resistance training performed with elastic tubing and weight machines in pacients with COPD. Methods: We evaluated 19 patients with COPD randomized into 2 groups: resistance training with elastic tubing (GR1: n: 9) and resistance training with weight machines (GR2: n: 10). The training was performed 3 times weekly for 12 weeks, with initial intensity of 2x15 RM progressive to 4x6RM. Initially we performed initial assessment and evaluation of lung function.The measurement of muscle strength test were performed using a digital dynamometer; blood sampling for analysis of expression of inflammatory TNF-α, IL-6 and PAI-I and the metabolic variables glucose, triacylglycerol (TAG) and total cholesterol were performed at baseline, 6 weeks and 12 weeks (48 hours after the last training session); the functional capacity was done through the Six-minute walk test (6MWT) (baseline and 12 weeks) and the muscle stress through the measurement of creatine kinase (CK) (baseline, 24, 48 and 72 hours after protocol) Results: There were significant gains in muscle strength and functional capacity in both groups, with similar gain deltas. Significant peak in CK levels was observed 24 hours after the end of training on the GR2 (p = 0.027), but with value within the normal range... / Mestre

Orientador: Leonardo Antonio Mamede Zornoff / Resumo: Introdução: As doenças cerebrovasculares são causas maiores de morbimortalidade no Brasil e no mundo, sendo associadas a enormes custos biopsicossociais. As alterações eletrocardiográficas e cardíacas na fase aguda do acidente vascular cerebral são relacionadas com elevada mortalidade após estes eventos e grande debate existe sobre a gênese destas alterações nesta fase ictal. O eletrocardiograma é método diagnóstico não invasivo capaz de fornecer informações sobre fisiologia e processos patológicos do coração, incluindo eventual influência negativa exercida pelo sistema nervoso autônomo. Objetivo: O presente estudo objetiva avaliar se alterações eletrocardiográficas e enzimáticas na fase aguda do AVC são preditoras de desfecho desfavorável definido por pontuação na escala modificada de Rankin entre 3-6 em 90 dias do evento cerebrovascular. Métodos: Foi realizado estudo prospectivo, com pacientes atendidos no PS de Neurologia do HC-FMB, no período de março de 2012 a março de 2013, com até 24 horas de evolução de AVC, e excluídos aqueles com eventos cardíacos recentes. Foram coletados dados demográficos, história clínica, traçados de eletrocardiograma e dosagens de biomarcadores de necrose miocárdica obtidos na admissão. Associação entre tipo AVC e variáveis categóricas e numéricas foi analisada pelos testes de Fisher e Kruskal-Wallis seguido do teste de Dunn para comparações múltiplas, respectivamente. Associação entre alguma complicação geral ou cardíaca com chance de mau prognóstico neurológico e óbito foi analisada por regressão logística simples. Regressão logística corrigida para sexo, idade, controle da pressão arterial e complicações cardíacas foi utilizada na determinação da associação entre alterações eletrocardiográficas e mau prognóstico neurológico. Resultados: Foram analisados... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Introduction: Cerebrovascular diseases are major causes of morbidity and mortality in Brazil and worldwide, being associated with huge biopsychosocial costs. Electrocardiographic and cardiac abnormalities in the acute phase of stroke are associated with high morbidity and mortality after these events and great debate exists about the genesis of these changes on ictal phase. The electrocardiogram is a noninvasive diagnostic method able to provide information about anatomy, physiology and pathological processes of the heart, including possible negative influence of the Autonomic Nervous System. Objective: This study aims to assess whether electrocardiographic and enzymatic alterations in the acute phase of stroke are predictors of unfavorable outcome defined by scores on the modified Rankin scale of 3- 6 within 90 days of the cerebrovascular event. Methods: A prospective study was conducted with patients treated at the HC-FMB Neurology ED, from March 2012 to March 2013, up to 24 hours of onset of stroke, and excluded those with recent cardiac events. Demographic data, medical history, electrocardiogram tracings and measurements of myocardial necrosis biomarkers obtained on admission were recorded. Association between stroke type and categorical and numerical variables was analyzed by Fisher and Kruskal-Wallis tests followed by Dunn's test for multiple comparisons, respectively. Association between any general or cardiac complication and poor neurological outcome and mortality was analyzed by simple logistic regression. Multiple logistic regression adjusted for sex, age, blood pressure control and cardiac complications was used to determine the association between electrocardiographic abnormalities and poor neurological outcome. Results: 112 patients were analyzed, with a median age of 69 years-old (26 - 93) and mostly male. Hemorrhagic stroke patients had the most... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Resumo: No presente trabalho, a atividade da enzima glicerol quinase (GK; EC 2.7.1.30; ATP: glicerol 3-fosfotransferase), proveniente de extratos de levedura seca de panificação, foi otimizada. A melhor preparação enzimática da GK foi obtida por rompimento celular com esferas de vidro, durante sete minutos, com lise de 54,2% das células. O extrato celular foi parcialmente purificado com 1% de sulfato de estreptomicina, antes da precipitação com igual volume de solução a 30% (m/v) de polietilenoglicol 3350, e posteriormente dialisado. A atividade máxima da GK foi obtida em pH 10,0, a 60ºC e 50mM de substrato, por metodologia clássica. A enzima apresentou alta estabilidade térmica ― a atividade foi completamente mantida até 50ºC, durante uma hora ― e em pH entre 6,0 e 8,0. Além disso, manteve-se estável, por quatro meses, a 4°C, na presença de azida de sódio 0,05% e cloreto de cobalto 10mM, e, por até oito meses, com o extrato liofilizado. Calculados pelos métodos de Lineweaver-Burk, Hanes-Woolf e Eadie-Hofstee, o valor da constante de Michaelis (Km) da enzima variou entre 1,99mM e 3,11mM, e a Vmax, entre 1,14U/mL e 1,19U/mL. Utilizou-se a metodologia de superfície de resposta (MSR) para melhor definição dos parâmetros da reação enzimática, observando-se valores ótimos de atividades a temperaturas entre 52ºC e 56ºC, pH entre 10,2 e 10,5 e concentração de substrato de 150mM a 170mM. A MSR mostrou-se adequada para modelar a reação e maximizar a atividade da glicerol quinase. Este método, de baixo custo, dosa a glicerol quinase em uma seqüência de reações, sendo de grande importância para diversas indústrias, como a de alimentos, açúcar e álcool. / Abstract: In the present study, the activity of the enzyme glycerol kinase (GK; EC 2.7.1.30; ATP: glycerol 3-phosphotransferase) from dry baker's yeast, was optimized. The best enzymatic preparation of GK was obtained by cell disruption with glass beads, for seven minutes, with 54.2% of lysed cells. Cell extract was partially purified with 1% of streptomycin sulphate, before the precipitation with equal volume of a 30% solution (m/v) of polyethylene glycol 3350, and then it was dialyzed. The maximum activity of GK was obtained with pH 10.0, at 60ºC and 50mM of substrate, by the classic methodology. The enzyme presented high thermal stability ― the activity was completely maintained up to 50ºC, during one hour ― and at pH between 6.0 and 8.0. Besides, it was stable, for four months, at 4°C, in the presence of sodium azide 0.05% and cobalt chloride 10mM, and, for up to eight months, with the lyophilized extract. The value of the Michaelis constant (Km) of the enzyme was calculated by the methods of Lineweaver-Burk, Hanes-Woolf and Eadie-Hofstee,and it varied between 1.99mM and 3.11mM, and Vmax, between 1.14U/mL and 1.19U/mL. Response surface methodology (RSM) was used for better definition of the parameters of the enzymatic reaction, being observed higher activity values at temperatures between 52ºC and 56ºC, pH between 10.2 and 10.5 and substrate concentration from 150mM to 170mM. RSM showed to be an adequate approach for modeling the reaction and maximizing the glycerol kinase activity. This low cost method doses glycerol kinase in a sequence of reactions, being of great importance for many industries, like food, sugar and alcohol. / Orientador: Maristela de Freitas Sanches Peres / Coorientador: Edwil Aparecida de Lucca Gattás / Banca: Luis Henrique Souza Guimarães / Banca: Rubens Monti / Mestre

A identificação de novos alvos terapêuticos no tratamento de glioblastomas multiformes (GBMs) se faz necessária devido ao mau prognóstico e ineficiência das terapias associadas a esses tumores. Nesta dissertação, avaliamos o envolvimento do Fator Nuclear kappaB (NFkappaB) e da via da PI3K/Akt no crescimento in vitro de glioblastomas, e o potencial uso dos inibidores de NFkappaB e de PI3K/Akt como possíveis agentes antitumorais. Com esta finalidade foram utilizados os inibidores farmacológicos de NFkappaB (partenolide), e de PI3K/Akt (quercetina e Ly294002), e o inibidor misto de NFkappaB/Akt (curcumina). Os inibidores de NFkappaB causaram uma significativa diminuição na viabilidade dos GBMs quando comparado com os inibidores de outras vias de sinalização (MAPK, MEK/ERK1/2, EGFr e JNK1/2), a qual foi tipo dose resposta. Além disso, os inibidores de NFkappaB apresentaram extravasamento de LDH no meio de cultura e perda de integridade da membrana plasmática que foi vista através da técnica do Iodeto de Propideo (PI). Já os inibidores de PI3K/Akt apresentaram um menor efeito do que o apresentado pelos inibidores de NFkappaB, não demonstrando uma curva do tipo dose resposta, ainda assim, diminuíram a viabilidade dos GBMs. Entretanto, não apresentaram extravasamento de LDH no meio de cultura, e não houve incorporação de PI, mostrando que, diferentemente do que ocorre com os inibidores de NFkappaB, a perda de viabilidade vista nas células tratadas com os inibidores de PI3K/Akt está preponderavelmente relacionada com uma diminuição na proliferação, e não com morte celular. Vimos também que os inibidores foram capazes de alterar o imunoconteúdo de fatores relacionados com morte e sobrevivência celular, tais como caspase 3, LC3 A/B, PARP e Hsp70, assim como o ciclo celular. Portanto, nossos resultados demonstram que a via da PI3K/Akt parece estar preferencialmente relacionada com a proliferação celular, enquanto a via do NFkappaB preferencialmente com sobrevivência. / The identification of new therapeutic targets for treatment of glioblastoma multiforme (GBMs) is necessary due to poor prognosis and ineffective therapies associated with these tumors. In this study we have assessed the role of Nuclear Factor-kappaB (NFkappaB) and the PI3K/Akt pathway in glioblastomas in vitro growth, and their inhibitors as potential antitumor agents. For this we used the pharmacological inhibitors of NFkappaB (Parthenolide), and PI3K/Akt (LY294002 and quercetin), and mixed inhibitor of NFkB / Akt (curcumin). NFkappaB inhibitors yielded a significant decrease in viability of GBMs compared to inhibitors of other signaling pathways (MAPK, MEK/ERK1/2, EGFr and JNK1 / 2), which was dose-dependent. Furthermore, inhibitors of NFkappaB showed LDH releasing in culture medium and membrane integrity losing, evaluated through the Propidium Iodide (PI)-based method. The PI3K/Akt inhibitors showed a smaller effect than NFkappaB inhibitors, also decreasing GBMs viability but playing no dose-dependence response. Despite there was not LDH releasing in culture medium and PI incorporation, showing that the loss of viability observed in cells treated with inhibitors of PI3K/Akt is associated with a decrease in the proliferation, unlike what happens with inhibitors of NFkappaB, no cell death was observed. We have also seen that the inhibitors were able to alter the contents of immune-related factors death and cell survival, such as caspase-3, LC3 A / B, PARP and Hsp70, as well as the cell cycle. Therefore, our results demonstrate that the PI3K/Akt pathway seems to be related to cell proliferation, while the NFkappaB pathway to survival.

O Mal de Alzheimer (MA) foi caracterizado pela primeira vez em 1907 pelo neuropatologista alemão Alois Alzheimer, tendo como sintomas clínicos disfunções cognitivas, fisiológicas, comportamentais, perda de memória, e eventualmente incontinência, demência, acamação e morte. É uma doença neurodegenerativa do sistema nervoso central que costuma afetar, principalmente, indivíduos em faixa etária mais avançada. Este mal é caracterizado microscopicamente pela presença de placas amilóides, que são acúmulos da proteína betaamilóide inter-neurônios, e emaranhados neurofibrilares, formados predominantemente por formas altamente fosforiladas de uma proteína associada aos microtúbulos, Tau, as quais formam massas emaranhadas que consomem o corpo celular neuronal, possivelmente levando à disfunção neuronal e finalmente à morte. MAPK p38? tem sido implicada em dois eventos associados ao MA, fosforilação da Tau e inflamação. MAPK p38? é ativada por uma via de fosforilação dupla em Thr180 e Tyr182. O planejamento de fármacos inibidores de p38? é principalmente focado em pequenas moléculas que competem pelo sítio catalítico do ATP. Aqui, nós utilizamos diferentes técnicas de modelagem molecular e planejamento racional baseado em estrutura e ligantes, tendo como base os inibidores da MAPK p38? descritos na literatura, além das estruturas depositadas no PDB. Como resultado das diferentes abordagens de triagens virtuais utilizadas neste trabalho, tais como \"docking\", farmacóforo, dinâmica molecular, campos de interação molecular, predição de atividade e toxicidade, cálculo de propriedades farmacocinéticas e físico-químicas, foi selecionado um total de 14 compostos que atendem aos critérios adotados de baixa ou nenhuma toxicidade potencial, bom perfil farmacoterapêutico predito, atividades calculadas em valores comparáveis aos obtidos para os compostos de referência, além da manutenção das principais interações observadas para os inibidores mais potentes. Estes compostos podem ser adquiridos para estudos de inibição in vitro frente à enzima MAPK p38?, contribuindo assim na busca de um potencial candidato à fármaco no tratamento do Mal de Alzheimer. / Alzheimer\'s disease (AD) was first characterized in 1907 by the German neuropathologist Alois Alzheimer, whose clinical symptoms includes cognitive, physiological and behavioral dysfunctions, memory loss, eventually incontinence, dementia, and death. It is a neurodegenerative disease of the central nervous system that usually affects individuals group in older age. This is characterized microscopically by the presence of amyloid plaques, which are accumulations of beta-amyloid protein inter-neurons, and neurofibrillary tangles formed predominantly by highly phosphorylated forms of the microtubule-associated protein, tau, which form tangled masses that consume neuronal cell body, possibly leading to neuronal dysfunction and ultimately death. p38? MAPK has been implicated in both events associated with AD, tau phosphorylation and inflammation. p38? MAPK pathway is activated by a dual phosphorylation at Thr180 and Tyr182 residues. The drug design of p38? MAPK inhibitors is mainly focused on small molecules that compete for ATP in the catalytic site. Here, we used different techniques of molecular modeling based on p38? MAPK structure deposited in the PDB and its inhibitors described in the literature. As a result of different virtual screening approaches used in this work, such as \"docking\", pharmacophore, molecular dynamics, molecular interaction fields, activity and toxicity predictions assays, pharmacokinetic properties and physicochemical, was selected a total of 14 compounds that meet these criteria of low or no toxicity potential, good pharmacotherapeutic profile, predicted activities calculated values comparable to those obtained for the reference compounds, while maintaining the main interactions observed for the most potent inhibitors. These compounds should be acquired for in vitro inhibition studies against the enzyme p38? MAPK, thereby helping in the search of a potential drug candidate for the treatment of Alzheimer\'s disease.

A insuficiência cardíaca é uma síndrome clínica de mau prognóstico caracterizada por disfunção cardíaca associada à intolerância aos esforços, retenção de fluído e redução da longevidade. Dentre as serina/treonina quinases associadas às alterações funcionais e estruturais cardíacas observadas na progressão da insuficiência cardíaca, a família das proteínas quinase C (PKC) composta por 12 diferentes isoformas parece modular a contratilidade miocárdica e o remodelamento cardíaco. No presente estudo, caracterizamos o fenótipo cardíaco e o perfil de ativação das diferentes isoformas de PKC na progressão da insuficiência cardíaca de etiologia isquêmica em ratos. Além disso, estudamos o efeito da inibição sustentada da isoforma PKCβII sobre a sobrevida, o remodelamento cardíaco e a função ventricular em modelo de insuficiência cardíaca de etiologia isquêmica. Conseguinte, identificamos possíveis substratos cardíacos da PKCβII envolvidos na progressão da insuficiência cardíaca. Para isso, avaliamos os efeitos agudo e crônico da inibição da PKCβII sobre o transiente de cálcio e a contratilidade de cardiomiócito isolados de ratos adultos com insuficiência cardíaca. Por fim, testamos as inibições específicas das PKCβII e PKCβI na progressão da hipertrofia cardíaca compensada para a insuficiência cardíaca em modelo animal de hipertensão arterial sustentada. Nossos resultados sugerem que a inibição sustentada da PKCβII reverte o quadro de insuficiência cardíaca, melhorando a função ventricular, o remodelamento cardíaco e a sobrevida dos diferentes modelos de insuficiência cardíaca estudados, constituindose em uma estratégia terapêutica celular promissora / Heart failure is a common endpoint for many forms of cardiovascular disease and a significant cause of morbidity and mortality worldwide. Protein kinase C isozymes emerge as important potential therapeutic targets in chronic cardiovascular disease. However, individual PKC isozymes play different roles in the pathogenesis of cardiac diseases. Here, we characterized the cardiac phenotype as well as the different PKC isozyme activation profile during myocardial-induced heart failure progression in rat. Furthermore, we evaluated the role of selective PKCβ II inhibition on survival, left ventricle remodeling and cardiac function in myocardial-induced heart failure. Moreover, we identified the cardiac PKCβII substrates related to heart failure. Finally, PKCβII and PKCβI specific inhibitors were chronically delivered to hypertensive-induced heart failure rats and the cardiac phenotype was evaluated. Our data suggest that 6-wks of PKCβII inhibition, but not PKCβI, improved animal survival by restoring cardiac function and promoting cardiac anti-remodeling effect in both myocardial infarctioninduced heart failure and hypertensive-induced heart failure rats. The improved cardiac function and anti-remodeling effect of PKCβII inhibition seems to be associated with increased contractility of cardiac myocytes, improved miofilaments/Ca2+ sensitivity and decreased cardiac inflammatory response. Altogether, the results provide evidence for beneficial effects of PKCβII specific intracellular inhibition on cardiac function and remodeling, which may be a promising cellular therapy for heart failure treatment

A cana-de-açúcar é uma gramínea com fotossíntese do tipo C4, com capacidade de acumular sacarose nos colmos em quantidades que excedem 50% de seu peso seco, característica única no reino vegetal (Moore, 1995). Sacarose e seu derivado mais importante, etanol, são dois produtos de grande importância mundial. Assim, o teor de sacarose em cana tem fundamental importância no aumento da produtividade dessas duas commodities. O melhoramento clássico parece ter alcançado seu limite, já que incrementos expressivos no teor de sacarose em novas variedades não têm sido observados e tudo aponta para a necessidade de estudos que levem a uma maior compreensão dos mecanismos moleculares associados à produção, transporte e acúmulo de sacarose em cana (Casu et al., 2005; Moore, 1995). Procurar seqüências promotoras de genes de interesse é importante para a obtenção de transgênicos, já que promotores constitutivos não apresentam resultados satisfatórios em cana (Lakshmanan et al., 2005). É também objetivo aqui hibridar mRNA de genótipos de cana-de-açúcar com segregação para acúmulo de sacarose, em uma plataforma customizada de oligos (Agilent), com aproximadamente 44k elementos, que compõe uma representatividade gênica não alcançada em esforços anteriores com microarranjos de cDNA. Genome walking foi a técnica utilizada na obtenção de regiões à montante do primeiro éxon, predito in silico, para três proteínas quinase de interesse, SASGMS11561, SASGMS16343 e SASGMS09047, que se mostraram moduladas em experimentos anteriores de hibridação com amostras segregantes para conteúdo de sacarose. Foi obtido sucesso nos três casos, tendo os fragmentos de DNA sido seqüenciados e oportunamente alinhados à montante dos correspondentes genes ortólogos em sorgo, bem como ao banco ainda em construção de contigs do genoma de cana-de-açúcar, obtidos por shotgun. A plataforma Agilent, com seus 43803 SAS únicos, mostrou-se uma ferramenta muito adequada para as hibridações de genótipos de mais alto Brix contra genótipos de mais baixo Brix. Um total de 569 genes diferencialmente expressos foram obtidos em pelo menos uma das três hibridações realizadas. Um grupo de genes, de diferentes categorias e perfis de modulação, foi validado por PCR em tempo real, obtendo uma taxa de aproximadamente 90%. Apesar do grande número de SAS diferencialmente expressos, por volta de 70% dos mesmos ainda se encontram não categorizados, seja por falta de similaridade de seqüência em bancos de dados de organismos próximos ou pela alta complexidade e esforço prático na cura desse processo de categorização manual. Assim, três fragmentos de seqüências promotoras para três proteínas quinase de interesse foram obtidos e seqüenciados, como parte dos esforços do grupo em formar um catálogo de promotores específicos para cana-de-açúcar. Um grupo de genes foi analisado dos resultados das hibridações por seus papéis relevantes nos processos que levam ao maior teor de sacarose em cana, devidamente corroborados por trabalhos do próprio grupo, bem como de outros / Sugarcane is a C4 plant with the unique characteristic of being capable of accumulating sucrose in its culms in quantities that exceed 50% of its dry weight (Moore, 1995). Sucrose and ethanol are highly valued products in the world of today. Sucrose content is a trait with fundamental importance in the on-going process of increasing productivity of these two sugarcane byproducts. Classic improvement of sugarcane seems to have reached its practical limits, given that it has become increasingly harder to obtain varieties with increased sugar content. This obstacle points towards the necessity of better comprehension of the molecular mechanisms associated to the production, transport and accumulation of sucrose in sugarcane (Casu et al., 2005; Moore, 1995). The search for promoter sequences of genes of interest is crucial for the production of transgenic lines, since the use of constitutive promoters in sugarcane has been highly problematic, leading to unsatisfactory results in most cases (Lakshmanan et al., 2005). Another objective was to hybridize sugarcane genotypes with contrasting sugar content in a customized Agilent oligo platform, containing approximately 44k elements, which signifies the best effort so far regarding gene representativeness. Genome walking was the chosen technique to obtain upstream regions of the first in silico predicted exon of three proteins kinases of interest, SASGMS11561, SASGMS16343 and SASGMS09047, all of them selected from previous hybridization experiments with contrasting sucrose content samples. Success was achieved in all three cases, and the obtained fragments were sequenced and aligned to their respective syntenic region on the sorghum genome as well as on contigs from an increasingly larger bank of genomic sugarcane sequences, from our group, which has been acquired using the shotgun sequencing method. The Agilent platform, with its 43803 unique sugarcane assembled sequences (SAS), has proven valuable as a powerful high scale tool for the hybridization of genotypes with contrasting Brix values (high versus low Brix). A total of 569 differentially expressed genes were obtained from at least one of the three experiments accomplished. A group of genes from different categories and modulation profiles was depicted and validated through real time PCR, with an approximate validation rate of 90%. Although the number of differentially expressed genes is high, around 70% of them is still uncategorized, mostly because of their unique identity and therefore lack of reference organisms to compare with and the high complexity and laboriousness of categorizing them manually. In summary, three promoter fragments from three different protein kinases of interest were obtained and sequenced, as a part of a greater effort to create a sugarcane promoter sequence catalogue. From the hybridization assays, a group of genes were analyzed, due to their putative importance in the processes that lead to a higher sucrose content in sugarcane, also corroborated by previous studies from our group as well as from others.

As doenças metabólicas são Erros Inatos do Metabolismo (EIM) que apresentam diferentes aspectos relacionados com sistemas e órgãos distintos, incluindo o cérebro e o coração. Dentre os EIM, as acidemias orgânicas e as aminoacidopatias são os mais freqüentes. Neste trabalho abordaremos a Deficiência de Guanidinoacetato Metiltransferase (GAMT), uma acidemia orgânica, e a Homocistinúria (HCU), uma aminoacidopatia. A Deficiência de GAMT é caracterizada bioquimicamente por acúmulo de guanidino acetato (GAA) e pela deficiência de creatina. Há evidências mostrando que o GAA pode causar excitotoxicidade e induzir estresse oxidativo. A creatina é uma amina de ocorrência natural com um papel muito importante no metabolismo energético, além de apresentar propriedades antioxidantes per se. A hiper-homocisteinemia é um fator de risco para doenças cardiovasculares, aterosclerose e trombose, no entanto, os mecanismos pelos quais a homocisteína (Hcy) desencadeia essas disfunções não são totalmente compreendidos. A Na+,K+-ATPase e a creatina cinase desempenham um papel fundamental no sistema nervoso central, uma vez que a alteração dessas enzimas, juntamente com a diminuição do metabolismo energético e a indução do estresse oxidativo têm sido associados com algumas doenças neurodegenerativas. Dessa forma, os objetivos desse trabalho serão apresentados em duas partes; como segue: Parte I - Ampliar o conhecimento sobre uma possível estratégia de tratamento dos pacientes afetados pela Deficiência de GAMT, investigando o efeito da administração de creatina sobre alterações causadas pela administração intraestriatal de GAA em ratos adultos; Parte II - Investigar o efeito da hiper-homocisteinemia crônica sobre alguns parâmetros de estresse oxidativo em coração de ratos jovens. Para os modelos experimentais mencionados, foram avaliados parâmetros do metabolismo energético (Na+,K+-ATPase, creatina cinase e complexo II da cadeia respiratória), bem como níveis de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS), atividade de enzimas antioxidantes denominadas superóxido dismutase e catalase, oxidação de 2',7'-diclorofluoresceína (H2DCF), e níveis de nitritos. Também avaliamos o efeito do ácido fólico sobre as alterações bioquímicas provocadas pela Hcy. Os nossos resultados mostram que a administração de creatina preveniu todos os parâmetros alterados pela administração de GAA. Acreditamos que a prevenção causada pela creatina pode contribuir, pelo menos em parte, para uma melhor compreensão dos mecanismos relacionados com o déficit energético e estresse oxidativo presentes na Deficiência de GAMT. Para o modelo experimental de hiper-homocisteinemia severa, os nossos resultados mostram que a administração crônica de Hcy aumentou a lipoperoxidação e a produção de espécies reativas, diminui as defesas antioxidantes enzimáticas e os níveis de nitritos em coração de ratos jovens. A administração concomitante de ácido fólico, preveniu os efeitos da Hcy provavelmente por suas propriedades antioxidantes, indicando que o estresse oxidativo provocado pela Hcy pode ser um mecanismo que contribui, pelo menos em parte, nas alterações cardiovasculares características dos pacientes hiper-homocisteinêmicos. Se confirmado em seres humanos, nossos dados poderão contribuir para a elucidação dos mecanismos cerebrais e cardiovasculares característicos da Deficiência de GAMT e da HCU, respectivamente, e propor terapias adjuvantes para as alterações pertinentes encontradas no cérebro e no coração dos pacientes afetados por essas doenças metabólicas. / Metabolic diseases are Inborn Errors of Metabolism (IEM) that present different aspects related to different systems and organs including the brain and the heart. Among the IEM, the organic acidemias and the aminoacidopathies are the most frequent. In this work we study the guanidinoacetate methyltransferase deficiency (GAMT), an organic acidemia, and the Homocystinuria (HCU), an aminoacid pathology. The GAMT deficiency is characterized biochemically by the accumulation of guanidineacetate (GAA) and creatine deficiency. There are evidences that the GAA can cause excitotoxicity and induce oxidative stress. Creatine is a naturally occurring amine with a very important role in energy metabolism, besides its antioxidant properties per se. Hyperhomocysteinemia is a risk factor for cardiovascular diseases, atherosclerosis and thrombosis, however, the mechanisms by which homocysteine (Hcy) triggers these disorders are not fully understood. The Na+, K+-ATPase and creatine kinase plays a key role in central nervous system, since alteration of these enzymes, together with the decrease of the energy metabolism and induction of oxidative stress have been associated with some neurodegenerative diseases. Thus, the objectives of this study will be presented in two parts, as follows: Part I - To increase knowledge on a possible treatment strategy of patients affected by GAMT deficiency, investigating the effect of creatine administration on changes caused by intrastriatal administration of GAA in adult rats; Part II – To investigate the effect of chronic hyperhomocysteinemia on some parameters of oxidative stress in the heart of young rats. For the experimental models mentioned were evaluated parameters of energy metabolism (Na+, K+-ATPase, creatine kinase and complex II of the respiratory chain), as well as levels of thiobarbituric acid reactive substances (TBARS), antioxidant enzymes called superoxide dismutase and catalase, oxidation of 2 ', 7'-dichlorofluorescein (H2DCF) and nitrite levels. We also evaluated the effect of folic acid on the biochemical changes caused by Hcy. Our results show that administration of creatine prevented all the parameters altered by the administration of GAA. We believe that the prevention caused by creatine may contribute, at least in part, to a better understanding of the mechanisms related to the energy deficit and oxidative stress present in GAMT deficiency. For the experimental model of severe hyperhomocysteinemia, our findings show that chronic administration of Hcy increased lipoperoxidation and reactive species generation, decreases the enzymatic antioxidant defenses and levels of nitrite in the heart of young rats. Concomitant administration of folic acid prevented the effects of Hcy probably by its antioxidant properties, indicating that the oxidative stress induced by the Hcy may be one mechanism that contributes at least in part, on cardiovascular features of hyperhomocysteinemic patients. If confirmed in humans, our data may contribute to elucidating the brain and cardiovascular mechanisms characteristics of the GAMT deficiency and of the HCU, respectively, and to propose adjuvant therapies relevant to the amendments found in the brain and heart of patients affected by these metabolic diseases.

Cistinose é um erro inato do metabolismo, associado ao acúmulo de cistina nos lisossomos, causado pelo efluxo defeituoso de cistina. O acúmulo de cistina provoca uma série de sintomas, dependendo do tecido envolvido. Atrofia cortical é uma possível conseqüência do acúmulo de cistina no córtex cerebral. Contudo, os mecanismos pelos quais a cistina é tóxica para os tecidos estão longe de serem esclarecidos. Considerando que a creatinaquinase é uma enzima tiólica crucial para a homeostasia energética, e que dissulfetos como a cistina podem alterar enzimas tiólicas pela troca tiol/dissulfeto, o objetivo do presente estudo foi investigar o efeito da cistina sobre a atividade da creatinaquinase em homogeneizado total e frações citosólica e mitocondrial de córtex cerebral de ratos Wistar de 21 dias de idade. Nós também fizemos estudos cinéticos e investigamos o efeito da glutationa reduzida, um protetor natural de grupos tiólicos, e cisteamina, a droga usada para o tratamento da cistinose, sobre a atividade da creatinaquinase. Os resultados mostraram que a cistina inibe a atividade enzimática nãocompetitivamente de uma maneira tempo e dose dependente. Resultados mostram ainda que a glutationa preveniu e reverteu parcialmente a inibição causada pela cistina, enquanto a cisteamina preveniu e reverteu completamente aquela inibição, sugerindo que a cistina inibe a atividade da creatinaquinase por interação com os grupos sulfidrílicos da enzima. Devido ao envolvimento da creatinaquinase na homeostasia energética do córtex cerebral, estes resultados sugerem um possível mecanismo para a toxicidade da cistina e também um possível efeito benéfico no uso da cisteamina em pacientes cistinóticos.