<p align="justify">Les glioblastomes sont les tumeurs cérébrales malignes les plus répandues chez l’adulte et l’enfant, et les plus agressives avec une médiane de survie inférieure à quinze mois. Deux caractéristiques biologiques rendent leur traitement particulièrement difficile. Tout d’abord, la capacité d’invasion du parenchyme cérébral par les cellules gliales tumorales rend la résection chirurgicale totale impossible. De plus, ces cellules développent une résistance aux stimuli pro-apoptotiques rendant la plupart des agents chimiothérapeutiques peu efficaces contre ce type de tumeur. Actuellement, le seul agent chimiothérapeutique efficace dans le traitement des glioblastomes est le témozolomide. Malheureusement des mécanismes de résistance acquise peuvent apparaître chez des patients traités avec cette molécule. Nous avons donc étudié ces mécanismes moléculaires de résistance acquise au témozolomide et dans un deuxième temps nous avons tenté de trouver de potentielles molécules susceptibles de lutter contre les gliomes. </p align="justify"><p><p align="justify">Nous avons rendu résistants deux modèles de cellules gliales tumorales au témozolomide par un traitement incrémental durant plusieurs mois. Grâce à une analyse de type Affymétrix, nous avons comparé l’expression de l’ensemble des gènes entre les lignées normales et les lignées rendues résistantes. Deux familles de gènes sont ressorties comme impliquées dans ce processus de résistance :les transporteurs glucose et les aldo-kéto réductase 1C (akr1c). Pour les transporteurs glucose, il se pourrait que leur implication se fasse au niveau du métabolisme des cellules résistantes en permettant d’apporter plus de substrat énergétique et ainsi contourner les effets pro-autophagiques du témozolomide. Dans le cas des akr1c, il semblerait que leur surexpression ait pour but d’augmenter la prolifération des cellules tumorales résistantes. </p align="justify"><p><p align="justify">Nous avons, par la suite, étudié les propriétés anticancéreuses de métabolites fongiques, les phyllostictines, extraites du champignon Phyllosticta cirsii. Quatre métabolites naturels et deux dérivés hémisynthétiques ont été testés démontrant des activités plus ou moins importantes sans toutefois montrer in vitro de biosélectivité entre cellules tumorales et cellules normales. Les phyllostictines semblent se lier au groupement thiol libre comme nous l’avons déterminé sur le glutathion ou la cystéine. Il reste à déterminer la cible des phyllostictines dans les cellules tumorales et à améliorer la sélectivité de ces molécules.</p align="justify"> / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Ce travail a pour objectif d'améliorer la connaissance des mécanismes physiologiques qui président à la tolérance à l'ennoyage du chêne. La principale contrainte de l'ennoyage est un déficit en oxygène (hypoxie). Les réponses à ce stress sont étudiées chez le chêne pédonculé (réputé tolérant) et le chêne sessile (plus sensible), à des stades précoces de développement des semis, en présence des cotylédons. Une période de drainage est incluse pour mimer un ennoyage temporaire. La croissance des semis a été suivie, notamment au niveau de l'architecture racinaire. La contribution de la nutrition azotée (assimilation et allocation) a été évaluée en suivant au préalable le devenir des éléments minéraux azotés dans la rhizosphère. La gestion des réserves glucidiques (amidon et sucres solubles) des organes de réserve (cotylédons) et des organes en croissance lors du développement des semis a été mise en relation avec la tolérance à l'ennoyage des chênes. Il ressort des paramètres de croissance étudiés que l'ennoyage a peu d'effets sur la première vague de croissance foliaire mais inhibe la deuxième vague, alors que la croissance racinaire est particulièrement inhibée. Néanmoins, le chêne pédonculé est capable d'une forte colonisation racinaire des horizons superficiels du sol ennoyé et, après drainage, son aptitude à régénérer des racines est plus efficace que chez le chêne sessile. Dans la rhizosphère, l'ennoyage entraîne un basculement réversible des formes azotées nitrates / ammonium. Les modifications du métabolisme azoté sont globalement similaires entre les deux espèces. L'assimilation de l'azote, via la nitrate réductase et la glutamine synthétase, n'est pas réellement perturbée mais, les deux espèces présentent une carence azotée au niveau foliaire. L'assimilation et l'allocation azotée n'apparaissent pas comme des traits discriminants de la tolérance à l'ennoyage chez ces espèces. Sous ennoyage, l'accumulation totale d'amidon est réduite mais elle reste active dans la partie basale du pivot et dans la tige des deux espèces. Elle est cependant plus élevée chez le chêne pédonculé. L'ennoyage restreint la mobilisation des réserves cotylédonaires d'amidon, notamment chez le chêne pédonculé. L'activité des α amylases cotylédonaires corrobore le taux de mobilisation de l'amidon. La tolérance à l'ennoyage des semis de chêne n'est pas associée à une stimulation de la mobilisation des réserves glucidiques cotylédonaires. Le chêne pédonculé serrait plus économe en glucide que le chêne sessile (faible mobilisation cotylédonaire / stockage d'amidon élevé / meilleure croissance). Cette particularité pourrait constituer un marqueur physiologique important de la tolérance à l'ennoyage chez les chênes.

Introduction: L'homéostasie du cholestérol est indispensable à la synthèse de la testostérone dans le tissu interstitiel et la production de gamètes mâles fertiles dans les tubules séminifères. Les facteurs enzymatiques contribuent au maintien de cet équilibre intracellulaire du cholestérol. L'absence d'un ou de plusieurs enzymes telles que la HMG-CoA réductase, la HSL et l'ACAT-1 a été associée à l'infertilité masculine. Toutefois, les facteurs enzymatiques qui contribuent au maintien de l'équilibre intra-tissulaire du cholestérol n'ont pas été étudiés. Cette étude a pour but de tester l'hypothèse que le maintien des taux de cholestérol compatibles avec la spermatogenèse nécessite une coordination de la fonction intracellulaire des enzymes HMG-CoA réductase, ACAT1 et ACAT2 et la HSL. Méthodes: Nous avons analysé l'expression de l’ARNm et de la protéine de ces enzymes dans les fractions enrichies en tubules séminifères (STf) de vison durant le développement postnatal et le cycle reproductif annuel et dans les fractions enrichies en tissu interstitiel (ITf) et de STf durant le développement postnatal chez la souris. Nous avons développé deux nouvelles techniques pour la mesure de l'activité enzymatique de la HMG-CoA réductase et de celle de l'ACAT1 et ACAT2. En outre, l'immunohistochimie a été utilisée pour localiser les enzymes dans le testicule. Enfin, les souris génétiquement déficientes en HSL, en SR-BI et en CD36 ont été utilisées pour élucider la contribution de la HMG-CoA réductase, l'ACAT1 et l'ACAT2 et la HSL à l'homéostasie du cholestérol. Résultats: 1) HMG-CoA réductase: (Vison) La variation du taux d’expression de l’ARNm de la HMG-CoA réductase était corrélée à celle de l'isoforme de 90 kDa de la protéine HMG-CoA réductase durant le développement postnatal et chez l'adulte durant le cycle reproductif saisonnier. L'activité enzymatique de la HMG-CoA réductase augmentait de façon concomitante avec le taux protéinique pour atteindre son niveau le plus élevé à 240 jours (3.6411e-7 mol/min/μg de protéines) au cours du développement et en Février (1.2132e-6 mol/min/μg de protéines) durant le cycle reproductif chez l’adulte. (Souris), Les niveaux d'expression de l'ARNm et l'activité enzymatique de la HMG-CoA réductase étaient maximales à 42 jours. A l'opposé, le taux protéinique diminuait au cours du développement. 2) HSL: (Vison), l'expression de la protéine de 90 kDa de la HSL était élevée à 180- et 240 jours après la naissance, ainsi qu'en Janvier durant le cycle saisonnier chez l'adulte. L'activité enzymatique de la HSL augmentait durant le développement pour atteindre un pic à 270 jours (36,45 nM/min/μg). Chez l'adulte, l'activité enzymatique de la HSL était maximale en Février. (Souris) Le niveau d’expression de l'ARNm de la HSL augmentait significativement à 21-, 28- et 35 jours après la naissance concomitamment avec le taux d'expression protéinique. L'activité enzymatique de la HSL était maximale à 42 jours suivie d'une baisse significative chez l'adulte. 3) ACAT-1 et ACAT-2: Le présent rapport est le premier à identifier l’expression de l'ACAT-1 et de l'ACAT-2 dans les STf de visons et de souris. (Vison) L'activité enzymatique de l'ACAT-2 était maximale à la complétion du développement à 270 jour (1190.00 CPMB/200 μg de protéines) et en janvier (2643 CPMB/200 μg de protéines) chez l'adulte. En revanche, l'activité enzymatique de l'ACAT-1 piquait à 90 jours et en août respectivement durant le développement et chez l'adulte. (Souris) Les niveaux d'expression de l'ARNm et la protéine de l'ACAT-1 diminuait au cours du développement. Le taux de l'ARNm de l'ACAT-2, à l’opposé du taux protéinique, augmentait au cours du développement. L'activité enzymatique de l'ACAT-1 diminuait au cours du développement tandis que celle de l'ACAT-2 augmentait pour atteindre son niveau maximal à 42 jours. 4) Souris HSL-/ -: Le taux d’expression de l'ARNm et l'activité enzymatique de la HMG-CoA réductase diminuaient significativement dans les STf de souris HSL-/- comparés aux souris HSL+/+. Par contre, les taux de l'ARNm et les niveaux des activités enzymatiques de l'ACAT-1 et de l'ACAT-2 étaient significativement plus élevés dans les STf de souris HSL-/- comparés aux souris HSL+/+ 5) Souris SR-BI-/-: L'expression de l'ARNm et l'activité enzymatique de la HMG-CoA réductase et de l'ACAT-1 étaient plus basses dans les STf de souris SR-BI-/- comparées aux souris SR-BI+/+. A l'opposé, le taux d'expression de l'ARNm et l'activité enzymatique de la HSL étaient augmentées chez les souris SR-BI-/- comparées aux souris SR-BI+/+. 6) Souris CD36-/-: L'expression de l'ARNm et l'activité enzymatique de la HMG-CoA réductase et de l'ACAT-2 étaient significativement plus faibles tandis que celles de la HSL et de l'ACAT-1 étaient inchangées dans les STf de souris CD36-/- comparées aux souris CD36+/+. Conclusion: Nos résultats suggèrent que: 1) L'activité enzymatique de la HMG-CoA réductase et de la HSL sont associées à l'activité spermatogénétique et que ces activités ne seraient pas régulées au niveau transcriptionnel. 2) L'ACAT-1 et de l'ACAT-2 sont exprimées dans des cellules différentes au sein des tubules séminifères, suggérant des fonctions distinctes pour ces deux isoformes: l'estérification du cholestérol libre dans les cellules germinales pour l'ACAT-1 et l'efflux du cholestérol en excès dans les cellules de Sertoli au cours de la spermatogenèse pour l'ACAT-2. 3) La suppression génétique de la HSL diminuait la HMG-CoA réductase et augmentait les deux isoformes de l'ACAT, suggérant que ces enzymes jouent un rôle critique dans le métabolisme du cholestérol intratubulaire. 4) La suppression génétique des transporteurs sélectifs de cholestérol SR-BI et CD36 affecte l'expression (ARNm et protéine) et l'activité des enzymes HMG-CoA réductase, HSL, ACAT-1 et ACAT-2, suggérant l'existence d’un effet compensatoire entre facteurs enzymatiques et non-enzymatiques du métabolisme du cholestérol dans les fractions tubulaires. Ensemble, les résultats de notre étude suggèrent que les enzymes impliquées dans la régulation du cholestérol intratubulaire agissent de concert avec les transporteurs sélectifs de cholestérol dans le but de maintenir l'homéostasie du cholestérol intra-tissulaire du testicule. / Introduction: Cholesterol homeostasis is essential for the synthesis of testosterone in interstitial tissue and the production of fertile gametes in the seminiferous tubules of the testis. Intracelluar cholesterol equilibrium in the testis is delicately maintained and regulated by enzymatic factors. The absence of one or more enzymes (HMG-CoA reductase, HSL and ACAT) has been implicated in the development of male infertility. However, the enzymatic factors that contribute to the maintenance of cholesterol equilibrium have not been investigated. This study is to test the hypothesis that the coordinated function of intracellular enzymes, HMG-CoA reductase, HSL and ACAT isoforms, are the basis of a system that helps to maintain cholesterol equilibrium during spermatogenesis. Methods: We characterized mRNA and protein expression levels of these enzymes in mink seminiferous tubules-enriched fraction (STf) during development and the annual reproductive cycle; or in mouse interstitial tissue-enriched fraction (ITf) and STf during postnatal development. Two novel techniques were developed to measure the HMG-CoA reductase, HSL and ACAT activities in mink and mouse STf. Additionally, immunohistochemistry was used to localize the enzymes in the testis. Finally, HSL knockout (KO) infertile male mice and selective cholesterol transporter (SR-BI, CD36) KO mice were used to elucidate the contribution of HMG-CoA reductase, HSL and ACAT isoforms in testicular cholesterol homeostasis when the enzyme or cholesterol transport system was genetically impeded. Results: 1) HMG-CoA reductase: (In mink STf), HMG-CoA reductase mRNA levels were relatively independent of 90kDa protein expression during development and the seasonal cycle. HMG-CoA reductase activity increased independently of its protein expression and reached maximal values by day 240 (3.6411e-7 mol/min/μg protein) during development and peaked in February (1.2132e-6 mol/min/μg protein) during the seasonal cycle. (In mouse STf), HMG-CoA reductase mRNA levels and enzymatic activity peaked by 42 days before decreasing while the protein levels tended to decrease steadily. 2) HSL: (In mink STf), an increase of 90kDa HSL protein expression by day 180- and 240 after birth as well as in January in seasonal cycle, was not related to the enzyme mRNA expression. HSL activity increased progressively through development and peaked by 270 days (36.45 nM/min/μg); another high HSL activity was shown in February. (In mouse STf), three significant elevations in HSL mRNA levels by day 21, 28, and 35 corresponded to a steady elevation of HSL protein expression throughout development. HSL activity peaked by day 42 but decreased remarkably in the adult. 3) ACAT-1 and ACAT-2: This is the first report to establish the presence of both ACAT-1 and ACAT-2 in the mink and mouse testis. (In mink STf), ACAT-2 activity reached its maximal value at 1190.00 CPMB/200μg protein by day 270 and 2643 CPMB/200μg protein in January. In contrast, ACAT-1 activity peaked by day 90 or in August during the seasonal cycle. (In mouse STf), ACAT-1 mRNA and protein levels were both decreased throughout development; ACAT-2 mRNA levels changes in the opposite direction of the protein levels, increasing throughout development. ACAT-1 activity in STf decreased throughout the development; while ACAT-2 activity increased significantly during development and peaked by day 42. 4) HSL-/- mice: KO HSL gene caused a decrease of HMG-CoA redutase mRNA expression and enzymatic activity in STf. However, ACAT-1 and ACAT-2 mRNA levels and enzymatic activities significantly increased in STf. 5) SR-BI-/- mice: The mRNA expression and activity of HMG-CoA reductase as well as ACAT-1 were statistically decreased in STf; whereas HSL mRNA level and activity were increased. 6) CD36-/- mice: The mRNA expression and activity of HMG-CoA reductase as well as ACAT-2 were significantly decreased in STf; while HSL and ACAT-1 mRNA levels and activities remained constant. Conclusion: These results suggest that 1) Activation of HMG-CoA reductase and HSL is associated with spermatogenetic activity, while the enzymatic activities may not only be regulated transcriptionally. 2) ACAT-1 and ACAT-2 are expressed in different cells of the tubules, suggesting distinct functions for these two closely related enzyme isoforms, with ACAT-1 being related to cholesterol esterification in germ cells and with ACAT-2 being associated with the removal of excessive cholesterol by Sertoli cells during spermatogenesis. 3) Genetically blocking HSL reduced the activity of HMG-CoA reductase while increasing activity of ACAT isoforms, suggesting the turn-off the enzyme in the cholesterol ester cycle may be essential for the accumulation of cholesterol esters in the tubules. 4) The dysfunction of intracellular cholesterol transporters affects regulation of the enzymes (HMG-CoA reductase, HSL and ACAT-1 and ACAT-2), which is presumably in response to compensatory extracellular cholesterol uptake. This study suggests that the enzymes implicated in the regulation of intracellular cholesterol may act cooperatively to maintain cholesterol homeostasis in testis.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Les Méthionine sulfoxyde réductases (Msr) catalysent la réduction spécifique des méthionine sulfoxydes (Met-O) en méthionines (Met). Elles sont impliquées dans la résistance des cellules à un stress oxydant et dans la virulence des bactéries pathogènes du genre Neisseria. Cette famille d'enzyme se compose de trois classes, les MsrA et B, structuralement distinctes, et présentant une stéréosléctivité respectivement pour l'isomère S et R de la fonction sulfoxyde du substrat. Une troisième classe, découverte récemment, et appelée fRMsr, catalyse la réduction spécifique de la forme libre de l'isomère R de la fonction sulfoxyde. La fRMsr appartient à la famille des domaines GAF, généralement impliqués dans la signalisation cellulaire, et les fRMsr représentent le premier domaine GAF présentant une activité enzymatique. Les études réalisées au cours de ma thèse sur la fRMsr de Neisseria meningitidis ont permis de montrer que : 1) fRMsr de N. meningitidis présente un mécanisme catalytique identique à MsrA/B avec la formation d'au moins un pont disulfure intramoléculaire Cys84-Cys118 réduit par la thiorédoxine (Trx) ; 2) La Cys118 est le résidu catalytique sur lequel l'intermédiaire acide sulfénique doit se former ; 3) L'étape réductase est l'étape cinétiquement déterminante du mécanisme à deux étapes conduisant à la formation du pont disulfure Cys84-Cys118. La combinaison de l'analyse des résultats cinétiques, et de la structure tridimensionnelle de la fRMsr de N. meningitidis en complexe avec le substrat ont permis de montrer : 1) L'existence d'un site de reconnaissance oxyanion impliqué dans la stabilisation de la fonction carboxylate ; 2) Un rôle de la fonction carboxylate du résidu Asp143 dans la catalyse de l'étape réductase ; 3) Le résidu Glu125 est impliqué dans la reconnaissance et/ou le positionnement du substrat Met-O probablement via la stabilisation du groupement NH3+ ; 4) Un rôle du résidu Asp141 dans le positionnement des résidus Asp143 et Glu125 ; 5) le noyau indole du Trp62 est impliqué dans la stabilisation du groupe méthyle-[epsilon] / Methionine sulfoxide reductases (Msr) catalyze the specific reduction of methionine sulfoxides (Met-O) into methionine (Met). They are involved in cell defences against oxidative stress and virulence of pathogenic bacteria of Neisseria genius. This family of enzymes consists of three classes, MsrA and MsrB, structurally-unrelated, Specific for the S and the R epimer of the sulfoxide function of the substrate, respectively. A third class, recently discovered and called fRMsr, selectively reduce the free form of the R epimer of the sulfoxide function. The fRMsr belongs to the family of GAF domains, they are usually involved in cell signaling, and fRMsr represent the first GAF domain to show enzymatic activity. The studies of the Neisseria meningitidis fRMsr have shown that: 1) The Neisseria meningitidis fRMsr have a identical catalytic mechanism to MsrA and MsrB with the formation of at least one intramolecular disulfide bond, Cys84-Cys118 reduced by thioredoxin (Trx) ; 2) The Cys118 is demonstrated to be the catalytic Cys on which a sulfenic acid is formed ; 3) The Reductase step is the rate determining step of the mechanism leading to the formation of the disulfide bond Cys84-Cys118. The combination of the biochemical and kinetics data, and the examination of the 3D structure of the N. meningitidis fRMsr in complex with its substrate shown: 1) an oxyanion hole involved in the accommodation of the carboxylate group ; 2) the carboxylate group of the Asp143 residue involved in the catalysis of step reductase, and 3) The Glu125 residue involved in the recognition and/or positioning of the Met-O probably by the stabilization of the NH3+; 4) the Asp141 residue involved in the positioning of Asp143 and Glu125 residues ; 5) the indole ring of the Trp62 residue involved in stabilizing of the epsilon-methyl group

Face aux agressions constantes que subit l’ADN, les cellules ont développé des mécanismes de protection, nommés checkpoints pour maintenir l’intégrité de leur génome. Chez Saccharomyces cerevisiae, la kinase Rad53 joue un rôle central dans ces voies et son activation conduit à de nombreux effets cellulaires tels que le ralentissement du cycle cellulaire, le ralentissement de la réplication, l’activation de la transcription de certains gènes, l’activation de la réparation… Lors d’un crible transcriptomique, utilisant une souche exprimant une forme hyperactive de Rad53, nous avons identifié le gène HUG1 comme l’un des gènes les plus transcrits suite à l’activation de la voie RAD53. Cependant les fonctions de Hug1 demeurent énigmatiques.Pour mieux comprendre les fonctions de Hug1 dans la réponse aux dommages de l’ADN, nous avons recherché ses partenaires physiques et avons identifié les protéines Rnr2 et Rnr4, les deux composants de la petite sous-unité de la Ribonucléotide Réductase (RNR). La RNR est un complexe enzymatique qui catalyse l’étape limitante de synthèse des nucléotides. Nous avons alors cherché à caractériser cette interaction par diverses méthodes. Nous avons ainsi montré que Hug1 est une protéine intrinsèquement désordonnée capable d’interagir physiquement avec la petite sous-unité de la RNR et qu’au moins onze acides aminés de Hug1 sont impliqués dans son interaction avec la RNR. Lors de nos investigations, nous avons observé que le fait d’étiqueter Rnr2 en position C-terminale sensibilisait les souches aux stress génotoxiques et que cette sensibilité était supprimée si on abrogeait la fonction de HUG1, faisant de Hug1 un nouvel inhibiteur de la RNR. Ainsi nous sommes parvenus à proposer un modèle de régulation de la RNR par Hug1. / To maintain genome integrity, cells have developed protection mechanisms, called checkpoints, in response to DNA damage insults. In Saccharomyces cerevisiae, Rad53 protein kinase is one of the major actors in these mechanisms, and its activation triggers several cellular responses such as cell cycle delay, replication delay, transcription modifications, activation of DNA repair pathways… Using an hyperactivative allele of RAD53, we identified HUG1, as one of the most induced gene in a transcriptomic analysis upon RAD53 pathway activation. However Hug1’s functions remains elusive.To better understand Hug1’s functions in DNA damage response, we searched for physical partners and identified Rnr2 and Rnr4 proteins, which are the two small subunits of Ribonucleotide Reductase (RNR). The RNR is an enzymatic complex that catalyses nucleotide reduction, a step limiting for dNTPs synthesis. We next experimentally tackled the Hug1-RNR interaction using various methods. We showed so that Hug1 is a small intrinsically disordered protein able to interact physically with the small RNR subunit and that at least eleven amino acids in Hug1 are involved in this interaction. During our investigations, we observed that C-terminal tagging of Rnr2 sensitizes strains to genotoxics stress and that this sensitivity was suppressed when HUG1’s function is abrogated. Hence, we showed that Hug1 is a negative RNR regulator and propose a model for Hug1’s function.

Mon objectif a consisté à élucider à l'échelle moléculaire le fonctionnement des systèmes enzymatiques complexes impliqués dans des processus de conversion d'énergie chez les êtres vivants. Je m'intéresse en particulier à la compréhension de deux étapes clés du fonctionnement commun à un grand nombre de ces systèmes, à savoir (i) les étapes d'interaction de ces complexes avec les quinones membranaires et (ii) les mécanismes catalytiques au niveau des sites actifs à molybdène. Le système modèle que j'étudie est la nitrate réductase A issue de la bactérie E. coli, en collaboration avec l'équipe du Dr. Axel Magalon (LCB, Marseille). Il permet la respiration anaérobie en catalysant la réduction du nitrate en nitrite et joue un rôle important dans le cycle biogéochimique de l'azote. Ma recherche vise en particulier à identifier les facteurs moléculaires qui permettent d'ajuster la réactivité de ces systèmes. Cela nécessite l'obtention d'informations structurales à l'échelle atomique sur ces complexes macromoléculaires. La stratégie utilisée a consisté dans un premier temps à générer des intermédiaires paramagnétiques clefs du fonctionnement de ces systèmes (radicaux semiquinones ou ion MoV). Puis j'ai caractérisé leurs propriétés rédox par potentiométrie suivie par spectroscopie RPE. Enfin, j'ai utilisé les techniques de spectroscopie RPE impulsionnelle à haute résolution, notamment la spectroscopie de corrélation des sous niveaux hyperfins (HYSCORE) pour sonder l'environnement magnétique local de ces intermédiaires à travers la détection des interactions nucléaires hyperfines et quadripolaires qui sont trop faibles pour être visibles par spectroscopie RPE classique. / The aim of my work is to elucidate at the molecular level the structure and the function of enzymes involved in energy conversion processes in living organisms. In particular, it is focused on the understanding of two important steps found in many of these systems, namely (i) their interaction with membrane quinones acting as electron/proton shuttles and (ii) the catalytic mechanism at the molybdenum active site. The nitrate reductase A (NarGHI) from the bacterium Escherichia coli is used as a model for these studies. This membrane-bound complex reduces nitrate into nitrite during anaerobic respiration and plays therefore an important role in the global nitrogen cycle. The goal of my research is mainly devoted to the identification of the molecular factors tuning the reactivity of this system at the two active sites. For this purpose, I mainly relied on the structural characterization of key paramagnetic intermediates e.g. semiquinone radicals or Mo(V) ion using electron paramagnetic resonance (EPR) spectroscopy in combination with rédox potentiometry. High resolution pulse EPR methods, especially Hyperfine Sublevel Correlation (HYSCORE) spectroscopy, were used to probe their local environment through the detection of hyperfine (and eventually quadrupole interactions) to nearby magnetic nuclei that are otherwise too weak to be measurable in conventional continuous wave EPR spectroscopy.

Cette thèse traite de la biodégradation par les bactéries d'une catégorie de polluants appelés hydrocarbures aromatiques polycycliques ou HAP. La bactérie Mycobacterium sp. 6PY1 a été isolée d'un sol pollué pour sa capacité à utiliser un HAP à 4 cycles, le pyrène, comme seule source de carbone et d'énergie. Pour comprendre comment le pyrène est métabolisé, l'identification des enzymes impliquées a été entreprise par une approche protéomique. Cette approche a notamment mis en évidence dans la souche 6PY1 deux arène dioxygénases, enzymes susceptibles de catalyser l'attaque initiale du pyrène. L'objectif de cette étude consistait à cloner les gènes de structure des arène dioxygénases identifiées chez Mycobacterium 6PY1, à surexprimer ces gènes en système hétérologue pour faciliter la purification des enzymes correspondantes, et à déterminer les propriétés biochimiques et catalytiques de ces enzymes. Les gènes pdoA1B1 codant la composante terminale d'une dioxygénase ont été clonés et surexprimés chez E. coli. Les propriétés catalytiques de cette enzyme, appelée Pdo1, ont été déterminées in vivo en dosant les produits d'oxydation de HAP composés de 2 à 4 cycles par chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse (CPG/SM). L'analyse de la sélectivité de l'enzyme, déterminée de cette façon montre que Pdo1 oxyde préférentiellement des HAP à 3 ou 4 cycles, comme le phénanthrène et le pyrène, mais n'attaque pas les di-aromatiques comme le naphtalène et le biphényle. La protéine Pdo1 s'est révélée instable et n'a été purifiée que sous forme inactive. Les gènes de structure d'une seconde composante dioxygénase ont été repérés dans un locus comportant deux autres gènes cataboliques. Les gènes pdoA2B2 codent pour une enzyme, appelée Pdo2, montrant une spécificité étroite vis-à-vis des HAP à 2 ou 3 cycles aromatiques et une nette préférence pour le phénanthrène. La protéine Pdo2 purifiée est un hexamère de type α3β3, possédant des centres [2Fe-2S] de type Rieske qui lui confèrent un spectre d'absorbance caractéristique. Des gènes susceptibles de coder pour une troisième dioxygénase ont été découverts dans le génome de Mycobacterium sp. 6PY1. Ces gènes sont très proches en séquence de ceux codant pour Pdo1, suggérant que la bactérie synthétise deux iso-enzymes capables d'oxyder le pyrène. Le fonctionnement des arène dioxygénases requiert deux protéines transporteurs d'électrons de type ferrédoxine et réductase. Celles qui sont associées aux enzymes Pdo1 et Pdo2 n'ont pas été identifiées. Cependant, l'activité des deux dioxygénases de la souche 6PY1 a été stimulée in vivo en co-exprimant dans E. coli des gènes accessoires recrutés d'autres bactéries. Enfin, des expériences d'immunodétection à l'aide d'anticorps spécifiques ont montré que les enzymes Pdo1 et Pdo2 sont co-induites en présence de HAP mais ne sont pas régulées de la même manière en fonction des conditions de croissance.