Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Curso de Pós-Graduação em Farmacologia / Made available in DSpace on 2012-10-17T15:50:53Z (GMT). No. of bitstreams: 0Bitstream added on 2014-09-25T16:17:19Z : No. of bitstreams: 1 181088.pdf: 2123229 bytes, checksum: 78d387e89fa7d5dfc4be12dae9ed8ba8 (MD5) / O presente trabalho investigou o substrato neuroanatômico e o envolvimento dos receptores taquicinérgicos NK1 e NK2 na área de maior relevância para o efeito ansiogênico induzido pela SP em ratos avaliados no teste do labirinto em cruz elevado (LCE). Nossos dados mostram que os ratos tratados com SP 10 pmol no septo lateral (SL) expressaram reações de defesa extremas no teste do LCE e na arena, denominadas como respostas de "freezing" e "darting", respectivamente, sendo essa ação muito mais evidente nessa área do que quando a SP foi injetada na região amigdalar ou no ventrículo lateral. Por outro lado, a injeção intra-septal de FK 888 (100 pmol), antagonista NK1, ou de SR 48968 (100 pmol), antagonista NK2, no SL, seguido da injeção de SP (10 pmol) no ventrículo lateral foi capaz de inibir as respostas aversivas induzidas pela injeção intracerebroventricular de SP. Estes resultados sugerem que o septo lateral parece ser um substrato neuroanatômico muito importante na mediação dos efeitos do tipo ansiogênico da SP e que os receptores NK1 e NK2 possuem um papel importante na mediação deste efeito.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências Médicas, Florianópolis, 2010 / Made available in DSpace on 2012-10-25T10:44:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 292555.pdf: 4664599 bytes, checksum: 4cd19d2f257f385a9d47c7b963f0b26c (MD5) / Os receptores de estrogênio (RE) são difusamente distribuídos no sistema nervoso central e estão envolvidos com neuroplasticidade. O papel dos RE nos processos epileptogênicos ainda são desconhecidos. Nós investigamos a expressão dos RE por imunoistoquímica no hipocampo e no neocórtex de ratos machos adultos (n= 3-4 por grupo) submetidos ao modelo de status epitepticus (SE) induzido pela pilocarpina. Em comparação ao respectivo grupo controle, a expressão do RE aumenta significativamente nos neurônios das subregiões do hipocampo CA1, CA2, CA3 e giro denteado apos 1h (fase aguda), 12h (período tóxico) e 5 dias (período silente) apos a indução do SE. Em todas estas regiões, exceto em CA3, a expressão do RE retorna aos níveis do controle 50 dias após o SE. Na fase crônica, houve uma tendência (p = 0,07) de um leve aumento na expressão do RE na região CA3 de animais submetidos ao SE em comparação ao grupo controle. No neocórtex parietal a expressão dos RE encontra-se aumentada 1h e retorna ao nível do controle em 12h, 5 e 50 dias apos a indução do SE. O aumento da expressão do RE é variável de acordo com o tempo e a região do cérebro analisada. Adicionalmente, os neurônios fortemente marcados para RE não coraram para Fluoro-Jade (um marcador de degeneração neuronal), sugerindo uma associação entre RE e neuroproteção. Nossos achados demonstraram alterações na expressão do RE relacionadas ao tempo e a localização cerebral no hipocampo e neocórtex de animais submetidos ao modelo da pilocarpina.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Farmacologia, Florianópolis, 2010 / Made available in DSpace on 2012-10-25T11:20:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 285138.pdf: 764341 bytes, checksum: 9418929b331c961d948cf3ff186fed83 (MD5) / O objetivo do presente trabalho foi o de estender e confirmar a ação antinociceptiva do (-)-linalol, bem como do envolvimento do sistema glutamatérgico e dos receptores de potencial transitório (TRP) no seu mecanismo de ação antinociceptivo em camundongos. O (-)-linalol administrado via sistêmica (intraperitoneal ou oral), central (intratecal) ou periférica (intraplantar) inibiu, de maneira dependente da dose, a nocicepção induzida pelo glutamato. Além disso, o (-)-linalol foi capaz de reduzir a nocicepção causada pela injeção intratecal de agonistas iGluRs (NMDA, AMPA e cainato), citocinas pró-inflamatórias (IL-1? e TNF-?) e SP. Entretanto, não preveniu a nocicepção induzida pelo trans-ACPD, agonista mGluR. Por outro lado, o (-)-linalol também inibiu a nocicepção induzida pelo cinamaldeido (CA, agonista TRPA1) e somente uma dose alta de (-)-linalol (200 mg/kg) foi capaz de inibir a nocicepção induzida pela capsaicina (agonista TRPV1). Além disso, o (-)-linalol inibiu a hipernocicepção mecânica, mas não a hipernocicepção térmica (quente), induzida pelo CA (i.pl.). A injeção i.pl. de glutamato induziu nocicepção em animais com deleção gênica TRPA1-/- de maneira equivalente àquela observada em camundongos selvagens, sendo que a nocicepção induzida pelo glutamato em animais TRPA1-/- foi também reduzida pelo (-)-linalol. O MK801 (antagonista de receptores NMDA) foi capaz de inibir a nocicepção induzida pelo CA e, interessantemente, a co-administração de doses sub-efetivas de (-)-linalol e de MK801 promoveram redução significativa da nocicepção induzida pelo CA. Usando a técnica de imagens de Ca+2, observou-se que o (-)-linalol inibiu o aumento da [Ca+2]i induzido pelo agonista TRPA1 (alil isotiocianato) em células CHO transfectadas com TRPA1. Porém, apenas a maior dose inibiu o aumento da [Ca+2]i induzido pela capsaicina em cultura de células CHO transfectadas com TRPV1. Em cultura de neurônios do GRD, a adição de (-)-linalol (500 µM) ao sistema causou um aumento na [Ca+2]i tanto em neurônios sensíveis quanto insensíveis aos agonistas TRPs (mentol, alil isotiocianato e capsaicina). Entretanto, doses menores de (-)-linalol (100 e 250 µM) foram capazes de reduzir o aumento da [Ca+2]i em neurônios do GRD induzido pelo AITC, sendo que esta resposta não foi bloqueada pela infusão de MK801. O (-)-linalol (500 µM) também foi capaz de reduzir o aumento da [Ca+2]i induzido pelo glutamato em cultura de neurônios do corno dorsal da medula espinhal. É importante mencionar que o (-)-linalol foi também efetivo em modelos de dor crônica. Assim, o (-)-linalol foi capaz de reduzir a hipersensibilidade mecânica e térmica (frio), bem como o edema de pata, induzida pelo CFA. Contudo, o (-)-linalol não foi capaz de reduzir a hipersensibilidade mecânica induzida pelo CFA em animais TRPA1-/-, sugerindo que o efeito do (-)-linalol na hipersensibilidade mecânica parece envolver os canais TRPA1. Na neuropatia induzida pela ligação parcial do nervo ciático, o (-)-linalol também foi eficiente em atenuar a hipersensibilidade mecânica. Portanto, o presente trabalho estende os dados descritos na literatura e demonstra que o (-)-linalol é eficaz em vários modelos de dor aguda e crônica, sendo, então, uma molécula interessante para o desenvolvimento de fármacos terapêuticamente úteis no controle de estados de dor, principalmente estados de dor crônica. / The objective of the present work was to extend and confirm the antinociceptive action of (-)-linalool, as well the involvement of glutamatergic system and transient receptor potential (TRP) channels in the mechanism (s) underlying the antinociceptive action of (-)-linalool. (-)-Linalool administered by systemic, central or peripheral routes inhibited, dose-dependent, the nociception induced by glutamate and the nociception induced by intrathecal injection of iGluRs agonists (NMDA, AMPA and kainate), pro-inflammatory cytokines (IL-1? e TNF-?) and SP. This compound also inhibited the nociception induced by cinnamaldehyde (CA, TRPA1 agonist) and only the highest dose of (-)-linalool (200 mg/kg) was able to inhibit the nociception induced by capsaicin (TRPV1 agonist). Moreover, (-)-linalool inhibited the mechanical hypersensitivity, but it did not reduce the thermal hypersensitivity, induced by CA (i.pl.). MK801 (NMDA antagonist) was able to inhibit the nociception induced by CA and, interestingly, sub-effectives doses of (-)-linalool co-administered with MK801 promoted significant reduction of CA-induced nociception. We observed that (-)-linalool inhibited the [Ca+2]i increase induced by TRPA1 agonist (AITC, allyl isothiocyanate) in CHO cells. In DRG neurons, (-)-linalool inhibited the [Ca+2]i increase by AITC, not being blocked by MK801. Also, (-)-linalool was able to reduces [Ca+2]i increased induced by glutamate in cultured dorsal horn neurons. It is important to mention that (-)-linalool was effective in pain chronic models. Therefore, (-)-linalool was able to reduce mechanical and thermal (cold) hypersensitivity induced by both CFA and nerve injury, but did not reduce the mechanical hypersensitivity induced by CFA in TRPA1-/-. So, this study adds information about the antinociceptive action of (-)-linalool and indicates that (-)-linalool might be potentially interesting in the development of new clinically relevant drugs for the management of persistent pain.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Farmacologia / Made available in DSpace on 2012-10-26T00:16:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 299102.pdf: 1115675 bytes, checksum: 1561537b124aa393233ecf22c382c035 (MD5) / Os sistemas endocanabinóide e adenosinérgico, através dos receptores A1 e CB1, compartilham uma série de características. Ou seja, ambos os receptores ativam proteínas Gi/o para mediar suas principais ações, inibem a liberação de diferentes neurotransmissores e são expressos em grandes concentrações no córtex, hipocampo e cerebelo. Além disso, agonistas dos dois receptores prejudicam processos relacionados à memória espacial enquanto que antagonistas induzem melhora cognitiva. Apesar das semelhanças entre os dois sistemas e da importância da memória espacial na fisiopatologia de diferentes doenças, poucos estudos avaliaram a possível interação entre ambos os sistemas no controle da memória espacial. Desta forma o objetivo deste trabalho foi avaliar a interação entre os sistemas adenosinérgico e endocanabinóide, através dos receptores A1 e CB1, na modulação da memória espacial. Para isso validou-se o modelo da localização de objetos em camundongos, o qual pareceu sensível a drogas amnésicas ou pró-mnemônicas. Além disso, demonstrou-se que a região CA1 do hipocampo participa da aquisição da memória de localização de objetos em camundongos. Posteriormente, utilizou-se o modelo recém validado e o labirinto aquático para avaliar o efeito pró-mnemônico da co-administração de antagonistas dos receptores A1 e CB1. Esta interação melhora o aprendizado de camundongos em doses até 20 vezes menores do que aquelas utilizadas para produzir o mesmo efeito quando administradas isoladamente. Na sequência demonstrou-se que as ações da co-administração são mediadas, pelo menos em parte, pela liberação de glutamato e a interação deste com os receptores NMDA no hipocampo e no córtex pré-frontal. No último grupo de experimentos, demonstrou-se que os receptores A1 e CB1 do hipocampo interagem para modular a amnésia induzida por agonistas de ambos. Ou seja, o efeito amnésico do agonista A1 é bloqueado pelo antagonista CB1, enquanto que o prejuízo de aprendizado induzido pelo agonista CB1 é atenuado pelo agonista A1. Sugerindo que tanto o tônus adenosinérgico quanto o endocanabinóide interagem para a modulação da amnésia induzida por agonistas dos receptores CB1 e A1, respectivamente. Por fim, conclui-se que os sistemas adenosinérgico e endocanabinóide, através de seus receptores A1 e CB1, interagem para o controle de processos associados à memória espacial de camundongos. / The adenosinergic and endocannabinoid systems share different characteristics through the A1 and CB1 receptors. For example, both are densely expressed in areas such as the cerebellum, prefrontal cortex, and hippocampus. The binding of agonists to them activates Gi/o proteins and similar mechanisms of signal transduction. Functionally, A1 and CB1 receptor activation inhibits the release of different neurotransmitters. In animal models of spatial learning, A1 and CB1 receptor agonists and antagonists have been reported to impair and to facilitate learning and memory, respectively. Despite these evidences, there are no studies evaluating the interaction between both systems in spatial memory processes. Initially, we have done a pharmacological validation of the object-location task in mice. This task is sensitive to amnesic and pro-mnemonic drugs, and the expression of memory seems to be dependent on the CA1 hippocampus. In a second set of results, we have shown that coadministration of subeffective doses of A1 and CB1 antagonists improves acquisition of spatial learning evaluated either in the water maze or in the object-location task. This effect was dependent on glutamate release into the hippocampus and prefrontal cortex. The blockade of NMDA receptors in the CA1 hippocampus and prefrontal cortex counteracts the effects of the coadministration evaluated in the object-location task. This suggests that the simultaneous blockade of the adenosinergic and endocannabinoid tonuses might enhance memory, and that the mechanism of this effect is dependent on glutamate release into the hippocampus and prefrontal cortex. The last group of experiments evaluated the interaction between A1 and CB1 receptors in the amnesia induced by the agonists of both. The result suggests that the amnesia induced by an A1 agonist is blocked by a CB1 receptor antagonist. On the other hand, the learning deficits induced by the CB1 receptor agonist are attenuated by the A1 receptor activation. This suggests that the adenosinergic and endocannabinoid systems might modulate amnesia induced either by A1 or CB1 agonists. Finally, these results also suggest that the adenosinergic and endocannabinoid systems interact to modulate behavioral processes associated with spatial memory.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Neurociências, Florianópolis, 2011 / Made available in DSpace on 2012-10-26T03:48:38Z (GMT). No. of bitstreams: 0Bitstream added on 2013-07-16T20:45:47Z : No. of bitstreams: 1 290970.pdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Neste estudo investigamos os efeitos da injeção intracerebroventricular (icv) de BRL37344 (agonista seletivo de receptores ß3-adrenérgicos, nas doses de 2 e 20 nmol), e SR59230 A (antagonista seletivo de receptores ß3-adrenérgicos, nas doses de 10 e 50 nmol) sobre a ingestão de alimento em ratos submetidos ao jejum de 24 horas. Os animais também foram previamente tratados por via ICV com o veículo ou o antagonista do receptor ß3-adrenérgicos (SR59230A na dose de 50 nmol), administrados 10 min antes da injeção ICV do agonista ß3-adrenérgicos (BRL37344 na dose de 20 nmol) ou veículo, com o objetivo de determinar a seletividade dos efeitos provocados pelo BRL37344 e SR59230A sobre ingestão de alimentos e avaliação de risco. Após as injeções, cada animal foi colocado na caixa de registro para avaliar os comportamentos ingestivos e não-ingestivos, como a avaliação de risco. Os resultados mostraram que a injeção ICV de BRL37344 na dose de 20 nmol provoca redução no consumo de alimento 1h após o tratamento. O tratamento ICV com ambas as doses de SR59230A diminuiu a freqüência de avaliação de risco. A injeção prévia via ICV de SR59230A aboliu a resposta hipofágica induzida pelo BRL37344. A presença do agonista do receptor ß3-adrenérgico suprimiu a redução na frequência de avaliação de risco, um comportamento relacionado à ansiedade, que neste estudo foi provocada pelo antagonista SR59230A de receptores ß3-adrenérgicos . A duração, a freqüência e latência para iniciar a alimentação, bem como a duracão e a frequência dos outros comportamentos não ingestivos não foram afetados pelos diferentes tratamentos. Esses resultados, demonstram que a resposta hipofágica provocada pelo BRL3744 é seletivamente mediada por receptores ß3-adrenérgicos encontrados no sistema nervoso central e além disso, sugerem a participação desses receptores adrenérgicos nos circuitos neurais centrais que controlam o comportamento de ansiedade. / Involvement of â3- adrenergic receptors in the control of food intake in rats (dissertation). Florianopolis; Masters in Neurosciences, Universidade Federal de Santa Catarina, 2011. This study examined the alteration in food intake evoked by intracerebroventricular (icv) injection of BRL37344 (a selective agonist of â3-adrenergic receptors) in 24 h-fasted rats at the doses of 2 nmol and 20 nmol. The effects on food intake of icv injection of SR59230A (a selective antagonist of â3-adrenergic receptors) at the doses of 10 nmol and 50 nmol was also investigated. The icv injection of saline (vehicle) was used as control. The animals were also treated with the VEH or with the antagonist of â3-adrenergic receptor (SR59230A at a dose of 50 nmol) administered icv 10 min before the injection of the â3- adrenergic agonist (BRL37344 at the dose of 20 nmol) or the VEH, in order to determine the selectivity of the effects evoked by the adrenergic agonist on food intake or the selectivity of the effects evoked by the antagonist on risk assessment behavior. The results showed that the icv injection of BRL37344 at the dose of 20 nmol evoked a reduction in food intake 1 h after the treatment .While the icv injetion with both doses of SR59230A failed to affect food intake, this treatment reduced the frequency (number/30 min) of risk assessment , an ethological parameter related to anxiety. Pretreatment with SR59230A abolished the hypophagic response induced by BRL37344. On the other hand, the â3-adrenergic receptor agonist suppressed in the reduction in frequency of risk assessment caused by the antagonist of these receptors. Feeding duration, frequency and latency to start feeding were not affected by the different treatments. These results show that the hypophagic response caused by BRL3744 is selectively mediated by â3 adrenergic receptors found in the central nervous system. Moreover, they suggest the involvement of these receptors in the central circuits that control anxiety.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina. Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Neurociências. / Made available in DSpace on 2012-10-22T22:52:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 226540.pdf: 2004432 bytes, checksum: b7d3aba93332fe51901667638c91c74a (MD5) / Neste estudo foi avaliado o efeito de GMP ou Guanosina em três diferentes situações: o efeito trófico sobre astrócitos em cultura, o efeito direto sobre neurônios em cultura e a influência de fatores tróficos liberados no meio de cultura durante o pré-tratamento dos astrócitos com GMP ou guanosina, sobre neurônios em culturas.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências da Saúde. Programa de Pós-Graduação em Farmacologia. / Made available in DSpace on 2012-10-23T13:57:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 243424.pdf: 1240520 bytes, checksum: 3b288558382f6a4199b323f0be477200 (MD5)

Orientador: Agnaldo Bruno Chies / Coorientador: Oduvaldo Câmara Marques Pereira / Banca: Liliam Fernandes / Banca: Carlos Alan Cândido Dias Junior / Banca: André Sampaio Pupo / Banca: Osni Lázaro Pinheiro / Resumo: As repercussões fisiológicas da redução a longo prazo dos níveis plasmáticos de testosterona têm sido sistematicamente estudadas, uma vez que retratam algumas situações clínicas comumente observadas em homens, tais como o hipogonadismo e o envelhecimento. Um dos importantes alvos das ações androgênicas é o sistema cardiovascular. Particularmente, existe uma importante lacuna de conhecimento em relação à ação da testosterona em leitos venosos. Observamos anteriormente que a orquidectomia promove aumento das ações vasomotoras da fenilefrina em veia porta de rato e que mecanismos relacionados à endotelina-1 poderiam estar envolvidos neste fenômeno. Assim, o objetivo do presente trabalho foi estudar a influência da orquidectomia, seguida ou não de reposição hormonal com testosterona, sobre as respostas vasomotoras de diferentes veias isoladas de rato a agonistas simpatomiméticos. Para isto, utilizaram-se ratos Wistar machos adultos controles e orquidectomizados, seguidos ou não de reposição hormonal (propionato de testosterona, 10mg/kg, i.p., por 3 semanas, com intervalo de 5 dias entre as doses). Destes animais, anéis (4-5 mm) de veias pulmonar, renal, femoral, mesentérica, assim como de artérias, pulmonar, femoral, mesentérica, aorta torácica e abdominal foram estudados em cubas de órgão isolado. Obtiveram-se curvas concentração-resposta para fenilefrina, noradrenalina, clonidina, metoxamina, assim como para endotelina-1, calculando-se pEC50 e resposta máxima (Rmax). Além disso, determinou-se a expressão do mRNA para endotelina-1 e para os receptores ETA e ETB. Os resultados mostraram que a orquidectomia seguida ou não de reposição hormonal não alterou a capacidade contrátil de veia porta frente à clonidina e metoxamina, tampouco frente à noradrenalina na presença de timolol... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The physiological repercussions of a long term reduction in testosterone levels have been systematically investigated, once it can be related with some clinical situations frequently seen in men such as hypogonadism and aging. One of the most important targets of androgen actions is the cardiovascular system. However, androgenic actions upon this system remain controversial especially in venous bed. We have previously observed that orchidectomy induces an increase in vasomotor responses of phenylephrine in rat portal vein. Probably mechanisms related to endothelin-1 could be involved in this phenomenon. Thus, the presented study aimed to investigate the influence of orchidectomy, followed or not by testosterone replacement, upon the response of different isolated veins to sympathomimetic agonists. In this manner, we used control and orchidectomized adult male Wistar rats, with the latter group followed or not by testosterone replacement (testosterone propionate, 10mg/kg, i.p., for 3 weeks, with 5-day intervals between the doses). Rings (3-4 mm) of pulmonary, renal, femoral and mesenteric veins and pulmonary, femoral and mesenteric arteries, as well as thoracic and abdominal aorta were studied in organ baths. Concentration-response curves were obtained to phenylephrine, norepinephrine, clonidine, methoxamine, and to endothelin-1. The maximum response (Rmax) and EC50 were calculated. Furthermore, we determined the mRNA expression of endothelin-1 and the ETA and ETB receptors. The results showed that orchiectomy, followed or not by testosterone replacement did not alter the contractile response of portal vein to clonidine and methoxamine, either face to noradrenaline in the presence of timolol (10-6M) or timolol (10-6M) + yohimbine (10-6M). However, although modifications of portal vein responses to endothelin-1 were not induced by orchidectomy... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Memoria para optar el título de Bioquímico / Los receptores tipo Toll (TLR) son proteínas de transmembrana que reconocen patrones moleculares asociados a patógenos (PAMPs). El TLR2 reconoce PAMPs de bacterias gram positivas, los cuales activan una vía de señalización clásica que involucra el reclutamiento de la proteína MyD88 y una alternativa donde participa la Fosfoinositol 3-Quinasa (PI3K). A su vez, los glucocorticoides (GCs) son moléculas que suprimen la inflamación y la inmunidad adaptativa, que recientemente han sido reportadas como potenciadoras de la expresión de ciertas moléculas de la inmunidad innata, tales como el TLR2. La importancia de PI3K y los GC en la regulación de la vía alternativa del TLR2 no ha sido estudiada aún. El objetivo general fue determinar la participación de PI3K en la producción de TNFα inducida por agonistas del TLR2 y GCs. Los objetivos específicos fueron: 1) Analizar el efecto de Pam3Cys-Ser-Lys4 un lipopéptido sintético análogo a la porción NH2-terminal de lipoproteínas de bacterias gram positivas, y Dexametasona, sobre la secreción de TNFα y la activación transcripcional de NFκB, en células A549. 2) Estudiar la participación de PI3K-Akt en la ruta de señalización del TLR2 inducida por Pam3Cys-Ser-Lys4 y Dexametasona. 3) Determinar la interacción entre TLR2-PI3K y GR-PI3K. Los resultados obtenidos muestran que la activación del TLR2 por Pam3Cys-Ser- Lys4 provocó un aumento en la expresión de TNFα y la activación transcripcional del TLR2, sin embargo el co-tratamiento con Dexametasona no alteró el efecto del agonista del TLR2. Al mismo tiempo, PI3K aumenta la expresión de TNFα e inhibe la transcripción del TLR2, al usar un dominante negativo para PI3K (p85-DN). PI3K activa la transcripción de genes que responden a la movilización de NFκB y AP-1, ya que células expuestas a Pam3Cys-Ser-Lys4 y que expresan el constructo p85-DN, presentan una disminución significativa de la activación transcripcional de NFκB y APLos resultados indicaron que Pam3Cys-Ser-Lys4 aumentó significativamente la fosforilación de Akt, como un indicador indirecto de la actividad de PI3K, y Dexametasona la revirtió. Por otra parte, se determinó la interacción entre p85 con el GR o el TLR2, siendo la primera modulada exclusivamente por Dexametasona. Estos resultados demuestran que PI3K presenta diversos mecanismos de regulación en la vía de señalización del TLR2 y además proponen mecanismos por los que los GCs intervienen en la ruta transduccional / Toll-like receptors (TLRs) are transmembrane proteins that recognize pathogenassociated molecular patterns (PAMPs). TLR2 identify PAMPs from gram positive bacteria, which activate a classical signaling pathway involving MyD88 recruitment to the receptor intracellular domain, and an alternative signaling pathway, which comprises the activation of the phosphoinositol 3-kinase (PI3K). Moreover, glucocorticoids (GCs) suppress the inflammation and adaptive immune responses, and have been recently reported to enhance the TNFα-induced expression of TLR2. The relevance of GCs in the regulation of the alternative pathway has not yet been described. The general aim of this thesis was to determine PI3K participation on TNFα production induced by TLR2 agonists in the presence or absence of GCs. The specific aims were: 1) To analyze the effect of Pam3Cys-Ser-Lys4, a specific synthetic ligand analogue to the NH2-terminal portion of gram positive bacterial lipoproteins, and Dexamethasone, a synthetic GC, on TNFα expression and NFκB transcriptional activation,in A549 cells. 2) To study the role of PI3K-Akt in the TLR2 signaling pathway induced by Pam3Cys-Ser-Lys4 in the presence or absence of Dexamethasone. 3) To determine the interaction between TLR2-PI3K and GR-PI3K. The results show that TLR2 activation by Pam3Cys-Ser-Lys4 promotes TNFα expression and TLR2 transcriptional activity, however co-treatment of cells with Pam3Cys-Ser-Lys4 and Dexamethasone did not revert TNFα increase. In relation to this pathway, we investigated if PI3K was involved in TNFα expression and TLR2 transcription activity regulation. Pam3Cys-Ser-Lys4 significantly increased Akt phosphorylation, as an indicator of PI3K activity, and Dexamethasone reverted to it. Moreover, by using a PI3K regulatory subunit dominant negative mutant cDNA (p85-DN) transiently expressed in cells, a remarkably decrease in NFκB and AP-1 transcriptional activation was observed. On the other hand, we determined p85 regulatory PI3K subunit interaction with GR or TLR2, and we were able to identify interaction between p85-GR in the presence of Dexamethasone. These results demonstrate that PI3K shows different mechanism of regulation in the TLR2 signaling and propose pathways in which GCs may be participating

Memoria para optar el título de Bioquímico / El síndrome de ovario poliquístico (PCOS) es una patología neuroendocrina muy común en mujeres en edad fértil y está relacionada con más del 75% de los casos de infertilidad anovulatoria. Aunque la etiología del PCOS se desconoce, en este último tiempo se ha acumulado mucha evidencia que señala a los nervios simpáticos del ovario como un componente importante en la patología. De hecho, en el modelo de ovario poliquístico inducido por la administración de una dosis única de valerato de estradiol se observó una activación de los nervios simpáticos del ovario, reflejado en un aumento del contenido y en la liberación de noradrenalina (NA) de los terminales nerviosos. Se cree que el PCOS puede ser adquirido en etapas tempranas, como lo demuestran experimentos realizados en ratas en donde se les administró EV en el período neonatal y prepuberal. En ambos casos hubo una activación de la inervación simpática. Para probar la hipótesis de una activación temprana de los nervios simpáticos como factor etiológico, en el presente trabajo se administró isoproterenol (ISO), un agonista beta adrenérgico, en dosis crecientes de 125µg/kg peso (1X), 10X y 1000X, para remedar un tono adrenérgico aumentado a ratas neonatas y se vio cómo se afectaba la función reproductiva de este órgano cuando las ratas llegaron al estado adulto. Como resultado del tratamiento se adelantó el inicio de la pubertad en las ratas tratadas con la dosis 1000X de ISO. Aunque no regular, todos los grupos tratados presentaron ciclicidad estral y los niveles de esteroides plasmáticos no se vieron afectados en las ratas tratadas respecto al grupo control. Se observó una disminución en el contenido de NA en ovario en la dosis 1000X de ISO, mientras que el contenido de NGF ovárico aumentó en las dosis 1X y 1000X. Al parecer, la administración neonatal de ISO no produjo cambios permanentes en la foliculogénesis y esteroidogenesis, ya que es probable que la ventana en que se estimuló no fuera la adecuada para cambiar el desarrollo folicular. Sin embargo, se verificaron cambios importantes en las catecolaminas adrenales y en el tamaño del corazón por efecto del tratamiento. El adelantamiento del inicio de la pubertad nos indica que la estimulación adrenérgica podría modificar la sincronización del eje hipotálamo-hipófisis-ovario / The polycystic ovary syndrome (PCOS) is the most frequent neuroendocrine disease in women during their reproductive years and corresponds to 75% of the anovulatory fertility cases. Although the ethiology of PCOS remains unknown, a sizeable body of evidence points to the ovarian sympathetic innervation as a major component of the disease. Indeed, in the PCO model induced by the injection of a single dose of estradiol valerate, an activation of the ovarian sympathetic nerves has been demonstrated, as indicated by the increase in norepinephrine content and release from the nerve terminals. As it is suggested in epidemiologic studies in women and later confirmed in rats, it is believed that the PCOS can be developed in early stages of life. Neonatal and prepubertal rats injected with a single dose of estradiol valerate developed PCOS in the adult life. In both cases, an activation of the ovarian sympathetic nerves occurs. To test the hypothesis of an early activation of ovarian sympathetic nerves as an ethiological factor of PCOS, in the present study we administered increasing doses of the beta-adrenergic agonist isoproterenol (ISO) in concentration of 125 μg/kg of body weight (ISO 1X), ISO 10X and ISO 1000X, to simulate an enhanced adrenergic tone in neonatal rats and to study the ovarian reproductive function when adults. The results show an early onset of puberty in the rats treated with the ISO 1000X dose. Although non-regular, all of the treated rats show estrous ciclicity and the plasma steroids levels did not change in the treated rats compared to the control group. The NE content in the ovary decreased in the ISO 1000X treated rats, while the NGF content in the ovary increase in the ISO 1X and in the ISO 1000X treated rats. It seems that the neonatal administration of ISO did not produce long term effects in the foliculogénesis and esteroidogenesis. It is quite possible that the window in which the stimulation occurs was not the most indicated to change the follicular development. However, the adrenal and heart function was “programmed” by the neonatal ISO administration. In addition, the early onset of puberty indicates that the adrenergic stimulation could modify the synchronization of the hypothalamus-hipophysis-ovary axis