A obesidade desencadeia mudanças funcionais no tecido adiposo perivascular (PVAT), favorecendo a liberação de fatores vasoconstritores e consequente ativação de mecanismos contráteis em células vasculares. A sinalização da interleucina 33 (IL-33) via receptor ST2 é essencial para o desenvolvimento e manutenção de células T reguladoras (Tregs) no tecido adiposo visceral. Na obesidade a função das Tregs é comprometida, resultando em estresse oxidativo e inflamação do tecido adiposo. No presente estudo testamos a hipótese que dieta rica em gordura diminui os níveis e a função da IL-33 no PVAT, levando à diminuição do número e função de Tregs, estresse oxidativo e inflamação neste tecido. Camundongos deficientes para o receptor ST2 (ST2 KO) e seus respectivos controles (Balb/C) receberam dieta controle ou hiperlipídica (HFD, high fat diet) durante 18 semanas. A função vascular foi avaliada em anéis de artérias mesentéricas, em presença ou ausência de PVAT, realizando-se curvas concentração-efeito para fenilefrina. Os seguintes grupos experimentais foram analisados: Controle PVAT (-), Controle PVAT (+), HFD PVAT (-) e HFD PVAT (+). Em artérias de camundongos Balb/C que receberam dieta controle, o PVAT diminuiu a resposta contrátil a fenilefrina. No entanto, HFD promoveu perda parcial do efeito anticontrátil promovido por este tecido. Em camundongos ST2 KO que receberam dieta controle, o PVAT diminuiu a resposta contrátil a fenilefrina. No entanto, a ausência de receptores ST2 em camundongos que receberam HFD levou à perda completa do efeito anticontrátil do PVAT. Houve diminuição do número de Tregs e aumento do número de neutrófilos no PVAT de camundongos alimentados com HFD. A incubação com IL-33 recombinante não reverteu a perda do efeito anticontrátil do PVAT promovido pela HFD. Aumento nos níveis séricos e teciduais de IL-6, bem como redução nos níveis de IL-10, foram observados em animais ST2 KO. Houve aumento nos níveis de ânion superóxido no PVAT de camundongos Balb/C alimentados com HFD e a ausência do receptor ST2 potencializou este efeito. Estes dados, analisados em conjunto, indicam que HFD compromete o papel modulador do PVAT e que IL-33 via receptor ST2 tem fundamental importância para a função do PVAT nesta condição experimental. / Obesity triggers functional changes in the perivascular adipose tissue (PVAT), favoring the release of vasoconstrictor factors. Interleukin-33 (IL-33) signaling, via ST2 receptor, is essential for the development and maintenance of regulatory T cells (Tregs) in the visceral adipose tissue. In obesity, Tregs function is compromised, resulting in adipose tissue inflammation. We hypothesized that high fat diet (HFD) decreases the number and function of Tregs and increases inflammation in the PVAT. Mice deficient for the ST2 receptor (ST2 KO) and their respective controls (Balb/C mice) were fed a control diet or a HFD for 18 weeks. Vascular function was evaluated in mesenteric resistance arteries, by performing concentration-effect curves to phenylephrine (PE). In Balb/C mice fed the control diet, PVAT decreased vascular PE contractions. However, a partial loss of PVAT anticontractile effect occurred in arteries from HFD-fed Balb/C mice. In arteries from ST2 KO mice fed the control diet, PVAT decreased PE contractions. However, a complete loss of PVAT anticontractile effects was observed in HFD-fed ST2 KO mice. There was a decrease in the number of Tregs and an increase in the number of neutrophils in the PVAT of mice fed the HFD. The absence of the IL-33 receptor increased IL-6 and reduced IL-10 in HFD-fed mice. There was an increase in superoxide anion levels in the PVAT of Balb/C mice fed HFD and the absence of the ST2 receptor potentiated this effect. These data show that HFD promotes PVAT dysfunction and IL-33 is fundamental to counteract HFD-induced PVAT dysfunction.

A cromoblastomicose é uma infecção fúngica crônica que acomete pele e tecido subcutâneo. As lesões podem ser classificadas em tumoral, verrucosa, cicatricial e do tipo placa. A resposta imune é principalmente celular e a forma grave da doença correlaciona-se com citocinas de perfil Th2. Nós exploramos populações celulares do tipo T reguladoras e Th17. Foram utilizadas vinte e três biópsias da forma verrucosa obtidas de pacientes com diagnóstico clínico e histopatológico de cromoblastomicose, sem tratamento. Foi realizado o método de imunohistoquímica para detectar Foxp3, CD25, TGF-beta, IL-6, IL-17 e IL-23. A IL-17 predominou sobre os outros marcadores, embora haja número regular de Foxp3. TGF-beta, IL-6 e IL-23 raramente foram visualizados. A constituição de uma resposta imune local com alta expressão de IL-17 e baixa expressão de outras citocinas pode ser, ao menos em parte, uma tentativa de ajudar o sistema imunológico contra infecções fúngicas. Células Foxp3 poderiam ser capazes de interferir na resposta imune eficiente contra fungos, mas também beneficiar o hospedeiro, através da capacidade de reduzir os danos do tecido que seguem uma resposta imune local. Esses elementos celulares podem contribuir para a cronicidade que caracteriza esta doença / Chromoblastomycosis is a chronic fungal infection that affects skin and subcutaneous tissue. Lesions can be classified in tumorous, verrucous, cicatricial and plaque type. The immune response is primarily cellular and the severe form of the disease correlates with a Th2 pattern of cytokines. We intended to explore the populations of regulatory T cells and the Th17 pattern. Twenty-three biopsies of verrucous form were obtained from patients with clinical and histopathological diagnostic of chromoblastomycosis, without treatment. It was performed an immunohistochemistry method to detect Foxp3, CD25, TGF-beta, IL-6, IL-17 and IL-23. IL-17 predominated over the other markers in chromoblastomycosis, although there was a regular number of Foxp3. TGF- beta, IL-6 and IL-23 were rarely visualized. The constitution of a local immune response with high expression of IL-17 and low expression of other cytokines could be at least in part, an attempt to help the immune system against fungal infection. Foxp3 cells could be able to interfere with the efficient immune response against fungi, but also benefit the host, through the ability to reduce the tissue damage that follows a local immune response. They could play a role in chronicity that characterizes this disease

Neste estudo são comparados os níveis de citocinas plasmáticas circulantes e as populações periféricas de células Treg CD4+CD25+, com base na expressão de FOXP3 e CTLA-4, e de células dendríticas (DCs) em indivíduos infectados por P. falciparum, P.vivax ou co-infectados por ambas as espécies e em controles saudáveis, porém expostos à malária, provenientes de uma área de transmissão instável na Amazônia brasileira. Amostras sangüineas de 76 pacientes infectados e de 18 controles expostos foram coletadas e processadas para a obtenção de células mononucleares. As populações celulares foram avaliadas por citometria de fluxo e os níveis de citocinas circulantes, pela técnica de ELISA de captura. A infecção aguda induziu aumento no percentual de células CD4+CD25+FOXP3+CTLA-4+ (p=0,0029; teste de Kruskal-Wallis) e redução no número absoluto de DCs (p=0,0008; teste de Kruskal-Wallis); mas esses efeitos ocorreram independente da espécie do parasito infectante. Entre os pacientes com malária vivax, 35-40% apresentaram baixa proporção de DCs que expressam a molécula co-estimulatória CD86. A única variável associada à baixa proporção de DCs CD86+ foi a proporção de células CD4+CD25+FOXP3+ que expressam CTLA-4. Em relação aos níveis de citocinas circulantes observou-se aumento nos níveis de IFN-<font face=\"Symbol\">&#947 na infecção por P. falciparum (p=0,0050; teste de Kruskal-Wallis). Apesar da concentração de IL-10 estar elevada em todos os indivíduos infectados em relação aos controles expostos (p<0,0001; teste de Kruskal-Wallis) esses níveis foram bem mais expressivos em indivíduos com malária vivax. Plasmodium falciparum e P. vivax parecem estimular diferentes padrões de resposta imune no hospedeiro, mesmo quando a comparação envolve somente indivíduos com malária não-complicada expostos a níveis semelhantes de transmissão de malária. / This study compares levels of circulating cytokines and peripheral-blood populations of CD4+CD25+ Treg cells, based on the expression of FOXP3 and CTLA-4, and dendritic cells (DCs) in individuals infected with P. falciparum, P. vivax or co-infected with both species and in healthy controls living in an area of unstable transmission of malaria in the Brazilian Amazon. Blood samples from 76 malaria patients and 18 malaria-exposed but non-infected controls were collected and processed to obtain mononuclear cells. Cell populations were characterized by flow cytometry and levels of circulating cytokines were measured by capture ELISA. Acute infection induced an increase in the proportion of CD4+CD25+FOXP3+CTLA-4+ cells (p= 0.0029, Kruskal-Wallis) and a decrease in the absolute number of DCs (p= 0.0008, Kruskal-Wallis), being both effects independent of the infecting parasite species. 35-40% of the P. vivax-infected subjects (but none in the other groups of subjects) had few circulating DCs expressing the co-stimulatory molecule CD86, a putative marker of DC activation. The only variable associated with a low proportion of CD86+ DCs was the proportion of CD4+CD25+FOXP3+ expressing CTLA-4. Analysis of circulating cytokine levels revealed increased levels of IFN- <font face=\"Symbol\">&#947 in P. falciparum infection (p= 0.0050, Kruskal-Wallis); although IL-10 levels were high in all infected individuals, compared with exposed controls (p<0.0001, Kruskal-Wallis), the increase was much more pronounced in vivax malaria. Plasmodium falciparum and P. vivax</i. appear to stimulate different patterns of immune response in humans, even when comparisons are limited to individuals with uncomplicated malaria exposed to similar levels of malaria transmission.

O ácido retinoico (RA), metabolito ativo da vitamina A, exerce ampla atividade biológica sobretudo na modulação da resposta imunológica. A interação do RA com os seus receptores nucleares induz a transcrição de genes que atuam na homeostase de sítios imunológicos, principalmente no tecido linfóide associado à mucosa intestinal (GALT). O RA promove a diferenciação de células T reguladoras CD4&#43CD25&#43Foxp3&#43, a migração de células efetoras para a mucosa intestinal induzindo a expressão de CCR9 e 4&#9467, além de inibir a diferenciação de linfócitos T helper (Th) 17 no intestino, garantindo a homeostase intestinal. Entretanto, eventos mediados pelo RA durante o desenvolvimento do sistema imunológico neonatal ainda não são totalmente conhecidos, principalmente no contexto materno-fetal. Desta forma, o objetivo do trabalho foi avaliar o efeito da suplementação materna com RA, durante a amamentação, no sitema imunológico da prole. Para tanto, camundongos fêmeas C57BL6 Foxp3-GFP receberam 6 doses de RA (1mg/gavagem), durante o período de amamentação, e o grupo controle recebeu apenas óleo vegetal. Os resultados mostram que a suplementação materna com RA foi capaz modular o sistema imunológico da prole aumentando o percentual de linfócitos T reguladores (Treg) esplênicos nas proles com 6 semanas de idade. Além disso, houve aumento percentual de linfócitos Treg, TCD4&#43 e TCD8&#43 que expressam CCR9, tanto no baço quanto nos linfonodos mesentéricos da mães e de suas prole, o que pode proporcionar a migração de células para o intestino. Este efeito foi duradouro nas proles até 6 semanas de idade. A suplementação materna com RA elevou o percentual de linfócitos Treg e linfócitos B IgA&#43 no intestino das proles, e a concentração de imunoglobulina (Ig) A fecal, mas não alterou a composição da microbiota intestinal. Nas mães suplementadas houve redução das concentrações séricas de IgA e IgG. Em contraste com o efeito tolerogênico do RA na lâmina própria do intestino, observamos o aumento sérico de interferon (IFN)- nas proles de mães suplementadas e aumento na secreção de IFN- por esplenócitos induzida por CL097 (agonista de Toll-like receptor 7/8), sugerindo que o RA pode ter um impacto importante na deficiente resposta de perfil Th1 nos neonatos. Para averiguar o efeito modulatório in vivo da suplementação materna de RA, foi avaliada a indução de colite por sulfato de sódio dextrano (DSS) nas proles. Não houve perda de peso acentuado nas proles de mães suplementadas com RA quando comprado às proles de mães controles, além de apresentarem a permeabilidade intestinal conservada e aumento do fator de transformação do crescimento (TGF)- &#946 no homogenato intestinal, indicando menor dano no tecido epitelial do intestino. Apesar disto, o RA não foi capaz de inibir totalmente o processo inflamatório na colite. No conjunto, os achados evidenciam que a suplementação materna com RA foi importante no desenvolvimento da imunidade de mucosa e na manutenção da homeostase intestinal, sendo um importante metabólito para atenuar respostas inflamatórias. A indução sérica de IFN- e após estímulo com CL097 pode indicar o uso de RA como estratégia para potencializar respostas Th1, crucial contra infecções virais e bacterianas no período neonatal. / Retinoic acid (RA), the active metabolite of vitamin A, exerts extensive biological activity mainly in the modulation of the immune response. The interaction of RA with its nuclear receptors induces the transcription of genes that acts on the homeostasis of immunological sites, especially in gut associated lymphoid tissue (GALT). RA promotes the differentiation of CD4&#43CD25&#43Foxp3&#43 regulatory T cells, migration of effector cells to the intestinal mucosa through gut-homing receptors CCR9 and 4&#9467, besides inhibiting the differentiation of T helper (Th) 17 cells in the gut, guaranteeing intestinal homeostasis. However, events mediated by RA during the development of the neonatal immune system are not totally known, especially in the maternal-fetal context. Thus, the aim of the study was to evaluate the effect of maternal RA supplementation during breastfeeding on the immune system of offspring. For this, C57BL/6 Foxp3-GFP female mice with 8-10 weeks-old received 6 doses of RA (1mg / gavage) during the breastfeeding period, and the control group received only vegetable oil. The results show that maternal RA supplementation was able to modulate the offspring immune system by increasing the percentage of splenic regulatory T (Treg) cells in offspring at 6 weeks of age. In addition, there was an enhancement in the CCR9 expression on regulatory T cells and CD4&#43 and CD8&#43 T cells, in the spleen and in the mesenteric lymph nodes of mothers and their offspring, which can provide migration of cells into the gut. This effect was long-term in offspring up to 6 weeks of age. Maternal RA supplementation also increasing the percentage of regulatory T cells and B IgA&#43 cells in the offspring´s gut, beside increasing the fecal immunoglobulin (Ig) A concentration, but did not alter the composition of the intestinal microbiota. In the supplemented mothers, serum concentrations of IgA and IgG were reduced. In contrast to the tolerogenic effect of RA on intestinal lamina propria, we observed a serum increase of interferon (IFN)- in offspring and increasing in CL097(Toll-like receptor 7/8 agonist)-induced IFN- secretion by splenocytes, suggesting that RA may have a significant impact on the deficient Th1 profile response in neonates. To investigate the modulatory effect in of RA maternal supplementation, was evaluated the induction of colitis by dextran sodium sulfate (DSS) in the offspring. There was no significant weight loss in the offspring from mothers supplemented with RA in comparison with the offspring from control mothers, as well as having preserved intestinal permeability and increased transforming growth factor (TGF)- &#946 in the intestinal homogenate, indicating less damage to intestinal epithelial tissue. Despite this, RA was not able to totally inhibit the inflammatory process in colitis. Taken together, the findings show that maternal RA supplementation was important in the development of mucosal immunity and maintenance of intestinal homeostasis, being an important metabolite to attenuate inflammatory responses. Induction of serum IFN- after TLR7/8 (CL097) stimulation may indicate the use of RA as a strategy to potentiate Th1 responses, crucial against viral and bacterial infections in the neonatal period.

Durante a ativação policlonal induzida pelo P. chabaudi a maior fonte de IL-2 são as células CD4+ ativadas, além disso, acorre a expansão de células Treg. No dia 7 após a infecção, a ausência de células Treg leva a uma exacerbação da ativação de células CD4+, além de altos níveis de anticorpos anti-P.chabaudi e auto-anticorpos. A neutralização da IL-2, com Mab anti-IL-2 JES6-1, na fase aguda da infecção leva a uma redução no número de células Treg. No dia 20 de infecção, a freqüência de células CD4+ ativadas esteve elevada e as células Treg voltaram aos níveis basais. Experimentos in vitro mostraram que a neutralização da IL-2 não altera a proliferação antígeno-específica de células CD4+ da fase aguda da infecção, porém, em tempos tardios da infecção houve um drástico aumento na freqüência de células CD4+ que proliferam em resposta a eritrócitos parasitados. Podemos concluir que a IL-2 e as células Treg são capazes de limitar a ativação policlonal induzida pelo P. chabaudi ainda que com cinéticas distintas. / Polyclonal activation during P. chabaudi infection results on a huge IL-2 production by activated CD4+ T cells, besides a considerable expansion of Treg cells. At day 7 after infection in the absence of Treg cells there is an enhanced response of activated CD4+ T cells, an increase of Abs anti-P.chabaudi and autoantibody production. Neutralization of IL-2 with Mab anti-IL2 JES6-1 during acute infection reveals a markedly reduction in Treg-cells number. At day 20 of infection we can observe an increase on activated CD4+ T cells frequency. Moreover, Treg cells return to values similar to controls. IL-2 in vitro assays during acute infection results on Ag-specific CD4+ T cells proliferation, on the other hand, at the late infection, we observed a huge increase of CD4+ T cells frequency that strongly response to PRBC. Our findings suggest that IL-2 and Treg cells are capable of restricting PLA during P.chabaudi infection, although with different kinetics.

Paracoccidioides brasiliensis é um fungo dimórfico patogênico agente etiológico da paracoccidioidomicose (PCM), uma micose endêmica no Brasil. A busca por alternativas para reduzir o tempo de tratamento da PCM levou ao desenvolvimento de uma vacina de DNA contendo a sequência do peptídeo P10 de P. brasiliensis. Neste trabalho, avaliamos a geração de células T de memória e células T reguladoras em camundongos imunizados com esta vacina de DNA antes e após o desafio com o fungo, através da análise de seus esplenócitos e linfócitos pulmonares por citometria de fluxo. Os resultados mostram um aumento no percentual de células T reguladoras e de memória no baço e pulmões dos animais imunizados antes e depois de 30, 60 e 120 dias do desafio em comparação com os grupos controle e não imunizado. Outro experimento revelou que o modelo experimental da PCM in vivo é capaz de induzir a expressão de ROR&#947t. Este estudo mostra que nossa vacina de DNA contra a PCM gera células com fenótipo de reguladoras e de memória, caracterizando seu potencial para o tratamento desta micose. / Paracoccidioides brasiliensis is a dimorphic fungal pathogen that is the etiological agent of paracoccidioidomycosis (PCM), a mycosis endemic in Brazil. The search for new alternatives to reduce the duration of PCM treatment led to the development of a DNA vaccine encoding the peptide P10 of P. brasiliensis. Presently, we evaluated the generation of memory and regulatory T cells in mice immunized with this DNA vaccine, before and after the challenge with the fungus by analizing their splenocytes and pulmonary lymphocytes by flow cytometry. The results show an increase in the percentage of regulatory and memory T cells on spleens and lungs of immunized mice before and after 30, 60 and 120 days of challenge compared with the control and untreated groups. Another experiment revealed that the PCM in vivo infection model is capable of inducing ROR&#947t expression. This study demonstrates that our DNA vaccine against PCM generates cells with a regulatory and memory phenotype, which shows its potencial in the treatment of this mycosis.

A cromoblastomicose é uma infecção fúngica crônica que acomete pele e tecido subcutâneo. As lesões podem ser classificadas em tumoral, verrucosa, cicatricial e do tipo placa. A resposta imune é principalmente celular e a forma grave da doença correlaciona-se com citocinas de perfil Th2. Nós exploramos populações celulares do tipo T reguladoras e Th17. Foram utilizadas vinte e três biópsias da forma verrucosa obtidas de pacientes com diagnóstico clínico e histopatológico de cromoblastomicose, sem tratamento. Foi realizado o método de imunohistoquímica para detectar Foxp3, CD25, TGF-beta, IL-6, IL-17 e IL-23. A IL-17 predominou sobre os outros marcadores, embora haja número regular de Foxp3. TGF-beta, IL-6 e IL-23 raramente foram visualizados. A constituição de uma resposta imune local com alta expressão de IL-17 e baixa expressão de outras citocinas pode ser, ao menos em parte, uma tentativa de ajudar o sistema imunológico contra infecções fúngicas. Células Foxp3 poderiam ser capazes de interferir na resposta imune eficiente contra fungos, mas também beneficiar o hospedeiro, através da capacidade de reduzir os danos do tecido que seguem uma resposta imune local. Esses elementos celulares podem contribuir para a cronicidade que caracteriza esta doença / Chromoblastomycosis is a chronic fungal infection that affects skin and subcutaneous tissue. Lesions can be classified in tumorous, verrucous, cicatricial and plaque type. The immune response is primarily cellular and the severe form of the disease correlates with a Th2 pattern of cytokines. We intended to explore the populations of regulatory T cells and the Th17 pattern. Twenty-three biopsies of verrucous form were obtained from patients with clinical and histopathological diagnostic of chromoblastomycosis, without treatment. It was performed an immunohistochemistry method to detect Foxp3, CD25, TGF-beta, IL-6, IL-17 and IL-23. IL-17 predominated over the other markers in chromoblastomycosis, although there was a regular number of Foxp3. TGF- beta, IL-6 and IL-23 were rarely visualized. The constitution of a local immune response with high expression of IL-17 and low expression of other cytokines could be at least in part, an attempt to help the immune system against fungal infection. Foxp3 cells could be able to interfere with the efficient immune response against fungi, but also benefit the host, through the ability to reduce the tissue damage that follows a local immune response. They could play a role in chronicity that characterizes this disease

Une cellule dendritique (CD) qui exprime le facteur de transcription GILZ durant l’apprêtement de l’antigène et sa présentation aux cellules effectrices, génère des lymphocytes T régulateurs (LTregs) CD25high Foxp3+ sécréteurs d’IL-10. La production de GILZ est dépendante de l’action des glucocorticoïdes, de l’IL-10 et du TGF-.Nous avons mis en évidence chez l’homme qu’une corticothérapie orale de 48h induit l’expression de GILZ dans les cellules présentatrices de l’antigène circulantes (CPAs) de sujets allergiques. Les CPAs isolées après la corticothérapie génèrent des LTregs CD25high Foxp3+ IL-10+ spécifiques de l’allergène.Nous également constaté in vitro que les mastocytes participent à l’activation des CDs au cours des réactions allergiques en régulant l’expression de GILZ. Les médiateurs d’origine mastocytaire, dont l’histamine, diminuent l’expression de GILZ dans les CDs et altèrent ainsi leur capacité à activer des LTregs. Nous avons identifié le mécanisme par lequel l’histamine diminue l’expression de GILZ dans les CDs humaines. L’histamine inhibe l’activité transcriptionnelle de Foxo3, un facteur de transcription régulant l’expression de GILZ. Enfin, nous avons démontré que des souris transgéniques qui surexpriment GILZ constitutivement dans les CDs sont protégées contre le développement de l’asthme allergique. L’ensemble de ces résultats permet d’envisager de nouvelles stratégies d’immunomodulation dans l’allergie, centrée sur la régulation de l’expression de GILZ dans les CDs. / We previously showed in vitro that DCs with a high level of GILZ activate regulatory T cells (Tregs) whereas DCs with low level of GILZ trigger effector T lymphocytes. Glucocorticoids (GCs), IL-10 and TGF- are potent inducers of GILZ expression. The aim of this thesis is to extend the above findings to induction of tolerance to allergens. Modulation of GILZ expression by DCs should induce allergen-specific Tregs able to inhibit the activation and proliferation of allergen specific T cell clones. In order to validate this concept we demonstrated that:- allergen-specific tolerance can be achieved in allergic patients treated with oral GC through the induction of GILZ expression in their antigen-presenting cells, and the role of allergen-specific Tregs in this effect,- mast cells play a role in the activation of DCs by inhibiting their expression of GILZ and thus their ability to stimulate Tregs against harmless environmental allergens,- GILZ-expressing DCs protect against allergic asthma in a model of transgenic mice over-expressing GILZ in their DCs.The present study supports the concept of an immune regulation of allergic responses through the modulation of GILZ expression by DCs and opens new perspectives in the development of innovative immunotherapies in the treatment of allergic diseases.

Regulatory T cells (Tregs), lymphocytes that suppress immunological reactions, are of great interest for our comprehension of basic immunology and as a therapeutic agent to treat immune-mediated pathologies. Understanding the physiology of these cells will help to inform clinical strategies targeting Tregs. In order to study the homing of human Tregs, we utilised genetic engineering to drive expression of fluorescent protein in human Tregs, permitting in vivo cell tracking. We optimised a protocol for lentivirus-mediated transduction of human Tregs during in vitro expansion, to generate high yields of stably-engineered cells. After infusing labelled cells into a humanised mouse model of skin allotransplantation, we detected human Tregs within a human skin graft by PCR and visualised Tregs moving in the graft, in a live mouse, by two-photon microscopy. Through reverse genetic analyses, we explored molecular mechanisms that allow Tregs to respond adaptively to environmental cues. Neuropilin-1 (NRP1), a transmembrane co-receptor, has been implicated in the function of mouse Tregs. Tregs transduced with shRNA to knock down NRP1 were severely impaired in their capacity to suppress cell proliferation in vitro and to prolong allograft survival in a humanised mouse model. qRT-PCR analysis revealed that transcription the gene encoding the anti-inflammatory cytokine IL-10, and the autophagy-associated genes BECN1, COPS4 and MAP1LC3B, was significantly diminished in NRP1-deficient Tregs. We concluded that in human Tregs, NRP1 is necessary for suppressive function, most likely via regulation of NRP1-dependent regulation of cytokine production and metabolism. Having identified a molecular target via which Treg function might be potentiated, we explored methods to target such molecules for cell therapy applications. Tregs engineered to over-express IL-10, but not NRP1, exerted significantly enhanced suppression of cell proliferation in vitro. Thus, relatively straightforward genetic engineering, compatible with generation of therapeutic cell yields, could be exploited to improve the efficacy of Treg cellular therapy.

O timo é o órgão linfóide primário responsável pela maturação dos linfócitos T onde se observam estruturas e células especializadas. A sinalização intra-tímica durante a maturação de linfócitos T não é bem esclarecida. Entre outras, a via de sinalização Notch, composta por receptores (Notch 1 a 4) e ligantes (DLL1, 3 e 4, Jagged 1 e 2), pode regular este processo. Neste trabalho temos como objetivo avaliar a expressão gênica e proteica de receptores e ligantes Notch nas diferentes fases de maturação de linfócitos T, linfócitos T reguladores naturais (nTreg) e células dendriticas tímicas (tDC). Para tanto, timos de 10 crianças submetidas à cirurgia cardíaca corretiva foram manipulados e as populações CD4-CD8-, CD4+CD8+, CD4+CD8-, CD4-CD8+, nTreg e tDC foram purificadas por citometria de fluxo. O RNA total foi isolado e os genes NOTCH1, 2 e 3, DLL1 e 4, JAG1 e 2, FOXP3 foram amplificados por RT-PCR. Alguns fragmentos de tecido foram avaliados por imunohistoquímica, quanto a expressão dos receptres Notch 1, 2, 3 e 4 e dos ligantes, DLL1 e 4, Jagged 1 e 2 em timócitos totais, células FOXP3+ e células S100+ em cada região tímica. Todos os genes de receptores e ligantes Notch foram expressos nas populações estudadas. Na população CD4-CD8- o gene NOTCH1 é mais expresso em comparação as outras populações de timócitos imaturos. Na população CD4+CD8+ o gene NOTCH2 é menos expresso, e o gene JAG2 mais expresso quando comparados à população CD4+CD8-. Os demais genes de receptores ligantes Notch são expressos de maneira similar entre as populações de timócitos. A avaliação relativa dos genes Notch nas populações de timócitos mostrou uma maior expressão do gene DLL1 na população CD4+CD8- e JAG1 na população CD4-CD8+ em comparação à CD4-CD8-. A expressão dos receptores e ligantes Notch no tecido mostrou ser homogênea entre as regiões. As nTreg expressam o gene do ligante JAG1 em maior nível entre os avaliados. A expressão gênica relativa das nTreg mostrou uma maior expressão de NOTCH1, NOTCH2, DLL4 e JAG1 e menor expressão de NOTCH3, DLL1 e JAG2 em relação as CD4-CD8-. Quando a relação utilizou a população CD4+CD8- observamos que as nTreg expressam mais os genes NOCTH1, NOCTH2, NOTCH3, DLL4 e JAG1, e em níveis similares DLL1 e JAG2. A avaliação histológica mostrou uma maior expressão de DLL4 em nTreg em comparação às demais proteínas avaliadas, e uma distribuição homogênea entre as regiões com exceção de Notch3 e Jagged2. As tDC mostraram uma maior expressão do gene JAG1 em comparação aos demais, e uma maior expressão da proteína DLL4. A expressão do receptor Notch2 em tDC difere entre as regiões tímicas. Em conjunto, nossos resultados mostraram que os receptores e ligantes Notch são expressos de forma gênica e proteica em todos os estágios de maturação de linfócitos T, nTreg e tDC do timo humano, com algumas variações quanto ao nível de expressão e distribuição no timo. Dados que se assemelham às avaliações murinas, porém com pontos a serem discutidos. Nossa inédita avaliação em nTreg propõem uma nova abordagem ao envolvimento da via Notch em sua maturação e a avaliação das tDCs sugere sua participação direta via Notch na maturação dos timócitos humanos / The thymus is a primary lymphoid organ responsible of maturing T lymphocytes, where specialized structures and cells are observed. The intrathymic signaling during lymphocytes maturation is unclear. Among them, Notch signaling pathway, which comprises in receptors (Notch1-4) and ligands (DLL1, 2 and 3, Jaaged1 and 2), may regulate this process. In this work our aim is to evaluate the expression of Notch receptors and ligands in different phases of T lymphocytes maturation, natural T regulatory cells (nTreg), and thymic dendritic cells (tDC). For this purpose, thymuses from 10 children who underwent corrective cardiac surgery were manipulated and populations CD4-CD8-, CD4+CD8+, CD4+CD8-, CD4- CD8+, nTreg and tDC were sorted by flow cytometry. Total RNA was purified and genes NOTCH1, 2 and 3, DLL1 and 4, JAG1 and 2, FOXP3 were amplified by RT-PCR. Some thymic fragments were evaluated by immunohistochemistry and screened for expression of Notch 1, 2, 3 and 4 receptors, DLL1 and 4, Jagged and e 2 ligands in total thymocytes, FOXP3+ cells and S100+ cells in each thymic region. All Notch receptors and ligands genes were expressed in studied populations. In CD4-CD8- subset NOTCH1 gene is more expressed in comparison to others immature thymocytes. In CD4+CD8+ subset NOTCH2 gene is less expressed, and JAG2 gene is more expressed when compared to CD4+CD8- population. The other receptors and ligands genes were expressed in a similar level among developing lymphocytes subsets. The relative Notch genes evaluation in developing lymphocytes populations showed a higher expression of DLL1 gene in CD4+CD8- population and JAG1 gene in CD4-CD8+ subset in comparison to CD4-CD8- thymocytes. The Notch receptors and ligands expression in thymic tissue showed to be homogeneous between thymic regions. The nTreg cells express JAG1 ligand gene in highest level among evaluated genes. The relative gene expression in nTreg presented higher expression of NOCTH1, NOTCH2, DLL4 and JAG1 genes, and low levels of NOTCH3, DLL1 and JAG2 related to CD4-CD8- subset. When relative gene expression were performed using CD4+CD8- subset, we observed that nTreg cells expressed more NOCTH1, NOCTH2, NOTCH3, DLL4 and JAG1, and in a similar level of expression DLL1 and JAG2 genes. The histological analysis showed that DLL4 was more expressed in nTreg cells in comparison to others proteins evaluated in this work, and a homogeneous distribution in thymic regions, in exception Notch3 and Jagged2. tDC cells presented higher expression of JAG1 gene among the others, and a higher expression of DLL4 protein. Notch2 expression in tDC was different between thymic regions. All together, our results showed that both genes and proteins of Notch receptors and ligands are expressed in distinct developmental stages of the maturation of T lymphocytes and nTreg cells and in the tDC cells in human thymus, with some variations in levels of expression and distribution in the thymus. These data are similar to the murine evaluations, but with some issues to be discussed. Our unpublished assessment in nTreg propose a new approach about the involvement of Notch pathway in its maturation and the evaluation of tDC suggests its direct participation of Notch signaling in the process of human thymocytes maturation