Alterações epigenéticas, como metilação do DNA e modificações pós traducionais em histonas, tem importante papel na carcinogênese mamária. A modulação de eventos epigenéticos constitui relevante alvo terapêutico, devido ao seu caráter reversível. Experimentalmente, o ácido docosahexaenoico (DHA), um membro da família dos ácidos graxos ômega-3, é capaz de diminuir proliferação, induzir morte celular e diminuir o potencial invasivo de células tumorais de mama. No entanto, os mecanismos antitumorais do DHA e sua capacidade de modular eventos epigenéticos ainda não estão totalmente elucidados. Nosso objetivo foi verificar, in vitro, a ação do DHA em eventos epigenéticos em diferentes linhagens de carcinoma mamário humano. Três linhagens celulares de câncer de mama (MDA-MB-231, SKBR-3 e MCF-7) foram tratadas durante 72 horas com 100 ?M de DHA ou etanol (controle). As modificações pós traducionais em histonas, acetilação no resíduo de lisina 9 da histona 3 (H3K9ac) e no resíduo 16 da histona 4 (H4K16ac), bem como trimetilação no resíduo de lisina 9 da histona 3 (H3K9me3) e no resíduo de lisina 27 da histona 3 (H3K27me3) foram avaliadas pela técnica de western blot. A análise da expressão do genes RASSF1A, DNMT1, DNMT3A e DNMT3B foi feita pela técnica da reação em cadeia da polimerase quantitativa via transcriptase reversa (RT-qPCR). A avaliação do padrão de metilação de região promotora do gene RASSF1A foi realizada pela técnica de reação em cadeia da polimerase metilação específica (MS-PCR). Foram também analisadas as fases do ciclo celular por citometria de fluxo. Comparado ao controle, o DHA induziu a acetilação no resíduo 16 da histona 4 (H4K16ac) nas linhagens MCF7 (p = 0,04) e MDA-MB-231 (p = 0,03). Observamos que a H3K9me3 foi parcialmente inibida nas linhagens MDA-MB-231 e SKBR-3, após o tratamento com DHA, mas sem alcançar valor estatisticamente significante. Encontramos também diminuição dos níveis de H3K27me3 após o tratamento com DHA nas três linhagens estudadas, porém não foi estatisticamente significativo. O DHA aumentou a expressão do gene RASSF1A na linhagem MCF-7 (1,98 vezes, p = 0,03), mas não nas linhagens MDA-MB-231 e SKBR-3. Não houve mudanças estatisticamente significativas na expressão dos genes DNMT1, DNMT3A e DNMT3B. As análises qualitativas da metilação demonstraram que a região promotora analisada do gene RASSF1A apresentou-se hipermetilada nas três linhagens celulares. Após o tratamento com DHA, houve tendência de desmetilação na região promotora do RASSF1A na linhagem MCF-7 e SKBR3, mas não na linhagem MDA-MB-231. Não houve diferença significativa na porcentagem de morte e distribuição das células MDA-MB-231, SKBR-3 e MCF-7 nas diferentes fases do ciclo celular após tratamento com DHA. Em conclusão, o DHA pode atuar em mecanismos epigenéticos e, ainda, reativar o gene supressor de tumor, como RASSF1A, anteriormente silenciado por hipermetilação, em células MCF-7. Espera-se que esses resultados contribuam para melhor compreensão do potencial papel anticâncer do DHA no câncer de mama / Epigenetic changes, such as DNA methylation and post-translational histone modifications, play an important role in mammary tumorigenesis. Epigenetic events are important as therapeutic targets, because of its reversible nature. Experimentally, docosahexaenoic acid (DHA), a member of the omega-3 fatty acids family, can reduce proliferation, induce apoptosis and decrease the invasive potential of breast tumor cells. However, the antitumor mechanism of DHA and its ability to modulate epigenetic events are not completely understood. Our objective was to verify, in vitro, the action of DHA in epigenetic events related to transcriptional reactivation of tumor suppressor gene, such as RASSF1A, in different human breast cancer cell lines. Three breast cancer cell lines (MCF-7, MDA-MB-231, SKBR-3) were treated with DHA (100 ?M) or vehicle (ethanol) for 72 hours. Western blot was used to analyze histone modification, as histone H3 lysine 9 (H3K9ac) and histone H4 lysine 16 (H4K16ac) acetylation, H3K9 trimethylation (H3K9me3) and H3K27 trimethylation (H3K27me3). Real time quantitative PCR (RT-qPCR) was performed for gene expression quantification of RASSF1A, DNMT1, DNMT3A and DNMT3B. DNA methylation of the promoter region of RASSF1A was evaluated by methylation specific PCR (MS-PCR). Moreover, we evaluated the phases of the cell cycle by flow cytometry. Compared to control cells, DHA induced H4K16ac in MCF-7 (p=0.04) and MDA-MB-231 (p=0.03). We observed that H3K9me3 was partially inhibited in MDA-MB-231 and SKBR-3 cells, after treatment with DHA, but did not reach a statistically significant value. We also found decreased levels of H3K27me3 after treatment with DHA in the three cell lines studied, but not statistically significant. DHA increased RASSF1A expression on MCF-7 (1.98 fold; p=0.03), but not in MDA-MB-231 and in SKBR-3 cells. There were no statistically significant changes in expression of genes DNMT1, DNMT3A and DNMT3B. These three breast cancer cells lines show methylation in specific region of RASSF1A promoter. DHA treatment increased RASSF1A promoter region hypomethylation in MCF-7 and SKBR-3. No significant difference was observed in the percentage of cell death nor cell distribution of MDA-MB-231, SKBR-3 and MCF-7 at different stages of the cell cycle after treatment with DHA. In conclusion, we suggest that DHA may act beneficially in epigenetic mechanisms and reactivation of tumor suppressor gene, RASSF1A as previously silenced by hypermethylation. It is hoped that these results can contribute to better understanding of the anticancer role of DHA in breast cancer

O sistema celulolítico do fungo filamentoso Trichoderma reesei é induzido transcricionalmente em pelo menos 1000 vezes pelo crescimento do fungo na presença de celulose e fortemente reprimido por glicose. Usando a abordagem de deleção no promotor, determinou-se que a região localizada entre -241 e -72 bp, em relação ao TATA box, denominada UARcb1, é responsável pela transcrição estimulada por celulose da enzima celobiohidrolase I (cbhl). Neste trabalho mostramos que essa região controla a transcrição de um gene repórter, sofrendo repressão por glicose, em Saccharomyces cerevisiae, um microrganismo que não possui os genes necessários para a utilização de celulose. A transcrição mediada por UARcbl, que é controlada por glicose, requer o produto do gene SNFl, uma proteína quinase, e dois repressores: SSN6 e TUP1, cujos papéis no controle de genes reprimidos por glicose, na levedura, são bem estabelecidos. Nossos resultados indicam um mecanismo conservado de controle por glicose em microrganismos eucarióticos. / The cellulotic system of the filamentous fungus Trichoderma reesei is transcriptionally induced 1000 -fold in presence of cellulose and is strongly repressed by glucose. Using the promoter deletion approach, the upstream activating region (UARcbl) responsible for cellulose-stimulated transcription of the major member of the cellulase system, cellobiohydrolase I, was localized between -241 and -72 relative to the TATA box. In this work we show that this region controls transcription and mediates glucose repression of a reporter gene in Saccharomyces cerevisiae, a unicellular microorganism that lacks the genes required for the utilization of cellulose. Glucose-controlled transcription mediated by the UARcbl requires the product of SNF1 gene, a protein kinase, and two repressors SSN6 and TUP1, which are well estalished in controlling glucose-represible yeast genes. Our results indicate a conserved mechanism of glucose control in eukariotic microorganisms.

O sistema celulolítico do fungo filamentoso Trichoderma reesei é induzido transcricionalmente em pelo menos 1000 vezes pelo crescimento do fungo na presença de celulose e fortemente reprimido por glicose. Usando a abordagem de deleção no promotor, determinou-se que a região localizada entre -241 e -72 bp, em relação ao TATA box, denominada UARcb1, é responsável pela transcrição estimulada por celulose da enzima celobiohidrolase I (cbhl). Neste trabalho mostramos que essa região controla a transcrição de um gene repórter, sofrendo repressão por glicose, em Saccharomyces cerevisiae, um microrganismo que não possui os genes necessários para a utilização de celulose. A transcrição mediada por UARcbl, que é controlada por glicose, requer o produto do gene SNFl, uma proteína quinase, e dois repressores: SSN6 e TUP1, cujos papéis no controle de genes reprimidos por glicose, na levedura, são bem estabelecidos. Nossos resultados indicam um mecanismo conservado de controle por glicose em microrganismos eucarióticos. / The cellulotic system of the filamentous fungus Trichoderma reesei is transcriptionally induced 1000 -fold in presence of cellulose and is strongly repressed by glucose. Using the promoter deletion approach, the upstream activating region (UARcbl) responsible for cellulose-stimulated transcription of the major member of the cellulase system, cellobiohydrolase I, was localized between -241 and -72 relative to the TATA box. In this work we show that this region controls transcription and mediates glucose repression of a reporter gene in Saccharomyces cerevisiae, a unicellular microorganism that lacks the genes required for the utilization of cellulose. Glucose-controlled transcription mediated by the UARcbl requires the product of SNF1 gene, a protein kinase, and two repressors SSN6 and TUP1, which are well estalished in controlling glucose-represible yeast genes. Our results indicate a conserved mechanism of glucose control in eukariotic microorganisms.

Essa dissertação tem por objetivo analisar as políticas públicas de assistência à infância e à juventude órfã, desamparada, abandonada e/ou infratora na cidade de Caxias do Sul – RS, entre os anos de 1962 e 1992. Busca estabelecer reflexões que transitam em duas direções: por um lado, investiga as relações dessas políticas municipais com as diretrizes das políticas públicas nacionais, inscritas no contexto da Doutrina de Segurança Nacional da ditadura civil-militar (1964-1985), e personificadas pela atuação da Fundação Nacional do Bem-Estar do Menor e das Fundações Estaduais de Bem-Estar do Menor. Essas diretrizes, amparadas juridicamente pela “Doutrina de Situação Irregular” legitimada no Código de Menores de 1979, buscavam formas de controle e contenção da infância carenciada, criminalizando e responsabilizando as crianças e jovens pela situação de pobreza em que se encontravam. Por outro lado, procura situar possíveis descontinuidades entre as ações desempenhadas pelo poder público municipal e as políticas normativas nacionais, já que a cidade de Caxias do Sul contou com um serviço assistencial municipalizado, a Comissão Municipal de Amparo à Infância, criado em 1962. Considera, também, as transformações da área da assistência pública após a promulgação da Constituição de 1988 e do Estatuto da Criança e do Adolescente, que trouxe consigo a noção de “Proteção Integral” e de garantia de direitos. Para a realização da pesquisa, foram utilizadas fontes institucionais, periódicas e orais, categorizadas tematicamente e analisadas de acordo com a narrativa cronológica do trabalho. Em um primeiro momento, considerou-se a trajetória da institucionalização de crianças e jovens no Brasil e no Rio Grande do Sul, dando-se especial destaque às transformações ocorridas ao longo da ditadura civil-militar e do processo de redemocratização do país. Em seguida, a realidade assistencial da cidade de Caxias do Sul foi analisada a partir de uma subdivisão que contemplou primeiramente as décadas de 1960 e 1970 e, posteriormente, as transformações da década de 1980 e 1990, até a criação do Conselho Tutelar da cidade, em 1992. As políticas públicas para a assistência ou institucionalização de crianças e jovens de Caxias do Sul combinaram benemerência, proteção e filantropia, enquadradas dentro da lógica da “Situação Irregular”, conjuntura que vai gradualmente se modificando ao longo da década de 1980, com a autocrítica e a transformação das instituições. No que se refere aos infratores, as iniciativas caxienses transitaram entre o confinamento, a reclusão e algumas ações de reeducação, sobretudo no período da redemocratização brasileira e da transformação das políticas nacionais para a infância. Episódios de desrespeito aos direitos humanos, estigmatização por parte da imprensa e extermínios de crianças e jovens pobres fizeram parte da realidade caxiense do período. Por outro lado, Caxias do Sul criou importantes instâncias protetivas, abrindo caminho para a reestruturação de sua rede de proteção dentro da lógica da garantia de direitos do Estatuto da Criança e do Adolescente. / This dissertation has as its main objective analyze the public policies of assistance to orphan, helpless, abandoned and/or offending childhood and youth in Caxias do Sul / RS, between 1962 and 1992. It searches to establish reflections that move toward two directions: on one hand, it investigates the relations of these municipal policies with the guidelines of the national public policies, entered in the context of the Doctrine of the National Security of the civil-military dictatorship (1964- 1985) and personified through the performance of National Foundation for the Welfare of Minors, and the State Foundations of Welfare of Minors. These guidelines, legally protected by the ‘Irregular Situation Doctrine”, legitimated in the Minors Code of 1979, sought forms of control and contention of the deprived childhood, criminalizing and putting responsibility in the children and young people for the poverty situation in which they found themselves. On the other hand, it searches to place possible discontinuities among the actions performed by the municipal government and the national regulatory policies, since Caxias do Sul had an assistance service municipalized, the Municipal Commission for the Support of Children, created in 1962. It also considers the transformations in the public assistance area after the Constitution of 1988 and the Statute of Child and Adolescent were enacted. They brought with them the notion of ‘Full Protection” and the guarantee of the rights. To execute this research, institutional, periodical, and oral sources were used and they were categorized thematically and analyzed according to the chronological narrative of the research. In the first moment, the trajectory of the institutionalization of children and teenagers in Brazil and in Rio Grande do Sul was considered, emphasizing the transformations occurred during the civil-military dictatorship and the process of bringing back the democracy to the country. Following, the caring reality in Caxias do Sul was analyzed from a subdivision that considered first the 1960s and the 1970s and, after, the transformations in the decades of 1980s and 1990s, until the creation of Tutelary Council in town, in 1992. The public policies to assistance or institutionalization of children and teenagers in Caxias do Sul matched benevolence, protection and philanthropy, situated inside a logical of the ‘Irregular Situation”, conjuncture that modifies gradually along the 1980s, with the self-criticism and the transformation of the institutions. In relation to the offenders, the initiatives from Caxias do Sul moved between the confinement and some reeducation actions, mainly when democracy was coming back to Brazil and in the moments of transformation of the national policies to infancy. Episodes of disrespect to the human rights, stigmatization by the press and extermination of deprived children and teenagers were part of the reality from Caxias do Sul in that period. On the other hand, Caxias do Sul created important protective instances, opening ways to the restructuration of its net of protection inside de logical of the guarantee of the rights from the Statute of Child and Adolescent.

Essa dissertação tem por objetivo analisar as políticas públicas de assistência à infância e à juventude órfã, desamparada, abandonada e/ou infratora na cidade de Caxias do Sul – RS, entre os anos de 1962 e 1992. Busca estabelecer reflexões que transitam em duas direções: por um lado, investiga as relações dessas políticas municipais com as diretrizes das políticas públicas nacionais, inscritas no contexto da Doutrina de Segurança Nacional da ditadura civil-militar (1964-1985), e personificadas pela atuação da Fundação Nacional do Bem-Estar do Menor e das Fundações Estaduais de Bem-Estar do Menor. Essas diretrizes, amparadas juridicamente pela “Doutrina de Situação Irregular” legitimada no Código de Menores de 1979, buscavam formas de controle e contenção da infância carenciada, criminalizando e responsabilizando as crianças e jovens pela situação de pobreza em que se encontravam. Por outro lado, procura situar possíveis descontinuidades entre as ações desempenhadas pelo poder público municipal e as políticas normativas nacionais, já que a cidade de Caxias do Sul contou com um serviço assistencial municipalizado, a Comissão Municipal de Amparo à Infância, criado em 1962. Considera, também, as transformações da área da assistência pública após a promulgação da Constituição de 1988 e do Estatuto da Criança e do Adolescente, que trouxe consigo a noção de “Proteção Integral” e de garantia de direitos. Para a realização da pesquisa, foram utilizadas fontes institucionais, periódicas e orais, categorizadas tematicamente e analisadas de acordo com a narrativa cronológica do trabalho. Em um primeiro momento, considerou-se a trajetória da institucionalização de crianças e jovens no Brasil e no Rio Grande do Sul, dando-se especial destaque às transformações ocorridas ao longo da ditadura civil-militar e do processo de redemocratização do país. Em seguida, a realidade assistencial da cidade de Caxias do Sul foi analisada a partir de uma subdivisão que contemplou primeiramente as décadas de 1960 e 1970 e, posteriormente, as transformações da década de 1980 e 1990, até a criação do Conselho Tutelar da cidade, em 1992. As políticas públicas para a assistência ou institucionalização de crianças e jovens de Caxias do Sul combinaram benemerência, proteção e filantropia, enquadradas dentro da lógica da “Situação Irregular”, conjuntura que vai gradualmente se modificando ao longo da década de 1980, com a autocrítica e a transformação das instituições. No que se refere aos infratores, as iniciativas caxienses transitaram entre o confinamento, a reclusão e algumas ações de reeducação, sobretudo no período da redemocratização brasileira e da transformação das políticas nacionais para a infância. Episódios de desrespeito aos direitos humanos, estigmatização por parte da imprensa e extermínios de crianças e jovens pobres fizeram parte da realidade caxiense do período. Por outro lado, Caxias do Sul criou importantes instâncias protetivas, abrindo caminho para a reestruturação de sua rede de proteção dentro da lógica da garantia de direitos do Estatuto da Criança e do Adolescente. / This dissertation has as its main objective analyze the public policies of assistance to orphan, helpless, abandoned and/or offending childhood and youth in Caxias do Sul / RS, between 1962 and 1992. It searches to establish reflections that move toward two directions: on one hand, it investigates the relations of these municipal policies with the guidelines of the national public policies, entered in the context of the Doctrine of the National Security of the civil-military dictatorship (1964- 1985) and personified through the performance of National Foundation for the Welfare of Minors, and the State Foundations of Welfare of Minors. These guidelines, legally protected by the ‘Irregular Situation Doctrine”, legitimated in the Minors Code of 1979, sought forms of control and contention of the deprived childhood, criminalizing and putting responsibility in the children and young people for the poverty situation in which they found themselves. On the other hand, it searches to place possible discontinuities among the actions performed by the municipal government and the national regulatory policies, since Caxias do Sul had an assistance service municipalized, the Municipal Commission for the Support of Children, created in 1962. It also considers the transformations in the public assistance area after the Constitution of 1988 and the Statute of Child and Adolescent were enacted. They brought with them the notion of ‘Full Protection” and the guarantee of the rights. To execute this research, institutional, periodical, and oral sources were used and they were categorized thematically and analyzed according to the chronological narrative of the research. In the first moment, the trajectory of the institutionalization of children and teenagers in Brazil and in Rio Grande do Sul was considered, emphasizing the transformations occurred during the civil-military dictatorship and the process of bringing back the democracy to the country. Following, the caring reality in Caxias do Sul was analyzed from a subdivision that considered first the 1960s and the 1970s and, after, the transformations in the decades of 1980s and 1990s, until the creation of Tutelary Council in town, in 1992. The public policies to assistance or institutionalization of children and teenagers in Caxias do Sul matched benevolence, protection and philanthropy, situated inside a logical of the ‘Irregular Situation”, conjuncture that modifies gradually along the 1980s, with the self-criticism and the transformation of the institutions. In relation to the offenders, the initiatives from Caxias do Sul moved between the confinement and some reeducation actions, mainly when democracy was coming back to Brazil and in the moments of transformation of the national policies to infancy. Episodes of disrespect to the human rights, stigmatization by the press and extermination of deprived children and teenagers were part of the reality from Caxias do Sul in that period. On the other hand, Caxias do Sul created important protective instances, opening ways to the restructuration of its net of protection inside de logical of the guarantee of the rights from the Statute of Child and Adolescent.

INTRODUÇÃO: Fatores associados à etiopatogenia das complicações diabéticas, incluindo hiperglicemia e estresse oxidativo, podem causar alterações epigenéticas que modificam a expressão de genes em células-alvo, sem alterar sua sequência de DNA. São considerados mecanismos epigenéticos: (1) as modificações pós-traducionais das histonas; (2) a metilação do DNA e (3) a ação dos micro-RNAs (miRNAs); todos já foram reconhecidos na patogênese da \"memória metabólica\", situação na qual a hiperglicemia continua a exercer efeitos deletérios prolongados mesmo depois de ser normalizada. A sirtuína-1 é uma enzima que causa modificações pós-traducionais das histonas por sua atividade de histona desacetilase, silenciando a transcrição gênica. O silenciamento gênico também pode ocorrer pela ação da DNA metiltransferase 1 (DNMT1), enzima que adiciona um grupamento metil (CH3) na posição 5 de resíduos de citosina localizadas em ilhas CpG presentes nas regiões promotoras dos genes. Os miRNAs constituem uma classe de pequenos RNAs não codificadores com cerca de 19 a 25 nucleotídeos que controlam a expressão gênica por meio da repressão da tradução ou da degradação do RNA mensageiro-alvo. As hipóteses do presente estudo são (1) que exista um perfil sérico de miRNAs associado à presença ou ausência de complicações crônicas e (2) que existam variantes em genes relacionados à desacetilação das histonas e à metilação de citosinas que poderiam predispor ao aparecimento das complicações diabéticas, o que se constituiria na \"genética da epigenética\". OBJETIVOS: (1) caracterizar e comparar o perfil de miRNAs sérico de pacientes com diabetes mellitus tipo 1 (DM1) sem nenhuma complicação microvascular versus aqueles com três complicações microvasculares: retinopatia diabética (RD), doença renal diabética (DRD) e neuropatia diabética, para identificar vias epigeneticamente moduladas nesses dois grupos de pacientes e (2) avaliar a frequência de polimorfismos de um único nucleotídeo nos genes que codificam as enzimas DNMT1 e sirtuína-1 e suas associações com cada uma das complicações microvasculares em pacientes com DM1. MÉTODOS: O perfil sérico de 381 miRNAs foi avaliado com o uso do estojo comercial Taqman® Human MicroRNA Array A em 10 pacientes bem caracterizados clínica e laboratorialmente divididos em dois grupos: Pacientes com DM1 sem complicações [sem DRD (Clearance de creatinina > 90 ml/min/1,73 m2 e excreção urinária de albumina < 20 mg/g de creatinina), sem polineuropatia sensitivo-motora distal (ausência de sintomas sugestivos de neuropatia, sensibilidade térmica e dolorosa e reflexo aquileu normais), sem neuropatia autonômica cardiovascular (NAC) e sem RD] e Pacientes com DM1 com complicações [DRD (Clearance de creatinina < 60 ml/min/1,73 m2 e excreção urinária de albumina > 200 mg/g de creatinina), com polineuropatia sensitiva-motora distal, com NAC instalada e RD moderada ou grave]. Os cinco miRNAs mais diferencialmente expressos foram validados em uma casuística bem caracterizada de 20 pacientes com DM1 sem nenhuma complicação e 27 com todas as complicações microvasculares, com o emprego do estojo comercial TaqMan(TM) Advanced miRNA cDNA Synthesis. A avaliação da frequência de polimorfismos de um único nucleotídeo nos genes que codificam as enzimas DNMT1 (rs8112895, rs7254567, rs11085721, rs17291414, rs10854076) e sirtuína-1 (rs10997870; rs12766485) foi realizada após a genotipagem por reação em cadeia da polimerase em tempo real, em uma casuística composta por 466 pacientes com DM1. RESULTADOS: Do total de 377 miRNAs-alvo avaliados no soro dos pacientes com DM1, um total de 21 miRNAs estava superexpresso no grupo com complicações. Dos 5 miRNAs para os quais foi realizada a validação na casuística de 47 pacientes com DM1, dois foram confirmados como superexpressos na população com complicações (hsa-miR-518d-3p e hsa-miR-618). O polimorfismo rs11085721 no gene que codifica a DNMT1 associou-se à presença de NAC no sexo feminino, sendo o alelo raro C considerado de risco e conferindo um odds ratio (intervalo de confiança de 95%) de 2,44 (1,26-5,28). Nenhum polimorfismo da sirtuína-1 associou-se às complicações microvasculares avaliadas. CONCLUSÃO: o perfil de miRNAs séricos difere entre pacientes com DM1 com e sem complicações. O achado de uma variante em um gene que codifica a enzima de uma via epigenética conferir suscetibilidade a uma complicação crônica sugere que também exista a \"genética da epigenética\" modulando o desenvolvimento das complicações / INTRODUCTION: Factors associated with the etiopathogenesis of diabetic complications, including hyperglycemia and oxidative stress, may cause epigenetic changes that modify the expression of genes in target cells without altering their DNA sequence. The following mechanisms are considered epigenetics: (1) post-translational modifications of histones; (2) methylation of DNA and (3) action of micro-RNAs (miRNAs); all have already been recognized in the pathogenesis of \"metabolic memory\", a situation in which hyperglycemia exerts prolonged deleterious effects even after its normalization. Sirtuin-1 is an enzyme that causes post-translational modifications of histones by their histone deacetylase activity, silencing gene transcription. Gene silencing may also occur through the action of DNA methyltransferase 1 (DNMT1), an enzyme that adds a methyl group (CH3) at position 5 of cytosine residues located in CpG islands from gene-promoter regions. miRNAs are a class of small non-coding RNAs with about 19 to 25 nucleotides that control gene expression by promoting translation repression or degradation of target messenger RNAs. The hypotheses of the present study are (1) there is a serum profile of miRNAs associated with the presence or absence of chronic complications and (2) there are variants in genes related to histone deacetylation and cytosine methylation that could predispose to diabetes complications, which would constitute the \"genetics of epigenetics\". OBJECTIVES: (1) to characterize and compare the serum miRNA profile of patients with type 1 diabetes mellitus (T1D) without any microvascular complications versus those with three microvascular complications: diabetic retinopathy (DR), diabetic kidney disease (DKD) and diabetic neuropathy to identify signaling pathways epigenetically modulated in these two groups of patients and (2) to assess the frequency of single nucleotide polymorphisms in the genes encoding DNMT1 and sirtuin-1 and their associations with each of the microvascular complications in T1D patients. METHODS: The serum profile of 381 miRNAs was evaluated using the Taqman® Human MicroRNA Array A kit in 10 clinical and laboratory well-characterized patients divided into two groups: Patients without microvascular complications: without DKD (creatinine clearance> 90 ml/min/1.73 m2 and urinary albumin excretion < 20 mg / g creatinine), without distal sensory-motor polyneuropathy (absence of symptoms suggestive of neuropathy and normal thermal and pain sensitivity and Achilles reflex), without cardiovascular autonomic neuropathy (CAN) and without DR; and T1D patients with complications: with DKD (creatinine clearance < 60 ml / min / 1.73 m2 and urinary albumin excretion> 200 mg / g creatinine), with distal sensory-motor polyneuropathy, with CAN and with DR moderate or severe. The five most differentially expressed miRNAs were validated in a well-characterized case series of 20 patients with no complications and 27 patients with all microvascular complications using the TaqMan (TM) Advanced miRNA cDNA Synthesis kit. The evaluation of the frequency of single nucleotide polymorphisms in genes encoding the DNMT1 (rs8112895, rs7254567, rs11085721, rs1729414, rs10854076) and sirtuin-1 (rs10997870; rs12766485) was performed by genotyping using real-time polymerase chain reaction in a sample of 466 T1D patients. RESULTS: Of the total of 377 target miRNAs evaluated in the serum of T1D patients, 21 miRNAs were overexpressed in the group with complications. Of the 5 miRNAs for which validation was performed in 47 patients, two were confirmed as overexpressed in the group with complications (hsa-miR-518d-3p and hsa-miR-618). The polymorphism rs11085721 in the gene encoding DNMT1 was associated with the presence of CAN in female patients, with the minor allele C being considered of risk and conferring an odds ratio (95% confidence interval) of 2.44 (1.26 - 5.28). Polymorphisms in the gene encoding Sirtuin-1 did not associate with microvascular complications. CONCLUSION: the serum miRNA profile differs between patients with and without microvascular complications. A variant in a gene encoding a enzyme of an epigenetic pathway conferring susceptibility to a chronic complication suggests that there is also the \"genetics of epigenetics\" modulating the development of complications

Essa dissertação tem por objetivo analisar as políticas públicas de assistência à infância e à juventude órfã, desamparada, abandonada e/ou infratora na cidade de Caxias do Sul – RS, entre os anos de 1962 e 1992. Busca estabelecer reflexões que transitam em duas direções: por um lado, investiga as relações dessas políticas municipais com as diretrizes das políticas públicas nacionais, inscritas no contexto da Doutrina de Segurança Nacional da ditadura civil-militar (1964-1985), e personificadas pela atuação da Fundação Nacional do Bem-Estar do Menor e das Fundações Estaduais de Bem-Estar do Menor. Essas diretrizes, amparadas juridicamente pela “Doutrina de Situação Irregular” legitimada no Código de Menores de 1979, buscavam formas de controle e contenção da infância carenciada, criminalizando e responsabilizando as crianças e jovens pela situação de pobreza em que se encontravam. Por outro lado, procura situar possíveis descontinuidades entre as ações desempenhadas pelo poder público municipal e as políticas normativas nacionais, já que a cidade de Caxias do Sul contou com um serviço assistencial municipalizado, a Comissão Municipal de Amparo à Infância, criado em 1962. Considera, também, as transformações da área da assistência pública após a promulgação da Constituição de 1988 e do Estatuto da Criança e do Adolescente, que trouxe consigo a noção de “Proteção Integral” e de garantia de direitos. Para a realização da pesquisa, foram utilizadas fontes institucionais, periódicas e orais, categorizadas tematicamente e analisadas de acordo com a narrativa cronológica do trabalho. Em um primeiro momento, considerou-se a trajetória da institucionalização de crianças e jovens no Brasil e no Rio Grande do Sul, dando-se especial destaque às transformações ocorridas ao longo da ditadura civil-militar e do processo de redemocratização do país. Em seguida, a realidade assistencial da cidade de Caxias do Sul foi analisada a partir de uma subdivisão que contemplou primeiramente as décadas de 1960 e 1970 e, posteriormente, as transformações da década de 1980 e 1990, até a criação do Conselho Tutelar da cidade, em 1992. As políticas públicas para a assistência ou institucionalização de crianças e jovens de Caxias do Sul combinaram benemerência, proteção e filantropia, enquadradas dentro da lógica da “Situação Irregular”, conjuntura que vai gradualmente se modificando ao longo da década de 1980, com a autocrítica e a transformação das instituições. No que se refere aos infratores, as iniciativas caxienses transitaram entre o confinamento, a reclusão e algumas ações de reeducação, sobretudo no período da redemocratização brasileira e da transformação das políticas nacionais para a infância. Episódios de desrespeito aos direitos humanos, estigmatização por parte da imprensa e extermínios de crianças e jovens pobres fizeram parte da realidade caxiense do período. Por outro lado, Caxias do Sul criou importantes instâncias protetivas, abrindo caminho para a reestruturação de sua rede de proteção dentro da lógica da garantia de direitos do Estatuto da Criança e do Adolescente. / This dissertation has as its main objective analyze the public policies of assistance to orphan, helpless, abandoned and/or offending childhood and youth in Caxias do Sul / RS, between 1962 and 1992. It searches to establish reflections that move toward two directions: on one hand, it investigates the relations of these municipal policies with the guidelines of the national public policies, entered in the context of the Doctrine of the National Security of the civil-military dictatorship (1964- 1985) and personified through the performance of National Foundation for the Welfare of Minors, and the State Foundations of Welfare of Minors. These guidelines, legally protected by the ‘Irregular Situation Doctrine”, legitimated in the Minors Code of 1979, sought forms of control and contention of the deprived childhood, criminalizing and putting responsibility in the children and young people for the poverty situation in which they found themselves. On the other hand, it searches to place possible discontinuities among the actions performed by the municipal government and the national regulatory policies, since Caxias do Sul had an assistance service municipalized, the Municipal Commission for the Support of Children, created in 1962. It also considers the transformations in the public assistance area after the Constitution of 1988 and the Statute of Child and Adolescent were enacted. They brought with them the notion of ‘Full Protection” and the guarantee of the rights. To execute this research, institutional, periodical, and oral sources were used and they were categorized thematically and analyzed according to the chronological narrative of the research. In the first moment, the trajectory of the institutionalization of children and teenagers in Brazil and in Rio Grande do Sul was considered, emphasizing the transformations occurred during the civil-military dictatorship and the process of bringing back the democracy to the country. Following, the caring reality in Caxias do Sul was analyzed from a subdivision that considered first the 1960s and the 1970s and, after, the transformations in the decades of 1980s and 1990s, until the creation of Tutelary Council in town, in 1992. The public policies to assistance or institutionalization of children and teenagers in Caxias do Sul matched benevolence, protection and philanthropy, situated inside a logical of the ‘Irregular Situation”, conjuncture that modifies gradually along the 1980s, with the self-criticism and the transformation of the institutions. In relation to the offenders, the initiatives from Caxias do Sul moved between the confinement and some reeducation actions, mainly when democracy was coming back to Brazil and in the moments of transformation of the national policies to infancy. Episodes of disrespect to the human rights, stigmatization by the press and extermination of deprived children and teenagers were part of the reality from Caxias do Sul in that period. On the other hand, Caxias do Sul created important protective instances, opening ways to the restructuration of its net of protection inside de logical of the guarantee of the rights from the Statute of Child and Adolescent.

Alterações epigenéticas, como metilação do DNA e modificações pós traducionais em histonas, tem importante papel na carcinogênese mamária. A modulação de eventos epigenéticos constitui relevante alvo terapêutico, devido ao seu caráter reversível. Experimentalmente, o ácido docosahexaenoico (DHA), um membro da família dos ácidos graxos ômega-3, é capaz de diminuir proliferação, induzir morte celular e diminuir o potencial invasivo de células tumorais de mama. No entanto, os mecanismos antitumorais do DHA e sua capacidade de modular eventos epigenéticos ainda não estão totalmente elucidados. Nosso objetivo foi verificar, in vitro, a ação do DHA em eventos epigenéticos em diferentes linhagens de carcinoma mamário humano. Três linhagens celulares de câncer de mama (MDA-MB-231, SKBR-3 e MCF-7) foram tratadas durante 72 horas com 100 ?M de DHA ou etanol (controle). As modificações pós traducionais em histonas, acetilação no resíduo de lisina 9 da histona 3 (H3K9ac) e no resíduo 16 da histona 4 (H4K16ac), bem como trimetilação no resíduo de lisina 9 da histona 3 (H3K9me3) e no resíduo de lisina 27 da histona 3 (H3K27me3) foram avaliadas pela técnica de western blot. A análise da expressão do genes RASSF1A, DNMT1, DNMT3A e DNMT3B foi feita pela técnica da reação em cadeia da polimerase quantitativa via transcriptase reversa (RT-qPCR). A avaliação do padrão de metilação de região promotora do gene RASSF1A foi realizada pela técnica de reação em cadeia da polimerase metilação específica (MS-PCR). Foram também analisadas as fases do ciclo celular por citometria de fluxo. Comparado ao controle, o DHA induziu a acetilação no resíduo 16 da histona 4 (H4K16ac) nas linhagens MCF7 (p = 0,04) e MDA-MB-231 (p = 0,03). Observamos que a H3K9me3 foi parcialmente inibida nas linhagens MDA-MB-231 e SKBR-3, após o tratamento com DHA, mas sem alcançar valor estatisticamente significante. Encontramos também diminuição dos níveis de H3K27me3 após o tratamento com DHA nas três linhagens estudadas, porém não foi estatisticamente significativo. O DHA aumentou a expressão do gene RASSF1A na linhagem MCF-7 (1,98 vezes, p = 0,03), mas não nas linhagens MDA-MB-231 e SKBR-3. Não houve mudanças estatisticamente significativas na expressão dos genes DNMT1, DNMT3A e DNMT3B. As análises qualitativas da metilação demonstraram que a região promotora analisada do gene RASSF1A apresentou-se hipermetilada nas três linhagens celulares. Após o tratamento com DHA, houve tendência de desmetilação na região promotora do RASSF1A na linhagem MCF-7 e SKBR3, mas não na linhagem MDA-MB-231. Não houve diferença significativa na porcentagem de morte e distribuição das células MDA-MB-231, SKBR-3 e MCF-7 nas diferentes fases do ciclo celular após tratamento com DHA. Em conclusão, o DHA pode atuar em mecanismos epigenéticos e, ainda, reativar o gene supressor de tumor, como RASSF1A, anteriormente silenciado por hipermetilação, em células MCF-7. Espera-se que esses resultados contribuam para melhor compreensão do potencial papel anticâncer do DHA no câncer de mama / Epigenetic changes, such as DNA methylation and post-translational histone modifications, play an important role in mammary tumorigenesis. Epigenetic events are important as therapeutic targets, because of its reversible nature. Experimentally, docosahexaenoic acid (DHA), a member of the omega-3 fatty acids family, can reduce proliferation, induce apoptosis and decrease the invasive potential of breast tumor cells. However, the antitumor mechanism of DHA and its ability to modulate epigenetic events are not completely understood. Our objective was to verify, in vitro, the action of DHA in epigenetic events related to transcriptional reactivation of tumor suppressor gene, such as RASSF1A, in different human breast cancer cell lines. Three breast cancer cell lines (MCF-7, MDA-MB-231, SKBR-3) were treated with DHA (100 ?M) or vehicle (ethanol) for 72 hours. Western blot was used to analyze histone modification, as histone H3 lysine 9 (H3K9ac) and histone H4 lysine 16 (H4K16ac) acetylation, H3K9 trimethylation (H3K9me3) and H3K27 trimethylation (H3K27me3). Real time quantitative PCR (RT-qPCR) was performed for gene expression quantification of RASSF1A, DNMT1, DNMT3A and DNMT3B. DNA methylation of the promoter region of RASSF1A was evaluated by methylation specific PCR (MS-PCR). Moreover, we evaluated the phases of the cell cycle by flow cytometry. Compared to control cells, DHA induced H4K16ac in MCF-7 (p=0.04) and MDA-MB-231 (p=0.03). We observed that H3K9me3 was partially inhibited in MDA-MB-231 and SKBR-3 cells, after treatment with DHA, but did not reach a statistically significant value. We also found decreased levels of H3K27me3 after treatment with DHA in the three cell lines studied, but not statistically significant. DHA increased RASSF1A expression on MCF-7 (1.98 fold; p=0.03), but not in MDA-MB-231 and in SKBR-3 cells. There were no statistically significant changes in expression of genes DNMT1, DNMT3A and DNMT3B. These three breast cancer cells lines show methylation in specific region of RASSF1A promoter. DHA treatment increased RASSF1A promoter region hypomethylation in MCF-7 and SKBR-3. No significant difference was observed in the percentage of cell death nor cell distribution of MDA-MB-231, SKBR-3 and MCF-7 at different stages of the cell cycle after treatment with DHA. In conclusion, we suggest that DHA may act beneficially in epigenetic mechanisms and reactivation of tumor suppressor gene, RASSF1A as previously silenced by hypermethylation. It is hoped that these results can contribute to better understanding of the anticancer role of DHA in breast cancer

O câncer de mama é a principal causa de mortalidade por câncer entre as mulheres. Alguns biomarcadores e características clínicas são utilizados para avaliar o prognóstico e prever a resposta a uma série de abordagens terapêuticas. A Homocisteína é conhecida como um fator de risco para doença vascular aterosclerótica, mas sua participação na biologia do câncer ainda é incerta. Cisteína é o aminoácido sulfurado derivado da Homocisteína no ciclo da Metionina. Este ciclo metabólico origina as bases nitrogenadas e também determina o nível de metilação da molécula de DNA. É atualmente reconhecido que a hipometilação global do genoma é um evento chave na transformação maligna das células. O objetivo deste estudo foi avaliar os níveis séricos de homocisteína e cisteína como biomarcadores de sobrevida e de progressão da doença em câncer de mama. Também foi avaliado o efeito de um curso de curta duração (um mês) de tratamento hormonal sobre os níveis de Homocisteína, Cisteína e metilação do DNA. Amostras de sangue foram obtidos por ocasião da biópsia inicial (pré-tratamento) em todas as pacientes e, de tumor e de tecido normal adjacente, ao diagnóstico eem um mês após, para as pacientes que receberam o regime hormonal neo-adjuvante (pré-operatório). Todas as pacientes eram mulheres na pós-menopausa, com tumores de mama ressecáveis, acompanhadas em dois hospitais públicos, que consentiram em participar de outros dois protocolos de pesquisa prévios. Homocisteína e Cisteína foram analisadas por HPLC e a metilação global do DNA do tecido foi determinada por meio da técnica de MSRE (Methylation-Sensitive Restriction Enzyme). Foi observada uma diferença significativa entre os níveis pré e póstratamento de Homocisteína e Cisteína em tumores avançados, sugerindo um papel prognóstico em pacientes com características clínicas reservadas. As variações nos níveis de Homocisteína se mostraram significativamente correlacionadas com a sobrevida livre de doença. O modelo de risco proporcional de Cox demonstrou que os níveis de homocisteína e o status dos linfonodos representaram fatores prognósticos independentes em termos de sobrevida livre de doença. Embora mais estudos sejam necessários para confirmar estes resultados, nossa pesquisa sugere que a Homocisteína pode ser usada como um biomarcador de prognóstico para câncer de mama / Breast cancer is the leading cause of cancer mortality among women. Some biomarkers and clinical features are used to evaluate prognosis and to predict response to a range of therapeutic approaches. Homocysteine is well known as a risk factor in atherosclerotic vascular diseases, but its participation in cancer biology is still unclear. Cysteine is a sulfur amino acid derived from Homocysteine in the Methionine cycle. This metabolic cycle originates the nitrogenous bases and determines the methylation level of the DNA molecule as well. It is currently recognized that the global hipomethylation of the genome is a key event in the malign transformation of cells. The aim of this study was to evaluate serum Homocysteine and Cysteine as biomarkers of survival and disease progression in breast tumor, as well as the methylation status of tumor and normal tissues. The effect of a short course (one month) of hormonal treatment on Homocysteine, Cysteine and DNA methylation levels was also evaluated. Blood samples were collected during the initial biopsy (pretreatment) in all patients and, tumor samples and normal adjacent tissue, at diagnosis and one month after, for the patients that received neo-adjuvant hormonal regimen (pre-treatment). All patients were post-menopausal women, with resectable breast tumors, followed at two public hospitals, and that had consented to participate in two previous research protocols related to their disease. Serum Homocysteine and Cysteine were analyzed by HPLC and tissue global DNA methylation was determined by the MSRE (Methylation- Sensitive Restriction Enzyme) technique. A significant difference was observed between pre- and post-treatment levels of Homocysteine and Cysteine in advanced tumors, suggesting a prognostic role in patients with poor clinical characteristics. Variations in Homocysteine levels were significantly correlated with disease free survival. Cox proportional risk model demonstrated that nodal status and Homocysteine levels were independent prognostic factors for Disease Free Survival. Although more studies are needed to confirm these results, our research suggests that Homocysteine might be used as a prognostic biomarker for breast cancer