A otimização e padronização de métodos moleculares são fundamentais para evitar distorções nos resultados causadas por processamento de ácidos nucleicos da abundância relativa de micro-organismos de uma amostra. Nos estudos sobre identificação microbiana, a etapa de validação é, na maioria dos casos, negligenciada. As principais etapas em que podem ocorrer vieses capazes de alterar a informação sobre a composição da comunidade microbiana são a extração e a RT-PCR. O rRNA é a molécula ideal para identificar os micro-organismos metabolicamente ativos por estar em maior quantidade dentro da célula. A inexistência de um protocolo de extração de RNA gold standard e de kits comerciais específicos para cada tipo de amostra ambiental pode comprometer as etapas posteriores à extração. O protocolo de extração de RNA adaptado neste trabalho mostrou alta eficácia na lise celular e na remoção de contaminantes co-extraidos, garantindo a integridade e a qualidade do rRNA extraído de amostras contendo altas concentrações de contaminantes. Devido as diferentes características químicas das amostras ambientais, o uso deste protocolo adaptado pode preservar a informação sobre os indivíduos metabolicamente ativos de uma comunidade microbiana. Foram utilizados consórcios artificiais na validação da etapa de PCR. O efeito sinérgico do uso de aditivos, da Taq polimerase de alto rendimento, do programa de sub-ciclagem e da limitação do programa de amplificação em 10 ciclos, mantiveram a proporção dos moldes dos consórcios analisados próximo ao esperado. Após a padronização da técnica de ARDRA, foi definido que há necessidade de entre 500 e 550 UFC para uma cobertura completa da diversidade de lodo ativado. O uso de enzimas combinadas MspI/HaeIII e HhaI/RsaI em uma mesma reação double digest proporcionou a separação dos clones de lodo ativado utilizando menos etapas de ARDRA. E o critério de corte em 3% do total agrupamentos, possibilitou selecionar os perfis mais representativos sem a perda de grupos importantes para a análise das bibliotecas. Foi concluído que, o uso de um protocolo inadequado de extração de RNA de amostras complexas pode gerar extratos contendo contaminantes co-extraidos que interferem na atividade da Taq polimerase e nas enzimas de restrição. Após o sequenciamento de nova geração, foi observado que o uso de diferentes iniciadores de PCR e do pré-processamento manual para os dados obtidos, foram essenciais para ampliar a cobertura observada para a amostra de lodo e melhorar a resolução dos resultados e a profundidade de identificação taxonômica, respectivamente. / The optimization and standardization of molecular methods are fundamental to avoid distortions in the results caused by nucleic acid processing of the relative abundance of microorganisms in a sample. In the studies on microbial identification, the validation step is, in most cases, neglected. The main steps in which biases capable of altering the composition of the microbial community can occur are extraction and RT-PCR. The rRNA is the ideal molecule to identify metabolically active microorganisms because they are in the greatest amount within the cell. The lack of a gold standard RNA extraction protocol and specific commercial kits for each type of environmental sample may compromise the post-extraction steps. The RNA extraction protocol adapted in this work showed high efficacy in cell lysis and in the removal of co-extracted contaminants, guaranteeing the integrity and quality of the rRNA extracted from samples containing high concentrations of contaminants. Due to the different chemical characteristics of the environmental samples, the use of this adapted protocol can preserve the information about the metabolically active individuals of a microbial community. Artificial consortia were used to validate the PCR step. The synergistic effect of the use of additives, the high yield Taq polymerase, the sub-cycling program and the limitation of the amplification program in 10 cycles, kept the proportion of the molds of the consortia analyzed close to the expected. After standardization of the ARDRA technique, it was defined that there is a need for between 500 and 550 CFU for a complete coverage of the diversity of activated sludge. The use of MspI / HaeIII and HhaI / RsaI combined enzymes in the same double digest reaction provided the separation of activated sludge clones using fewer ARDRA steps. And the criterion of cut in 3% of the total groupings, allowed to select the most representative profiles without the loss of important groups for the analysis of the libraries. It was concluded that the use of an inadequate RNA extraction protocol from complex samples can generate extracts containing co-extracted contaminants that interfere with Taq polymerase activity and restriction enzymes. After the sequencing of the new generation, it was observed that the use of different PCR primers and manual preprocessing for the obtained data were essential to increase the coverage observed for the sludge sample and to improve the resolution of the results and the depth of taxonomic identification, respectively.

O presente estudo teve o objetivo de verificar o padrão de expressão dos genes HOXB13 e HHEX em carcinomas epidermóides de boca (CEB) através das técnicas de Transcriptase Reversa em Reação de Cadeia Polimerase (RT- PCR) e Hibridização In situ (ISH). Fragmentos de tecido tumoral e de tecido não tumoral adjacente à lesão foram obtidos de 30 pacientes portadores de CEB no Serviço de Cirurgia de Cabeça e Pescoço do HC - FMUSP. As amostras tiveram seus cDNAs extraí dos e submetidos à amplificação por PCR. Os “ amplicons" foram visualizados sob luz UV por eletroforese em gel de agarose a 1% contendo brometo de etí dio. A amplificação dos genes foram correlacionadas com a classificação UICC, TNM, graduação histológica, localização e espessura tumoral, invasão de tecidos adjacentes, perineural e vascular. Após seqüenciamento dos “ amplicons" e confirmação dos genes foram confecionadas as sondas de mRNA para realização da técnica de hibridização in situ. Os resultados obtidos através da técnica de RT-PCR mostraram que: a amplificação dos transcritos dos genes HOXB13 e HHEX podem ser detectados tanto no carcinoma epidermóide quanto no tecido não tumoral adjacente à lesão; não existindo diferença na amplificação dos transcritos de ambos genes para os dois grupos de tecido estudados; a amplificação do transcrito do gene HOXB13 mostrou relação estatí stica com os fatores prognósticos: espessura tumoral, invasão perineural e invasão vascular; a amplificação do transcrito do gene HHEX mostrou relação estatí stica com os fatores prognósticos: invasão vascular,envolvimento com os tecidos adjacentes e uma relação inversa com a idade do paciente. A expressão dos transcritos dos genes HOXB13 e HHEX, detectados pela técnica de ISH, mostrou um padrão de marcação consistente e invariável para os tecidos analisados, estando expressos tanto em carcinoma epidermóide quanto no tecido não tumoral adjacentes à lesão. Os resultados apontam para uma correlação entre a expressão do HHEX e do HOXB13 e alguns fatores prognósticos importantes podendo representar um indicador prognóstico valoroso para o entendimento do comportamento biológico do CEB. / The aim of this study was to verify the HOXB13 and HHEX genes expression in oral squamous cell carcinoma (OSCC) using Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) and in situ Hybridization techniques. Tumoral tissues and adjacent non-tumoral oral mucosa specimens were obtained from 30 patients with OSCC at the Head and Neck Surgery Service HC (FMUSP). The samples were cDNA extracted and submitted to the RT-PCR technique. The amplicons were visualized in electrophoresis on a 1% agarose gel with ethidium bromide. Genes expressions were correlated with UICC staging, TNM stage, tumor location, tumor thickness, adjacent tissues involvement, vascular and perineural invasion, and cellular differentiation. Finally, direct sequence analysis was performed on PCR products to confirm cDNA sequence. Riboprobes were confectioned for in situ hybridization analysis. RT-PCR results showed HOXB13 and HHEX transcripts in both tumoral and non-tumoral tissue samples; no statistical correlation was verified between HOXB13/HHEX expressions and tumoral or non-tumoral tissues; there was a positive correlation between HOXB13 tumoral expression and tumor thickness, neural invasion, and vascular invasion; there was a positive correlation between HHEX tumoral expression and adjacent tissue involvement, vascular invasion, and a inverse relationship with patients age; ISH technique exhibited a consistent and invariable pattern of expression for both genes on both tumoral and non-tumoral tissue samples. Present results points out to a correlation between HOXB13 and HHEX expressions, and some important prognostic indicators, and this may represent a valuable tool to understand the biological behavior of OSCC.

Bei konventionellen Mikroarray-Experimenten zur Genexpressionsanalyse wird fluoreszenz- oder radioaktiv-markierte cDNA oder RNA mit immobilisierten Proben hybridisiert. Für ein gut detektierbares und auswertbares Ergebnis werden jedoch pro Array mindestens 15 - 20 &#181;g Hybridisierungstarget benötigt. Dazu müssen entweder 15 - 20 &#181;g RNA direkt durch Reverse Transkription in markierte cDNA umgeschrieben werden oder bei Vorhandensein von weniger Startmaterial die RNA amplifiziert werden (Standard- Affymetrix-Protokolle, Klur et al. 2004). Oft sind damit zeit- und kostenintensive Probenpräparationen verbunden und das Ergebnis ist nicht immer reproduzierbar. Obwohl es inzwischen einige Protokolle gibt, die dieses Problem zu lösen versuchen (Zhang et al. 2001, Iscove et al. 2002, McClintick et al. 2003, Stirewalt et al. 2004), eine optimale, leicht handbare und reproduzierbare Methode gibt es weiterhin nicht, weshalb in dieser Arbeit ein weiterer Lösungsansatz gesucht wurde.<br> In der vorgestellten Arbeit werden zwei einfache Methoden beschrieben, mit denen Gene aus geringen RNA-Mengen nachgewiesen werden können: erstens die On Chip- RT-PCR mit cDNA als Matrize und zweitens diese Methode als One-Step-Reaktion mit RNA als Matrize.<br><br> Beide Methoden beruhen auf dem Prinzip der PCR an immobilisierten Primern auf einer Chipoberfläche. Diese Möglichkeit der exponentiellen Amplifikation ist reproduzierbar und sensitiv.<br><br> In Experimenten zur Etablierung des On-Chip-PCR-Systems wurden für die Immobilisierung der Primer verschiedene Kopplungsmethoden verwendet. Die affine Kopplung über Biotin- Streptavidin erwies sich als geeignet. Die On-Chip-Reaktion an kovalent gebundenen Primern wurde für amino-modifizierte Primer auf Epoxy-Oberflächen sowie für EDC-Kopplung auf silanisierten Oberflächen gezeigt. Für die letztgenannte Methode wurde die On-Chip-PCR optimiert, dass Spottingkonzentrationen der Primer von 5 - 10&#181;M schon ausreichend sind. Der Einsatz von fluoreszenz-markierten Primern während der PCR ermöglicht eine unmittelbare Auswertung nach der Synthese ohne zusätzliche Detektionsschritte. In dieser Arbeit konnte außerdem mit der vorgestellten Methode der simultane Nachweis zweier Gene gezeigt werden. Die Methode kann noch als Multiplex-Analyse ausgebaut werden, um so mehrere Gene in gleichzeitig einem Ansatz nachweisen zu können.<br><br> Die Ergebnisse der Versuche mit Matrizen aus unterschiedlichen Zelltypen deuten darauf hin, dass die On-Chip-RT-PCR eine weitere optimale Methode für den Nachweis von gering exprimierten Genen bietet. / The detection of low quantities of mRNA is often difficult and methods like microarray analysis require large amount of starting material or have to be amplified before application. The reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) is often the chosen method to detect specific RNA sequences on account of its high sensitivity. The solid phase amplification technology by On-Chip-PCR provides a combination of amplification of rare target material and its on chip detection in one step.<br><br> In this report a novel application for the On-Chip-PCR technology is described. It was suitable to identify mRNA sequences and genes, respectively. For this approach we amplified cDNA sequences using immobilized specific primers and fluorescent labeled primers. They were used for genes coding subunits of the mouse muscle acetylcholine receptor (Chrna1, Chrnb1, Chrnd) and the genes coding for myogenin (Myog), muscle creatine kinase (Ckmm) and Atpase (Atp2a2). The cDNA templates were synthesized before the On-Chip application by Reverse Transcription from mRNA. For this application only at most 500 pg of total-RNA preparation was sufficient for detectable results and no pre-amplification steps were needed.<br><br> Furthermore the handling of RT-PCR could be minimized by using a One-step- RT-PCR protocol. This method used immobilized primers on glassy supports detecting specific mRNA sequences from 5 pg or less of total RNA preparations.<br> Moreover to the detection of low quantities of RNA preparation, low abundant genes could be detected by this method.

Chez la brebis, les BMPs inhibent la synthèse et la libération de FSH. La détection des ARNm de certaines BMPs dans l’hypophyse et de leurs récepteurs sur les cellules gonadotropes suggère une action paracrine/autocrine des BMPs sur la production de FSH. L’objectif de cette thèse a visé à déterminer l’importance des BMPs hypophysaires, en particulier BMP-4, dans la régulation de la sécrétion de FSH chez la brebis. Nous montrons que l’expression des ARNm du système BMP-4,analysée par RT-PCR en temps réel, ne varie pas au cours du cycle oestrien ou in vitro quelque soit le temps d’incubation (6h-48h) et le traitement (GnRH, oestradiol, activine) des cellules hypophysaires.Afin de déterminer si les cellules hypophysaires ovines sécrètent des BMPs, des milieux conditionnés(MC) hypophysaires ont été soumis à un test d’activité biologique reposant sur des cellules embryonnaires transfectées avec un élément de réponse BMPs couplé au gène rapporteur luciférase.Aucun effet des MC n’a été observé sur l’activité luciférase comparé au milieu non conditionnésuggérant l’absence ou la très faible activité BMP des MC, et cela quelque soit le temps d’incubation(6h-48h) et le traitement (GnRH, oestradiol, activine) des cellules hypophysaires. Toutefois, nous détectons une activité inhibitrice de BMPs qui est augmentée par la GnRH et l’oestradiol suggérant l’implication d’inhibiteurs de BMPs dans la régulation de la production de FSH. En conclusion,l’ensemble de nos résultats n’est pas en faveur d’un rôle de BMP-4 hypophysaire dans la synthèse de FSH chez l’adulte. Un rôle des BMPs au niveau hypophysaire via la voie endocrine peut s’envisager puisque nous avons mis en évidence une bioactivité de type BMP dans le sérum ovin. Les inhibiteurs BMPs produits par l’hypophyse, qui restent à identifier, pourraient moduler la biodisponibilité des BMPs atteignant l’hypophyse par la voie sanguine. / BMPs inhibit FSH synthesis and release in ewe. The detection of BMP mRNAs in the pituitary as well as the colocalisation of the two types of BMP receptors on gonadotrope cells suggest that these BMPs can exert paracrine/autocrine actions on FSH production. The aim of this thesis work was to determine the importance of pituitary BMPs in the regulation of FSH production in the ewe. We showed that the level of mRNAs for BMP-4 system, analyzed by real-time RT-PCR, did not vary across the oestrous cycle or in vitro whatever the incubation period (6h-48h) and the treatment (GnRH, oestradiol, activin) of pituitary cells. By using a bioactivity test based on embryonic mesenchymal cells transfected with an expression construct containing a BMP-responsive element fused to firefly luciferase reporter gene,we detected no BMP activity within conditioned media from pituitary cells whatever the incubation period (6h-48h) and the treatment (GnRH, oestradiol, activin) of the pituitary cells. However, we detected a BMP inhibitory activity which is increased by GnRH and oestradiol suggesting the implication of BMP inhibitor(s) in FSH regulation. In conclusion, the results are not in favor of a role for pituitary BMP-4 in the regulation of FSH synthesis in adult ewe. An endocrine action of BMPs at pituitary level can be evoked since BMP bioactivity was detected within ovine serum. BMP inhibitors that remain to be identified can modulate the bioavailability of BMPs reaching the pituitary by the blood way.

Submitted by Simone Souza (simonecgsouza@hotmail.com) on 2017-09-21T14:53:07Z No. of bitstreams: 1 DISS_2014_Nayara Zuchi.pdf: 3111436 bytes, checksum: 8b58de352642d734fc2fdd8891b32e5e (MD5) / Approved for entry into archive by Jordan (jordanbiblio@gmail.com) on 2017-09-26T12:55:13Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DISS_2014_Nayara Zuchi.pdf: 3111436 bytes, checksum: 8b58de352642d734fc2fdd8891b32e5e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-09-26T12:55:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DISS_2014_Nayara Zuchi.pdf: 3111436 bytes, checksum: 8b58de352642d734fc2fdd8891b32e5e (MD5) Previous issue date: 2014-03-27 / CAPES / Introdução: O gênero Alphavirus, família Togaviridae, alberga arbovírus de importância médica relatados em áreas tropicais mundialmente. Nas Américas, os alfavírus de maior importância compreendem os das encefalites equinas e o vírus Mayaro (MAYV). No Brasil, o MAYV tem sido relatado em epidemias de doença febril principalmente no norte do país. O principal objetivo deste estudo foi investigar a situação epidemiológica de alfavírus em pacientes febris durante epidemia de dengue em Mato Grosso (MT). Material e Métodos: Entre 2011 e 2012, 604 amostras de soro de pacientes com doença febril aguda suspeita de dengue durante epidemia em MT foram submetidas a Duplex-RT-PCR seguida de Multiplex-semi-nested-PCR para pesquisa dos alfavírus MAYV, vírus Aura e os vírus das encefalites equinas do Leste, Oeste e Venezuelana. Amostras positivas foram confirmadas em dois testes independentes e os produtos de PCR submetidos a sequenciamento nucleotídico. Amostras positivas foram submetidas a RT-PCR em tempo real (RT-qPCR) e isolamento viral em cultura de células. Todas as amostras foram também investigadas para flavivirus em um estudo paralelo. Resultados: Foram encontrados 15/604 (2,5 %) pacientes positivos para o MAYV em Cuiabá (9), Várzea Grande (3), Nossa Senhora do Livramento (1) e Sorriso (2). Destes, 12 (80,0 %) apresentaram co-infecções com DENV-4 e 3 (20,0 %) infecções únicas pelo MAYV. Dentre 13 amostras submetidas a RT-qPCR, 10 (76,9 %) apresentaram carga viral entre log 0,965-3,321 cópias/μL. Discussão: Casos esporádicos de infecção pelo MAYV foram identificados durante uma grande epidemia de dengue no MT em residentes de áreas urbanas, sem histórico recente de viagem ou visita a áreas rurais e/ou silvestres. A ocorrência do MAYV em estados adjacentes, em cidades afetadas pela rodovia Cuiabá-Santarém e soroprevalência em índios Xavantes no estado corroboram a evidência da circulação de MAYV no MT. Apesar do MAYV ser transmitido principalmente por Haemagogus janthinomys em áreas silvestres, as evidências encontradas no presente estudo sugerem a circulação de MAYV em área urbana de MT. Contudo, o ciclo de transmissão do vírus no estado não foi elucidado. A evidência de circulação do MAYV em indivíduos febris durante epidemia de dengue em área urbana deve ser motivo de atenção das autoridades locais de saúde pública para a eventual circulação silenciosa de outros arbovírus no estado. / Introduction: The Alphavirus genus, Togaviridae family, comprises arboviruses of medical importance reported in tropical areas worldwide. In the Americas, the most important alfaviruses are the equine encephalitis group and Mayaro virus (MAYV). In Brazil, MAYV has been reported in outbreaks of febrile illness mainly in the North region of the country. The aim of this study was to investigate the epidemiological situation of alfaviruses in febrile patients during a dengue outbreak in Mato Grosso (MT). Material and methods: Between 2011 and 2012 in MT, 604 serum samples collected from patients suspected of acute febrile illness were submitted to Duplex-RT-PCR followed by Multiplex-semi-nested-PCR for MAYV, Aura virus and East, West and Venezuelan equine encephalitis viruses. Positive samples were confirmed twice in independent tests and, PCR products were submitted to nucleotide sequencing. Positive samples were also submitted to Real time RT-PCR (RT-qPCR) and inoculation in cell culture. The samples were also investigated for flaviviruses in a parallel study. Amostras positivas foram submetidas a RT-PCR em tempo real (RT-qPCR) e isolamento viral em cultura de células. Todas as amostras foram também investigadas para flavivirus em um estudo paralelo. Results: 15/604 (2.5 %) patients from Cuiabá (9), Várzea Grande (3), Nossa Senhora do Livramento (1) and Sorriso (2) were positive for MAYV; 12 (80 %) are co-infected with DENV-4 and 3 (20 %) are single infections with MAYV. Co-infected patients presented a wider variety of clinical manifestations. Among 13 samples tested by RT-qPCR, 10 (76.9 %) presented viral load ranging from log 0,965-3,321 copies/μL. Discussion: Sporadic infections with MAYV were identified during a massive Dengue outbreak in MT in residents of urban areas without recent history of travel or visit to rural or sylvatic areas. The occurrence of MAYV infections in neighboring states, including cities affected by the Cuiabá-Santarém highway and seroprevalence in Xavante Indians from MT, corroborate the evidence of MAYV circulation in MT. Despite MAYV is transmitted mainly by Haemagogus janthinomys in sylvatic areas, the evidence found in this study suggests the circulation of MAYV in urban areas of MT. However, the transmission cycle of MAYV in MT remains to be determined. The evidence of MAYV circulation in febrile individuals during a dengue outbreak in urban areas should cause concerns in the local public health authorities about the eventual silent circulation of arboviruses in the state.

As doenças respiratórias agudas (DRAs) são as causas mais comuns de morbidez e mortalidade infantil mundial, podendo ser causadas por uma grande variedade de microorganismos. A fim de se detectar os vírus respiratórios mais comumente associados às infecções agudas do trato respiratório e traçar seu perfil epidemiológico, utilizamos um protocolo de GS RT-PCR (GeneScan Transcrição Reversa-Reação em Cadeia da Polimerase) para a rápida detecção simultânea do, vírus influenza A e B, parainfluenzavirus tipo 1, 2 e 3, picornavirus, metapneumovirus e o adenovírus. As amostras clínicas foram colhidas de crianças menores de cinco anos de idade, apresentando sintomas respiratórios, no Hospital Universitário (HU) da Universidade de São Paulo (USP), durante o ano de 2003. O GS RT-PCR se mostrou uma metodologia sensível e específica, capaz de detectar uma diversidade maior de agentes infecciosos do trato respiratório em relação à Imunofluorescência Indireta (IFI), reduzindo neste estudo a porcentagem de amostras negativas de 69,9% (235 amostras) para 22% (74 amostras). / A reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) assay based on automated fluorescent capillary electrophoresis and GeneScan software analysis was used to detect nine common respiratory viruses in clinical specimens from young children. Assays for human respiratory syncytial virus (HRSV), human parainfluenza viruses 1, 2, and 3, influenza A and B viruses, human metapneumovirus, adenovirus and picornavirus were incorporated into a screening PCR standard assay format. The optimized assay panel was used to test 336 respiratory specimens obtained from children hospitalized with acute respiratory illness (ARI) that had been previously tested by viral culture and indirect immunofluorescence staining (IIF). GS RT-PCR showed be a sensitive and specific methodology, able to detect a larger diversity of respiratory viruses regarding IFI, reducing in this study the percentage of negative samples of 69,9% (235 samples) to 22% (74 samples).

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:54:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 779211 bytes, checksum: 4a3374e8dbdb8acc4c76f3d67ff07495 (MD5) Previous issue date: 2008-02-25 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Among health problems in livestock production, infectious contagious diseases are those that stand out most being mastitis one of the main disease conditions. One of the most promising ways to reduce problems caused by infectious contagious diseases, besides sanitary control, is the selection of resistant animals, in order to incorporate this trait within the herd. The candidate gene strategy might be used as a tool for the selection of best adapted and more productive animals, whereas for the selection of the best animals, characterization of genetic expression from susceptible and resistant cows is important. Therefore, the objective of the present study was to characterize the expression of genes that can be related with mastitis resistance/susceptibility phenotype. Thus, an investigation was made on IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IFN- g and TNF- a&#305; gene expression on milk cells from Dairy Gyr and Holstein black-white (BW) cows with and without clinical mastitis, throughout real-time quantitative PCR (qPCR) technique. Six animals from each breed were evaluated three with mastitis and three without it. The total RNA was extracted from milk cells in order to synthesize the cDNA s first strand. For qPCR reactions, the GAPDH gene was used as endogenous control. Five comparisons for each gene expression analysis were made: Non-mastitis cows vs Mastitis cows from both breeds; Non- mastitis Holstein cows vs Mastitis Holstein cows; Non-mastitis Dairy Gyr cows vs Mastitis Dairy Gyr cows; Non-mastitis Holstein cows vs Non-mastitis Dairy Gyr cows; Mastitis Holstein cows vs Mastitis Dairy Gyr cows. Within Dairy Holstein BW animals, the IL-10 gene had the highest expression in mastitis animals (p<0.001), and on both breeds the IL-10 also had a higher expression on mastitis animals (p<0.05). It was also possible to identify in the healthy group a higher expression of all genes on the Holstein breed (p>0.5), being the expression of the genes IL-2 and IFN-y significantly different (p<0.001). It was possible to verify a difference, between the two breeds, on the gene expression profile of mastitis resistance/susceptibility phenotype. However, mastitis is a multifatorial disease and is affected by a large number of genes, so more genes and animals under different infection stages must be used on further studies to a better understanding of the immune response mechanism and design of more efficient strategies for control and eradication of mastitis. / Na produção animal, dentre os problemas de sanidade, as doenças infecto-contagiosas são as que mais se destacam, sendo a mastite uma das principais doenças. Uma das opções mais promissora para a redução dos problemas causados pelas doenças infecto-contagiosas, além dos cuidados sanitários, é a seleção de animais resistentes e a incorporação desta característica aos rebanhos. Como ferramenta para a seleção de animais melhores adaptados e mais produtivos pode ser utilizada a estratégia de genes candidatos, e para sua escolha é importante caracterizar a expressão gênica em animais resistentes e susceptíveis às doenças. Desta forma, o objetivo do presente trabalho foi caracterizar a expressão de genes que podem estar relacionados com o fenótipo de resistência/susceptibilidade à mastite. Para tanto, foi investigada a expressão dos genes IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL- 10, IFN- g e TNF- a&#305; em células presentes no leite de fêmeas bovinas com e sem mastite, por meio da técnica de PCR quantitativo em tempo real (qPCR). Foram avaliados seis animais da raça Holandesa Preto e Branco (PB) e seis animais da raça Gir Leiteiro, sendo três com mastite e três sem mastite dentro de cada raça. O RNA total extraído a partir de células presentes no leite de cada animal, foi usado na confecção da primeira fita de cDNA e as reações de qPCR foram realizadas usando-se o gene GAPDH como controle endógeno. Ao todo, cinco comparações foram feitas na análise de expressão de cada gene: vacas sem mastite vs vacas com mastite de ambas as raças; vacas da raça Holandesa sem mastite vs vacas da raça Holandesa com mastite; vacas da raça Gir sem mastite vs vacas da raça Gir com mastite; vacas da raça Holandesa sem mastite vs vacas da raça Gir sem mastite; vacas da raça Holandesa com mastite vs vacas da raça Gir com mastite. Dentre os animais da raça Holandesa PB, aqueles que apresentaram mastite clínica expressaram mais IL-10 (p<0,001). O gene IL-10 também foi mais expresso (p<0,05) nas vacas com mastite em comparação às vacas sem mastite quando consideradas ambas as raças. Dentre as vacas hígidas (sem mastite), as da raça Holandesa PB tenderam a expressar em maior quantidade todos os genes considerados neste estudo, sendo a expressão dos genes IL-2 e IFN-y significativamente diferente (p<0,001). Foi possível verificar diferença no perfil de expressão dos genes considerados no presente trabalho em relação ao fenótipo resistência/susceptibilidade à mastite entre as duas raças estudadas. Porém, a mastite é uma doença multifatorial e afetada por muitos genes, portanto são necessários mais estudos que incluam outros genes e maior número de animais em diferentes fases de infecção, de modo que o mecanismo de resposta imune relacionado à mastite seja melhor compreendido e venha gerar estratégias mais eficientes de controle e erradicação da mastite.

Micro-organismos persistentes que permanecem viáveis e em níveis elevados nos canais radiculares após os procedimentos endodônticos podem influenciar no sucesso do tratamento endodôntico. O objetivo deste estudo foi avaliar a quantidade e a atividade metabólica de bactérias persistentes utilizando métodos moleculares baseados em rDNA e rRNA. Foram selecionados 15 pacientes com infecções endodônticas primárias assintomáticas. Amostras microbiológicas foram coletadas dos canais radiculares após a cirurgia de acesso (S1), após o preparo químico-cirúrgico realizado com Sistema Reciproc e NaOCl 2.5% (S2) e após medicação intracanal com Ca(OH)2 por 14 dias (S3). As amostras dos canais radiculares foram submetidas à extração de DNA e RNA. O RNA foi submetido à reação de transcrição reversa para confecção de DNA complementar (cDNA). O efeito dos procedimentos endodônticos na redução bacteriana foi determinado por qPCR baseada em rDNA, utilizando iniciadores universais para a região 16S rRNA do domínio Bacteria e iniciadores espécie-específicos para Bacteroidaceae [G-1] sp oral taxon 272. A atividade metabólica de bactérias totais e Bacteroidaceae [G-1] sp oral taxon 272 foi calculada pela razão rRNA/rDNA baseados nos dados dos ensaios de qPCR. Os dados foram analisados pelo teste de Wilcoxon para análise quantitativa e teste de McNemar para comparação da taxa de detecção dos métodos, com nível de significância de 5%. Todas as amostras S1 foram positivas para bactérias totais, com uma mediana de 1,87 x 105 cópias de rDNA por amostra. Após o preparo químico-cirúrgico houve uma redução significativa de rDNA de bactérias totais (mediana 7,86 x 104, P = 0,01). Entretanto, não houve redução de rDNA bacteriano após a medicação intracanal quando comparada à etapa anterior (mediana 7,97 x 104, P > 0,05). Os resultados da razão rRNA/rDNA revelaram que houve uma redução do metabolismo de bactérias totais em S2 (mediana 1, P = 0,04) e um aumento do metabolismo bacteriano em S3 (mediana 2, P = 0,04). Na análise de Bacteroidaceae [G-1] sp oral taxon 272, o tratamento endodôntico não influenciou na redução nem no metabolismo bacteriano. Concluiu-se que o número total de bactérias foi drasticamente reduzido após o preparo químico-cirúrgico, assim como seu metabolismo. Entretanto, o metabolismo bacteriano aumentou após o uso da medicação intracanal com Ca(OH)2. Bacteroidaceae [G-1] sp. oral taxon 272 permaneceu metabolicamente ativo após o preparo químico-cirúrgico e medicação intracanal, participando, assim, da composição da microbiota persistente. / High levels of microorganisms that persist viable in root canals after endodontic procedures may influence endodontic treatment outcome. This study aimed to evaluate the amount and the metabolic activity of persistent bacteria using rRNA- and rDNA-based molecular methods. Fifteen patients with primary endodontic infections were selected. Microbiological samples were taken from root canals after access cavity (S1), after chemomechanical preparation with Reciproc System and 2.5% NaOCl (S2) and after intracanal medication with calcium hydroxide for 14 days (S3). DNA and RNA were extracted from root canal samples, and cDNA was synthetized using reverse transcription reaction. The effect of endodontic procedures on bacterial reduction was determined by rDNA-based qPCR using universal primers for 16S rRNA Bacteria domain and species-specific primers to Bacteroidaceae [G-1] sp oral taxon 272. The metabolic activity of total bacteria and Bacteroidaceae [G-1] sp oral taxon 272 was calculated by rRNA/ rDNA ratio estimated by qPCR. The data was analyzed by the Wilcoxon test for quantitative analysis and McNemar test for comparison of the detection rate of the methods, with 5% significance level. All S1 samples were positive for total bacteria, with a median value of 1.87 x 105 bacterial cells. After chemomechanical preparation a significant reduction of bacterial rDNA was observed (median 7.86 x 104, P = 0.01). Nevertheless, there was no bacterial rDNA reduction after intracanal medication when compared to S2 samples (median 7.97 x 104, P > 0.05). The rRNA/ rDNA ratio showed a reduction of total bacteria metabolism in S2 (median 1, P = 0,04), and an increase of bacterial metabolism in S3 (median 2, P = 0,04). Bacteroidaceae [G-1] sp oral taxon 272 analysis showed that endodontic treatment did not impact the amount and the metabolic activity of this taxon. In conclusion, the number and metabolism of total bacteria were severely reduced after chemomechanical preparation. On the other hand, the bacterial metabolism increased after intracanal dressing with Ca(OH)2. Bacteroidaceae [G-1] sp. oral taxon 272 remained metabolically active after chemomechanical preparation and intracanal dressing thus participating in the composition of the persistent microbiota.

Por representar a mais importante arbovirose em nível mundial, as infecções causadas pelos vírus da dengue são de grande importância em nosso país, apresentando uma ampla variedade de sintomas clínicos que vão desde infecção assintomática até formas mais graves da doença. O título de anticorpos neutralizantes produzidos frente à infecção por dengue parece ser determinante na forma de apresentação da doença no paciente. Atualmente, a forma com que o teste de neutralização é realizado demanda tempo para sua realização. O objetivo deste trabalho foi padronizar um ensaio de neutralização viral por RT-PCR em tempo real em cepas virais dos quatro sorotipos dengue para, posteriormente, ser empregada na detecção rápida e em grande escala de anticorpos em soro de pacientes e de candidatos vacinais. Para isso, foram construídas curvas padrão, para cada sorotipo viral, por meio da transcrição in vitro do RNA viral. O ensaio de neutralização padronizado nesse estudo reduziu o número de dias de detecção da neutralização em 48 horas quando comparada com a técnica de neutralização tradicional (PRNT), além de utilizar técnicas moleculares sensíveis e específicas para detecção como a RT-PCR em tempo real que garantem maior aplicabilidade do teste. / Because Dengue virus is the most important arboviral disease worldwide, infections caused by this pathogen are of great importance in Brazil, producing a wide variety of clinical symptoms ranging from asymptomatic infection to more serious forms of the disease. The title of neutralizing antibodies produced against the dengue infection appears to be determinant in the outcome of the disease. Currently, neutralization tests that have been performed take time for its execution. The aim of this study was to standardize a viral neutralization assay by real-time RT-PCR of viral strains of the four Dengue serotypes to subsequently be used for rapid detection and large-scale using antibodies of patients and for vaccine candidates. For this matter, standard curves were constructed for each Dengue serotype, by in vitro transcription of viral RNA. The neutralization assay in this study reduced the period of neutralization to 48 hours, compared to traditional neutralization test (PRNT), and it uses a more sensitive and specific molecular technique for detection of neutralizing antibodies, such as real time RT-PCR, to ensure greater applicability of the test

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Laboratory tests are essential for dengue diagnosis, in that sense algorithms are proposed, which proposes instructions for a more effective laboratory dengue diagnosis. Aim. To evaluate the performance of laboratory tests in the confirmation of suspected dengue cases, appling an algorithm, during a dengue epidemic in Goiânia, Central West Brazil 2012-2013. Methodology. This is a retrospective analytical observational study in a database of a prospective cohort with suspected dengue cases. The algorithm applied was based on three periods in the acute phase of disease, 0-3, 4-7 and >7 days after onset of symptoms (DOS) and in detection of immunoglobulins M and G (IgM and IgG), non-structural 1 protein antigen (NS1Ag) and viral RNA by reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR). Positivity was seen individually and in association of tests in the algorithm and per day of infection, and used to confirm cases. The tests performance was evaluated by the sensitivity, specificity and accuracy of each test when compared to the others association, also in the algorithm. The results were statistically analyzed using SPSS Statistics 17.0, R software and OPENEPI. Results. 592 patients with suspected dengue were included, 415 (70.1%) were laboratory confirmed. In the 0-3 DOS period, the best positivities were by RT-PCR (81.6%) and NS1Ag (63.3%). While, IgM obtained the best positivities in 4-7 and >7 DOS periods (85.5% and 93.3%, respectively). Individually, RT-PCR and IgM tests were the most efficient to add positivity to diagnosis at the beginning and at the end of the acute phase of infection, respectively. Sensitivity results were similar to those of positivity, whereas NS1Ag specificities were greater than 90% at all periods. Conclusion. The algorithm sowed which laboratorial test was the best for the course of disease. Until 3 DOS, molecular is most sensitive test; between 4-7 DOS, two techniques may be required to obtain an accurate diagnostic. NS1Ag test, presented less detection in secondary infection cases, however, they was more specific test and can be used in differential diagnosis of dengue. These results contributed to diagnostic decision in the epidemiological context with concomitant arbovirus circulation. / Introdução. Testes laboratoriais são fundamentais para o diagnóstico da dengue, nesse sentido são propostos algoritmos, que propõe instruções para um diagnóstico laboratorial de dengue mais eficaz. Objetivo. Avaliar o desempenho de testes laboratoriais na confirmação de casos suspeitos de dengue, no curso de duas epidemias (2012 e 2013) em Goiânia, Goiás, Centro-Oeste do Brasil. Metodologia. Trata-se de um estudo observacional analítico que analisou uma base de dados clínicos e laboratoriais de uma coorte prospectiva de pacientes com suspeita clínica de dengue. O algoritmo aplicado baseou-se em três períodos da doença, 0-3, 4-7 e >7 dias após o início dos sintomas (DOS) e no uso de testes de detecção das imunoglobulinas M e G (IgM e IgG), do antígeno da proteína não-estrutural 1 (NS1Ag) e do RNA viral por reação em cadeia da polimerase via transcriptase reversa (RT-PCR). Foram avaliadas a positividade dos testes individualmente e em associação de testes por dia de infecção; e a sensibilidade, especificidade e acurácia dos testes. A análise estatistica usou os programas SPSS Statistics 17.0, R software e OPENEPI. Resultados. Dos 592 pacientes selecionados, 415 (70,1%) foram confirmados laboratorialmente. No período de 0-3 DOS, a RT-PCR e NS1Ag obtiveram 81,6% e 63,3% de positividade respectivamente. IgM obteve as positividade nos períodos de 4-7 e >7 DOS (85,5% e 93,3%, respectivamente). Individualmente, os testes de RT-PCR e IgM positividade ao diagnóstico no início e no final da fase aguda da infecção, respectivamente. Os resultados de sensibilidade foram semelhantes aos de positividade, enquanto os de especificidade de NS1Ag foram superiores à 90% em todos os períodos. Conclusão. O algoritmo apontou qual teste laboratorial foi o melhor para o curso da doença. Até 3 DOS, o teste molecular é o mais sensível; Entre 4-7 DOS, duas técnicas podem ser necessárias para obter um diagnóstico preciso. O teste de NS1Ag apresenta menor detecção em casos de infecção secundária, no entanto, foi o teste mais específico, podendo ser utilizado no diagnóstico diferencial de dengue. Estes resultados contribuíram para a decisão diagnóstica no contexto epidemiológico com a circulação concomitante de arbovírus.