Caenorhabditis elegans es un nematodo de vida libre utilizado para responder interrogantes biológicos generales desde hace aproximadamente 60 años. Su fácil manipulación genética, el conocimiento del conectoma completo y la sencillez para estudiar su comportamiento, lo convierten en un excelente modelo para abordar preguntas neurobiológicas fundamentales y realizar ensayos farmacológicos. En esta tesis doctoral, empleamos al nematodo C. elegans como modelo para el estudio de la modulación neuronal de conductas asociadas a la alimentación y para la búsqueda de compuestos con potencial terapéutico. Una adecuada alimentación es esencial para la supervivencia de los animales. El sistema nervioso modula la actividad motora en función de la disponibilidad de alimento en el medio ambiente y del estado nutricional interno. Cuando los animales han experimentado un ayuno prolongado y encuentran comida nuevamente, permanecen en un área pequeña para explotar al máximo la nueva fuente de nutrientes. El estímulo de comida tanto en ratones como en invertebrados produce la liberación de serotonina (5-HT). En C. elegans, la 5-HT modula comportamientos relacionados principalmente con la presencia de alimento: aumenta el bombeo faríngeo y la deposición de huevos y suprime la locomoción. Cuando C. elegans ha permanecido en ausencia de comida por un largo período y retorna al alimento, exhibe un drástico descenso de la velocidad e incrementa el bombeo faríngeo para favorecer la ingesta de comida. Se sabe que la abrupta reducción de la locomoción en el encuentro con el alimento depende de la liberación de 5-HT desde dos neuronas serotoninérgicas denominadas NSM y ADF. Por otro lado, la tiramina (TA) y octopamina (OA), análogos de noradrenalina y adrenalina en invertebrados, respectivamente, son capaces de ejercer efectos opuestos a la 5-HT reduciendo el bombeo faríngeo y la puesta de huevos. A su vez, así como la 5-HT modula comportamientos que favorecen la alimentación en presencia de comida, la OA, por el contrario, regula conductas que son importantes durante el ayuno, como por ejemplo el aumento de la locomoción para facilitar la búsqueda de alimento. Sin embargo, las acciones ejercidas por la TA con respecto a la alimentación y locomoción aún no son del todo claras. A pesar de que existen evidencias de los efectos antagónicos entre las vías serotoninérgicas y tira/octopaminérgicas, los mecanismos y significancia de esta interacción aún no se conocen con exactitud. Es así que, mediante técnicas de biología molecular, microscopia, ensayos comportamentales y farmacológicos, nos propusimos estudiar el rol de estas aminas biogénicas en la conducta de alimentación en C. elegans. Mediante ensayos de comportamiento, observamos que mutantes nulos tdc-1, deficientes de la síntesis de TA, aun estando bien alimentados, son hipersensibles a la disminución de la locomoción en el encuentro con el alimento (lo cual se asemeja al comportamiento de animales hambreados). Esto sugiere que la 5-HT y TA ejercen efectos antagónicos en este comportamiento. Mediante ensayos de imágenes de calcio in vivo, observamos que la actividad del par de neuronas tiraminérgicas (llamadas RIM) disminuye en ausencia de alimento y aumenta paulatinamente en el regreso al mismo. Además, el agregado exógeno de TA durante el ayuno rescata parcialmente la gran desaceleración de la locomoción en la realimentación. Estos resultados en conjunto, nos permiten hipotetizar que la inhibición de la actividad de la neurona tiraminérgica durante el ayuno favorece la exacerbación de los efectos dependientes de la señal serotoninérgica en la realimentación. Finalmente, intentamos caracterizar los mecanismos moleculares involucrados en esta intermodulación. Al evaluar la actividad de las neuronas serotoninérgicas NSM y ADF en animales deficientes de TA, determinamos que la falta de TA exacerba la señal serotoninérgica en la vuelta al alimento. Esto sugiere que la TA inhibe la actividad de las neuronas serotoninérgicas apoyando nuestra hipótesis de que la disminución de la actividad tiraminérgica en el ayuno es necesaria para la exacerbada liberación de 5-HT en la realimentación. Además, de los cuatro receptores tiraminérgicos conocidos (tres GPCRs TYRA-2, TYRA-3 y SER-2 y un canal de cloruro LGC-55), encontramos que tres de ellos están implicados en la modulación de la locomoción a través de un circuito paralelo río abajo de las neuronas serotoninérgicas: los receptores TYRA-2 y TYRA-3 estimulan la locomoción, mientras que SER-2 la disminuye. En resumen, nuestros resultados sugieren que la inhibición de las neuronas tiraminérgicas durante el ayuno es clave para el comportamiento de los animales en la realimentación. Considerando las similitudes que existen en las conductas de alimentación y a la conservación de los componentes neuronales implicados en su regulación en el reino animal, nuestros resultados podrían colaborar al entendimiento del rol de estas señales no sólo en invertebrados sino también en otros animales. Hemos mencionado además que C. elegans es un excelente modelo para realizar ensayos farmacológicos. Aprovechando esta ventaja y la cercanía evolutiva entre C. elegans y otras especies de nematodos parásitos, realizamos una búsqueda de compuestos con potencial actividad antihelmíntica. Las infecciones producidas por nematodos parásitos generan una sustancial morbilidad en billones de personas y pérdidas considerables del ganado y agricultura. Dado a las deficientes políticas de salud pública y a las malas condiciones de calidad de vida e higiene, estas infecciones afectan principalmente a los países más empobrecidos. A su vez, la aparición de parásitos resistentes en el ganado se ha convertido en una preocupación global y es una complicación emergente en las helmintiasis humanas. A pesar de esto, la industria farmacéutica ha relegado el desarrollo de nuevos antihelmínticos en las últimas décadas. Por lo expuesto, la investigación de moléculas con nuevos mecanismos de acción antihelmínticos es una necesidad urgente. La dificultad para realizar ensayos con parásitos en el laboratorio, la cercanía filogenética con las demás especies dentro del filo nematoda y su fácil manipulación genética convierten al nematodo de vida libre C. elegans en un modelo eficiente para el estudio de moléculas con potencial antihelmíntico. En el segundo capítulo de esta tesis realizamos un cribado de moléculas derivadas del imidazol en C. elegans con el objetivo de identificar nuevos compuestos con acción terapéutica, específicamente con potencialidad antihelmíntica. Encontramos un compuesto, el Diisopropil-fenil imidazol (DII), que produce letalidad selectiva en nematodos adultos, siendo inocuo para células humanas en cultivo HEK-293 y larvas de D. melanogaster. Al presentar un efecto nematicida específico, decidimos estudiar en mayor profundidad su modo de acción. Evaluando la resistencia a la droga de cepas mutadas en genes que codifican para blancos moleculares de antihelmínticos conocidos, encontramos que el DII actúa a través de la subunidad no- UNC-29 de un receptor ionotrópico colinérgico muscular (AChR). UNC-29, junto con las subunidades UNC-38, UNC-63, LEV-1 y LEV-8, ha sido tradicionalmente considerada como parte del AChR de tipo L sensible a la droga antihelmíntica Levamisol (L-AChR). Las drogas, como el levamisol, que actúan como agonistas de receptores ionotrópicos colinérgicos generan la despolarización rápida de la célula muscular y parálisis del gusano. Observamos que el DII no genera estos efectos tradicionales de los agonistas nicotínicos y tampoco desplaza la curva dosis-respuesta del levamisol, como lo haría un antagonista del L-AChR. Además, determinamos que los mutantes deficientes de las demás subunidades que conforman el L-AChR clásico, son sensibles al DII. Estos resultados en conjunto sugieren que el DII actúa a través de un AChR muscular, que contiene la subunidad UNC-29, distinto al L-AChR clásico. Existen suficientes evidencias que avalan la presencia de múltiples clases de AChRs musculares con composiciones de subunidades diferentes distribuidas en el cuerpo del animal. Esto apoya nuestra hipótesis de que el blanco molecular del DII en gusanos adultos podría ser un AChR aún no identificado. En general, las larvas de parásitos son más resistentes a los antihelmínticos clásicos como el levamisol. Sin embargo, determinamos que el DII es letal para las larvas y que existe otro blanco molecular distinto a UNC-29 implicado en este mecanismo. Esto presenta una ventaja terapéutica, ya que antihelmínticos que actúan a través de más de un mecanismo de acción otorgan una terapia más efectiva y retrasan la expansión de resistencias. Creemos que el DII constituye el puntapié inicial para el desarrollo de un compuesto con potencialidad terapéutica. El hecho de que el DII presente actividad nematicida específica y que actúe a través de un blanco molecular diferente al de los antihelmínticos clásicos, sienta las bases para la dilucidación completa de su mecanismo de acción, así como la evaluación de su efectividad en nematodos parásitos. En conclusión, en este trabajo de tesis explotamos la potencialidad del nematodo C. elegans con dos objetivos bien diferentes: 1) en el capítulo I nos centramos en intentar de contribuir con el entendimiento de un interrogante biológico fundamental: ¿cómo los circuitos neuronales producen comportamientos específicos que responden a las necesidades metabólicas del organismo?, y 2) en el capítulo II, con un perfil más aplicado, nos propusimos identificar nuevas moléculas con potencialidad antihelmíntica, que en el futuro puedan ser consideradas posibles terapias antiparasitarias. / Caenorhabditis elegans is a free-living nematode that has been used for approximately 60 years to answer to general biological questions. Its easy genetic manipulation, the knowledge of its entire connectome and the simplicity to study its behavior, make it an excellent model for addressing fundamental neurobiological questions and carry out pharmacological assays. In this Ph. D. thesis, we used the nematode C. elegans as a model to study the neural modulation of feeding behaviors and to search for compounds with therapeutic potential. An adequate feeding is essential for animal survival. The nervous system modulates motor activity depending on the availability of food in the environment and the nutritional internal state. When animals have experienced a long fasting period and find food again, they stay in a small area to fully exploit the new source of nutrients. The food stimulus both in mice and invertebrates produces serotonin (5-HT) release. In C. elegans, 5-HT modulates behaviors primarily related to the presence of food: it enhances pharyngeal pumping and egg-laying and suppresses locomotion. When C. elegans has been in absence of food for a long period of time and returns to food, the worm exhibits a drastic decrease in speed and stimulates pharyngeal pumping to promote food intake. It is known that the abrupt decrease in locomotion upon food encounter depends on 5-HT release from two serotoninergic neurons called NSM and ADF. On the other hand, tyramine (TA) and octopamine (OA), norepinephrine and epinephrine analogs in invertebrates, respectively, have the potential of exerting opposite effects to 5-HT, reducing pharyngeal pumping and egg-laying. Moreover, just as 5-HT modulates behaviors that promote feeding in the presence of food, OA, on the contrary, regulates behaviors that are important during starvation, like increasing locomotion to ease the foraging for food. Nevertheless, TA feeding-and-locomotion-related behaviors are still not entirely clear. Even though there is evidence of the serotoninergic and tyra/octopaminergic antagonistic effects, the mechanisms and relevance of this interaction are not yet known exactly. Thus, using molecular biology technics, microscopy, behavioral and pharmacological assays, we decided to study the role of these biogenic amines in food-related behaviors in C. elegans. Performing behavioral assays, we observed that tdc-1 null mutants, deficient in TA synthesis, even though well-fed, are hypersensitive to the decrease in locomotion upon food encounter (which resembles the behavior of starved animals). This suggests that 5-HT and TA exert antagonistic effects on this behavior. By calcium imaging in vivo assays, we observed that the activity of the pair of tyraminergic neurons (called RIM) decreases in absence of food and increases gradually when animals return to food. Furthermore, the addition of exogenous TA during starvation partially rescues the enhanced slowdown of locomotion in refeeding. Taken together, these results allow us to hypothesize that the inhibition of the tyraminergic neuron activity during starvation favors the exacerbation of serotonergic signal-dependent effects on refeeding. Finally, we tried to characterize the molecular mechanisms involved in this intermodulation. When evaluating the activity of the serotoninergic neurons NSM and ADF in TA-deficient animals, we determined that the lack of TA exacerbates the serotoninergic signal on the return to food. This suggests that TA inhibits the activity of serotoninergic neurons supporting our hypothesis that the reduction in tyraminergic activity during starvation is necessary for the exacerbated release of 5-HT upon refeeding. In addition, of the four known tyramine receptors (three GPCRs TYRA-2, TYRA-3 and SER-2 and a chloride channel LGC-55), we found that three of them are involved in the modulation of locomotion through a parallel circuit downstream of serotonergic neurons, namely TYRA-2 and TYRA-3 receptors stimulate locomotion, while SER-2 decreases it. Summing up, our results suggest that the inhibition of tyraminergic neurons during starvation is key for animals’ behavior upon refeeding. Taking into account the similarities in feeding behaviors and the conservation of neuronal components involved in their regulation in the animal kingdom, our results could contribute to the understanding of the role of these signals not only in invertebrates but also in other animals. We have also claimed that C. elegans is an excellent model to carry out pharmacological assays. Thus, taking advantage of this and the evolutionary closeness between C. elegans and other parasitic nematode species, we conducted a search for compounds with potential anthelmintic activity. Parasitic nematode infections generate substantial morbidity in billions of people and considerable losses to livestock and agriculture. Due to deficient public health policies and low quality of life and hygiene conditions, these infections mainly affect the poorest countries. Moreover, the appearance of resistant parasites in livestock has become a global concern and is an emerging complication in human helminth infections. In spite of this, the pharmaceutical industry has relegated the development of new anthelmintics in the last decades. Therefore, the investigation of molecules with new anthelmintic mechanisms of action is an urgent need. The difficulty in testing parasites in the laboratory, the phylogenetic relationship with other species within the phylum Nematoda and the ease of its genetic manipulation, make the free-living nematode C. elegans an efficient model for the study of molecules with anthelmintic potential. In the second chapter of this Ph. D. thesis, we screened imidazole-derived molecules in C. elegans with the aim to identify new compounds with therapeutic action, specifically with anthelmintic potential. We found one compound, Diisopropylphenyl-imidazole (DII), that produces selective lethality in adult nematodes, being innocuous for cultured human HEK-293 cells and D. melanogaster larvae. As this compound has a specific nematicidal effect, we decided to study its mode of action in greater depth. By the assessment of drug resistance of strains mutated in genes encoding known anthelmintic molecular targets, we found that DII acts through a non- UNC-29 subunit of a muscle cholinergic ionotropic receptor (AChR). UNC-29, along with the UNC-38, UNC-63, LEV-1 and LEV-8 subunits, has traditionally been considered as part of the L-type AChR, sensitive to the anthelmintic drug Levamisole. Drugs, such as levamisole, which act as ionotropic cholinergic receptor agonists, generate rapid depolarization of the muscle cell and worm paralysis. We observed that DII does not generate these well-known effects of nicotinic agonists and does not shift the dose-response levamisole curve either, as a L-AChR antagonist would do. Furthermore, we determined that mutants deficient in the other subunits that form the classic L-AChR are sensitive to DII. Altogether, these results suggest that DII acts through a muscle AChR, which contains the UNC-29 subunit, different from the classic L-AChR. There is sufficient evidence to support the presence of multiple classes of muscle AChRs with different subunit compositions distributed throughout the body of the animal. This supports our hypothesis that de DII molecular target could be a still unidentified AChR. In general, parasite larvae are more resistant to classic anthelmintics like levamisole. Nonetheless, we determined that DII is lethal to larvae and that there is another molecular target other than UNC-29 involved in this mechanism. This has a therapeutic advantage since anthelmintics that act through more than one mode of action provide a more effective therapy and delay the expansion of resistance. We believe that DII constitutes the starting point for the development of a compound with therapeutic potential. The fact that DII has specific nematicidal activity and that acts through a different classic anthelmintic molecular target lays the groundwork for the complete elucidation of its mechanism of action, as well as the evaluation of its effectiveness in parasitic nematodes. In conclusion, in this thesis work we exploited the potentiality of the nematode C. elegans with two very different objectives: 1) in chapter I, we focused on trying to contribute to the understanding of a fundamental biological question, namely how neural circuits produce specific behaviors that respond to the organism metabolic needs?, and 2) in chapter II, with a more applied view, we proposed to identify new molecules with anthelmintic potential that could in the future be considered as possible antiparasitic therapies.

A patogenia da hiponatremia decorrente do uso da Fluoxetina em pacientes idosos não está bem definida. Este achado tem sido atribuído a uma secreção inapropriada do Hormônio Antidiurétido (HAD), embora ainda não tenha sido evidenciado um aumento dos níveis plasmático deste hormônio nestes pacientes. Desta forma, este trabalho visa investigar o efeito da Fluoxetina sobre o rim e mais especificamente se ela teria um efeito direto sobre o Ducto Coletor Medular Interno (DCMI) de ratos normais: 1) Estudos in vivo- 10 ratos foram suplementados com aplicações intraperitoniais diárias de 10mg/kg de Fluoxetina. Após 10 dias os animais foram sacrificados e o sangue e os rins foram coletados para posterior análise. 2) Estudos in vitro- a) estudos com a técnica de Imunoblotting para avaliar a expressão da proteína da Aquaporina 2 (AQP2) em ratos suplementados e em suspensão de túbulos de DCMI de 10 ratos normais incubados com 10-7M de Fluoxetina por 30 min. b) estudos com microperfusão de segmentos isolados do nefron- a permeabilidade osmótica à água (Pf, mm./sec) foi determinada em DCMI perfundidos de ratos normais(n=6) com a técnica standart, na presença de10-7M de Fluoxetina. Resultados: 1) Os estudos in vivo mostraram que o peso caiu de 179±1,28g para 158±1,15g (p<0,0001), o Na plasmático caiu de 139,3±0,78mEq/l para 134,9±0,5mEq/l (p<0,0001) e não houve alterações do K e do HAD plasmáticos. 2) Os estudos in vitro-a) a análise densitométrica dos ensaios com imunoblotting mostraram um aumento da expressão da proteína da AQP2 de 40%, ambos, em ratos suplementados (cont-99,6± 5,2 vs Fx 145,6±16,9, p< 0,05) e em frações de membrana da suspensão de túbulos incubados com Fluoxetina (cont-100,0±3,5.vs 143,0±2,0, p<0,01). b) A Fluoxetina aumentou a Pf nos DCMI, na ausência de HAD de 7,24±2,07 para Fx- 15,77±3,25 (p<0,01). Em resumo, nossos dados revelaram que a Fluoxetina determinou uma diminuição do peso corporal e do nível plasmático de Na sem alterar os níveis plasmáticos de K e HAD e ocasionou um aumento da expressão da proteína da AQP2 e um aumento da permeabilidade à água nos DCMI, levando-nos à conclusão de que o efeito direto da Fluoxetina no DCMI, aumentando a reabsorção de água, pode ser responsável pela hiponatremia encontrada nos pacientes idosos com depressão que fazem uso desta droga. / The pathogenesis of the hyponatremia after Fluoxetine(Fx) supply in elderly is not well understood. This event has been attributed to an inappropriate antidiuretic hormone secretion although the vasopressin enhanced plasma level has not been demonstrated yet in these pacients. Thus, this experiment was designed to investigate the effect of Fx on the kidney and more specifically if it would have a direct effect in the inner medullary collecting duct (IMCD) from normal rats: 1) in vivo study- 10 rats were supplied daily with i.p. injections of Fx 10 mg/kg. After five days, the rats were sacrificed and blood and kidneys were collected. 2) in vitro studya) Immunobloting studies for AQP2 protein expression, in IMCD from supplied rats and in IMCD tubules suspension from 10 normal rats incubated with mm./sec) Fx. by 30 min. b) Microperfusion studies- the osmotic water permeability (Pf, mm./sec) was determined in normal rats IMCD(n=6) isolated and perfused by the standart methods.Fx (10-7M) was added to the bath fluid. Results: In vivo study showed that the weight decreased from 179±1.28g to 158±1.5g(p<0.0001); the Na+ plasma level decreased from 139.3±0.78mEq/l to 134.9±0.5mEq/l(p<0.0001), the K+ and the ADH plasma level remained unchanged. In vitro study- a) the densitometric analysis of the immunobloting essays showed an increase in AQP2 protein abundance of about about 40%, both, in supplied rats (cont-99.6± 5.2 vs Fx 145.6±16.9, p< 0.05), and in membrane fraction extracted from IMCD tubule suspension incubated with Fx ( cont-100.0±3.5.vs 143.0±2.0,p<0.01). b) Fx increased the Pf in IMCD in absence of vasopressin from the control period- 7.24±2.07 to Fx- 15.77±3.25 (p<0.01). In summary, our data revealed that, after Fx, weight, and plasma Na+ level decreased, the plasma K+ and ADH levels remained unchanged, whereas the AQP2 protein abundance and the water absorption in IMCD increased, leading us to conclude that the direct effect of Fx in the IMCD, could account for the hyponatremia produced by this drug in depressed elderly.

Não disponível / Not available

A depressão é o mais comum dos distúrbios afetivos. Afeta ao menos 10% da população idosa do Brasil. Nos idosos, alguns fatores ligados ao metabolismo parecem estar bastante relacionados a esse transtorno, como uma menor concentração de noradrenalina e serotonina (5-HT) e uma maior atividade da monoaminooxidase em relação a adultos jovens. Os inibidores seletivos da recaptação da serotonina (ISRS), principalmente a sertralina, são a primeira opção no tratamento da fase aguda e manutenção dos episódios depressivos em idosos. As plaquetas vêm sendo amplamente utilizadas como modelo para estudar na periferia alterações que ocorrem no sistema nervoso central. A 5-HT apesar de ser primordialmente expressa no cérebro, também pode ser encontrada em plaquetas. Este neurotransmissor está envolvido em inúmeros aspectos do funcionamento normal do cérebro desde a regulação do humor até a regulação hormonal. A deficiência nos níveis de 5-HT pode estar intimamente ligada a alguma anormalidade na atividade da glicogênio sintase quinase 3B(GSK3B). Esta enzima exerce funções no metabolismo celular que vão desde sobrevivência celular, metabolismo e processamento de proteínas, até processos cognitivos. A atividade da GSK3B é estreitamente regulada pela fosforilação. Fosforilação no sítio ser9 inativa a enzima, enquanto que a desfosforilação neste mesmo sítio ativa a enzima. Diversos estudos têm mostrado que a forma inativa da enzima exerce um efeito neuroprotetor. O objetivo do presente estudo foi verificar a influência do tratamento com sertralina, em pacientes idosos com diagnóstico de depressão maior, sobre a 5- HT e GSK3B após 3 e 12 meses de tratamento. A quantificação da 5-HT foi realizada por HPLC e da GSK3B plaquetária, pelos métodos de ELISA e blotting, que se revelaram equivalentes. Após um ano de tratamento encontramos uma diminuição da 5-HT plaquetária nos pacientes com depressão maior com relação aos níveis basais, bem como um aumento da forma total da enzima GSK3B (GSKT), uma diminuição da forma fosforilada (pGSK) e da razão entre pGSK e GSKT (rGSK). Quando comparados os níveis de GSK3B de pacientes tratados por um ano e controles, observamos uma maior expressão de GSKT em pacientes; enquanto a pGSK e rGSK se mostraram equivalentes. Pudemos observar, portanto, uma modulação da 5-HT e da GSK3B pelo uso de sertralina. Essa modulação pode indicar que a ação antidepressiva deste fármaco pode estar associada a essas vias de sinalização / Depression is the most common affective disorders. It affects at least 10% of the elderly population of Brazil. In the elderly, some factors related to metabolism appear to be closely related to this disorder, such as lower concentration of noradrenaline and serotonin (5-HT) and increased monoamine oxidase activity in relation to young adults. The selective serotonin reuptake inhibitors (SSRI), especially sertraline are the first choice in treating acute and maintenance of depressive episodes in the elderly. Platelets have been widely used as a model to study in peripheral changes that occur in Central Nervous System. Although 5-HT is primarily expressed in the brain, it can also be found in platelets. This neurotransmitter is involved in numerous aspects of normal brain function since the regulation of mood to the hormonal regulation. A deficiency in 5-HT levels may be closely related to an abnormality in glycogen synthase kinase 3B (GSK3B) activity. This enzyme plays several functions in cell metabolism, ranging from cell survival, metabolism and protein processing, to cognitive processes. The GSK3B activity is tightly regulated by phosphorylation. Phosphorylation on Ser9 site inactives the enzyme, whereas dephosphorylation in the same site actives the enzyme. Several studies have shown that the inactive form of the enzyme plays a neuroprotective effect. The objective of this study was to investigate the influence of sertraline in elderly patients diagnosed with major depression, on platelet 5-HT and GSK3B after 3 and 12 months of treatment. Quantification of 5-HT was performed by HPLC and GSK3B by ELISA and western blotting. The methods for platelet GSK3B determination showed to be equivalent. After one year of treatment we found a decrease of platelet 5-HT in patients with major depression relative to their baseline levels, as well as an increase in the total form of GSK3B enzyme (GSKT), a decrease in phosphorylated form (pGSK) and the ratio between pGSK and GSKT (rGSK). Comparing the levels of GSK3B of patients with one year of treatment and controls, we found a higher GSKT expression in patients; while pGSK and rGSK showed to be equivalent. Therefore we observed a modulation of 5-HT and GSK3B by sertraline. This modulation may indicate that the antidepressant action of this drug may be associated with these signaling pathways

Made available in DSpace on 2016-08-10T10:38:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 FERNANDA APARECIDA VARGAS DE BRITO E ALVES.pdf: 1009586 bytes, checksum: 8dc12edf912fed637ebefe39ffdd52d4 (MD5) Previous issue date: 2012-06-30 / Introduction: Fibromyalgia is a syndrome characterized by widespread chronic pain. The syndrome is chronic with dubious possibility of healing. The prevalence in the world population varies from 0,66 to 4,4 %. It is believed that fibromyalgia is the result of abnormal changes in sensory processing of pain. In this context, are inserted gene polymorphisms T102C gene HTR2A serotonin receptor. The HTR2A gene T102C polymorphism is the presence of a thymine (T) or cytosine (C), defined by a transition from T to C at nucleotide position 102. It is a silent polymorphism receptor gene HTR2A, which determine the different levels of gene expression. Objectives: To determine and compare the allele frequency and genotype of the T102C polymorphism of the serotonin receptor gene HTR2A in a group of 48 women diagnosed with fibromyalgia and 50 healthy controls. Methodology: For this we used the PCR- RFLP , from DNA extracted from peripheral blood samples obtained from control and testing. The comparison of allele and genotype frequencies was performed by Chi -square test. Results: The results showed allele frequencies obtained for both groups were: T (46,9%) and C (53,1%). The TT genotype frequencies were found (22,9%), TC (47,9%) and CC (29,2%) for patients with fibromyalgia and TT (16%), TC (70%) and CC (14%) for controls. Conclusions: The FMS is composed of multiple characteristics that reflect a diversity of causes. Our results showed a significantly higher frequency for the CC genotype in patients with FMS, partially explaining the reduced serotoninergic response observed in such patients. / Introdução: A Fibromialgia é uma síndrome reumática caracterizada por dor difusa e crônica. A síndrome é crônica com duvidosa possibilidade de cura. A prevalência na população mundial varia de 0,66 a 4,4%. Acredita-se que a fibromialgia seja o resultado de mudanças anormais no processamento sensorial da dor. Neste contexto, inserem-se os polimorfismos do gene T102C do gene do receptor de serotonina HTR2A. O polimorfismo T102C do gene HTR2A consiste na presença de uma timina (T) ou citosina (C), definida por uma transição de um T para C na posição nucleotídica 102. Trata-se de um polimorfismo silencioso do gene do receptor HTR2A, que determinam níveis de expressão gênica diferentes. Objetivos: Determinar e comparar a freqüência alélica e genotípica do polimorfismo T102C do gene do receptor de serotonina HTR2A em um grupo de 48 mulheres diagnosticadas com fibromialgia e 50 controles saudáveis. Metodologia: Para isso foi utilizada a técnica de PCR-RFLP, a partir de DNA extraído de amostras de sangue periférico obtidas do grupo controle e testes. A comparação das freqüências alélicas e genotípicas foi feita por meio de teste Chi-quadrado. Resultados: Os resultados demonstraram as freqüências alélicas obtidas para os dois grupos foram: T (46,9%) e C (53,1%). As freqüências genotípicas encontradas foram TT (22,9%); TC (47,9%) e CC (29,2%) para os pacientes com fibromialgia e TT (16%); TC (70%) e CC (14%) para os controles. Conclusões: A SFM é composta por múltiplas características que refletem em uma diversidade de causas. Nossos resultados demonstraram que o genótipo CC foi significativamente mais comum nas pacientes com a SFM, justificando parcialmente a menor resposta serotononérgica observada nesse grupo.

Made available in DSpace on 2016-08-10T10:38:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PAULA APARECIDA BORGES PERES.pdf: 1092863 bytes, checksum: 6b1ba024090a288ed778814bb2668c7f (MD5) Previous issue date: 2012-08-31 / Despite its obscure aetiopathology, fibromyalgia is defined by diffuse musculoskeletal pain and not joint, and heightened sensitivity to palpation of certain muscle points, mainly affecting women, in a ratio of 6 to 10 women for every man. Several studies have demonstrated the role of polymorphisms of genes serotonergic, dopaminergic and catecholaminergic in the etiology of fibromyalgia. Thus, genetic factors may be determinants in the pathogenesis of fibromyalgia and some environmental factors may trigger fibromyalgia in genetically predisposed individuals. In this context, it seems that the gene polymorphism T102C serotonin receptor (5-HT2A) is relevant in susceptibility to fibromyalgia. The objective of this study was to perform a metaanalysis in order to investigate the association between polymorphism of the serotonin receptor gene (5-HT2A), the T102C SNP in susceptibility to fibromyalgia. Five studies, between the years 1999 to 2011, about 5-HT2AT102C polymorphism in fibromyalgia were selected and used for making a meta-analysis. The epidemiological profile of fibromyalgia patients revealed a mean age of 46.7 (+ 5.9) years, with extremes ranging from 21 to 77 years. The proportion between genders showed a difference of approximately 7 women for every man diagnosed fibromyalgia. The average time in which patients suffering from fibromyalgia syndrome is 7.4 (+ 2.9) years. Allele frequencies for T and C, the gene for 5- HT2AT102C were, respectively, for patients: 337 (43.1%) and 445 (56.9%) and for the controls: 362 (51.6%) and 340 (48.4%), indicating a predominance of the C allele in patients with fibromyalgia (p=0.0013). When evaluating the genotypic frequencies, we found: 73 (18.7%) TT, 191 (48.8%) and TC 127 (32.5%) CC. The control group: 98 (27.9%) TT, 166 (47.3%) and TC 87 (24.8%) CC. The CC genotype appears more frequently in the patients fibromyalgia patients (p=0.0046). A meta-analysis generated a universe of simultaneous evaluation of 742 individuals (391 fibromyalgia patients and 351 controls). The applied tests indicated no significant differences between the case and control groups. Thus, the result of the meta-analysis suggests no correlation between polymorphism in question and susceptibility to fibromyalgia. We suggest the use of a broad panel of SNPs with the intention of increasing the chances of finding an association between genetic polymorphisms and susceptibility to fibromyalgia. / Apesar de sua etiopatologia obscura, a fibromialgia é definida por dores musculoesqueléticas difusas e não articulares e sensibilidade a palpação exacerbada em determinados pontos musculares, afetando principalmente mulheres, numa proporção de 6 a 10 mulheres para cada homem. Vários estudos têm demonstrado o papel relevante dos polimorfismos de genes serotoninérgicos, dopaminérgicos e catecolaminérgicos na etiologia da fibromialgia. Desta forma, fatores genéticos podem ser determinantes na patogênese da fibromialgia e alguns fatores ambientais podem desencadear a fibromialgia em indivíduos geneticamente predispostos. Neste contexto, parece que o polimorfismo T102C do gene do receptor da serotonina (5-HT2A) pode ser relevante na suscetibilidade à fibromialgia. Assim, o objetivo do presente trabalho foi o de realizar uma meta-análise com o intuito de investigar a associação entre o polimorfismo do gene do receptor da serotonina (5- HT2A), no SNP T102C, na suscetibilidade à fibromialgia. Cinco estudos, entre os anos de 1999 a 2011, sobre o polimorfismo 5-HT2AT102C em fibromialgia foram selecionados e utilizados para a confecção de uma meta-análise. O perfil epidemiológico dos pacientes fibromiálgicos revelou uma idade média de 46,7 (+ 5,9) anos, com os extremos variando de 21 a 77 anos. Adiconalmente, a proporção entre gêneros apontou uma diferença de aproximadamente 7 mulheres com fibromialgia para cada homem diagnosticado. O tempo médio em que os pacientes sofrem da síndrome fibromiálgica é de 7,4 (+ 2,9) anos. As frequências alélicas para T e C, para o gene 5-HT2AT102C, foram, respectivamente, para os pacientes: 337 (43,1%) e 445 (56,9%) e para os controles: 362 (51,6%) e 340 (48,4%), indicando um predomínio do alelo C em pacientes com fibromialgia (p=0,0013). Ao avaliar as frequências genotípicas, encontrou-se: 73 (18,7%) TT, 191 (48,8%) TC e 127 (32,5%) CC. No grupo controle foram: 98 (27,9%) TT, 166 (47,3%) TC e 87 (24,8%) CC. O genótipo CC aparece em maior frequência no grupo dos pacientes fibromiálgico (p=0,0046). A meta-análise gerou um universo de avaliação simultânea de 742 indivíduos (391 pacientes com fibromialgia e 351 controles). Os testes aplicados não indicaram diferenças significativas entre os grupos caso e controle. Assim, o resultado da meta-análise sugere ausência de correlação entre o polimorfismo em questão e a suscetibilidade à fibromialgia. Sugerimos a utilização de um amplo painel de SNPs com a intenção de aumentar as chances de se encontrar associação entre polimorfismos gênicos e suscetibilidade à fibromialgia.

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O hipotireoidismo é uma desordem endócrina, mais prevalente no sexo feminino, e que pode causar uma série de alterações comportamentais e neurológicas, dentre elas a depressão. O flavonoide crisina, presente no maracujá do mato, própolis e mel de abelha, vem sendo estudado a alguns anos, sendo relatados seus efeitos antioxidantes, anticancerígenos, antihiperglicêmicos, ansiolíticos, e atualmente tem-se demonstrado sua atividade antidepressiva. O objetivo deste estudo foi investigar a ação terapêutica da crisina em modelo tipo depressivo induzido pelo hipotireoidismo em camundongos fêmeas C57BL/6 adultas. Primeiramernte os animais foram divididos em dois grandes grupos (n=20): controle e hipotireoidismo. O hipotireoidismo foi induzido por exposição contínua ao fármaco antitireoideo metimazol (MTZ) 0,1% + 0,475% de sucralose, durante 31 dias na água. No 31º dia foi retirado sangue da veia caudal e determinado os níveis de T3 e T4. Após os animais foram separados em quatro grupos (n=10): controle, hipotireoidismo, crisina, hipotireoidismo + crisina. A crisina (20mg/kg) foi administrada diariamente por 28 dias, via oral. Ao final do tratamento, os animais passaram por testes comportamentais de campo aberto (TCA), nado forçado (TNF) e suspensão de cauda (TSC), após realizou-se eutanásia nos animais, e coletou-se o sangue por punção cardíaca para análise bioquímica de T3 e T4, e retirou-se as estruturas cerebrais hipocampo e córtex pré frontal, para análises neuroquímicas de serotonina (5-HT), dopamina (DA), norepinefrina (NA). Nossos resultados demonstraram que os animais com hipotireoidismo apresentaram um aumento no tempo de imobilidade nos testes de TNF e TSC e a crisina foi capaz de reverter este tempo em ambos os testes. Demonstrou-se também que a crisina foi capaz de restaurar os níveis de neurotransmissores: 5-HT em ambas estruturas cerebrais e DA no hipocampo dos animais com hipotireoidismo, corroborando com os resultados dos testes comportamentais, nos quais o TNF está relacionado com o sistema serotoninérgico e o TSC com o sistema dopaminérgico. Em conclusão, nossos resultados demonstram pela primeira vez que a crisina é capaz de reverter o estado tipo depressivo induzido pelo hipotireoidismo, possivelmente por normalizar os níveis de 5-HT e DA. / The thyroid gland is one of the largest glands in the body, it produces triiodothyronine (T3) and thyroxine (T4), these hormones are responsible for body homeostasis. The reduction in the production of these hormones leads to hypothyroidism. The hypothyroidism is an endocrine disorder, more prevalent in females, which can cause a number of behavioral and neurological changes, including depression. The chrysin flavonoid present in the passion fruit of the bush, propolis and bee honey, has been studied for some years, being reported your antioxidant effect, anticancer, antihyperglycemic, anxiolytic, and currently your antidepressant activity was demonstrated. The objective of this study was to investigate the therapeutic action of chrysin in a model of like-depression induced by hypothyroidism in adult C57BL/6 female mice. First, the animals were divided into two groups (n=20): control and hypothyroidism. Hypothyroidism was induced by continuous exposure to the antithyroid drug methimazole (MTZ) 0.1% + 0.475% sucralose for 31 days on water. On the 31st day blood was drawn from the caudal vein and T3 and T4 levels were determined. After the animals were separated into four groups (n=10): control, hypothyroidism, chrysin, hypothyroidism + chrysin. The treatment of chrysin (20mg/kg) was administered daily for 28 days, orally. At the end of treatment the animals they passed for behavioral tests of open field test (OFT), forced swimming test (FST) and tail suspension test (TST), performed euthanasia in the animals, and collected the blood by cardiac puncture for biochemical analyze of T3 and T4, and the hippocampus and prefrontal cortex brain structures were removed for neurochemical analyzes of serotonin (5-HT), dopamine (DA), norepinephrine (NA). Our results demonstrated that animals with hypothyroidism showed an increase in the time of immobility in the tests of FST and TST and the chrysin was able to reverse this time in both tests. It was also demonstrated that the chrysin was able to restore the levels of neurotransmitters: 5-HT in both structures cerebral and DA in the hippocampus of animals with hypothyroidism, corroborating with the results of behavioral tests, in which FST is related to the serotonergic system and the TST with the dopaminergic system. In conclusion, our results demonstrate for the first time that chrysin is able of reversing the depressive-induced state induced by hypothyroidism, possibly by normalizing 5-HT and DA levels.

A depressão se constitui um transtorno de alta frequência mundial, apresentando como um dos fatores etiológicos, a exposição a eventos estressores. Em termos neurobiológicos, vários trabalhos da literatura sugerem a importância das projeções serotoninérgicas que partem do Núcleo Mediano da Rafe (NMnR) para o Hipocampo Dorsal (HD) na adaptação ao estresse, a partir da desconexão das associações aversivas previamente aprendidas de suas consequências comportamentais. Assim, o presente trabalho apresenta como objetivo investigar o envolvimento dos receptores tipo 5-HT1a localizados no Núcleo Mediano da Rafe no processo de evocação de memórias aversivas. Para isso, ratos Wistar foram submetidos a cirurgia estereotáxica para a implantação de uma cânula-guia direcionada ao Núcleo Mediano da Rafe (NMnR). Passado o período de recuperação, os animais foram expostos a 40 choques inescapáveis (0,6mA; 10) (condição experimental) em uma caixa de vai-e-vem. Após 24 h, os animais receberam duas injeções intracerebrais de Salina (Sal), 8OHDPAT (DPAT; 3nmoles/0,2µl; agonista de 5-HT1aR) e/ou WAY100635 (WAY; 0,3nmoles/0,2µl; antagonista de 5-HT1aR) combinadas de forma a compor os seguintes grupos experimentais: Sal+Sal, WAY+Sal, Sal+DPAT e WAY+DPAT. Cinco minutos após as injeções, todos animais foram submetidos a uma sessão de teste, na qual foram apresentados 30 choques elétricos escapáveis (0,4mA; 10) nas patas, sinalizados por uma luz (15W; 20) que permanecia acesa durante a apresentação dos choques. Durante a sessão teste foram registrados a latência, o número de esquivas, fugas, falhas e o total de cruzamentos. Um grupo controle também foi realizado, sendo que os animais foram apenas colocados na caixa, sem exposição a choques inescapáveis, sendo testados 24 h após. Os resultados foram analisados pela ANOVA de medidas repetidas. Também foi calculada porcentagem de animais desamparados (%DA) em cada condição, analisada pelo teste do Qui-quadrado. A pré-exposição a choques inescapáveis levou ao desenvolvimento de desamparo aprendido, efeito esse não atenuado pelo tratamento com DPAT, o que pode ser observado na elevada %DA em todos os grupos. Por outro lado, na condição controle, observou-se uma reduzida %DA para todos os tratamentos. Nossos resultados sugerem que a ativação de receptores de tipo 5-HT1a do NMnR não está envolvida na evocação de memórias aversivas. / The depression is a high-frequency disorder in the world, having as one of the etiological causes the exposure to stressful events. In neurobiological terms, several studies of literature suggest the importance of serononinergic projections from the Median Raphe Nucleus for dorsal hipocampus in adaptation to stress, from the disconnection of aversive associations previously learnead of its behavioral consequences. Thus, the aim of this work is to investigate the involvement of 5-HT1a receptors located in the Median Raphe Nucleus in the aversive memory recall process. For this, Wistar rats were submitted to sterioc surgery for the implantation of a guided cannula aimed to MnRN. After the recovery period, the animals were exposed to 40 inescapable shocks (0,6mA; 10 \") (experimental condition) in a shuttled box. After 24 h, the animals received two intracerebral injections of saline (Sal), 8OHDPAT (DPAT; 3nmoles / 0,2l; 5-HT1aR agonist) and / or WAY100635 (WAY; 0,3nmoles / 0,2l; antagonist 5 -HT1aR) combined to compose the following groups: Salt + Salt + WAY Sal, Sal + DPAT and WAY + DPAT. Five minutes after the injections, all animals were submitted to a test session in which were presented 30 escapable eletric footshocks (0,4mA; 10 \") sinilized by a light (15W, 20\") which remained on during the presentation of shock. During the test session were recorded latency for these responses, the number of avoidance, escape, failure and the total crossings. A control group was performed, and the animals just placed in the shuttle box, without exposing inescapable shocks. The results were analyzed by repeated measures ANOVA. It was also calculated percentage of helpless animals (%HA) in each condition analyzed by chi-square test. The pre-exposure to inescapable shocks led to the development of learned helplessness, this effect does not attenuated by treatment with DPAT, which can be observed in high % of all groups. On the other hand, in the control condition, there is a reduced % of all treatments. Our results suggest that activation of 5-HT 1a of NMnR is not involved in the evocation of aversive memories.

Danos mitocondriais e diminuição nos níveis de ATP têm sido recentemente atribuídos à sertralina. Nós investigamos o efeito da sertralina em plaquetas humanas, já que estas células demonstram várias similaridades funcionais com neurônios e astrócitos. Os efeitos da sertralina em diferentes parâmetros foram investigados em plaquetas lavadas de 18 voluntários saudáveis do sexo masculino, depois de 24h de exposição ao fármaco. A toxicidade da sertralina foi observada apenas nas concentrações mais altas, 30 e 100μM, nas quais a viabilidade das plaquetas foi significantemente reduzida a 76 ± 3% e 20 ± 2 %, respectivamente. As mesmas concentrações reduziram o ATP a 73 ± 3% e 13 ± 2 %, respectivamente. Os valores basais de glicogênio não foram afetados significativamente pelo tratamento com sertralina. A captação de glutamato foi reduzida de forma significativa após o tratamento com 3, 30 e 100 μM, em 28 ± 6 %, 32 ± 5% e 54 ± 4 %, respectivamente. Nosso estudo demonstra que a sertralina em concentrações terapêuticas não compromete a viabilidade plaquetária, porém seu uso não pode ser considerado isento de risco, pois em um cenário no qual os níveis de glutamato extracelular estão potencialmente aumentados, a sertralina poderia agravar uma condição excitotóxica / Mitochondrial damage and fall in ATP levels have been recently attributed to sertraline. We investigated the effect of sertraline on human platelets, since these cells display several functional similarities with neurons and astrocytes. The effects of sertraline on different parameters were investigated in washed platelets from 18 healthy male volunteers, after 24 h of drug exposure. Sertraline toxicity was observed only at the highest concentrations, 30 and 100 μM, which significantly reduced platelet viability to 76 ± 3% and 20 ± 2%, respectively. The same concentrations significantly decreased total ATP to 73 ± 3% and 13 ± 2%, respectively. Basal values of glycogen were not significantly affected by sertraline treatment. The glutamate uptake was significantly reduced after treatment with 3, 30 and 100 μM, by 28 ± 6%, 32 ± 5% and 54 ± 4%, respectively. Our study showed that sertraline at therapeutic concentrations does not compromise platelet viability, but its use may not be without risk, since in a scenario where extracellular glutamate levels are potentially increased, sertraline might aggravate an excitotoxic condition.

O labirinto em cruz elevado (LCE) é um dos testes de ansiedade mais empregados na atualidade. Uma característica intrigante desse modelo é a abolição dos efeitos ansiolíticos dos benzodiazepínicos como resultado de uma única experiência prévia no labirinto. Este fenômeno, chamado “one-trial tolerance” (OTT), tem recebido considerável atenção e dentre as diversas hipóteses sugeridas para explicá-lo, podemos citar uma alteração no estado emocional do animal, perda do conflito motivacional e habituação do comportamento exploratório. A descoberta de que benzodiazepínicos reduzem a atividade de neurônios serotoninérgicos, associada a resultados obtidos em testes de conflito que mostram que antagonistas serotoninérgicos podem causar efeitos ansiolíticos comparáveis aos benzodiazepínicos, levaram à noção de que a serotonina (5-HT) é o principal neurotransmissor envolvido na ansiedade. No entanto, com o uso de outros modelos animais, o envolvimento da 5-HT tem sido questionado, ao mesmo tempo em que outras aminas biogênicas, como a noradrenalina (NA), têm sido implicadas na modulação da ansiedade. Nesse estudo procedemos uma análise etofarmacológica de ratos tratados com o antagonista serotoninérgico cetanserina e os antidepressivos fluoxetina e desipramina submetidos ao teste e reteste no LCE. Esses antidepressivos aumentam os níveis sinápticos de 5-HT e NA, respectivamente. Além disso, foram medidas as concentrações plasmáticas de corticosterona - considerada um índice confiável de medo e estresse - de ratos expostos à sessão única ou repetida no LCE. As drogas administradas antes da reexposição ao labirinto não produziram efeitos ansiolíticos, replicando o fenômeno da OTT comumente associado aos benzodiazepínicos. Por outro lado, a cetanserina administrada antes da primeira sessão produziu um efeito ansiolítico, mas o tratamento subcrônica com fluoxetina e desipramina não alterou o comportamento exploratório dos animais no LCE. Ratos submetidos à sessão única ou repetida no labirinto apresentaram um aumento similar dos níveis plasmáticos de corticosterona, indicando que a reexposição ao LCE apresenta propriedades aversivas e a OTT deve estar mais relacionada à uma alteração no estado emocional do animal do que à habituação do comportamento exploratório. / The elevated plus-maze (EPM) is currently one of the most used test of anxiety. An intriguing feature of this model is the abolition of the anxiolytic effect of benzodiazepines by a single previous experience with the maze. This phenomenon, termed one-trial tolerance (OTT), has received considerable attention and among the several hypotheses suggested to explain it, we can listed a shift in the animal emotional state, lack of motivational conflict and exploratory behavior habituation. The discovery that benzodiazepines reduce the activity of serotonergic neurons, associated with results obtained in conflict tests showing that serotonergic antagonists may cause anxiolitic-like effects comparable to the benzodiazepines, has led to the notion that the serotonin (5-HT) is the most important neurotransmitter involved in the anxiety. Nevertheless, with the use of other animal models, the 5-HT involvement has been questioned, at the same time that other biogenic amines, such as noradrenalin (NA), have been implicated in the anxiety modulation. In this study, we carried out an ethopharmacological analysis of rats under treatment with the serotonergic antagonist ketanserin and the antidepressants fluoxetine and desipramine submitted to the test and retest in the EPM. These antidepressants increase the synaptic levels of 5-HT and NA, respectively. Besides, plasma corticosterone concentrations - considered a reliable index of fear and stress - of rats exposed once or twice to the EPM were measured. The drugs injected before the retest in the EPM did not produce anxiolytic effects, replicating the OTT phenomenon generally associated with the benzodiazepines. On the other hand, ketanserin injected before the first session produced an anxiolytic effect but the subchronic treatment with fluoxetine and desipramine did not change the exploratory behavior of the animals in the EPM. Naive and experienced rats show a similar increase in the plasma corticosterone levels when submitted to the EPM, indicating that the retest to EPM has aversive properties and the OTT may be more related to a change in the emotional state of the animal than to a habituation of the exploratory behavior.