CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / As serpentes do gÃnero Bothrops sÃo responsÃveis pela maior parte dos acidentes ofÃdicos ocorridos no Brasil, representando um sÃrio problema de saÃde pÃblica pela freqÃÃncia com que ocorrem e pela morbidade e mortalidade que ocasionam. Envenenamento por serpente Bothrops atrox conduz à alteraÃÃo sistÃmica que à responsÃvel pela causa preliminar de morte apÃs acidente ofÃdico. Esse trabalho teve como objetivo avaliar os efeitos farmacolÃgicos do veneno bruto da serpente Bothrops atrox (VBA) na perspectiva de elucidaÃÃo dos mecanismos fisiopatolÃgicos causados aos tecidos. Primeiramente, avaliou-se as aÃÃes do VBA no sistema de perfusÃo renal, no qual o ÃrgÃo era exposto à peÃonha de B. atrox para se avaliar as possÃveis alteraÃÃes dos parÃmetros renais. ApÃs a perfusÃo renal, os rins foram submetidos à anÃlise histolÃgica. Os parÃmetros foram analisados pelo ANOVA e Student t-test, com p<0,005. Os resultados encontrados demonstraram que VBA promoveu diminuiÃÃo significativa na pressÃo de perfusÃo (PP) e na resistÃncia vascular renal (RVR). O fluxo urinÃrio (FU) e o ritmo de filtraÃÃo glomerular (RFG) aumentaram significativamente. Foi observado aumento e diminuiÃÃo do percentual de transporte de cloreto e sÃdio, respectivamente. As alteraÃÃes histolÃgicas dos rins perfundidos foram discretas, indicando presenÃa de material proteinÃceo nos glomÃrulos e tÃbulos. Realizou-se uma investigaÃÃo da participaÃÃo do Ãxido nÃtrico (NO) nos efeitos sistÃmicos causados por VBA, em um experimento in vivo. Houve um aumento na produÃÃo de nitrito no sangue dos animais tratados com VBA. Efetuou-se o bloqueio farmacolÃgico com L-NAME e o aumento na produÃÃo de nitrito foi abolida. AtravÃs desses resultados conclui-se que o VBA causa alteraÃÃo nos parÃmetros renais e induz aumento na produÃÃo de Ãxido. / Snakes of the genera Bothrops are the most responsible for ophidian accidents occurred in Brazil, representing a serious public health problem due to their frequency, morbity and mortality rates. Envenomation caused by the species Bothrops atrox leads to systemic complication, which is responsible for the preliminary cause of death after ophidian accident. The aim of this work was to evaluate the pharmacological effects of the crude venom of Bothrops atrox (VBA), in perspective of elucidating the physiopathological mechanisms occurred in the tissues. First of all, the actions of VBA were evaluated in the renal perfusion system, in which the organ was exposed to the venom of B. atrox to evaluate possible renal parameters alterations. After the renal perfusion, the kidneys were submitted to histological analysis. The parameters were analyzed by ANOVA and Student t-test, with p<0,005. The results showed that VBA decreased the perfusion pressure (PP) and renal vascular resistance (RVR) significantly as in contrast with the urinary flow (UF) and glomerular filtration rate (GFR) which had a significant increase. It was observed both increase and reduction of the percentage of chloride and sodium transport, respectively. The histological alterations of the perfused kidneys were discrete, indicating the presence of proteinaceous substance in the glomeruli and tubules. An investigation was made - in an in vivo experiment - into the participation of nitric oxide (NO) in the systemic effects induced by VBA. There was an increase of the nitrite production in the blood of animals that received the VBA treatment. Pharmacological blockade with L-NAME was carried out and the increase of the nitrite production was nullified. Due to these results, we conclude that VBA causes alterations on renal parameters and it induces increase of the oxide production.

nÃo hà / A serpente Bothrops neuwiedi possui veneno que tem aÃÃo principalmente do tipo prÃ-coagulante, hemorrÃgica e proteolÃtica. O veneno da Bothrops neuwiedi quando inoculado, possui aÃÃo primariamente local e secundariamente sistÃmica. Os efeitos sistÃmicos do envenenamento compreendem alteraÃÃes em diferentes sistemas como: hematolÃgico, cardiovascular, hepÃtico, urinÃrio, respiratÃrio, imunolÃgico, digestÃrio e nervoso. Os mecanismos que ocasionam tais alteraÃÃes sÃo complexos e os vÃrios componentes tÃxicos dos venenos podem agir direta ou indiretamente nas cÃlulas. Este trabalho teve como objetivo investigar as possÃveis alteraÃÃes hematolÃgicas e histolÃgicas induzidas pelo veneno total e pelas fraÃÃes fosfolipase A2 e lectina C da serpente Bothrops neuwiedi, nos tempos 2, 4, 8, 16 e 24 horas em camundongos Swiss e avaliar as cabenegrinas A-I e A-II na neutralizaÃÃo das atividades biolÃgicas do veneno total da serpente Bothrops neuwiedi analisando seu potencial antiofÃdico para possÃvel complementaÃÃo da soroterapia. Foram estudadas as aÃÃes do veneno total, fosfolipase A2 e lectina C sobre o sistema hematolÃgico, avaliando o hemograma, mielograma e esplenograma em diferentes tempos. O hemograma foi realizado pelo contador de cÃlulas sanguÃneas Sysmex-Roche, modelo KX-21N, o mielograma atravÃs da contagem diferencial e morfolÃgica das cÃlulas da medula Ãssea atravÃs de lÃminas obtidas apÃs citocentrifugaÃÃo (centrÃfuga citolÃgica modelo IncibrÃs) e o esplenograma atravÃs da quantificaÃÃo e morfologia das cÃlulas em âimprintâ do baÃo. ApÃs o estudo hematolÃgico, rins, baÃo, fÃgado e coraÃÃo foram submetidos à anÃlise histolÃgica. Todos os parÃmetros estudados foram analisados pelo teste de ANOVA e pelo teste nÃo-paramÃtrico exato de Kruskal-Wallis, com p< 0,05. Os resultados mostraram que as principais alteraÃÃes quantitativas nas cÃlulas hematolÃgicas com o uso do veneno total e as fraÃÃes lectina C e fosfolipase A2 da serpente Bothops neuwiedi foram: discreto aumento do nÃmero de hemÃcias e no hematÃcrito, leucocitose e plaquetopenia no sangue perifÃrico; aumento das cÃlulas eritrÃides e mielÃides no mielograma e aumento das cÃlulas mielÃides no esplenograma. Estas alteraÃÃes foram mais evidentes nos tempo de duas e quatro horas apÃs o envenenamento. As alteraÃÃes histolÃgicas no baÃo, rins, coraÃÃo e fÃgado, caracterizaram-se principalmente, por congestÃo, edema intersticial, hemorragia, degeneraÃÃo hidrÃpica e processo inflamatÃrio. Quando os animais foram tratados com as cabenegrinas, foi verificado que estas nÃo conseguiram reverter Ãs alteraÃÃes quantitativas das cÃlulas no baÃo provocadas pelo veneno total. PorÃm, as cabenegrinas A-I e A-II em todas as diluiÃÃes utilizadas foram capazes de inibir a plaquetopenia, reduzir o aumento da concentraÃÃo de cÃlulas mielÃides no mielograma e reverter todas as alteraÃÃes histolÃgicas encontradas em todos os ÃrgÃos estudados. TambÃm foi visto que a cabenegrina A-I na diluiÃÃo 2,5:1 e as cabenegrinas A-II nas diluiÃÃes 2,5:1 e 5:1 neutralizaram as alteraÃÃes na contagem diferencial, ou seja, as referidas cabenegrinas diminuÃram o nÃmero de neutrÃfilos segmentados, refletindo tambÃm no nÃmero de neutrÃfilos totais. Estes resultados sugerem que as cabenegrinas A-I e A-II poderÃo no futuro ser utilizadas como coadjuvantes no tratamento do acidente provocado pela serpente Bothrops neuwiedi. / The venom of the Bothrops neuwiedi provokes an action mainly of the hemorrhagic, proteolytic and coagulant type. When inoculated, the venom cause primarily a local action, and secondarily a systemic action. The systemic effects of poisoning include changes in various systems such as hematological, cardiovascular, liver, urinary, respiratory, immune, digestive and nervous. The mechanisms that cause the changes are complex and the various toxic components of the venom may act directly or indirectly on the cells. This study aimed first to investigate possible histological and hematological caused by the whole venom and by the phospholipase A2 and lectin C fractions from Bothrops neuwiedi snake, at 2, 4, 8, 16 and 24 hours intervals in mice, and then evaluate the cabenegrins A-I and A-II in the neutralization of the biological activities of the snake whole venom, analyzing its anti-ophidian potential for possible complementation of serum therapy. We studied the actions of the whole venom and of the phospholipase A2 and lectin C fractions on the hematological system, evaluating the hemogram, the myelogram and the splenogram, at different times. The hemogram was performed by the Sysmex-Roche blood cell counter model KX-21N; the myelogram was performed through the differential and morphological count of bone marrow cells using slides obtained after cytospin (using Cytological Centrifuge model IncibrÃs); and the splenogram, by quantifying and morphology of the cells in "imprint" of the spleen. After the hematological study, the kidneys, spleen, liver and heart were subjected to histological analysis. All studied parameters were analyzed by the ANOVA test and by the nonparametric Kruskal-Wallis exact test, with p<0.05. The results showed that main quantitative changes in the hematological cells, using the whole venom and the phospholipase A2 and lectin C fractions were: slight increase in erythrocytes and hematocrit, leukocytosis and thrombocytopenia, with repercussion in the peripheral blood; increase of erythroid and myeloid cells in myelogram and increase in myeloid cells in the splenogram. These changes were more evident two and four hours after the poisoning. The histological changes in the kidneys, spleen, liver and heart were characterized mainly by congestion, interstitial edema, hemorrhage, hydropicdegeneration and inflammatory process. When animals were treated with cabenegrins it was detected that these could not revert the quantitative changes of the spleen cells caused by the whole venom. However, all dilutions of cabenegrins AI and A-II were able to inhibit the thrombocytopenia and the increase of myeloid cells in the myelogram, and reverse all the histological changes found in all the studied organs. The treatment with cabenegrins also showed that the cabenegrins A-I (in the 2.5:1 dilution) and the cabenegrins A-II (in the 2.5:1 and 5:1 dilutions) neutralized the changes in the differential count, i.e., these cabenegrins decreased the number of segmented neutrophils, reflecting in the total number of neutrophils. These results suggest that the cabenegrins AI and A-II may be used in the future as an adjunctive treatment of treatment of snake accidents caused by Bothrops neuwiedi.

A hemostasia previne a perda de sangue após uma lesão vascular e garante a fluidez sanguínea. Para isso há a participação de células carreadoras de fator tissular e também de plaquetas, além de fatores plasmáticos, cofatores, fosfolipídios e íons cálcio que resultam na liberação dos fibrinopeptídios do fibrinogênio e polimerização dos monômeros de fibrina, transformando-os em fibrina estável. Os polifosfatos também participam da ativação da via intrínseca da cascata de coagulação ativando o fator XII e a pré-calicreína plasmática. Os répteis possuem peculiaridades quanto ao mecanismo de coagulação, apresentando níveis altos de anticoagulantes circulantes e ausência ou deficiência de alguns fatores de coagulação. Pouco se sabe sobre a participação real dos trombócitos e polifosfatos no mecanismo hemostático de serpentes. Assim, o objetivo deste estudo foi investigar o mecanismo hemostático da serpente de C.d. terrificus, avaliando também o papel dos trombócitos e dos polifosfatos. Os testes de coagulação apresentaram tempos prolongados, mas o nível de fibrinogênio (227, 47 ± 20,38 g/dL) foi semelhante ao humano. Foi constatada a presença de FXII, que foi ativado pelos polifosfatos, reduzindo o tempo de coagulação em Rotem. Os trombócitos de C.d. terrificus (13,37 ± 1,22 x 109/L) são células nucleadas elipsoidais, que apresentam superfície lisa quando não estão ativados. Esses trombócitos agregaram com colágeno 5,84 ± 0,85 &Omega;) e cálcio ionóforo (24 ± 3,3 %). Porém, não ativaram com ADP, como previamente mostrado em outros répteis. A adesão trombocitária observada (1,25 ± 0,37 %) foi mais baixa do que em seres humanos (11%), lembrando que a adaptação do método usado não foi totalmente adequada às serpentes. Embora se saiba pouco sobre a importância das variações das características morfológicas das fibras de fibrina, que em C.d. terrificus diferem das de ratos, humanos e outras espécies descritas de mamíferos, o tipo dessa rede de fibrina pode estar influenciando no processo final da hemostasia, juntamente com a participação dos trombócitos. A eficácia do mecanismo hemostático em serpentes C.d. terrificus parece estar relacionada principalmente à ativação da coagulação pelo fator tissular. Assim, a fase de iniciação é tão eficiente quanto em mamíferos, diferindo mais na fase de propagação do coágulo, ou seja, na via intrínseca. A baixa concentração de alguns fatores de coagulação e níveis elevados de inibidores naturais, tais como a antitrombina, interfere nesse sistema mais lento e possivelmente diminui os riscos trombóticos / Hemostasis prevents blood loss after vascular injury and provides the blood flow. Platelets and tissue factor bearing cell, plasma factors, cofactors, phospholipids and calcium ions participate in this process that results in the release of fibrinogen fibrinopeptides and polymerization of fibrin monomers, converting to stable fibrin. Polyphosphates also participate in the activation of the intrinsic pathway of the coagulation cascade by activating factor XII and plasma prekallikrein. The peculiarities of blood coagulation of reptiles are high levels of circulating anticoagulants and absence or low level of some coagulation factors. The role of thrombocytes and polyphosphates in the hemostatic mechanism of snakes is not well known. The objective of this study was to investigate the hemostatic mechanism of C.d. terrificus snake evaluating the role of thrombocytes and polyphosphates. Coagulation tests showed prolonged times, but the level of fibrinogen (227.47 ± 20.38 g/dL) was similar to human. It was also observed the presence of FXII activated by polyphosphates reducing the clotting time in Rotem. Thrombocytes of C.d. terrificus (13.37 ± 1.22 x 109/L) are ellipsoidal nucleated cells, which exhibit smooth surface when not activated. These thrombocytes were activated by collagen (5.84 ± 0.85 &Omega;) and calcium ionophore (24 ± 3.3%). However, they did not aggregate with ADP as previously shown in other reptiles. The thrombocytes adhesiveness observed (1.25 ± 0.37%) was lower than in humans (11%), probably, in part because the adaptation of the method used was not fully adequate to snakes. Although little is known about the importance of morphological characteristics of C.d. terrificus fibrin fibers, which differ from rat, human and other mammalian species described, possibly this type of fibrin network may influence the final stages of hemostasis, with thrombocytes participation. The efficacy of the hemostatic mechanism in C.d. terrificus snakes seems to be mainly related to the activation of coagulation by tissue factor. Thus, the initiation phase is as efficient as in mammals, differing in the propagation phase of coagulation or intrinsic pathway. The low concentration of some coagulation factors and high levels of natural inhibitors such as antithrombin may be interfering with that system, and also preventing thrombotic diseases

A finalidade desse trabalho foi a análise de aspectos estruturais e biológicos de uma lectina do veneno de B. atrox, denominada galatrox. A purificação da galatrox envolveu dois passos cromatográficos, sendo o primeiro por afinidade em coluna de agarose-lactose e o segundo referente a aplicação do material retido no gel de agarose-lactose (LacR), em coluna de Sephadex G-25. As etapas de purificação foram monitoradas por leitura de absorbância em 280nm e SDS-PAGE. Preparações de galatrox foram submetidas à digestão in situ com tripsina e a massa molecular e o sequenciamento dos peptídeos obtidos foram determinados por espectrometria de massa (MALDI-TOF-MS e ESI-CID-MS/MS). A seqüência N-terminal de aminoácidos da galatrox foi obtida pela reação automatizada de Edman (PROCISE-419®). A atividade lectínica dessa proteína foi caracterizada por meio de testes de aglutinação de eritrócitos humanos, na presença ou ausência de diferentes carboidratos como lactose (4mM) e galactose (20mM), EDTA (5mM) e aquecimento (100ºC/10min). A desgranulação mastocitária foi determinada pela liberação de -Hexosaminidase por células RBL-2H3 sensibilizadas com IgE anti-DNP(dinitrofenil) e estimuladas com galatrox, veneno bruto, fração não retida na coluna de agarose-lactose (Lac-nR), HSA-DNP (controle positivo) ou PBS (controle negativo). O nível de indução de apoptpse e/ou necrose de células RBL-2H3 tratadas com galatrox foi avaliado pela marcação com anexina V-FITC e/ou iodeto de propídeo e analisado por citometria de fluxo (FACScanto®) com o auxílio do software (CBA-DIVA®). A camptotecina foi utilizada como referência de apoptose/necrose. A atividade edematogênica foi testada em camundongos pela injeção intraplantar de galatrox; fração Lac-nR, veneno bruto e PBS. Análise por SDS-PAGE indicou que as preparações de galatrox eram homogêneas e continham bandas de 14.000 e 28.000 de massa molecular relativa em condições redutoras ou não, respectivamente. A seqüência N-terminal foi correspondente aos seguintes aminoácidos: NNXPQDWLPMNGLXYKIFD, e a seqüência de alguns aminoácidos internos corresponderam a KDFSWEWTDR e GHSEVWLGLWDK. A atividade hemaglutinante dessa lectina foi dose-dependente e inibida por EDTA (5mM), aquecimento (100ºC/10min) e lactose (32mM, 16mM, 8mM, 4mM, 2mM, 1mM, 0,5mM). Ao contrário do veneno bruto e da fração Lac-nR, esta lectina não foi edematogênica e nem promoveu apoptose e necrose de células RBL- 2H3. A galatrox induziu uma discreta desgranulação mastocitária em comparação com o veneno bruto e a fração Lac-nR. Com base nos dados obtidos sugere-se que a galatrox é uma lectina homodímérica com 28.000 de massa molecular relativa, ligante de -galactosídeos e que apresenta similaridade estrutural com outras lectinas tipo-C do veneno de Bothrops ssp. Além disso, a galatrox comportou-se como um fraco agente pró-inflamatório e não induziu efeitos apoptótico e necrótico significantes. Finalmente, esse trabalho poderá contribuir para o melhor entendimento do impacto biológico da presença de lectinas no veneno e nos envenenamentos, bem como na geração de novos produtos biotecnológicos. / The aim of this work was the analysis of structural and biological aspects of a B. atrox venom lectin, named galatrox. The galatrox purification involved two chromatographic steps, starting with an affinity column of Lactosyl-Sepharose followed by application of the retained material on a Lactosyl-Sepharose gel (LacR) in Sephadex G-25 column. The purification steps were monitored by absorbance at 280nm and SDSPAGE. Galatrox samples were submitted to digestion in situ with trypsin and the sequencing mass of the obtained peptides were determined by mass spectrometry (MALDI-TOF-MS and ESI-CID-MS/MS). The N-terminal sequence of amino acids from galatrox was obtained by automatized Edman degradation (PROCISE-491®). The lectin activity of this protein was characterized by human erytrocytes agglutination test in presence or absence of different carbohydrates as lactose (4mM) and galactose (20mM), EDTA (5mM) and heat. The mast cells degranulation was determined by -hexosaminidase release in RBL-2H3 cells sensibilized with anti-DNP IgE and challenged with galatrox, crude venom in a non retained fraction in Lactosyl-Sepharose (Lac-nR) , HAS-DNP (positive control) or PBS (negative control). The apoptosis and/or necrosi induced level in treated RBL- 2H3 cells with galatrox was evaluated using AnnexinV and/or Propidium iodide and analysed by flow citometry (FACSCanto®) with the help software (CBA-DIVA®). The camptotecin was used with apoptosi/necrosi reference. The edematogenic was tested in mice by the intraplantar injection of galatrox, Lac-nR fraction, crude venom and PBS. SDS-PAGE analyse indicated that the galatrox preparations were homogenous and contained a single band of 14,000 or 28,000 relative molecular weight showed in reducting or non-reducting conditions, respectively. N-terminal amino acid sequence was determined as following: NNXPQDWLPMNGLXYKIFD, and some internal amino acid sequence was obtained which correspond to KDFSWEWTDR and GHSEVWLGLWDK. The hemagglutination activity of this lectin was dose dependent and inhibited by EDTA (5mM), heating (100ºC/10min) and lactose (32mM, 16mM, 8mM, 4mM, 2mM, 1mM, 0,5mM). In the other hand, the crude venom and Lac-nR fraction, this lectin was not edematogenic nor promoted apoptosis and necrosi of RBL-2H3 cells. The galatrox induced a discret mast cells degranulation compared with crude venom and Lac-nR fraction. Based in obtained datas is suggested that galatrox is a homodimeric lectin with relative molecular mass of 28,000, -galactoside bindings and that shows structural similarity with other Ctype lectins from Bothrops ssp. venom. Even more the galatrox showed to be a weak proinflamatory agent and did not induced significant apoptotic and necrotic effect. Finally this work would contribute to better understanding of the biological impact that the lectin presence in venom and in poisonings as well in the generation of a new biotechnological products.

As serpentes contêm em sua peçonha inúmeras substâncias que vão desde componentes inorgânicos até proteínas complexas com diferentes atividades sobre diversos sistemas fisiológicos. As serpentes do gênero Lachesis estão distribuídas na floresta tropical da América Central e do Sul, incluindo o Brasil. Entre as substâncias encontradas na peçonha dessas serpentes estão as fosfolipases A2 (PLA2), que constituem uma família de enzimas que catalisam a hidrólise da ligação éster sn-2 em glicerofosfolipídeos e exibem uma variedade de atividades fisiológicas e patológicas, incluindo neurotoxicidade pré e pós-sináptica. Elas induzem a formação de edema, afetam a agregação plaquetária, além de serem potentes promotores de inflamação. Os objetivos desse trabalho foram o isolamento, a caracterização estrutural e bioquímica de uma nova PLA2 presente na peçonha de Lachesis muta. A peçonha foi submetida a uma filtração em gel em coluna HiPrep Sephacryl S200, obtendo-se as frações LmS-A a LmS-K. As frações LmS-G, LmS-H e Lms-I apresentaram elevada atividade fosfolipásica, com destaque para a fração LmS-G, que foi então submetida a uma cromatografia de fase reversa, obtendo-se um pico majoritário denominado Lmr-PLA2. A sequência de aminoácidos da Lmr-PLA2 apresentou alta identidade com PLA2s já descritas na literatura, porém, com alguns resíduos distintos, caracterizando-a como uma nova PLA2. Além disso, a enzima possui o resíduo D49 na sua sequência de aminoácidos, sugerindo ser uma PLA2 cataliticamente ativa, confirmado pelo ensaio de atividade hemolítica indireta. A massa molar determinada por espectrometria de massas foi de 13,9 kDa. Através de eletroforese bidimensional, foi determinado o ponto isoelétrico de 5,49, indicando ser uma PLA2 ácida. Os parâmetros cinéticos obtidos foram velocidade máxima (Vmax) e a constante de Michaelis (Km) de 1,147 nmol/min/mL e 0,404 mM além de Kcat = 0,41 min-1, ou número de turnover, e a eficiência catalítica Kcat/Km= 1,02 mM-1min-1 sobre o substrato NOB (3-(octanoyloxy)benzoic acid). A Lmr-PLA2 inibe a agregação plaquetária, é edematogênica, mas não é miotóxica. Os níveis plasmáticos de creatina cinase, proteínas, ureia e ?-glutamiltranspeptidase de camundongos que receberam injeção de Lmr-PLA2 não foram alterados. Estes dados juntamente com as análises de miotoxicidade demonstraram que a enzima tem baixa toxicidade in vivo. A elevada atividade catalítica e baixa toxicidade da Lmr-PLA2 tornam esta molécula promissora para o desenvolvimento de fármacos. / Snakes contain numerous substances in their venom ranging from inorganic to complex proteins with different activities on various physiological systems. Snakes of the genus Lachesis are distributed in the rainforest of Central and South America, including Brazil. Among the substances found in the venom of these snakes are phospholipases A2 (PLA2), which constitute a family of enzymes that catalyze the hydrolysis of the sn-2 ester bond in glycerophospholipids and exhibit a variety of physiological and pathological activities, including neurotoxicity pre- and post-synaptic. They induce the formation of edema, affect platelet aggregation and are potent promoters of inflammation. The objectives of this work are the isolation, structural and biochemical characterization of a new PLA2 present in the venom of Lachesis muta rhombeata. The role venom was subjected to gel filtration in Sephacryl S200, obtaining fractions LMS-A to LMS-K. The fractions LMS-G, LMS-H and LMS-I exhibited phospholipase activity, particularly the fraction LMS-G, which was then subjected to reversed phase chromatography, yielding a majority peak called Lmr-PLA2. The amino acid sequence of Lmr-PLA2 showed high identity with PLA2s already described in the literature, but with some distinct residues, characterizing it as a new PLA2. Additionally, this enzyme possesses the residue D49 in its amino acid sequence, indicating that one catalytically active PLA2 confirmed by indirect hemolytic activity. The molar mass determined by mass spectrometry was 13.9 kDa and its isoelectric point 5.49, indicating that Lm-PLA2 is an acid phospholipase. The kinetic parameters were Vmax = 1.147 nmol/min/mL and Km = 0.404 mM; Kcat = 0.41 min-1, or turnover number, e a catalytic efficiency, Kcat/Km = 1.02 mM-1min-1 with NOB (3-(octanoyloxy)benzoic acid) substrate. Lmr-PLA2 inhibits platelet aggregation, causes edema, but it is not myotoxic. Plasma levels of creatine kinase, protein, urea and ?-glutamyltranspeptidase of mice injected with Lmr-PLA2 have not changed. These data together with myotoxicity analysis showed that the enzyme has low toxicity in vivo. The high catalytic activity and low toxicity of Lmr-PLA2 make this molecule promising for drug development.

Neste trabalho descrevemos o isolamento, a caracterização funcional e estrutural de uma metaloprotease hemorrágica, denominada BjussuMP-I. A proteína foi isolada da peçonha de Bothrops jararacussu por combinação de dois passos cromatográficos, utilizando filtração molecular em Sephacryl S-200, equilibrada em tampão Tris-HCl (0,01 M, pH 7,0) seguida de cromatografia de interação hidrofóbica em Phenyl-Sepharose CL-4B, equilibrada em tampão Tris-HCl (0,01 M, pH 7,6 mais NaCl 4 M) e eluída com gradiente de NaCl (4-0 M) a 25°C no mesmo tampão. BjussuMP-I é uma proteína com massa molecular de 60 kDa e pI 5,6, a qual induziu hemorragia após injeção intradérmica em camundongos, com uma dose hemorrágica mínima (DHM) de 4,5 g. A atividade hemorrágica da BjussuMP-I foi totalmente inibida após incubação com um agente quelante (EDTA), confirmando a dependência de metal da enzima para esse efeito. BjussuMP-I possui atividade proteolítica sobre a caseína e fibrinogênio e nenhum efeito sobre a gelatina. Por outro lado, demonstrou alta especificidade pela cadeia do fibrinogênio enquanto que a cadeia somente foi hidrolisada na presença de altas concentrações da metaloprotease. A protease foi ativa sobre o fibrinogênio em pH neutro e alcalino e inativada a 75 °C. A dependência de metal da enzima foi demonstrada pela inibição exercida por EDTA, EGTA e 1,10 fenantrolina. Verificou-se uma inibição parcial pelo ?-mercaptoetanol e PMSF, enquanto que leupeptina e aprotinina não afetaram a atividade fibrinogenolítica. A enzima foi ativada na presença de íons Ca++ e Mg++, sendo inibida por Mn++, Fe++, Zn++, Co++ e Ni++. Além disso, baixas concentrações da enzima produziram lise no coágulo de fibrina. BjussuMP-I também demonstrou inibição da agregação plaquetária induzida por colágeno e ADP e atividade bactericida sobre Escherichia coli e Staphylococcus aureus. Verificou-se que as atividades hemorrágica e proteolítica da BjussuMP-I foram neutralizadas pelo diterpenóide clerodane (Bt-CD) de Bacharis trimera. Também se observou uma inibição total do efeito hemorrágico, utilizando o extrato aquoso de Pentaclethra macroloba (EPema). A enzima foi reconhecida por anticorpos antineuwiedase, com uma reação de identidade imunológica parcial. A seqüência completa do cDNA da BjussuMP-I com 1540 pb codificou para uma proteína de 547 resíduos de aminoácidos, que conservou os domínios comuns a metaloproteases hemorrágicas de alto peso molecular da classe PIII: (i) pré-pró-peptideo, (ii) metaloprotease, (iii) disintegrina-símile e (iv) domínio rico em cisteína. / In this study the isolation, functional and structural characterization of a hemorrhagic metalloprotease, named BjussuMP-I is reported. The protein was isolated from Bothrops jararacussu snake venom by a combination of two chromatographic steps, using gel filtration on Sephacryl S-200 (0.01 M Tris-HCl, pH7.6 buffer) and Phenyl-Sepharose CL-4B chromatography (0.01 M Tris-HCl plus 4 M NaCl, pH7.6 buffer) followed by a concentration gradient from 4 to 0 M NaCl at 25°C in the same buffer. BjussuMP-I is a 60 kDa protein with a pI 5.6, which induced hemorrhage after intradermal injection in mice with a minimum hemorrhagic dose (MHD) of 4.5 g. The hemorrhagic activity of BjussuMP-I was totally abolished after incubation with a chelating agent (EDTA), corroborating the metal-dependence of this effect. BjussuMP-I shows proteolytic activity on casein, collagen and fibrinogen, although no effect on gelatin was observed. In addition, it presented a high specificity toward the -chain of fibrinogen, while the -chain was only hydrolyzed at high concentrations of the metalloprotease. The protease was active against fibrinogen in neutral and alkaline pH and was inactivated at 75°C. The metal dependence of the enzyme was confirmed through inhibition by EDTA, EGTA and 1,10 phenantroline. A partial inhibition was observed with -mercaptoetanol and PMSF, while leupeptin and aprotinin did not inhibit the fibrinogenolytic activity. The enzyme was active in the presence of Ca++ and Mg++ and it was inhibited by Mn++, Fe++, Zn++, Co++ and Ni++. In addition, low concentrations of the enzyme presented lyses in fibrin plate after 12 h of incubation. BjussuMP-I also displayed inhibitory effect on collagen- and ADP-stimulated platelet aggregation, as well as bactericidal activity against Escherichia coli and Staphylococcus aureus. It was reported that both hemorrhagic and proteolytic activities of BjussuMP-I were neutralized by the clerodane diterpenoide (Bt-CD) from Bacharis trimera. Full inhibition of hemorrhage was also observed by using aqueous extract from Pentaclethra macroloba (EPema). The enzyme was recognized by anti-neuwiedase antibodies in a reaction of partial immunologic identity. The complete cDNA sequence of BjussuMP-I with 1540 pb encoded open reading frames of 547 amino acid residues which conserved the common domains of P-III high molecular weight hemorrhagic metalloproteases: (i) pre-pro-peptide, (ii) metalloprotease, (iii) disintegrin-like and (iv) rich cysteine domain.

O fibrinogênio é uma glicoproteína presente no plasma composta por duas subunidades idênticas formadas por três pares de cadeias polipeptídicas (A&#945; B&#946; e &#978;), interligadas por pontes dissulfeto. A trombina cliva o fibrinogênio, liberando os fibrinopeptídeos A e B, formando fibrina e, conseqüentemente, o coágulo. Esse trabalho descreve a purificação e caracterização do fibrinogênio a partir do plasma da serpente Bothrops jararaca (B. jararaca). O fibrinogênio purificado foi obtido através de adsorção com cloreto de bário, precipitações com sulfato de amônio e cromatografia de gel filtração. O fibrinogênio de B. jararaca apresentou massa molecular de 370 kDa em condições não reduzidas e, em condições reduzidas, apresentou massas moleculares de 71, 60 e 55 kDa, similares às cadeias A&#945; B&#946; e &#978; dos fibrinogênio humano e bovino (64, 56 e 47 kDa, respectivamente). Através do seqüenciamento da região amino-terminal das cadeias polipeptídicas por degradação de Edman, foram obtidos os oito primeiros aminoácidos de cada cadeia do fibrinogênio de B. jararaca. As seqüências foram: Gly-Asp-Pro-Glu-Asp-Tyr-Leu-Gly para a cadeia A&#945;, Gly-Ser-Asp-His-Asp-Asp-Glu para a cadeia B&#946; e Glu-Ser-X-Leu-Asp-Glu-Glu-Gly para a cadeia &#978; . As seqüências foram então comparadas com a de outros animais já descritos (NCBI-National Center for Biotechnology Information, www.ncbi.nih.gov), mas devido ao pequeno número de aminoácidos obtidos não foi possível observar similaridades. Através de espectrometria de massa (MALDI-TOF) foram observadas algumas seqüências peptídicas, mas não foi possível obter a seqüência completa do fibrinogênio de B. jararaca. Essas seqüências não apresentaram homologia significante com outras seqüências já descritas. O fibrinogênio de B. jararaca foi coagulado pela trombina bovina enquanto que os venenos das serpentes B. jararaca, Crotalus durissus terrificus e Lachesis muta rhombeata não foram capazes de induzir a formação de coágulo. Além disso, os anticorpos anti-fibrinogênio de B. jararaca produzidos em coelho não reconheceram o fibrinogênio humano. Contudo, os anticorpos anti-fibrinogênio humano reconheceram o fibrinogênio de B. jararaca. Assim, mesmo apresentando similaridades entre os fibrinogênios de B. jararaca e de mamíferos, eles possuem comportamentos distintos, podendo sugerir que a B. jararaca apresenta uma molécula de fibrinogênio diferente do humano para evitar um possível auto-envenenamento. / Fibrinogen is a plasma glycoprotein that is composed of two sets of three nonidentical polypeptide chains (A&#945; B&#946; and &#978; ) which are covalently linked by disulfide bonds. Thrombin cleaves fibrinogen to form fibrin and, consequently, the fibrin clot. This work describes the purification and characterization of fibrinogen from Bothrops jararaca (B. jararaca) snake plasma. Purified fibrinogen was obtained by barium chloride adsorption, ammonium sulfate precipitation and gel filtration chromatography. B. jararaca fibrinogen showed a molecular mass of 370 kDa in non-reducing conditions, similar to human and bovine fibrinogen with 340 kDa. Reduced fibrinogen showed three chains of 71, 60 and 55 kDa, which are similar to the molecular masses of human and bovine A&#945; B&#946; and &#978; fibrinogen chains (64, 56 and 47 kDa, respectively). B. jararaca fibrinogen was clotted by bovine thrombin, however, B. jararaca, Crotalus durissus terrificus and Lachesis muta rhombeata venoms were not able to induce fibrin formation. The N-terminal sequence of B. jararaca fibrinogen chains from PVDF membranes showed only the first eight amino acids residues from each chain. The Nterminal sequence was Gly-Asp-Pro-Glu-Asp-Tyr-Leu-Gly for A&#945; chain, Gly-Ser-Asp- His-Asp-Asp-Glu for B&#946; chain, and Glu-Ser-X-Leu-Asp-Glu-Glu-Gly for &#978; chain. The B. jararaca fibrinogen chains N-terminal sequences were compared to other animal Nterminal sequences previously described. However, due to low signal detection during Edman degradation, the sequence results were not sufficient to provide an accurate Blast search identity (NCBI-National Center for Biotechnology Information, www.ncbi.nih.gov). Mass spectrometry (MALDI-TOF) analysis provides some peptide sequences that did not present the complete sequences. Besides, anti-B. jararaca fibrinogen produced in rabbit did not recognize human fibrinogen while anti-human fibrinogen recognized B. jararaca fibrinogen. Thus, despite B. jararaca fibrinogen presents a molecular mass similar to human fibrinogen, the former shows distinctive features, which protect B. jararaca snakes from a fortuitous ingress of snake venom proteins into snake circulation, which could cause a self-envenomation

O efeito inflamatório da jararagina, toxina hemorrágica do veneno de Bothrops jararaca, foi avaliado através de um sistema in vitro (células peritoneais murinas-MPACs) e in vivo (coxim plantar de camundongos), onde foi avaliada a produção de mRNA que codifica as citocinas TNF-a, IL-1b e IL-6 por RT-PCR e a liberação destas no sobrenadante de cultura e no local de injeção (ELISA). Além disso, o domínio da jararagina responsável pela liberação local das citocinas foi estudado. Nossos resultados mostram que a jararagina induziu a expressão de mRNA que codifica para o TNF-a, IL-1b e IL-6 em MPACs, 4 horas após o estímulo, entretanto a ação enzimática da jararagina interferiu com a detecção dstas citocinas no sobrenadante da cultura. A jararagina inibida com EDTA induziu a liberação destas citocinas no modelo in vitro (MPACs). No modelo in vivo foi verificada a liberação local de TNF-a, IL-1b e IL-6 no sobrenadante do homogenato do tecido, sendo a IL-6 a citocina liberada em maior quantidade. Tanto o domínio disintegrina/rico em cisteína, como o metaloproteinase, da jararagina, participam desta liberação. Este estudo mostrou o envolvimento direto de citocinas em um modelo inflamatório, liberadas pela metaloproteinase de veneno botrópico, em cultura de células e também no local da injeção. / The inflammatory effect of jararhagin, a haemorrhagic toxin from Bothrops jararaca venom, was evaluated in an in vitro (Murine Peritoneal Adherent Cells-MPACs) and in vivo system (mouse footpad), through the production of TNF-a, IL-1b and IL-6 mRNA (RT-PCR) and the release of these cytokines in the culture supernatant and locally at the site of injection (ELISA). In addition the domain of jararhagin responsible for the local release of cytokines was studied. Our results showed that the jararhagin can induce the mRNA expression for TNF-a, IL-1b and IL-6 in MPACs at 4 hours after treatment, however the enzymatic activity of jararhagin was found to affect the detection of the cytokines in the culture supernatant. The jararhagin inhibited with EDTA was found to induce the release of these cytokines by MPACs. Concerning the in vivo model, the local release of TNF-a, IL-1b and IL-6 was detected in the footpad homogenate. Both of the jararhagin domains, the metalloproteinase and the disintegrin/cystein rich domains play a role in this release. This study showed the direct involvment of cytokines in an inflammatory model, released by snake venom metalloproteinases in the cell culture and also locally at the site of injection.

O gênero Bothrops apresenta ampla distribuição pelo território brasileiro, sendo a espécie B. jararaca seu representante de maior importância médica na região sudeste. Análises genéticas e filogeográficas descrevem a existência de um grupo monofilético, denominado grupo Jararaca, que inclui, além da espécie B. jararaca, as espécies insulares B. alcatraz e B. insularis. A proximidade evolutiva entre estas espécies, cujo desenvolvimento se iniciou no Pleistoceno, e suas diferenças quanto à dieta, levantam subsídios para o entendimento de seus venenos e suas atividades biológicas. O objetivo deste estudo foi a caracterização dos componentes do veneno de B. alcatraz por diferentes metodologias analíticas com a finalidade de aprofundar o conhecimento sobre os venenos do gênero Bothrops e sobre a evolução dos venenos das espécies do grupo Jararaca. As abordagens analíticas utilizadas foram a avaliação do proteoma dos venenos do grupo Jararaca por eletroforese e identificação de proteínas por digestão com tripsina e análise por cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas (LC-MS/MS), análise do N-terminoma e do peptidoma do veneno de B. alcatraz por LC-MS/MS e análise da glicosilação dos venenos do grupo Jararaca pelo tratamento com glicosidases, cromatografia de afinidade à lectinas (concanavalin A, ConA; wheat germ agglutinin, WGA; peanut agglutininin, PNA) e caracterização do N-glicoma por MSn. Os perfis eletroforéticos unidimensionais, obtidos com e sem redução das proteínas, mostraram que o veneno de B. alcatraz difere dos venenos de B. jararaca (adultos e filhotes) e do veneno de B. insularis (adultos). O perfil eletroforético bidimensional do veneno de B. alcatraz corroborou estas diferenças e revelou que a coleta do veneno na presença ou ausência de inibidores de proteinases tem influência no número de spots visualizados. Os resultados da análise dos proteomas dos venenos do grupo Jararaca mostraram que não há diferenças qualitativas significantes entre eles, e que os três apresentam um padrão similar de distribuição das classes de toxinas. A análise quantitativa label free dos proteomas revelou algumas diferenças, indicando que o veneno de B. alcatraz apresenta maior conteúdo de metaloproteinses e fosfolipases A2, que os venenos de B. jararaca e B. insularis. A identificação do peptidoma do veneno de B. alcatraz mostrou diversas formas de peptídeos potenciadores de bradicinina, além de produtos de degradação de diferentes classes de toxinas. A avaliação da glicosilação das proteínas dos três venenos revelou que após a remoção das cadeias de N-glicanos e O-glicanos os perfis eletroforéticos se mostram mais parecidos. A identificação das proteínas do veneno de B. alcatraz que mostraram afinidade pelas lectinas revelou que a ConA interagiu com um número maior de componentes, seguida por WGA e PNA. As análises qualitativa e quantitativa do N-glicoma dos venenos do grupo Jararaca mostrou que os três venenos compartilham as mesmas estruturas de N-glicanos e em abundância relativa similar. Em conjunto, os resultados deste estudo indicaram que no grupo Jararaca, os proteomas dos venenos das espécies B. jararaca e B. insularis apresentam similaridade entre si, e se diferem do veneno de B. alcatraz, principalmente com relação ao grau de glicosilação de suas proteínas. / The Brothrops genus is largely distributed on the Brazilian territory, and B. jararaca is the species of most medical importance in the Southeastern region. Genetic and phylogeographic analyses describe the existence of a monophyletic group, named Jararaca group, which is composed of B. jararaca and of the insular species B. alcatraz and B. insularis. The close evolutionary relationship between these species, which started in the Pleistocene era, and their diet-related differences, are important aspects for the understanding of their venoms and biological activities. The aim of this study was to characterize the venom of B. alcatraz by different analytical methodologies, in order to advance the knowledge on the venoms of Bothrops genus and on the evolution of the venoms of species of the Jararaca group. The analytical approaches used in this study included the charactrization of the proteomes of the venoms of the Jararaca group by electrophoresis and protein identification by trypsin digestion and analysis by liquid chromatography coupled to mass spectrometry (LC-MS/MS), N-terminomic and peptidomic analyses of the venom of B. alcatraz by LC-MS/MS and glycosylation analyses of the venoms of the Jararaca group by treatment with glycosidases, affinity chromatography to lectins (concanavalin A, Con A; wheat germ agglutinin, WGA; peanut agglutininin, PNA) and characterization of the N-glicomes by MSn. The one-dimensional electrophoretic profiles were evaluated under reducing and non-reducing conditions and showed that the venom of B. alcatraz differs from B. jararaca (newborn and adult) and B. insularis (adult) venoms. The two-dimensional electrophoretic profile of B. alcatraz venom corroborated these differences and revealed that the milking of the venom in the presence or in the absence of proteinase inhibitors influences the number of spots visualized on the gel. The results of the analysis of venom proteomes of the Jararaca group showed no significant qualitative differences between them; moreover, the three venoms showed a similar pattern of distribution of toxins classes. However, the label free quantitative analysis of these proteomes revealed some differences, and indicated that the venom of B. alcatraz has a higher content metaloproteinses and phospholipase A2 than B. jararaca and B. insularis venoms. The identification of B. alcatraz venom peptidome showed various forms of bradykinin-potentiating peptides, as well as products of the degradation of different toxins classes. The assessment of the glycosylation level of proteins of the three venoms showed that after removal of N-glycan and O-glycan chains their electrophoretic profiles become more similar. The identification of B. alcatraz venom proteins that showed affinity for lectins indicated that ConA interacted with a larger number of components, followed by WGA and PNA. The qualitative and quantitative analysis of the N-glicome of the venoms of the Jararaca group showed that they share the same N-glycan structures, which were also found in similar relative abundance. Taken together, the results of this study indicate that in the Jararaca group, the venom proteomes of B. jararaca and B. insularis show similarity to each other and differ from the venom of B. alcatraz, especially with respect to the degree of protein glycosylation.

Orientadores: Gilberto de Nucci, Elen Cristina Teizem Landucci / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-11T21:27:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ferreira_Tatiane_M.pdf: 838991 bytes, checksum: fcfc9182e3cb79df03511f3867236e61 (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: A habilidade do veneno bruto de Lachesis muta muta e da fosfolipase A2 básica (LmTX-I) de induzir aumento da permeabilidade microvascular na pata e pele de ratos foi investigada nesse trabalho. O veneno bruto ou LmTX-I foi injetado subplantar ou intradermicamente e o edema foi medido após intervalos de tempo específicos. O volume da pata foi medido usando um hidropletismômetro, enquanto o extravasamento na pele foi medido através do acúmulo de albumina humana marcada com 125I (injetada previamente i.v.) nos sítios de pele. A liberação de histamina dos mastócitos de ratos foi medida por espectrofluorometria. O veneno bruto (0,3-3 µg/pata) ou LmTX-I (0,1-1 µg/pata) induziu edema de pata de maneira dose-dependente. A injeção intradérmica do veneno bruto (0,003-10 µg/sítio) ou LmTX-I (0,003-0,3 µg/sítio) na pele dorsal também resultou em extravasamento de proteínas plasmáticas de maneira dose-dependente. O extravasamento plasmático induzido pelo veneno bruto foi significativamente diminuído pelo tratamento com mepiramina (antagonista de receptor H1, 6 mg/kg), ciproeptadina (antagonista H1 e 5-HT2, 2 mg/kg), LNAME (inibidor não seletivo da síntese de óxido nítrico, 100 nmol/sítio), SR140333 (antagonista de receptor NK1, 1 nmol/sítio), icatibant (antagonista de receptor B2, 0,6 mg/kg) e indometacina (inibidor não seletivo das cicloxigenases, 5 mg/kg), mas não pelo tratamento com PCA4248 (antagonista de receptor de PAF, 5 mg/kg). O extravasamento na pele induzido pela LmTX-I foi significativamente inibido pela ciproeptadina, mepiramina, indometacina e PCA4248, enquanto que L-NAME, SR140333 e icatibant não tiveram efeito. Tanto o veneno bruto quanto a LmTX-I induziram a liberação de histamina de mastócitos peritoneais de ratos de maneira concentração-dependente. Em conclusão, o veneno de L. m. muta e a LmTX-I aumentam a permeabilidade microvascular por mecanismos envolvendo a ativação de mastócitos e a formação de metabólitos do ácido araquidônico. A resposta induzida pelo veneno bruto também envolve liberação de substância P, bradicinina e óxido nítrico enquanto a resposta induzida pela LmTX-I conta com a participação do PAF. / Abstract: The ability of crude venom and a basic phospholipase A2 (LmTX-I) from Lachesis muta muta venom to increase the microvascular permeability in the rat paw and skin has been investigated. Crude venom or LmTX-I were injected subplantarly or intradermically, after which oedema was measured at selected times thereafter. Paw volume was measured using a hydropletismometer, whereas skin extravasation at the skin sites was measured as accumulation of i.v. injected 125I-human serum albumin. Histamine liberation from rat mast cell was measured spectrofluorometrically. Crude venom (0.3-3 µg/paw) or LmTX-I (0.1-1 µg/paw) induced a dose-dependent rat paw oedema. Intradermal injection of crude venom (0.03-10 µg/site) or LmTX-I (0.003-0.3 µg/site) in the dorsal skin also resulted in dosedependent plasma extravasation. Crude venom-induced plasma extravasation was significantly inhibited by the histamine H1 receptor antagonist mepyramine (6 mg/kg), the histamine/5-hydroxytriptamine antagonist cyproheptadine (2 mg/kg), the nitric oxide synthesis inhibitor N?-L-nitro-arginine methyl ester (L-NAME; 100 nmol/site), the tachykinin NK1 receptor antagonist SR140333 (1 nmol/site), the bradykinin B2 receptor antagonist Icatibant (0.6 mg/kg) and the cyclooxygenase inhibitor indomethacin (5 mg/kg). The platelet-activating factor receptor antagonist PCA4248 (5 mg/kg) had no significant effect. LmTX-I-induced skin extravasation was significantly inhibited by cyproheptadine, mepyramine, indomethacin and PCA4248, while L-NAME, SR140333 and Icatibant had no effect. Additionally, both Lachesis muta muta venom and LmTX-I concentration-dependently induced histamine release from rat peritoneal mast cells. In conclusion, Lachesis muta muta venom and LmTX-I increase microvascular permeability by mechanisms involving mast cell activation and both had arachidonic acid metabolites participation. Crude venom-induced responses also involves substance P, bradykinin and nitric oxide release, whether LmTX-I-induced response involves PAF. / Mestrado / Mestre em Farmacologia