Emerging infectious diseases represent a threat to biodiversity, posing significant challenges to wildlife conservation globally. Infectious diseases can cause population declines, local extirpations and, in rare cases, complete species extinction. Among emerging pathogens, pathogenic fungi have been responsible for drastic declines in several high-profile vertebrate taxa, such as Batrachochytrium dendrobatidis causing chytridiomycosis in many species of amphibians worldwide. Recently, an emerging infectious disease, 'snake fungal disease' (SFD), caused by the fungal pathogen Ophidiomyces ophidiicola, is affecting the health of snake populations in North America by causing skin infections which can be fatal. Given the potential impact of this disease on snake biodiversity worldwide, compounded by the pressure of anthropogenic stressors that already jeopardize the viability of many snake populations, there is a clear need for ecological research in this understudied system. This dissertation is comprised of 4 data chapters focusing on the disease dynamics of snake fungal disease in Europe, and the factors resulting in differential infection. In chapter 2, I develop a large field-based data collection in 10 countries in Europe to investigate the presence of disease hotspots and the variation of disease prevalence across host species, and to examine the pathogen genotypes that are present on the landscape. I found isolated areas of disease hotspots, and models including an interactive effect of host species and which pathogen clade are present on the landscape were best at explaining disease prevalence. In chapter 3, I perform a virulence challenge assay using 120 corn snakes (Pantherophis guttatus) and 7 strains of O. ophidiicola (3 collected from Europe, 4 from the USA). This experiment reveals that pathogen genotypes associated with higher disease prevalence in Europe also have higher pathogen virulence, and that different strains from the USA show variation in virulence. These results also match both physiological host responses measured in the lab and landscape patterns of disease. In chapter 4, I explore two mitigation-driven snake translocation projects in Europe that were complicated due to O. ophidiicola outbreaks. One snake species, N. tessellata, appears highly susceptible to SFD, indicating that under stressful conditions, O. ophidiicola can cause mortality regardless of pathogen genotype, and that this snake species may be important in pathogen maintenance. Finally in chapter 5, I report the presence of a different fungal pathogen in Spain, Parannannizziopsis sp., never reported in wild snakes in Europe before. Broadly, my dissertation demonstrates coevolutionary relationships between hosts and pathogens and has important implications to snake conservation over large scales. / Doctor of Philosophy / Biodiversity conservation is under significant threat globally due to the ever-growing human population. Threats such as habitat loss, climate change, pollution and infectious diseases are all important factors that are affecting wildlife populations. Snakes, and specifically infectious diseases of snakes, have been understudied compared to that of other types of wildlife in Europe. My dissertation focuses on understanding the disease ecology and conservation implications of snake fungal disease, an infectious disease that can be life-threatening to snakes. I first developed a study of this disease in multiple countries over three years to understand how common the disease is across the landscape, which species of snakes are most infected, and how severe skin infections are. I found specific areas in Europe where disease prevalence is high and attributed these higher disease areas to specific snake species and fungal strains that interact together to cause higher infection rates (chapter 2). Secondly, I designed a controlled experimental study in the laboratory to test the capacity of different pathogenic strains, collected in Europe and the USA, to harm its host. I chose a single host species, the corn snake (Pantherophis guttatus) to test this question. I found that different pathogen strains vary in their ability to cause severe disease, and these results were confirmed with field observations. I also found that one strain collected from coastal Virginia is able to cause more severe disease when compared to all other strains (chapter 3). Finally, I found that under captive stress, strains that might not be able to cause severe disease in the wild can lead to snake mortality, specifically in one snake species that might be more susceptible than others (chapter 4). Broadly, this dissertation describes complex interactions between snakes and fungal pathogens and has relevance to reptile conservation.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / A insuficiÃncia renal aguda à uma das complicaÃÃes mais freqÃentes nos envenenamentos ofÃdicos. Contudo, a sua patogÃnese permanece obscura. Em nossos estudos foram avaliados os efeitos renais causados pelas miotoxinas purificadas dos venenos das serpentes Bothrops jararacussu (Bthtx I, Lys 49 e Bthtx II, Asp 49) e Bothrops moojeni (BmTx I, Lys 49), assim como pelas lectinas dos venenos de Bothrops moojeni (BmLec) e Bothrops jararacussu (BJcuL). Tentando avaliar o mecanismo envolvido nos efeitos renais das substÃncias acima mencionadas, foram testados os efeitos da indometacina, um bloqueador inespecÃfico de ciclooxigenase. Adicionalmente, foram avaliados os efeitos inibitÃrios do Tezosentan, um bloqueador de receptor de endotelina, nos efeitos renais causados pela miotoxina I da serpente Bothrops moojeni. Para tanto, as miotoxinas, na dosagem de 5Âg/mL, ou as lectinas, na dosagem de 10Âg/mL foram adicionadas 30 minutos depois do inÃcio dos experimentos. Contudo, a indometacina e o tezosentan foram adicionados no sistema de perfusÃo sempre no inÃcio de cada experimento na dosagem de 10Âg/mL. Os efeitos renais foram comparados com um grupo controle, onde os rins foram perfundidos somente com a soluÃÃo de Krebs-Henseleit modificada. Bthtx I, BthtxII e BmLec aumentaram a pressÃo de perfusÃo (C120= 110,28  3,09, Bthtx I120 = 171,20  6,3 *, Bthtx II120 = 175,50  7,20 * e BmLec120 = 152,50  2,10 *), a resistÃncia vascular renal (C120= 5,46  0,54, Bthtx I120= 8,62  0,37 *, Bthtx II120= 8,90  0,36 * e BmLec120= 7,77  0,30*), o fluxo urinÃrio (C120= 0,143  0,008, Bthtx I120= 0,326  0,048*, e Bthtx II120= 0,373  0,085*, BmLec120= 0,085  0,007* ), o ritmo de filtraÃÃo glomerular (C120= 0,678  0,065, Bthtx I120= 0,855  0,133 *, Bthtx II120= 1,224  0,282*, BmLec120=1,037  0,055*) e a excreÃÃo de sÃdio potÃssio e cloreto (ENa+, EK+, ECl-). PorÃm, diminuÃram os percentuais dos transportes tubulares de sÃdio (C120= 79,76  0,56, Bthtx I120= 62,23  4,12*, Bthtx II120= 70,96  2,93* e BmLec60= 77,25  1,36*) e potÃssio (C60= 66,38  3,31, Bthtx I60= 55,79  5,57 *, Bthtx II60= 50,86  6,16* e BmLec60= 59,78  3,49). A indometacina foi capaz de bloquear os efeitos causados pela miotoxina I da B. jararacussu e lectina da B. moojeni, mas reverteu parcialmente os efeitos causados pelas miotoxinas II e lectina da B. jararacussu e miotoxina I da B. moojeni. O tezosentan, por sua vez, bloqueou os efeitos causados pela miotoxina I da B. moojeni. Foi concluÃdo que prostaglandinas estÃo envolvidas nas alteraÃÃes renais promovidas pelas substÃncias isoladas das serpentes B. jararacussu e B. moojeni, enquanto que endotelina seria o principal mediador nas alteraÃÃes renais causadas pela miotoxina I da B. moojeni. / Acute renal failure is one of the most common systemic complications after snakebite. However, its pathogenesis remains obscure. In this study, we evaluated the renal effects of Bothrops jararacussu myotoxins I and II (Bthtx-I Lys 49 and BthtxII, Asp 49), Bothrops moojeni myotoxin I and the lectins from Bothrops moojeni and Bothrops jararacussu. Attempting to investigate the mechanisms involved in the renal effects of the mentioned toxins, we tested indomethacin, an unespecific cyclooxigenase inhibitor. Additionally, tezosentan, an endothelin receptor blocker, was used to evaluate the role of endothelin in the renal effects of Bothrops moojeni myotoxin I. All myotoxins (5 Âg/mL) and lectins (10Âg /mL) were added to the perfusion system 30 min after the beginning of each perfusion. Indomethacin (10Âg/mL) and tezosentan (10 Âg /mL) were always added 30 minutes before the tested substances. The renal effects were compared against a control group, where kidneys were perfused only with the modified Krebs-Henseleit solution. Myotoxins from Bothrops jararacussu and the lectin from Bothrops moojeni increased the perfusion pressure (C120= 110.28  3.09, Bthtx I120= 171.20  6.3 * ,Bthtx II120= 175.50  7.20 * and BmLec120= 152.50  2.10 *), the renal vascular resistance (C120= 5.46  0.54, Bthtx I120= 8.62  0.37 *, Bthtx II120= 8.90  0.36 * and BmLec120= 7.77  0.30*), the urinary flow (C120= 0.143  0.008, Bthtx I120= 0.326  0.048*, and Bthtx II120= 0.373  0.085* ), the glomerular filtration rate (C120= 0.678  0.065, Bthtx I120= 0.855  0.133 *, Bthtx II120= 1.224  0.282* and BmLec120= 1.037  0.055*) and the sodium, potassium and chloride excretion. On the other hand, the same substances decreased the percent of renal tubular transport of sodium (C120= 79.76  0.56, Bthtx I120= 62.23  4.12*, Bthtx II120= 70.96  2.93* and BmLec60= 77.25  1.36*), potassium (C60= 66.38  3.31, Bthtx I60= 55.79  5.57 *, Bthtx II60= 50.86  6.16* and BmLec60= 59.78  3.49*). Indomethacin inhibited the renal effects induced by Bothrops jararacussu myotoxin I and Bothrops moojeni lectin, but partially blocked the effects promoted by myotoxin II and the lectin of Bothrops jararacussu, and the effects of myotoxin I of Bothrops moojeni. Tezosentan inhibited the renal effects induced by B. moojeni myotoxin I. In conclusion, prostaglandins are involved in the renal alterations induced by myotoxins and lectins purified from the snake venoms of Bothrops jararacussu and Bothrops moojeni. In addition, endothelin is the main mediator of the renal alterations promoted by Bothrops moojeni myotoxin I

With exploding human populations and landscapes that are changing, an increasing number of wildlife species are brought to the brink of extinction. In Canada, the eastern hog-nosed snake, 'Heterodon platirhinos', is found in a limited portion of southern Ontario. Designated as threatened by the Committee on the Status of Endangered Wildlife in Canada (COSEWIC), this reptile has been losing its habitat at an alarming rate. Due to the increase in development of southern Ontario, it is crucial to document what limits the snake’s habitat to direct conservation efforts better, for the long-term survival of this species. The goals of this study are: 1) to examine what environmental parameters are linked to the presence of the species at a landscape scale; 2) to predict where the snakes can be found in Ontario through GIS-based habitat suitability models (HSMs); and 3) to assess the role of biotic interactions in HSMs. Three models with high predictive power were employed: Maxent, Boosted Regression Trees (BRTs), and the Genetic Algorithm for Rule-set Production (GARP). Habitat suitability maps were constructed for the eastern hog-nosed snake for its entire Canadian distribution and models were validated with both threshold dependent and independent metrics. Maxent and BRT performed better than GARP and all models predict fewer areas of high suitability when landscape variables are used with current occurrences. Forest density and maximum temperature during the active season were the two variables that contributed the most to models predicting the current distribution of the species. Biotic variables increased the performance of models not by representing a limiting resource, but by representing the inequality of sampling and areas where forest remains. Although habitat suitability models rely on many assumptions, they remain useful in the fields of conservation and landscape management. In addition to help identify critical habitat, HSMs may be used as a tool to better manage land to allow for the survival of species at risk.

Os venenos de serpentes são misturas complexas com composição variada, possuindo constituintes orgânicos e inorgânicos. Dentre os compostos orgânicos, destacam-se as proteínas, tóxicas e/ou com altas atividades enzimáticas. Desta forma, os venenos desenvolvem importante papel na captura de presas e auxílio à digestão. Venenos de serpentes da família Viperidae apresentam ampla e variada gama de ações biológicas, como proteólise, coagulação, hemorragia, neurotoxicidade e miotoxidade. Populações de serpentes habitantes endemicamente em ilhas são bons modelos para estudos de evolução, especialmente quando comparadas a espécies de mesmo gênero que habitam o continente. Espécies ancestrais de serpentes do gênero Bothrops sofreram isolamento geográfico cerca de 9 mil anos atrás, quando no Período Pleistoceno porções de terra na região Sudeste do Brasil foram isoladas do continente, levando a formação de ilhas costeiras, devido a elevação do nível do mar. Tal isolamento deu origem a novas espécies insulares pertencentes ao gênero Bothrops. Estudos relacionados aos venenos destas espécies, suas especificidades e diferenças com relação a serpentes continentais são escassos. O Arquipélago de Alcatrazes localiza-se no litoral de São Paulo, distando aproximadamente 35 Km da costa. Não há relatos da existência de mamíferos na ilha, com exceção de morcegos. Serpentes adultas da espécie Bothrops alcatraz, endêmica da Ilha de Alcatrazes, apresentam características encontradas em serpentes juvenis do grupo das jararacas, como a dieta baseada exclusivamente em animais ectotérmicos e a composição diferenciada do veneno. O presente trabalho tem como objetivo caracterizar as principais ações do veneno da serpente B. alcatraz, espécie endêmica e ilhoa, isolando cromatograficamente suas frações. Resultados indicam no veneno de B. alcatraz apresenta as atividades coagulante sobre plasma humano, fosfolipásica, miotóxica e edematogênica mais ativas quando comparadas com as ações do veneno de B. jararaca do continente. As ações proteolítica, hemorrágica e toxicidade para camundongos são mais potentes no veneno de B. jararaca. A presença de ação neurotóxica específica para artrópodes no veneno de B. alcatraz sugere a ação de uma fosfolipase A2, a qual foi isolada cromatograficamente. As propriedades e composição do veneno de B. alcatraz indicam uma provável evolução de toxinas adaptadas a seu tipo de presa/alimento. / Snakes venoms are complex mixtures with varied composition constituted by organic and inorganic molecules. The main organic components are proteins, which can be toxic and show high enzymatic activities, thus playing important role in prey capture and digestion in snakes. Viperidae snakes family show wide range of biological actions, as proteolytic, coagulant, hemorrhagic, neurotoxic and myotoxic activities. Snake populations inhabiting endemically islands are useful models for evolution studies, specially when compared to their congeneric continental species. Bothrops species ancestors from Southeastern Brazil underwent geographic isolation about 9 thousand years ago, during the Pleistocene Period, when land portions were separated from the continent by the sea. The isolation originated new (island endemic) Bothrops species. Studies related to those snake venoms, its specialties and differences among continental species of the genera Bothrops are scarce. The Alcatrazes Archipelago is located in São Paulo coast, 35 kilometer far from the continent. There are no register of mammals in those islands, except for bats. Bothrops alcatraz is endemic from the Alcatrazes Island. Adults show some similarities to young specimens from the continental jararaca group. They feed exclusively on ectothermic animals and their venom shows a different composition. The aim of this study was to analyze the endemic island snake, B. alcatraz, venom, isolating by chromatography the venom fractions. Results indicated that B. alcatraz venom presents coagulant, phospholipase, myotoxic and edema forming activities higher than continental B. jararaca venom. The proteolytic, haemorrhagic and mice toxicity are higher on B. jararaca venom. The specific neurotoxic action in arthropods of B. alcatraz venom suggests a phospholipase A2 action, which was isolated bt cromatography. The properties and composition of B. alcatraz venom indicates a possible evolution of toxins adapted to the prey kinds.

Alguns estudos têm proposto que os acidente ofídicos em crianças estão associados a maior gravidade e ao maior risco de desenvolvimento de complicações comparados aos acidentes em adultos. Este estudo retrospectivo descreve as características de acidentes causados por serpentes do gênero Bothrops admitidos no Hospital Vital Brazil/Instituto Butantan/SP (HVB/IB) e compara a gravidade, e necessidade de soroterapia antiveneno e o risco para o desenvolvimento de complicações entre crianças (menores de 13 anos) e adultos. Trata-se de uma coorte histórica que utilizou dados de prontuários do arquivo do HVB/IB de dezembro de 1999 a junho de 2003. Foram incluídos no estudo pacientes que trouxeram a serpente ou apresentavam manifestações clínicas ou laboratoriais compatíveis com envenenamento botrópico. Não foi observada diferença estatisticamente significante na freqüência da gravidade dos envenenamentos, no número de ampolas administradas e na freqüência de complicações entre os dois grupos estudados. O estudo sugere que os acidentes ofídicos causados por serpentes do gênero Bothrops apresentam gravidade semelhante na avaliação admissional e evolução com a mesma proporção de complicações em crianças quando comparados aos acidentes em adultos / Some studies propose that the level of severity of the accidents caused by snakes in children can be associated with a stronger envenoming and a higher risk of later complication if compared to the same accidents in adults. This retrospective study aim to describe the caracteristics of snakebites acidents of the genus Bothrops, and compare their severities, necessity of antivenom, and the risk of developing later complications between children (less than 13 years) and adults, all the accidents where admitted at Hospital Vital Brazil/Instituto Butantan/SP, Brazil (HVB). This retrospective cohort study was carried out by using HVB\'s records of snakebite victims, from December 1999 to June 2003. Patients included were those who brought the snake and/or have the clinical or laboratorial presence of abnormalities compatible with Bothrops envenoming. No statistic differences were found between the two groups of this study concerning the severity of envenoming, number of antivenom vials and the frequency of complications. This study suggests that snakebite accidents are similar between adults and children. Age is not supposed to be a predictor of complication in such accidents

As peçonhas de serpente do gênero Bothrops se caracterizam por induzir miotoxicidade, edema, coagulação e hemorragia. Por essa razão, alguns pesquisadores estão buscando por tratamentos alternativos contra os envenenamentos ofídicos com inibidores naturais e artificiais. O presente estudo tem como objetivo estudar as interações entre as PLA2s (Asp49 e Lys49) de veneno de serpente Bothrops jararacussu, denominadas BthTX-I e BthTX-II, respectivamente, e o inibidor vegetal isolado da espécie Cordia verbenacea. C. verbenacea apresenta diversas atividades farmacológicas já demonstradas, sendo utilizada também pela população como antiofídica. O extrato hidroalcoólico das folhas preparado à seco, foi submetido a técnicas cromatográficas como Sephadex LH-20 e CLAE, obtendo-se a purificação do princípio ativo antiofídico da planta, denominado ácido rosmarínico. A peçonha de B. jararacussu foi submetida à cromatografia de filtração em gel Sephadex G-75 e, à cromatografia de troca iônica. O ácido rosmarínico (AR) foi isolado do extrato metanólico de C. verbenacea e apresentou inibição da hemorragia provocada pela peçonha bruta de B. jararacussu. Em comparação, o ácido rosmarínico® também inibiu o efeito hemorrágico causado pela peçonha bruta de B. jararacussu. A atividade edematogênica provocada pelas toxinas BthTX-I e II foi avaliada e testada com os inibidores. Ambos AR e AR® não inibiram significativamente a induçào de edema. Resultados semelhantes foram obtidos com as atividades anticoagulante, e fosfolipásica. O ácido rosmarínico, AR e AR®, demonstrou alto efeito inibitório sobre a citotoxicidade e miotoxicidade induzida pela peçonha bruta e pela toxina BthTX-I. Ambos inibidores apresentou um menor efeito sobre a atividade miotóxica induzida pela toxina BthTX-II. Simulações de docking realizadas com três PLA2s e AR mostraram perfis de interações similares, reforçando as principais interações enzima-inibidor obtidas experimentalmente, relatadas na literatura. Os cálculos de derivação de farmacóforo baseados em diferentes inibidores relatados na literatura, assim como estudos de campos de interação molecular foram realizados, nos quais os resultados indicaram as principais modificações na estrutura do inibidor ácido rosmarínico necessárias para otimização. Nas simulações de screening virtual, novos potenciais inibidores de BthTX-I foram selecionados a partir de base de dados de compostos drug-like, direcionando os próximos passos aos testes biológicos, os quais serão realizados com esta fosfolipase e os novos candidatos a inibidores modelados. / Snake venoms from Bothrops genus are characterized by inducing myotoxicity, edema, thrombosis and hemorrhage. Thus, some researchers are searching for alternative treatments against ophidian poisoning with natural and artificial inhibitors. This work aimed study the interactions between PLA2s (Asp49 e Lys49) from Bothrops jararacussu snake venom, named BthTX-I and BthTX-II, respectively, and the inhibitor isolated from Cordia verbenacea plant. C. verbenacea presents several pharmacological activities already demonstrated, and it is also used by the population by its antiophidic activity. The hydroalcoholic extract prepared from the dried leaves, was submitted to chromatographic techniques as Sephadex LH-20 and HPLC, resulting in the purification of the antiophidian compound active from the plant, named rosmarinic acid. B. jararacussu snake venom was submitted to gel filtration chromatography on Sephadex G-75 and ion exchange chromatography. Rosmarinic acid (RA) was isolated from the C. verbenacea methanolic extract and it presented hemorrhage inhibition caused by crude venom from B. jararacussu. In comparison with this, Rosmaric acid® also inhibited the hemorrhagic effect caused by crude venom from B. jararacussu. Edematogenic activity caused by BthTX-I and II was evaluated and tested with the inhibitors. Both, RA e RA® did not inhibit the edema indution significantly. Similar results were obtained with the anticoagulant and phospholipasic activity. The rosmarinic acid, RA e RA®, presented high inhibitory effect for myotoxicity and cytotoxicity induced by crude venom and the toxin BthTX-I. Both inhibitors presented minor effect on myotoxicity activity induced by BthTX-II toxin. Docking simulations performed with three PLA2 and RA have shown similar interactions profiles, corroborating the main enzyme-inhibitor interactions experimentally obtained, reported in literature. Pharmacophore perception calculations based on different inhibitors reported in literature as well as molecular interaction fields studies were here carried out, whose results indicate the main changes in the structure of the rosmarinic acid inhibitor necessary to optimization. In the virtual screening simulations, novel potential BthTX-I inhibitors were selected from drug-like compounds databases, thus guiding next steps towards biological tests, which will must be performed with this phospholipase and the new inhibitor candidates modeled.

Estudos prévios demonstraram que as atividades biológicas do veneno da serpente Bothrops jararaca sofrem significantes modificações ontogenéticas. Neste estudo é apresentada uma análise comparativa do proteoma, peptidoma e transcriptoma da glândula de veneno de filhotes e adultos de B. jararaca, correlacionando os resultados obtidos com algumas características funcionais dos venenos. Venenos de 694 filhotes de até duas semanas de idade e 110 adultos, provenientes do Estado de São Paulo foram extraídos e liofilizados para as análises proteômicas/peptidômicas e funcionais. O mRNA de glândulas de veneno de 20 filhotes e 10 adultos foi obtido para a contrução de bibliotecas de cDNA e a análise de Expressed Sequence Tag (ESTs). Demonstramos que a atividade hemorrágica é similar para os venenos de filhotes e adultos, enquanto que o veneno de adultos é discretamente mais letal para camundongos; entretanto, o veneno de filhotes mostrou-se extremamente mais letal para aves, uma característica que pode garantir proteção contra potenciais predadores nas fases iniciais de vida da espécie. A atividade coagulante do veneno de filhotes é cerca de 10 vezes mais alta que aquela verificada para o veneno de adultos e é atribuída sobretudo à atividade de metaloproteinases. Essas diferenças nas atividades funcionais se refletiram nos diferentes perfis verificados por eletroforese bidimensional e identificação de spots de proteínas por digestão tripsínica in-gel seguida de análise por cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas em tandem, zimografia com gelatina, imunocoloração utilizando anticorpos específicos anti-proteinases, e glicoproteínas com afinidade pela concanavalina -A. A comparação dos venenos por derivatização com tags isóbaros (iTRAQ) e a análise das ESTs revelaram diferenças claras entre os níveis de toxinas presentes nos venenos e as metaloproteinases foram a classe de toxinas mais expressa, além de serem as toxinas cujos perfis estruturais apresentaram maior mudança, como ilustrado pelo quociente PIII/PI, que é maior nos venenos de filhotes. Dimorfismo sexual foi detectado em diversas classes de toxinas no veneno de adultos por análises proteômicas e transcriptômicas e, surpreendentemente, o fator de crescimento de nervo foi detectado apenas no veneno/glândula de veneno de machos. A análise glicoproteômica mostrou que N-glicosilações parecem ser as modificações pós-traducionais mais proeminentes nas toxinas de B. jararaca, e os perfis de N-glicosilação apresentaram-se distintos para as proteínas dos venenos de filhotes e adultos. Entretanto, a composição de N-glicanos não variou entre as amostras, indicando que diferenças na utilização de motivos de N-glicosilação poderiam explicar as diferenças nos níveis de glicosilação observados pelos diferentes perfis eletroforéticos dos venenos. A análise da fração peptídica dos venenos de filhotes e adultos por espectrometria de massas resultou num perfil similar de Peptídeos Potenciadores de Bradicinina (BPPs), que foram detectados em suas formas canônicas e também com novas seqüências, cujas estruturas primárias sugerem um processamento da proteína precursora em sítios até então não descritos. Acreditamos que este seja o estudo mais abrangente sobre a variabilidade do veneno de uma serpente já realizado e os resultados demonstram que há uma relação clara entre as alterações ontogenéticas na dieta e tamanho corporal e o proteoma/peptidoma do veneno desta espécie. / Previous studies have demonstrated that the biological activities displayed by the venom of the snake Bothrops jararaca undergo a significant ontogenetic shift. In this investigation, we performed comparative proteomic, peptidomic and transcriptomic analyses of venoms and venom glands from newborn and adult specimens of B. jararaca and correlated the results with the evaluation of functional venom features. Venoms from 694 two-week old newborns and 110 adults from São Paulo state were milked and lyophilized for functional and proteomic/peptidomic analyses. Additionally, mRNA was obtained from the venom glands of 20 newborns and 10 adults and used for the construction of cDNA libraries and Expressed Sequence Tag (ESTs). We demonstrate that newborn and adult venoms have similar hemorrhagic activities, while the adult venom has a slightly higher lethal activity upon mice; however, the newborn venom is extremely more potent to kill chicks, a feature that might ensure protection against potential predators in early stages of B. jararaca life. Interestingly, the coagulant activity of the newborn venom upon human plasma is ten times higher than that of the adult venom and is contributed mainly by metalloproteinases. Differences in functional activities were clearly reflected in the venom different profiles of two-dimensional gel electrophoresis (2D-PAGE) and protein spot identification by in-gel trypsin digestion followed by liquid chromatography and tandem mass spectrometry (LC-MS/MS), gelatin zimography, immunostaining using specific anti-proteinase antibodies, and concanavalin A-binding proteins. The venom comparison by isobaric tag peptide labeling (iTRAQ) and ESTs analysis revealed clear differences in toxin levels. The metalloproteinases were detected as the toxin class most expressed in the venoms in addition to being the toxins whose structural profile most changed, as illustrated by the ratio P-III/P-I class being higher in newborn venoms. Sexual dimorphism has been detected in various adult venom toxin classes by proteomic and transcriptomic analyses and, interestingly, the nerve growth factor was detected only in the male venom gland/venom. The glycoproteomic analysis showed that N-glycosylation seems to be the most prominent post-translational modification in B. jararaca toxins and the N-glycosylation profiles differed for newborn and adult venom toxins. Nevertheless, the N-glycan composition between the samples did not vary indicating that differences in the utilization of the N-glycosylation motif could be the explanation for the differences in the glycosylation levels indicated by the differential electrophoretic profiles of venom proteins. The analysis of the peptide fraction of newborn and adult venoms by mass spectrometry revealed a similar profile of Bradykinin Potentiating peptides (BPPs), however these were detected in the venoms showing their canonical sequences and also novel sequences corresponding to BPPs processed from their precursor protein at sites so far not described. To the best of our knowledge, this is the most comprehensive study on a snake venom variation and the results clearly demonstrate a relationship between the ontogenetic shift in diet and animal size, and the venom proteome/peptidome in B. jararaca species

As peçonhas de serpentes são consideradas ricas fontes de componentes com importantes ações farmacológicas. Estudar seus componentes permite esclarecer a patogenia do envenenamento e identificar moléculas com potenciais aplicações biotecnológicas. As serpentes da espécie Crotalus durissus habitam diversas regiões do Brasil e suas peçonhas são compostas de grande quantidade de proteínas (cerca de 95%), carboidratos, cátions metálicos, aminas biogênicas, nucleosídeos, componentes não enzimáticos, aminoácidos livres e uma pequena fração lipídica. Muitos componentes ainda não foram isolados, embora alguns já tenham sido identificados em análises ômicas (transcriptoma e proteoma), como é o caso do VEGF (Fator de Crescimento Endotelial Vascular) identificado por estas técnicas na peçonha de Crotalus durissus collilineatus (C.d.c). Os VEGFs são homodímeros não enzimáticos com massas moleculares de 20 a 30 kDa, para o dímero, e de 13 a 16 kDa, para o monômero. Eles desempenham o papel principal na angiogênese (crescimento de novos vasos). No entanto, seu papel no envenenamento ainda não está elucidado. Diante disso, o presente estudo teve como objetivo isolar e elucidar os aspectos estruturais e funcionais parciais, de um VEGF da peçonha da serpente C.d.c. A peçonha foi inicialmente submetida a uma análise por LC-MS para um conhecimento geral dos seus componentes. Em seguida, foi fracionada por cromatografia líquida de fase reversa em sistema FPLC (Fast Protein Liquid Chromatography) e, posteriormente, todas as 43 frações obtidas foram submetidas ao ELISA para identificação do VEGF. As frações 23, 24 e 25 foram positivas para VEGF e, por isso, escolhidas para serem estudadas. Estas frações foram recromatografadas por meio de três protocolos (troca catiônica, fase reversa e troca aniônica). Após os fracionamentos, todas as subfrações foram submetidas ao ELISA para identificação do VEGF e à eletroforese em gel de poliacrilamida para a análise da composição das mesmas. Em seguida, essas amostras foram reduzidas, alquiladas e digeridas com tripsina e submetidas a ensaios de espectrometria de massas (ESI-Q-TOF e PMF), para identificar peptídeos trípticos de VEGF e, as que mostraram maior pureza na eletroforese, foram analisadas por sequenciamento amino-terminal, a fim de elucidar sua estrutura primária. Nestes estudos foram identificados um Fator de crescimento de fibroblasto (FGF) e duas isoformas de VEGF. A cromatografia em coluna de troca iônica (HiTrap QXL) foi a mais efetiva na purificação dos compostos das frações 23, 24 e 25. As 6 subfrações obtidas, após confirmação da presença de VEGF pelo ELISA, eletroforese e espectrometria de massas, foram submetidas a uma análise de reconhecimento do VEGF pelo soro anticrotálico comercial por meio do ELISA e o VEGF foi reconhecido com alta afinidade pelo soro. Em seguida, essas amostras foram analisadas por ELISA com anticorpo anti-FGF a fim de confirmar a presença do FGF, porém, este não foi reconhecido nas amostras pelo anticorpo, nas concentrações utilizadas. As frações contendo VEGF, denominado de CdcVEGF, foram submetidas aos ensaios funcionais. No ensaio de angiogênese in vitro, no qual se analisa a indução da formação de tubos em Matrigel® pelas células endoteliais vasculares umbilicais humanas (HUVECs), todas as 6 subfrações induziram a angiogênese, confirmando que mantiveram sua atividade após os fracionamentos e dentre estas, a subfração denominada de 24-QXL3 foi a mais potente, mostrando uma indução da formação dos tubos ainda mais potente que o controle positivo (bFGF). No ensaio in vitro de migração de células mononucleares de sangue periférico humano (quimiotaxia em câmara de boyden), os CdcVEGFs não alteraram significativamente a migração das células, nas concentrações testadas. Os dados obtidos neste trabalho ampliam o conhecimento sobre a composição da peçonha de C.d.c, além de desenvolver um novo protocolo para isolamento de VEGF e possibilitar sua caracterização. Adicionalmente, foi possível a identificação de um novo FGF, o qual ainda não havia sido identificado na peçonha de C.d.c. / Snake venoms are considered rich sources of a variety of components that displays important pharmacological activities. The study of these diverse components allows the elucidation of envenoming pathology and the identification of molecules with potential biotechnological applications. The snakes of Crotalus durissus species inhabit various regions of Brazil and their venoms are a complex mixture of proteins (around 95%), carbohydrates, metal cations, biogenic amines, nucleosides, non-enzymatic components, free amino acids and a small lipid fraction. Many components have not yet been isolated, although some of them have already been identified in omics analysis (transcriptome and proteome), like the VEGF (Vascular Endothleial Growth Factor) identified by these techniques in the Crotalus durissus collilineatus (C.d.c) venom. VEGFs are non-enzymatic homodimers with molecular weights varying from 20 to 30 kDa for the dimer and 13 to 16 kDa for the monomer. They have a central role in angiogenesis (growth of new vessels) but their role in the envenoming pathophisiology is not elucidated. This study aimed to isolate and perform the elucidation of the structural and functional aspects of a VEGF from C.d.c snake venom. Initially, the venom was submitted to a LC-MS analysis for the global knowledge of its components. Then, it was fractionated by reversed phase chromatography on FPLC system (Fast Protein Liquid Chromatography) and later all the fractions collected were submitted to an ELISA for identification of VEGF. The fractions 23, 24 and 25 proved being positive for VEGF and therefore, were chosen to be studied. These fractions were rechromatographed by three different protocols (cation exchange, reversed phase and anionic exchange). All the subfractions obtained by these chromatographies were analyzed by ELISA for the confirmation and identification of VEGF and by an SDS-PAGE for the analysis of their composition. These subfractions were then reduced, alquilated and digested with tripsin and submitted to spectrometry analysis (ESI-QTOF and PMF) in order to identify tryptic peptides of VEGF and the ones that presented a higher level of purity in the electrophoresis, were analyzed by amino-terminal sequencing to elucidate its primary structure. In these studies were identified an FGF and two isoforms of VEGFs. The chromatography on ion-exchange column (HiTrap QXL column) was the most effective in purifying the compounds of fractions 23, 24 and 25. The six subfractions obtained, after confirmation of the presence of VEGF by the ELISA, electrophoresis and mass spectrometry, were analyzed by another ELISA with anticrotalic serum and the VEGF was recognized with high affinity by the serum, indicating that the molecule is immunogenic. Subsequently, another ELISA was performed with a FGF-antibody to confirm the presence of FGF in the samples. However, the antibody was not able to recognize it in the concentrations used of the fractions. The VEGF found in all six subfractions was denominated as CdcVEGF and submitted to functional analysis. In the in vitro angiogenesis assay, which analyzes the induction of tube formation in Matrigel® by human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) cells, all 6 subfractions induced angiogenesis, confirming that they maintained their activities after the fractionations. Among those, the subfraction 24-QXL3 showed a more potent response, demonstrating a tube formation even more significant than the positive control (bFGF). In the in vitro assay for the migration of human peripheral blood mononuclear cells (chemotaxis technique in boyden chamber), the CdcVEGFs did not significantly alter cell migration at the concentrations tested. The data obtained in this study amplify the knowledge about the composition of C.d.c venom and the development of a new isolation protocol for VEGF, possibiliting its characterization. Additionally, it was possible to identify a new FGF, which had not yet been identified in C.d.c venom.

O carcinoma hepatocelular é um dos tipos de cânceres mais comuns em adultos com sua incidência aumentando mundialmente a cada ano. O tratamento curativo é o transplante de fígado, mas as muitas dificuldades encontradas para o procedimento faz com que a quimioterapia seja amplamente utilizada. Além disso, pode ocorrer quimiorresistência e muitos efeitos adversos, o que impulsiona a busca por novos compostos terapêuticos. L-aminoácido oxidases (LAAO) isoladas de peçonhas de serpentes têm demonstrado bons resultados de citotoxicidade em linhagens celulares tumorais, no entanto estes resultados representam sistemas in vitro em monocultura e estudos recentes demonstram que o microambiente tumoral tem um importante papel na transformação neoplásica, no crescimento e invasão do tumor e na resistência quimioterápica. Assim, avaliou-se uma LAAO purificada da peçonha de Bothrops jararacussu (BjussuLAAO-II) em células de carcinoma hepatocelular (HepG2) em monocultura e em cocultura com células endoteliais de veia umbilical humana (HUVEC) com o objetivo de simular o microambiente tumoral, onde, normalmente, é observado mais de um tipo celular. A atividade citotóxica foi avaliada por meio do ensaio do MTT e do ensaio de sobrevivência clonogênica, a atividade genotóxica por meio do ensaio do cometa, a produção de espécies reativas de oxigênio por meio de fluorescência e os danos ao cromossomo por meio do ensaio do micronúcleo. Em células HepG2, em monocultura, todas as concentrações testadas (0,25 - 5,00 ?g/mL) foram citotóxicas e aumentaram os níveis intracelulares de espécies reativas de oxigênio. Verificou-se dano genotóxico na concentração de 5,00 ?g/mL e não houve dano cromossômico. Quando cultivada em cocultura com células HUVEC, as concentrações de 1,00 e 5,00 ?g/mL de BjussuLAAO-II foram citotóxicas às células HepG2 e aumentaram os níveis de espécies reativas de oxigênio. A concentração de 5,00 ?g/mL induziu danos ao DNA e não houve danos aos cromossomos. Estes efeitos podem ser correlacionados ao aumento de espécies reativas de oxigênio intracelulares e as diferenças entre os resultados de mono e cocultura devido à simulação de parte do microambiente tumoral. Em monocultura de células HUVEC, todas as concentrações testadas foram citotóxicas, houve dano genotóxico nas concentrações de 1,00 e 5,00 ?g/mL e nenhuma concentração testada induziu danos cromossômicos. Como há elevada citotoxicidade, danos ao DNA e indução de efeitos pró-oxidantes em células HepG2, BjussuLAAO-II representa um composto promissor no desenvolvimento de novos fármacos antitumorais / Hepatocellular carcinoma is one of the most common types of cancers in adults whose incidence increases worldwide each year. Liver chirurgic and transplantation is the best choice of treatment, but the many difficulties encountered in the procedure cause chemotherapy to be widely used. In addition, chemo resistance and many adverse effects can occur, which improves the search for new therapeutic molecules. L-amino acid oxidases (LAAO) isolated from snake venoms have demonstrated good cytotoxicity results in tumor cell lines, however these results represent in vitro monoculture systems and recent studies have shown that the tumor microenvironment plays an important role in neoplastic transformation in tumor growth and invasion and chemotherapeutic resistance. A LAAO purified from Bothrops jararacussu venom (BjussuLAA-IIO) venom was evaluated in hepatocellular carcinoma (HepG2) cells in monoculture and co-culture with human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) with the aim of simulating the tumor microenvironment, where more than one cell type is normally observed. Cytotoxic activity was assessed by the MTT assay and clonogenic survival assay, genotoxic activity by comet assay, reactive oxygen species production by fluorescence, and chromosome damage by the micronucleus assay. In HepG2 cells, in monoculture, all concentrations tested (0.25 - 5.00 ?g/mL) were cytotoxic and increased intracellular levels of reactive oxygen species. Genotoxic damage at the concentration of 5.00 ?g/mL was observed and there was no chromosomal damage. When cultured with HUVEC cells, concentrations of 1.00 and 5.00 ?g/mL of BjussuLAA-II were cytotoxic to HepG2 cells and increased levels of reactive oxygen species. The concentration of 5.00 ?g/mL induced DNA damage and there was no damage to the chromosomes. These effects can be correlated to the increase of intracellular reactive oxygen species and the differences between the mono and co-culture results due to the simulation of part of the tumor microenvironment. In HUVEC monoculture, all concentrations tested were cytotoxic, genotoxic damage at concentrations of 1.00 and 5.00 ?g/mL, and no concentration tested induced chromosome damage. As there is high cytotoxicity, DNA damage and induction of pro-oxidant effects in HepG2 cells, BjussuLAAO-II represents a promising compound in the development of novel antitumor drugs

Mudanças ontogenéticas na dieta e na composição do veneno são características freqüentemente observadas em espécies do gênero Bothrops. A serpente Bothrops insularis é endêmica da Ilha da Queimada Grande, litoral Sul de São Paulo, cuja separação do continente ocorreu há aproximadamente 11 000 anos, após a última glaciação ao final do Pleistoceno. Não existem mamíferos na ilha e esta espécie alimenta-se, na fase juvenil, de animais ectotérmicos (artrópodes e anfíbios) e de endotérmicos (aves migratórias) na fase adulta. A população apresenta anormalidades sexuais evidenciadas por machos, fêmeas e intersexos (fêmeas que apresentam hemipênis rudimentares, porém não funcionais). Três filhotes de B. insularis (1 macho e 2 intersexos) nascidos em cativeiro, de uma fêmea intersexo, foram mantidos no Laboratório de Herpetologia do Instituto Butantan, seus venenos extraídos (idades de 10, 15, 20, 24,33 e 41 meses) e liofilizados para utilização em ensaios subseqüentes. Utilizou-se também o veneno da mãe da ninhada e um pool de venenos de exemplares adultos. A análise eletroforética (SDS-PAGE 7,5- 17,5%) evidenciou similaridades entre as amostras de venenos nas diferentes fases de vida dos animais. A análise densitométrica revelou um aumento pronunciado da expressão de uma banda protéica na faixa de massa molecular de 24kDa. O teor protéico dos venenos variou de 618 a 1189 g de proteína por mg de veneno. Os resultados experimentais sugerem que fosfolipases A2 e hialuronidases não têm expressão pronunciada na fase adulta dos animais (41 meses). Os venenos foram capazes de hidrolisar as cadeias A e B do fibrinogênio e promover áreas de lise em placa de fibrina, independentemente da idade analisada. O progressivo aumento de intensidade da atividade hemorrágica e proteólise em zimografia sugere uma regulação da expressão de proteases, sobretudo de metaloproteases (uma característica importante, uma vez que esta espécie apresenta uma alteração ontogenética de dieta, alimentando-se de presas maiores quando os animais se tornam adultos). Por outro lado, a atividade proteolítica sobre a caseína não apresentou um aumento ontogenético significativo. Ensaios com inibidores de proteases, mostraram que EDTA e ortofenantrolina (10 mM) diminuíram expressivamente a atividade gelatinolítica em zimografia, reduziram a área de lise em placa de fibrina e inibiram a clivagem das cadeias A e Bdo fibrinogênio. Os venenos dos animais jovens (15 meses) mostraram-se mais ativos nos ensaios de coagulação sanguínea (Dose Mínima Coagulante sobre o Plasma e ativação dos fatores X e II da cascata de coagulação sanguínea) em relação ao dos adultos (41 meses). Observou-se uma maior toxicidade dos venenos para abelhas e aves, contudo não foi possível estabelecer diretamente uma relação ontogenética. Para mamíferos (camundongos) os venenos do Intersexo 1 e do Macho (41 meses) apresentaram menores valores de DL50 em relação aos demais. A miotoxicidade das amostras dos venenos mostrou-se acentuada na fase inicial de vida dos animais (15 meses). Foram evidenciadas variações individuais ao longo das análises efetuadas neste trabalho, contudo a variabilidade ontogenética mostrou-se presente na maioria dos ensaios realizados. A seletividade do veneno para presas locais foi demonstrada pela eficácia do veneno para artrópodes e aves, em detrimento a mamíferos. Desta forma, conclui-se que o veneno possui peculiaridades na sua composição que favorecem a alimentação desta serpente em seu habitat insular e, embora haja uma marcante alteração de dieta durante a ontogênese desta espécie, a toxicidade do veneno para os itens alimentares locais é uma característica presente durante toda a vida dos animais. / Ontogenetic changes on diet and venom composition are a common feature among Bothrops species. Bothrops insularis is an endemic snake of Queimada Grande Island, South coast of são Paulo State, which mainland separation has ocurred for about 11 000 years ago, after the last glaciation, at late Pleistocene. There are no mammals on the Island and B .insularis feed on ectothermic preys when young (arthropods and amphibians) and endothermic (migratory birds) when becomes adult. Sexual abnormalities are often verified on B. insularis population with males, females and intersexes existence (females with non-functional rudimentary hemypenis). Three B. insularis siblings (1 male and 2 intersexes) borned on captivity, from an Intersex female, were kept in Herpetology Laboratory on Instituto Butantan. Venoms were extracted (10, 15, 20, 24, 33 and 41 months of animal’s age) and lyophilized for subsequent assays. Offspring’s mother venom and a pool of B. insularis adult venoms were also analyzed as a comparison parameter. Electrophoretic profiles (SDS-PAGE 7,5- 17,5%) showed similar patterns among samples at distinct animal’s ages. Densitometric analysis showed increase of expression of proteic band at 24 kDa of molecular mass range. Protein content varies of 618 up to 1189 g of protein per mg of venom. Experimental results suggests that phosfolipases A2 and hyaluronidases do not have an increase on its expression on adult phase (41 months) of B .insularis. Venoms were able to hydrolyze A and B fibrinogen chains and to promote lysis on fibrin plate, regardless of animal’s age. The increase of haemorrhagic activity and proteolysis on zimography profiles, suggests a regulation of protease expression, mainly of metaloproteases (an important characteristic, since this species has an ontogenetic shift on its diet, feeding on larger preys when becomes adult). On the other hand, proteolytic activity upon casein did not show significative ontogenetic variability. Protease inhibithors assays showed that EDTA and orthophenantrolin (10 mM) expressively reduced gelatinolytic activity on zimography, fibrin plate lysis area, and were able to prevent A and B fibrinogen chains cleavage. Venoms from young animals (15 months) had higher coagulant activity than adult ones (Minimum Coagulant Dose upon human Plasma and activation of blood coagulation cascade factors X and II). Venom toxicity was higher for bees (just-emerged Apis mellifera) and chicks (one day age Bovans white chicks), although a direct relation with ontogeny was not established. Intersex 1 and male venoms (41 months) showed the lower LD50 values for mammals (mice). Prominent myotoxicity was found for young venoms (15 months). Experimental results showed individual variability, and, mainly, a conspicuous ontogenetic variability. Venom selectivity towards local preys was demonstrated by the expressive toxicity upon arthropods and chicks, in comparison to mammals. Our results show that Bothrops insularis venom had peculiarities on its composition that support snake’s diet on its insular habitat and, although a clearly ontogenetic diet change occurs on this species, venom toxicity towards local preys is a characteristic present during all lifetime of this species.