Na Martinica, os envenenamentos por Bothrops lanceolatus apresentam um quadro clínico trombótico, acompanhado de inflamação local extensa, envolvendo edema, dor e hemorragia limitada. Neste estudo foi mostrado que vários componentes do veneno compartilham similaridades antigênicas com venenos de espécies da América do Sul. O veneno de B. lanceolatus é citotóxico para queratinócitos e células endoteliais, induzindo a produção de citocinas e quimiocinas pro-inflamatórias pelas células. O veneno de B. lanceolatus ativa a cascata do complemento, liberando anafilatoxinas, assim como o complexo terminal do complemento. Ele apresenta uma ação proteolítica sobre os componentes purificados C3, C4, C5, e o inibidor de C1, C1-INH. O veneno também desequilibra o balanço de expressão dos reguladores do complemento na membrana das células endoteliais. Estes dados demonstram que o veneno de B. lanceolatus exibe uma potente ação proinflamatória, pela ativação do sistema complemento e pela sua toxicidade em células endoteliais. / In Martinique envenomations by Bothrops lanceolatus are characterized by a systemic thrombotic syndrome and important local inflammation, involving oedema and pain, but limited haemorrhage. In this study, we show that several components of B. lanceolatus venom share antigenic similarities with South American Bothrops species. Still, B. lanceolatus venom proteases present substrate specificity. The venom is cytotoxic for keratinocytes and endothelial vascular cells, inducing the production of pro-inflammatory cytokines and chemokines. B. lanceolatus venom activates the complement cascade, releasing anaphylatoxins and the terminal complement complex. It also shows a direct proteolytic activity upon the purified complement proteins C3, C4, C5, and the inhibitor of C1, C1-INH. B. lanceolatus venom modified the balance of complement regulators on endothelial cells membrane. In conclusion, B. lanceolatus venom displays important pro-inflammatory properties, as it activates the complement cascade and impacts endothelial cells.

Made available in DSpace on 2016-08-10T10:55:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Fernanda de Oliveira Feitosa de Castro.pdf: 485024 bytes, checksum: 876ee7e1b14c3a6b20a7d9aef9cbe13a (MD5) Previous issue date: 2011-02-25 / Snake s venoms are complexes mixtures of proteins and peptides, aminoacids, nucleotides, lipids and carbohydrates, that showes importants biologicals activities like cytotoxicity, neurotoxicity, systemic myolysis, cardiotoxicity, kidney damage, hematologic disorders, like others. These molecules has shown pharmacological potential components with potent action against bacterias, virus and fungis. This present work aimed assed no cytotoxic effect of the crude venom of the snake Bothrops pauloensis in the culture of peripheral blood mononuclear cells (PBMC). After standardization of obtaining PBMC and evaluation of ideal concentration of fitohemagglutinin (PHA) and interleukin-2 (IL-2) for the cell culture was performed the evaluation of no citotoxic effect on CMN by different doses of crude venom of Bothrops pauloensis. The CMN was separated by density gradient, posterior being cultured. The evaluation of the no cytotoxic activity of the venom was performer by the visualization of the plate after 24, 48 and 72 hours. The concentration 0,05 mg/ml did not appear citotoxic activity, suggesting the possibility of using in testing with CMN infected by viruses, bacteria and fungi. / Os venenos de serpentes são misturas complexas compostas por proteínas e peptídeos, aminoácidos, nucleotídeos, lipídios e carboidratos que apresentam importantes atividades biológicas como citotoxicidade, neurotoxicidade, miólise sistêmica, cardiotoxicidade, danos renais, desordens hematológicas entre outras. Essas moléculas têm-se mostrado como potenciais componentes farmacológicos com potente ação contra a atividade de bactérias, vírus e fungos. O presente trabalho visou avaliar a atividade não citotóxica do veneno bruto da cobra Bothrops pauloensis em células mononucleares (CMN) do sangue periférico humano. Após a padronização da obtenção de CMN do sangue periférico e da concentração ideal de fitohemaglutinina(PHA) e interleucina-2 (IL- 2) para cultivo celular, foi realizada a avaliação do efeito não citotóxico de diferentes concentrações do veneno bruto da Bothrops pauloensis no cultivo celular. As células mononucleares do sangue periférico foram separadas por meio gradiente de densidade e cultivadas em meio de cultura. A avaliação da atividade citotóxica do veneno foi realizada pela visualização da placa após 24, 48 e 72 horas. A concentração 0,05 μg/ml não apresentou atividade citotóxica, sugerindo a possibilidade de utilização em ensaio com CMN infectadas por vírus, bactérias e fungos.

Neste trabalho, mostramos que a extração de veneno promove aumento na ativação dos fatores de transcrição NF<font face=\"symbol\">kB e AP-1. Noradrenalina, liberada após extração de veneno, é responsável por esse aumento. A estimulação dos adrenoceptores <font face=\"symbol\">a e <font face=\"symbol\">b estão envolvidos nessa resposta, entretanto, o grau de ativação de AP-1 é alterado dependendo do tempo. Foi verificado dimorfismo sexual na ativação dos fatores de transcrição da glândula de veneno, sendo a ativação de NF<font face=\"symbol\">kB mais rápida nas fêmeas do que nos machos e a ativação de AP-1 maior nas fêmeas. Mostramos ainda que a extração de veneno ativa a glândula de veneno através da estimulação da inervação noradrenérgica. Noradrenalina atuando em adrenoceptores <font face=\"symbol\">a e <font face=\"symbol\">b regula a síntese de proteínas da glândula de veneno e não a síntese de toxinas do veneno. Em conclusão, a estimulação da inervação noradrenérgica desencadeia o ciclo de produção de veneno regulando a síntese de proteínas da glândula que provavelmente são essenciais para sua ativação e posterior produção de veneno, através da ativação de fatores de transcrição. Thesis: Noradrenergic Innervation in activation of venom gland of Bothrops jararaca snake. / In this work we showed that venom extraction increases the activation of transcription factors like NF<font face=\"symbol\">kB and AP-1. Noradrenaline released after venom extraction is responsible for NF<font face=\"symbol\">kB and AP-1 activation. Stimulation of both <font face=\"symbol\">a- and <font face=\"symbol\">b-adrenoceptors is involved in this response, however the increase of AP-1 activation is time dependent. A sexual dimorphism has been verified in NF<font face=\"symbol\">kB and AP-1 activation. Activation of NF<font face=\"symbol\">kB occurs earlier in female than in male snakes and activation of AP-1 is greater in female than in male snakes. We also showed that venom extraction activates venom gland by stimulating noradrenergic innervation. Noradrenaline acting at both <font face=\"symbol\">a- and <font face=\"symbol\">b-adrenoceptors regulates synthesis of protein of the venom gland, but not the toxin of the venom. In conclusion, stimulation of noradrenergic innervation triggers the venom production cycle by regulating synthesis of protein that probably is essential to activate venom gland to produce venom by activating transcription factors.

O veneno da subespécie de cascavel Crotalus durissus terrificus (C.d.terrificus) altera a coagulação, tem ação neurotóxica, miotóxica e efeito imunossupressivo. O veneno de C.d.terrificus e a sua fração majoritária, crotoxina (CTX), inibem a resposta celular e humoral, sendo esse efeito independente da indução de morte celular. O objetivo foi investigar os mecanismos envolvidos na imunossupressão exercida pela CTX. A CTX induz a produção de IL-10, TGF-<font face=\"Symbol\">&#946 e prostaglandina E2 (PGE2) pelas células dos camundongos que a receberam. Menor secreção de IFN-<font face=\"Symbol\">&#947 e IL-12 foi observada nas culturas de células de camundongos imunizados e que receberam CTX. A CTX aumenta a expressão da enzima indoleamina 2,3 dioxigenase e a geração de células T reguladoras em camundongos imunizados com OVA e que receberam CTX. A CTX foi capaz de inibir a expressão de CD40, CD80, CD86 e de MHC de classe II em células de camundongos imunizados e nas células dendríticas (DCs) purificadas destes animais. Em culturas de DCs, a CTX induz alta secreção de IL-10, TGF-<font face=\"Symbol\">&#946 e PGE2 e menor de IL-12. / The venom of the rattlesnake Crotalus durissus terrificus (C.d.terrificus) changes the coagulation system and presents neurotoxic, myotoxic and immunosuppressive effect. The venom and its main fraction, crotoxin (CTX) inhibited both the cellular and humoral response. This effect is not due to induction of cell death. The objective was to investigate the immunosuppressive mechanisms of CTX. CTX induces production of IL-10, TGF-<font face=\"Symbol\">&#946 and prostaglandin E2 (PGE2) by cells of mice that received it. Lower secretion of IFN-<font face=\"Symbol\">&#947 and IL-12 was observed in the cultured cells from mice immunized that received CTX. CTX promotes increased expression of the enzyme indoleamine 2,3 dioxygenase and generation of regulatory T cells in mice immunized with OVA and receiving the toxin. CTX was able to inhibit the expression of CD40, CD80, CD86 and MHC II in mice immunized and in dendritic cells (DCs) purified from these animals. In cultures of DCs, CTX increased secretion of IL-10, TGF-<font face=\"Symbol\">&#946 and PGE 2 and lower IL-12.

As peçonhas ofídicas apresentam uma grande diversidade de componentes proteicos e estes podem variar dependendo de diversos fatores, como espécie, hábitos alimentares e comportamentais, ontogenia e até mudanças sazonais. Este alto grau de variabilidade pode levar a mudanças na fisiopatologia do envenenamento ofídico. No Brasil, as serpentes da espécie Crotalus durissus são capazes de habitar várias regiões do país e sua peçonha está sujeita a variabilidade, levando a uma grande dificuldade no tratamento do envenenamento, que é realizado por infusão do soro antiofídico. O estudo proteômico permite conhecer os componentes expressos pela glândula de peçonha. Sendo assim, este trabalho teve como objetivos realizar uma análise comparativa das diferenças intraespecíficas na composição proteica das peçonhas de 22 espécimes de Crotalus durissus collilineatus através de técnicas ômicas, avaliar a capacidade neutralizante do soro antiofídico produzido pelo Instituto Butantan contra essas peçonhas, avaliar a atividade hialuronidásica de cada peçonha e comparar as alterações bioquímicas e imunológicas de camundongos após o envenenamento crotálico experimental. Para isto, as peçonhas de 22 serpentes da espécie C. d. collilineatus, da região de Catalão - GO, foram fracionadas em uma coluna de fase reversa C-18 acoplada a um sistema de cromatografia líquida rápida de proteínas e analisadas por eletroforese em gel de poliacrilamida e métodos de espectrometria de massas. Inicialmente, foi observado que as peçonhas destas 22 serpentes variaram entre as cores branca e amarela. Os perfis cromatográficos foram semelhantes, entretanto, apresentaram diferenças qualitativas e quantitativas significativas de alguns componentes, por exemplo, apenas duas das peçonhas apresentaram a proteína crotamina. Outros componentes previamente relatados em outros estudos também foram identificados, como, o complexo da crotoxina, serinoproteases, metaloproteases e convulxina. Pela primeira vez foi possível evidenciar por técnicas proteômicas alguns componentes para a subespécie C. d. collilineatus, como: fator de crescimento neural, enzima conversora de angiotensina, fosfodiesterase, 5\'-nucleotidase, carboxipeptidase, glutaminil ciclase, glutationa peroxidase, NADH desidrogenase e fosfolipase B. Através do método de ELISA, constatou-se que o soro anticrotálico produzido pelo Instituto Butantan foi capaz de reconhecer todas as peçonhas utilizadas, embora algumas frações isoladas não tenham sido reconhecidas com tanta eficácia. A atividade hialuronidásica também foi avaliada, evidenciando que as peçonhas de algumas serpentes não apresentaram atividade detectável desta enzima. Por fim, o envenenamento crotálico experimental em camundongos Balb/c revelou que peçonhas diferentes são capazes de produzir alterações bioquímicas e imunológicas distintas. Assim, as vítimas do envenenamento podem necessitar de tratamentos diferenciados. Este trabalho mostrou que existem variações intraespecíficas importantes nas peçonhas de C. d. collilineatus, sendo que algumas podem ser mais miotóxicas que outras, evidenciadas por induzirem grandes aumentos dos níveis de creatina quinase. Além disso, este estudo proteômico revelou a presença de novos componentes proteicos na peçonha de C. d. collilineatus, contribuindo significativamente para o conhecimento de sua composição. Adicionalmente, estes dados indicam que quanto mais diversificado for o pool de peçonhas utilizado para a imunização de cavalos, melhor será o soro anticrotálico produzido, de forma que o único tratamento para este acidente seja ainda mais eficaz. / Snake venoms present a wide variety of protein components and these can vary depending on several factors such as species, eating and behavioral habits, ontogeny and even seasonal changes. This high degree of variability can lead to changes in the pathophysiology of snake bite envenoming. In Brazil, snakes of the species Crotalus durissus are capable of inhabiting various regions of the country and its venom is subject to variability, leading to a high difficulty in treating envenoming, which is performed by the infusion of an antivenom. Proteomic studies allow the knowledge of the components expressed by the venom gland. Thus, this study aimed to perform a comparative analysis of intraspecific differences in the protein composition of the venoms of 22 specimens of Crotalus durissus collilineatus through omics techniques, to evaluate the neutralizing capacity of antivenom produced by Instituto Butantan against these venoms, to evaluate the hyaluronidase activity of each venom and to compare the biochemical and immunological changes of mice after experimental crotalic envenoming. In this way, the snake venoms of the 22 species of C. d. collilineatus, from Catalão - GO region, were fractionated on a reverse phase column C-18 coupled to a fast protein liquid chromatography system and analyzed by polyacrylamide gel electrophoresis and mass spectrometry methods. Initially, it was observed that the venoms of these 22 snakes varied between white and yellow colors. The chromatographic profiles were similar, however, presenting significant qualitative and quantitative differences of some components, for example, only two venoms showed the protein crotamine. Other components previously reported in other studies were also identified, such as crotoxin, serine proteases, metalloproteases and convulxin. For the first time, it was possible to demonstrate, by proteomic techniques, some components not found thus far in the subspecies C. d. collilineatus, such as nerve growth factor, angiotensin converting enzyme, phosphodiesterase, 5\'-nucleotidase, carboxypeptidase, glutaminyl cyclase, glutathione peroxidase, NADH dehydrogenase, and phospholipase B. By ELISA method, it was found that the crotalic serum produced by the Instituto Butantan was able to recognize all the venoms used, although some isolated fractions have not been recognized effectively. The hyaluronidase activity was also evaluated, showing that the venom of some snakes do not presented detectable activity of this enzyme. The experimental crotalic envenoming in Balb/c mice revealed that different venoms are able to produce different biochemical and immunological changes. Thus, the victims of envenoming may need different treatments. This study demonstrated that there are significant intraspecific variations in the venom of C. d. collilineatus, and some of them may be more myotoxic than others, evidenced by an increasing of creatine kinase levels. Furthermore, the proteomic study revealed the presence of new protein components in the venom of C. d. collilineatus, significantly contributing to the knowledge of its composition. In addition, these data indicate that the more diverse the pool of the venoms used for the immunization of horses, better will be the anticrotalic serum produced, so that the only treatment for this accident will be even more effective

As serinoproteases de peçonha de serpentes (SVSPs) agem sobre pontos específicos do sistema circulatório, sendo consideradas promissoras para o tratamento de uma diversidade de desordens hemostáticas. No presente estudo, é descrita a expressão de uma serinoprotease de Crotalus durissus collilineatus (Collineina-1) em Pichia pastoris, bem como a purificação dessa toxina a partir da peçonha de C. d. collilineatus e a caracterização estrutural e enzimática da Collineina-1 nas formas nativa e recombinante. O cDNA que codifica a serinoprotease foi amplificado a partir da biblioteca de cDNA da glândula de peçonha de C. d. collilineatus e ligado ao vetor pPICZ A. A linhagem KM71H de P. pastoris foi transformada com o plasmídeo recombinante e as colônias foram selecionadas por resistência à zeocina. A expressão heteróloga foi realizada em meio mínimo suplementado com metanol, resultando em um rendimento de 56 mg de proteína por litro de cultura. A proteína recombinante foi purificada por um protocolo baseado em técnicas cromatográficas de troca iônica e fase reversa. A purificação da serinoprotease a partir da peçonha de C. d. collilineatus foi realizada pela combinação de técnicas de cromatografia de exclusão molecular, troca iônica e fase reversa, e resultou no isolamento de duas isoformas, denominadas Collineina-1 e 2. Quando analisada por espectrometria de massas, a Collineina-1 recombinante apresentou massa molar de 28.868 Da, enquanto as enzimas Collineina-1 e 2 apresentaram massas de 29.475 Da e 29.388 Da, respectivamente. A partir do alinhamento das sequências parciais das serinoproteases, foi possível determinar 100% de identidade dos aminoácidos para a Collineina-1 nativa e recombinante. O alinhamento múltiplo da sequência deduzida de aminoácidos da Collineina-1 indica uma semelhança estrutural dessa proteína com outras serinoproteases de peçonha de serpente. As enzimas nativa e recombinante mostraram efeitos similares sobre fibrinogênio bovino por clivarem preferencialmente a cadeia A do fibrinogênio, liberando o fibrinopeptídeo A. Ambas as enzimas induziram a coagulação do plasma bovino de forma dose-dependente, sendo que a Collineina-1 recombinante apresentou maior potencial coagulante, com uma dose mínima coagulante (DMC) de 0,08 mg/uL contra 0,225 mgu/L para a proteína nativa. As serinoproteases foram capazes de hidrolisar os substratos cromogênicos S-2222, S-2238 e S2302, embora ambas as enzimas tenham demonstrado maior atividade sobre o substrato S-2302. A atividade esterásica sobre o TAME foi avaliada em diferentes condições de temperatura e na presença de íons divalentes. As duas enzimas demonstraram alta termoestabilidade e tiveram a atividade inibida na presença dos íons Zn2+ e Cu2+. A cinética enzimática de ambas as serinoproteases seguiram o modelo de Michaelis-Menten. A Collineina-1 nativa apresentou um valor de Km de 1,43 mM, contra 1,682 mM para a proteína recombinante, indicando que a proteína nativa apresenta maior afinidade pelo substrato TAME. No entanto, as enzimas apresentaram valores similares de Kcat/Km (250,69 mM.min-1 para a Collineina-1 e 248,03 mM.min-1 para a rCollineina-1), sugerindo que as serinoproteases não diferem significativamente na eficiência em hidrolisar o substrato. Estes resultados demonstraram a adequação do sistema de escolha na produção heteróloga da Collineina-1, já que a proteína recombinante foi expressa com integridade funcional sobre os parâmetros avaliados. / Snake venom serine proteases (SVSPs) act on specific points of the circulatory system and are promising for the treatment of a variety of hemostatic disorders. In the present study, we describe the expression of a serine protease from Crotalus durissus collilineatus (Collineina- 1) in Pichia pastoris, the purification of the native toxin from C. d. collilineatus venom and the structural and enzymatic characterization of Collineina-1 in native and recombinant forms. The cDNA encoding the serine protease was amplified from cDNA library of C. d. collilineatus venom gland and cloned into pPICZ A vector. KM71H P. pastoris strain was transformed with the recombinant plasmid and colonies were selected by zeocin resistance. Heterologous expression was carried out in minimal medium supplemented with methanol, resulting in a yield of 56 mg of protein per liter of culture. The recombinant protein was purified by ion exchange and reverse phase chromatography. Purification of the native serine protease was accomplished by combining techniques of molecular exclusion, ion exchange and reversed phase, and resulted in the isolation of two isoforms, named Collineina-1 and 2. When analyzed by mass spectrometry, the recombinant Collineina-1 showed a molar mass of 28,868 Da, while Collineina-1 and 2 presented masses of 29,475 and 29,388 Da, respectively. The alignment of partial sequences of the enzymes resulted in 100% of amino acid identity between native and recombinant Collineina-1. The multiple alignment of deduced amino acid sequence of Collineina-1 indicates structural similarity with other snake venom serine proteases. The native and recombinant forms of the enzyme showed similar effects on bovine fibrinogen by cleaving preferentially A chain, releasing fibrinopeptide A. Both enzymes induced coagulation of bovine plasma in a dose-dependent way, though recombinant Collineina-1 presented a higher coagulant potential, with a minimum coagulant dose (MCD) of 0.08 mg/uL against 0.225 mg/uL for the native form. The serine proteases hydrolyzed S- 2222, S-2238 and S2302 chromogenic substrates, although both enzymes demonstrated increased activity upon S-2302. The esterase activity on TAME was evaluated at different temperatures and in the presence of divalent ions. Both enzymes showed high thermostability and their activity were inhibited in the presence of Zn2+ and Cu2+. The enzyme kinetics of both serine proteases followed Michaelis-Menten model. The native Collineina-1 showed a Km value of 1.43 mM, against 1.682 mM for the recombinant form, indicating that the native protein has a higher affinity for TAME substrate. However, enzymes had similar values for Kcat/Km (250.69 mM.min-1 for Collineina-1 and 248.03 mM.min-1 for rCollineina-1), suggesting that the serine proteases did not differ significantly in the efficiency to hydrolyze the substrate. These results demonstrated the adequacy of the system of choice in producing the snake venom serine protease, since the recombinant protein was expressed with functional integrity on the evaluated parameters.

A bothropasina é uma proteína hemorrágica de 48 kDa, pertencente à classe P-III das metaloproteases, isolada a partir do veneno bruto da serpente brasileira Bothrops jararaca, e que possui os domínios adesivos desintegrina (D) e rico em cisteína (C). Neste trabalho, nós apresentamos a estrutura cristalográfica da bothropasina complexada ao inibidor POL647. O domínio catalítico , metaloprotease (M), pode ser dividido em dois subdomínios, dispostos de maneira muito similar aos descritos para essa família de metaloproteases de venenos de serpentes (em inglês \"SVMPs\"), que inclui os sítios de ligação ao zinco e ao cálcio. A cisteína livre, resíduo Cys189, está localizado em um núcleo hidrofóbico e, sendo assim, impossibilitado de fazer pontes dissulfeto ou qualquer outra interação. O domínio D não apresenta estruturas secundárias bem definidas, sendo constituído, majoritariamente, por estruturas desordenadas como \"loops\", porém estabilizados por 7 pontes dissulfeto e por dois íons cálcio. A região do motivo ECD está localizada em um \"loop\" e é estruturalmente relacionado à região RGD das desintegrinas-RGD, derivadas de SVMPs da classe P-II. O motivo ECD é estabilizado pela ponte dissulfeto Cys277-Cys310 (entre os domínios D e C), além de um íon cálcio. A cadeia lateral do Glu276 do motivo ECD está exposta ao solvente. Na bothropasina, a região hiper variada (em inglês HVR), descrita para outras P-III de SVMPs, presente no domínio C, de fato, é bastante conservada quando comparada a outros membros da classe P-III de diversas espécies. Nós propomos que esse subgrupo deva ser referido como PIII-HCR (região altamente conservada) SVMPs. Ainda é proposto que as diferenças estruturais dos domínios D, C ou DC possam estar envolvidas em uma melhor adaptação da estrutura na interação com diferentes alvos, além do reconhecimento e especificidade a um substrato para o domínio M. / Bothropasin is a 48kDa hemorrhagic P-III metalloprotease isolated from the venom of the Brazilian snake Bothrops jararaca, which has the disintegrin (D) and cysteine-rich (C) adhesive domains. We present the crystal structure of the bothropasin complexed with the inhibitor POL647. The catalytic domain, metalloprotease (M), consists of two subdomains in a very similar scaffold to the ones described for other snake venom metalloproteases (SVMPs) including the zinc and calcium binding sites. The free cysteine, residue Cys189, is in a hydrophobic core and it is not available for disulfide bonding or other interactions. The D domain does not have a defined secondary structure, but instead is composed by mostly loops stabilized by seven disulfide bonds and by two calcium ions. The ECD region is in a loop and it is structurally related to the RGD region of RGD-disintegrins, which are derived from P-II SVMPs. The ECD motif is stabilized by the Cys277-Cys310 disulfide bond (between D and C domains) and by one calcium ion. The side chain of the Glu276 of the ECD motif is solvent exposed. In bothropasi, the HVR (hyper-variable region) described for other P-III SVMPs in the C domain in fact presents a well conserved sequence with respect to several other P-III members from different species. We propose that this subset be referred to as PIII-HCR (highly-conserved region) SVMPs. We further propose that the structural differences in the D, C or DC domains may be involved in selecting target binding which in turn could generate substrate diversity or specificity for the M domain.

Alguns estudos têm proposto que os acidente ofídicos em crianças estão associados a maior gravidade e ao maior risco de desenvolvimento de complicações comparados aos acidentes em adultos. Este estudo retrospectivo descreve as características de acidentes causados por serpentes do gênero Bothrops admitidos no Hospital Vital Brazil/Instituto Butantan/SP (HVB/IB) e compara a gravidade, e necessidade de soroterapia antiveneno e o risco para o desenvolvimento de complicações entre crianças (menores de 13 anos) e adultos. Trata-se de uma coorte histórica que utilizou dados de prontuários do arquivo do HVB/IB de dezembro de 1999 a junho de 2003. Foram incluídos no estudo pacientes que trouxeram a serpente ou apresentavam manifestações clínicas ou laboratoriais compatíveis com envenenamento botrópico. Não foi observada diferença estatisticamente significante na freqüência da gravidade dos envenenamentos, no número de ampolas administradas e na freqüência de complicações entre os dois grupos estudados. O estudo sugere que os acidentes ofídicos causados por serpentes do gênero Bothrops apresentam gravidade semelhante na avaliação admissional e evolução com a mesma proporção de complicações em crianças quando comparados aos acidentes em adultos / Some studies propose that the level of severity of the accidents caused by snakes in children can be associated with a stronger envenoming and a higher risk of later complication if compared to the same accidents in adults. This retrospective study aim to describe the caracteristics of snakebites acidents of the genus Bothrops, and compare their severities, necessity of antivenom, and the risk of developing later complications between children (less than 13 years) and adults, all the accidents where admitted at Hospital Vital Brazil/Instituto Butantan/SP, Brazil (HVB). This retrospective cohort study was carried out by using HVB\'s records of snakebite victims, from December 1999 to June 2003. Patients included were those who brought the snake and/or have the clinical or laboratorial presence of abnormalities compatible with Bothrops envenoming. No statistic differences were found between the two groups of this study concerning the severity of envenoming, number of antivenom vials and the frequency of complications. This study suggests that snakebite accidents are similar between adults and children. Age is not supposed to be a predictor of complication in such accidents

Made available in DSpace on 2016-04-28T20:15:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2009 - Ana Paula de Aragao Gama.pdf: 3298309 bytes, checksum: 4431d39927607e7468491c92864e1b38 (MD5) Previous issue date: 2009-02-18 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior / This study had as a purpose determine the clinic-pathological and laboratory changes in inoculated sheeps with the Bothrops jararaca and B. jararacussu poison, for the purpose to provide subsidies for the establishment of the diagnosis and differential diagnosis of snake bites. The liofilized venoms were diluted in 1 ml saline and administrated subcutaneously into four sheep. Three of the animals died, and the one that received 0. 5mg/kg (B. jararaca) recovered. Clinical signs were observed from 7 minutes to 1 hours after inoculation. The evolution period varied from 7 hours and 9 minutes up to 21 hours and 59 minutes. The symptoms, independent of the dosage, were swelling (hemorrhage/oedema) of the inoculation site, increased bleeding time and capillary filling; tachycardia, dyspnea, hipocorated mucous membranes and diminished reaction to external stimuli in some animals. Laboratory exam revealed pronounced normocytic and normochromic anemia, trombocytopenia, slight reduction of fibrogen and total plasmatic protein, diminished hematocrit in too animals, besides pronounced increase of the creatinaquinase and lactic dehydrogenase. The main findings at necropsy were large hemorrhagic or oedema areas in the subcutaneous tissue of the inoculation site. Besides hemorrhages/oedema, the main histopathologic alteration was hyalinization of muscle fibers and vessels, most severe at the inoculation site. This study it was seen, that the swelling at the inoculation site and adjacency was due to blood, for B. jararaca venom and oedema, for B. jararacussu venom. / Esse estudo teve como objetivo determinar as altera??es cl?nico-patol?gicas e laboratoriais em ovinos inoculados com a pe?onha de Bothrops jararaca e B. jararacussu, no intuito de fornecer subs?dios que possam facilitar o estabelecimento do diagn?stico e do diagn?stico diferencial dessa condi??o. Os venenos liofilizados foram dilu?dos em 1 ml de solu??o fisiol?gica e administrados a quatro ovinos por via subcut?nea. Tr?s ovinos foram a ?bito e um que recebeu a dose de 0,5 mg/kg (B. jararaca), recuperou-se. Os sinais cl?nicos tiveram in?cio entre 7 minutos e 1 horas. O per?odo de evolu??o variou de 7 horas e 9 minutos a 21 horas e 59 minutos. O quadro cl?nico, independentemente das doses, caracterizou-se por aumento de volume (hematoma/edema) no local da inocula??o, tempo de sangramento e de preenchimento capilar aumentados; taquicardia, dispn?ia, mucosas hipocoradas e apatia em alguns animais. O exame laboratorial revelou acentuada anemia normoc?tica normocr?mica, trombocitopenia, acentuada redu??o de fibrinog?nio e prote?nas plasm?ticas totais, hemat?crito diminu?do em dois animais, al?m de acentuado aumento de creatinaquinase e desidrogenase l?tica em todos os animais. ? necropsia, os principais achados eram extensos hematomas/edemas no local da inocula??o e tecidos adjacentes e, em dois animais, acentuado edema pulmonar agudo (B. jararacussu). Al?m de hemorragias/edema, a principal altera??o histopatol?gica verificada foi necrose das fibras musculares e de vasos, no local de inocula??o e adjac?ncias. Nos ovinos deste estudo, o aumento de volume observado no local de inocula??o e adjac?ncias era constitu?do por sangue (B. jararaca) e edema (B. jararacussu).

As fosfolipases A2 (PLA2s) são enzimas que induzem vários efeitos farmacológicos e geralmente, correspondem a maior porcentagem do conteúdo protéico dos venenos de serpentes. Desta forma, o isolamento e a caracterização bioquímica, funcional e estrutural de PLA2s poderão gerar informações importantes para o melhor entendimento dos efeitos farmacológicos e de efeitos tóxicos ocasionados por estas proteínas. Através de dois métodos cromatográficos (troca-iônica em CM-Sepharose e hidrofóbica em Phenyl-Sepharose) foi isolada uma isoforma de fosfolipase A2 ácida presente na peçonha da serpente Bothrops moojeni, denominada de BmooPLA2. Quando submetida à eletroforese em gel de poliacrilamida com agente desnaturante, BmooPLA2 apresentou massa molar relativa de aproximadamente 14.000. A proteína isolada, BmooPLA2, possui uma única cadeia polipeptídica, pI~5,2, é rica em aminoácidos hidrofóbicos, ácidos e possui 14 resíduos de cisteína. Esta isoforma pH-termoestável apresentou alta atividade fosfolipásica. A enzima induziu edema moderado in vivo, na concentração de 25 g. Além disso, a BmooPLA2 foi capaz de inibir a agregação plaquetária de modo dose dependente e induzir efeito hipotensor nas concentrações de 15 e 30 g . Foi realizada também a construção da biblioteca de cDNA da glândula de peçonha da serpente Bothrops moojeni, onde o cDNA que codifica a proteína BmooPLA2 foi clonado e a proteína recombinante expressa em E. coli. Todos os ESTs (Expressed Sequence Tags) foram classificados de acordo com a homologia de sua estrutura primária com sequências conhecidas. As sequencias codificando para toxinas representaram cerca de 30% do total de sequências identificadas. De acordo com o transcriptoma, as toxinas mais expressas pela serpente Bothrops moojeni são as metaloproteases (SVMP), as quais correspondem a aproximadamente 77% das toxinas encontradas. A proteína recombinante apresentou a mesma sequência de aminoácidos, atividade fosfolipásica e efeito inibitório sobre plaquetas, observados para a proteína nativa BmooPLA2, sugerindo que a recBmooPLA2 foi expressa, purificada e reenovelada em sua forma ativa. Como nenhum estudo abordou a participação das PLA2s ácidas de Bothrops nos processos inflamatórios e os mecanismos envolvidos na liberação desses mediadores, particularmente os prostanóides, as toxinas nativa e recombinante foram avaliadas quanto ao seu efeito sobre a resposta inflamatória (ensaios sobre leucócitos in vitro), avaliando a expressão da enzima COX-2 e liberação do prostanóide PGE2, além de outros mediadores como TXB4 e LTB2, após a incubação com macrófagos isolados, in vitro. Com estes resultados foi possível uma melhor compreensão da composição da peçonha desta serpente, bem como um melhor entendimento da participação das PLA2s ácidas envenenamento ofídico, abrindo novas perspectivas para sua aplicação biotecnológica. / The phospholipase A2 (PLA2s) are enzymes that induce various pharmacological effects and usually correspond to a higher percentage of the protein content of snake venoms. Thus, isolation, biochemical, functional and structural characterization of PLA2s may generate important information for a better understanding of the pharmacological effects and toxicity induced by these proteins. Through two chromatographic steps (ion exchange on CMSepharose and hydrophobic in Phenyl-Sepharose) an acidic phospholipase A2 isoform was isolated from the venom of the snake Bothrops moojeni and named BmooPLA2. Its biochemical and partial functional characterization were also performed. When submitted to electrophoresis on polyacrylamide gel with denaturing agent (SDS-PAGE), BmooPLA2 presented relative molar mass of approximately 14,000. The isolated protein, BmooPLA2, has a single polypeptidic chain, pI ~ 5.2, is rich in hydrophobic amino acids and has 14 cysteine residues. This pH-thermostable isoform showed high phospholipasic activity. The enzyme induced moderate edema in vivo, at the concentration of 25 g. In addition, BmooPLA2 was able to inhibit platelet aggregation in a dose dependent manner and showed hypotensive effect at different concentrations (15 and 30 g). It was also carried out the construction of the cDNA library from the venom gland of the snake Bothrops moojeni, where the cDNA encoding the protein BmooPLA2 was cloned and a recombinant protein expressed in E. coli. All ESTs (Expressed Sequence Tags) were classified according to their primary structure homology with known sequences. The sequences coding for toxins accounted for approximately 30% of all identified sequences. According to the transcriptome, the majority of the toxins expressed by the snake Bothrops moojeni are metalloproteases (SVMP), which correspond to approximately 77% of the toxins found. The recombinant protein presented the same amino acid sequence, phospholipase activity and inhibitory effect on platelets, observed for the native BmooPLA2, suggesting that recBmooPLA2 was expressed, purified and refolded in its active form. Since no study has addressed the involvement of acidic PLA2s from Bothrops genus upon inflammatory processes and the mechanisms involved in the release of such mediators, particularly prostanoids, native and recombinant toxins were evaluated for their effects on the inflammatory response (essays on leukocytes in vitro), evaluating the expression of COX-2 and prostanoid release of PGE2, as well as other mediators as TXB4 and LTB2, after incubation with isolated macrophages, in vitro. With these results it was possible to better understand the composition of the venom of this snake, and a better understanding of the role of acidic PLA2s on the snake envenomation, opening new perspectives for its biotechnological application.