Memorial apresentado ao Instituto de Biociências da Universidade Estadual Paulista-UNESP-Botucatu, para obtenção do título de Livre-Docente em Microbiologia-Bacteriologia

A vancomicina é um antimicrobiano de escolha para o tratamento de microrganismos gram-positivos multirresistentes, como Staphylococcus aureus resistente à meticilina (MRSA). Apesar da importância ouso indiscriminado gera preocupação em relação à resistências bacteriana, além de ser considerado nefrotóxico e haver carência de dados em pediatria.Objetivo:Avaliar o perfil de utilização de vancomicina, a presença de eventos adversos, nefrotoxicidade e o desfecho clínico pacientes de uma Unidade de Terapia Intensiva. Método: Estudo transversal, retrospectivo, conduzido entre pacientes pediátricos internados em unidade de terapia intensiva que receberam vancomicina durante o período de abril de 2013 a junho de 2014. Os dados foram coletados de fontes secundárias como prontuário, prescrições e exames laboratoriais. Resultados: De 94 pacientes selecionados, 53,2% eram lactentes e o CID mais prevalente foi bronquiolite aguda devido a outros microrganismos especificados. A duração do tratamento com vancomicina teve uma média de 13±6,7 dias e uma dose média inicial de 51,2±14,7 mg/kg/dia. Entre os eventos adversos observados, edema foi o mais prevalente, seguido de toxicidade renal. Dos doze pacientes que tiveram MRSA identificado em hemocultura ou cultura de secreções, três tiveram infecção persistente e um foi a óbito em menos de 30 dias. Dos pacientes com nefrotoxicidade, 63,6% utilizaram vancomicina por mais de 14 dias e todos tiveram níveis séricos ≥15 μg/ml. Conclusão: As faixas de doses de vancomicina usadas estão dentro do que tem sido recomendado na literatura, contudo o aparecimento de toxicidade renal parece ter relação significativa não somente com o nível sérico de vancomicina, mas também com o tempo de tratamento. Sugere-se a realização de estudos que consigam confirmar essa tendência associativa entre tempo, concentração sérica de vancomicina e aparecimento de nefrotoxicidade. / Vancomycin is an antibiotic of choice for the treatment of multidrug-resistant grampositive microorganisms, as methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA). Despite the importance their indiscriminately use causes concern regarding the bacterial resistance, besides being nephrotoxic agent and there are few studies in pediatric patients. Objective: To evaluate the profile of use of vancomycin, the presence of adverse events, nephrotoxicity and clinic outcome in children admitted to the Intensive Care Unit. Method: Cross-sectional and retrospective study, with pediatric patients admitted to the intensive care unit who received vancomycin during the period from April 2013 to June 2014. Data were collected from secondary sources such as patient records, prescriptions and laboratory tests. Results: 94 selected patients, 53.2% were aged infants and the most prevalent CID was acute bronchiolitis due to other specified microorganism. The duration of vancomycin treatment averaged 13±6.7 days and an initial mean dose was 51.2±14.7 mg/kg/day. Among the adverse events observed edema was the most prevalent, followed by renal toxicity. Of the twelve patients who had MRSA identified in blood or secretions culture, three had persistent infection and one died in less than 30 days. Of patients with nephrotoxicity, 63.6% used vancomycin for more than 14 days and all had vancomycin serum levels ≥15 μg/mL. Conclusion: Vancomycin doses used are in agreement with recommended in literature, however the onset of renal toxicity seems to be related with serum level and the duration of vancomycin treatment. It is suggested to conduct studies to confirm this associative tendency among treatment duration, vancomycin serum levels and appearance of nephrotoxicity.

As interações que ocorrem entre as bactérias e amebas podem dar-se através de relações mútuas, onde ambos os organismos se beneficiam da associação ou parasitárias, em que um organismo se beneficia em detrimento do outro. Quando esses organismos compartilham o mesmo ambiente, pode resultar em algumas alterações, seja no crescimento dos organismos, nos padrões de adaptação, na morfologia, no seu desenvolvimento ou até mesmo na sua capacidade para sintetizar proteínas e outras substâncias. No presente estudo, avaliou-se a interação entre Acanthamoeba polyphaga e Staphylococcus aureus (MRSA) através de um modelo de cocultivo em diferentes tempos de incubação. A partir deste, 89% das células amebianas permaneceram viáveis após contato com a bactéria. O isolado bacteriano foi visualizado no interior da ameba através de microscopia confocal e de fluorescência em até 216 horas de cocultivo, sendo considerado um microrganismo resistente à ameba. O contato de A. polyphaga com S. aureus (MRSA) não demonstrou alteração fenotípica da ameba através dos testes fisiológicos de osmo e termotolerância. O lisado da cultura amebiana aumentou o crescimento de S. aureus (MRSA) nos diferentes tempos de incubação, porém houve diferença significativa apenas entre o controle e 96 horas de cocultivo. O crescimento de S. aureus (MRSA) foi inibido ao longo dos tempos de incubação pelo efeito do sobrenadante da cultura amebiana apresentando diferença significativa entre o controle e 96 horas de cocultivo, sugerindo-se que A polyphaga tenha secretado algum tipo de metabólito, que inibiu o crescimento da bactéria. A interação dos microrganismos não apresentou alterações significativas no perfil de susceptibilidade aos antibióticos testados. S. aureus (MRSA) permaneceu viável em cistos de A. polyphaga, reforçando a hipótese de que Acanthamoeba pode desempenhar um papel crucial na propagação de S. aureus (MRSA) na comunidade e ambiente hospitalar. O maior percentual de amebas encistadas deu-se em 96 horas de incubação quando cocultivadas com o isolado de S. aureus (MRSA), apresentando um aumento progressivo deste percentual a cada período de incubação. A partir disso, estudos devem intensificar-se para melhor compreender os mecanismos de virulência envolvidos na interação entre ambos os microrganismos. / The interactions that occur between bacteria and amoebae can give through mutual relations, where both organisms benefit from the association or parasitic in which one organism benefits at the expense of the other. When these organisms share the same environment, can result in some changes in the growth of organisms, in adaptation patterns, in morphology, development or even in their ability to synthesize proteins and other substances. In the present study, we evaluated the interaction between Acanthamoeba polyphaga and Staphylococcus aureus (MRSA) using a coculture model at different incubation times. From this, 89% of amoebic cells remain viable after contact with the bacteria. The bacterial isolate was visualized inside the amoeba through confocal microscopy and fluorescence for up to 216 hours of cocultivation, being considered a resistant microorganism to the amoeba. The contact of A. polyphaga with S. aureus (MRSA) showed no phenotypic changes of amoeba through physiologic osmo or thermotolerance tests. The lysate of amoebic culture increased the growth of S. aureus (MRSA) in the different incubation times, but there was a significant difference only between the control and 96 hours of cocultivation. The growth of S. aureus (MRSA) has been inhibited over the incubation times for the effect of amoebic culture supernatant showing a significant difference between the control and 96 hours of coculture, suggesting tha A. polyphaga has some kind of secreted metabolites inhibiting the growth of bacteria. The interaction of microorganisms showed no significant changes in the susceptibility profile of the tested antibiotics. S. aureus (MRSA) remained viable cysts of A. polyphaga, reinforcing the hypothesis that Acanthamoeba can play a crucial role in the spread of S. aureus (MRSA) in the community and hospital. The highest percentage of encysted amoebae occurred in 96 hours of incubation when cocultured with the isolate of S. aureus (MRSA), with a progressive increase in this percentage to each incubation period. From this, studies should be intensified to better understand the virulence mechanisms involved in the interaction between these two organisms.

A presença de bactérias patogênicas com capacidade de formar biofilme nos dispositivos de uso médico constitui um dos principais problemas na saúde pública. O biofilme confere proteção contra os mecanismos de defesa do hospedeiro e ação dos antimicrobianos, aumentando a virulência e resistência dos micro-organismos. A erradicação deste tipo de biofilmes é uma das principais estratégias no tratamento de doenças infecciosas associadas a bactérias patogênicas. A erradicação pode ser feita com o uso de biomoléculas produto do metabolismo secundário de diferentes micro-organismos. O objetivo deste estudo foi procurar novas moléculas com o potencial de erradicar biofilmes patogênicos associados a implantes médicos a partir de bactérias associadas ao género Drosera usando como bactérias alvo os patógenos Pseudomonas aeruginosa e Staphylococcus epidermidis. Para isto, foram crescidos 193 isolados bacterianos associados à planta Drosera que cresce na região litoral de Nova Tramandaí (RS) no sul do Brasil. Do total de isolados bacterianos foram usados os 36 que apresentaram atividade proteolítica para a produção de sobrenadantes bioativos. Os sobrenadantes bioativos foram usados para testes de erradicação de biofilme usando placas de 96 poços e a técnica de Cristal Violeta nas duas bactérias alvo. Nove isolados bacterianos associados à Drosera apresentaram atividade de erradicação de biofilme por acima de 40%, três deles para P. aeruginosa e seis para S. epidermidis. Destes isolados foi escolhido o isolado com melhor atividade de erradicação para P. aeruginosa e foram realizados testes para determinação da concentração mínima de erradicação de biofilme, antiformação de biofilme, viabilidade celular e microscopia eletrônica de varredura junto com a identificação da bactéria por médio de genes 16S, bem como o fracionamento bioguiado do sobrenadante. Adicionalmente, o sobrenadante bioativo foi testado in vitro em um modelo de dispositivo médico (cateter). A bactéria Gram-positiva que apresentou maior atividade de erradicação em seu sobrenadante possui 99% de similaridade com o Bacillus pumilus. Esta atividade de erradicação de biofilme de P. aeruginosa, pode ser atribuída à presença de uma molécula o composto de aproximadamente 34 kDa. Esta biomolécula o composto pode constituir uma alternativa complementária ao uso dos antibióticos convencionais. A perspectiva de purificar e caracterizar esta biomolécula ou composto para P. aeruginosa permitirá estudar seu mecanismo de ação e o uso no tratamento deste biofilme patogénico na clínica. / The presence of pathogenic bacteria with the ability to form biofilm on medical devices is one of the major problems in public health. The biofilm protects against the host defense mechanisms and the action of antibiotics, increasing the virulence and resistance of microorganisms. The elimination of this type of biofilms is a main strategy in the treatment of infectious diseases associated with pathogenic bacteria. This elimination can be done by using biomolecules from the secondary metabolism product of different micro-organisms. The objective of this study was to look for new molecules with the potential to eradicate pathogenic biofilms associated with medical implants from bacteria associated with gender Drosera using bacteria as targets Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus epidermidis pathogens. For this, were grown 193 bacterial isolates associated with Drosera plant that grows in the coastal region of New Tramandaí (RS) in southern Brazil. Of total bacterial isolates were used which had 36 proteolytic activity for the production of bioactive supernatants. The bioactive supernatants were used for biofilm eradication tests using 96- well plates and Crystal Violet technique in both target bacteria. Then the supernatant with the best eradication activity to P. aeruginosa was chosen to determine the minimum concentration to eradicate biofilm, biofilm inhibition, cell viability and scanning electron microscopy together with the identification of the bacteria by means of 16S and bioguided the fractionation of the supernatant. Additionally, the bioactive supernatant was tested in an in vitro model using the clinical device. Nine bacterial isolates associated with Drosera showed biofilm eradication activity by over 40%, three for P. aeruginosa and six for S. epidermidis. The Gram-positive bacterium with 99% similarity to the Bacillus pumilus showed the best biofilm eradication activity to P. aeruginosa capacity allocated to the presence of a molecule composed of approximately 34 kDa. These biomolecules can be an alternative to complement the use of conventional antibiotics or the direct use of antibiotic activity is presented as the case of bioactive found for P. aeruginosa supernatant. The prospect of purify and characterize this biomolecule or compound to P. aeruginosa will allow us to study this mechanism of action and the use in the treatment of this pathogenic biofilm in the clinic.

O uso de metais na fabricação de implantes ortopédicos iniciou-se nas primeiras décadas do século XX. O aumento do uso de biomateriais implantáveis aumentam também os casos de infecção. A colonização da superfície do biomaterial pode ter início no momento da inserção do corpo estranho no organismo e geralmente é causada por microrganismos da microbiota da pele ou região adjacente ao implante. Este estudo teve por objetivo avaliar por métodos microbiológicos e microscópio eletrônico de varredura (MEV), a aderência bacteriana à superfície de aço inoxidável e liga de titânio de uso médico, bem como a molhabilidade da superfície destes metais. As bactérias usadas foram Staphylococcus epidermidis ATCC 12228 e Staphylococcus aureus ATCC 25923. Os discos de aço inoxidável (15,0 mm de diâmetro x 2,0 mm de espessura) e de liga de titânio (12,0 mm de diâmetro x 2,0 mm de espessura) foram inseridos, asséptica e separadamente, em tubos contendo 15,0 mL de caldo Mueller Hinton e 200,0 \'mü\'L de suspensão bacteriana da ordem de \'10 POT.8\' UFC/mL. Cada bactéria foi estudada individualmente. Os tubos foram incubados por 1, 6, 24, 48 e 72 horas sob agitação a 37 graus Celsius. Após os períodos de incubação, os discos foram retirados do caldo de cultura e submetidos ao banho de ultrassom em 5,0 mL de solução fisiológica 0,85% esterilizada. Deste líquido, foram realizadas diluições da ordem de \'10 POT.-1\' a \'10 POT.-4\' para a quantificação de células viáveis. Os valores foram expressos em UFC/mL. Para S. epidermidis sobre a liga de titânio, o número de células viáveis foi em 1 hora: 7,20 x \'10 POT.4\'; 6 horas: 3,90 x \'10 POT.6\'; 24 horas: 3,80 x \'10 POT.6\'; 48 horas: 9,70 x \'10 POT.6\' e 72 horas: 1,00 x \'10 POT.7\'. Sobre o aço inoxidável, o número de células viáveis foi em 1 hora: 3,00 x \'10 POT.3\'; 6 horas: 2,90 x \'10 POT.6\'; 24 horas: 3,20 x \'10 POT.6\'; 48 horas: 1,41 x \'10 POT.7\' e 72 horas: 1,88 x \'10 POT.7\'. Para S. aureus ) sobre a liga de titânio, o número de células viáveis foi em 1 hora: 2,00 x \'10 POT.3\'; 6 horas: 1,00 x \'10 POT.4\'; 24 horas: 3,10 x \'10 POT.4\'; 48 horas: 4,30 x \'10 POT.4\' e 72 horas: 5,80 x \'10 POT.3\'. Sobre o aço inoxidável, o número de células viáveis foi em 1 hora: 6,00 x \'10 POT.3\'; 6 horas: 2,00 x \'10 POT.3\'; 24 horas: 1,50 x \'10 POT.4\'; 48 horas: 3,20 x \'10 POT.5\' e 72 horas: 6,00 x \'10 POT.3\'. Ambas as superfícies metálicas foram caracterizadas como de média molhabilidade, onde a liga de titânio teve média \'+ OU -\' desvio padrão de 39,016 \'+ OU -\' 11,267 e o aço inoxidável 58,083 \'+ OU -\' 7,165. Tanto o S. aureus quanto o S. epidermidis aderiram às superfícies dos biomateriais estudados, como foi observado por meio de MEV. Com base nos resultados é possível concluir que os dois microrganismos são capazes de aderir a superfícies metálicas. Isto aumenta a preocupação quanto à patogênese das infecções relacionadas a implantes ortopédicos, uma vez que esses microrganismos estão presentes na pele humana e oferecem o risco de reações inflamatórias e infecção, promovendo a perda do implante para efetivar a cura. / The utilization of metals in the manufacture of orthopedic implants started in first decades of twentieth century. The increased use of implantable biomaterials increased also infection cases. Biomaterial surface colonization can start at the moment of foreign body insertion in the organism and is usually caused by microorganisms of skin microbiota or adjacent region to the implant. This study aimed to evaluate microbiological methods and scanning electron microscopy (SEM), the bacterial adhesion to surface of stainless steel and titanium alloy of medical use, as well as the surface wetability of these metals. The used bacteria were Staphylococcus epidermidis ATCC 12228 and Staphylococcus aureus ATCC 25923. The stainless steel (15,0 mm diameter x 2,0 mm thick) and titanium alloy (12,0 mm diameter x 2,0 mm thick) discs were inserted, aseptic and individually, into tubes containing 15,0 mL Mueller Hinton broth and 200,0 \'mü\'L of bacterial suspension with \'10 POT.8\' CFU/mL concentration. Each bacterium was individually studied. The tubes were incubated for 1, 6, 24, 48 and 72 hours under agitation at 37 Celsius degrees. After incubation periods, the discs were removed from culture broth and submitted to the ultrasound bath in 5,0 mL of sterile saline. From this liquid were realized dilutions of \'10 POT.-1\' to \'10 POT.-4\' to quantify the viable cells. Values were expressed in CFU/mL. S. epidermidis over titanium alloy viable cells number was in 1 hour: 7,20 x \'10POT.4\'; 6 hours: 3,90 x \'10 POT.6\'; 24 hours: 3,80 x \'10 POT.6\'; 48 hours: 9,70 x \'10 POT.6\' and 72 hours: 1,00 x \'10 POT.7\'. Over stainless steel viable cells number was in 1 hour: 3,00 x \'10 POT.3\'; 6 hours: 2,90 x \'10 POT.6\'; 24 hours: 3,20 x \'10 POT.6\'; 48 hours: 1,41 x \'10 POT.7\' and 72 hours: 1,88 x \'10 POT.7\'. To S. aureus over titanium alloy viable cells number was in 1 hour: 2,00 x \'10 POT.3\'; 6 hours: 1,00 x \'10 POT.4\'; 24 hours: 3,10 x \'10 POT.4\'; 48 hours: 4,30 x \'10 POT.4\' and 72 hours: 5,80 x \'10 POT.3\' and over stainless steel viable cells number was in 1 hour: 6,00 x \'10 POT.3\'; 6 hours: 2,00 x \'10 POT.3\'; 24 hours: 1,50 x \'10 POT.4\'; 48 hours: 3,20 x \'10 POT.5\' and 72 hours: 6,00 x \'10 POT.3\'. Both metal surfaces were characterized as medium wetability, where the contact angle of titanium alloy was mean \'+ OU -\' standard deviation 39,016 \'+ OU -\' 11,267 and stainless steel 58,083 \'+ OU -\' 7,165. Both S. aureus as S. epidermidis adhered to surfaces of biomaterials studied, as observed by SEM. Based on the results we concluded that two microorganisms are able to adhere to metal surfaces. This increases the concern about the pathogenesis of infections related to orthopedic implants, since these microorganisms are present in human skin and provide the risk of infection and inflammatory reactions, furthering implant loss to effective cure.

A infecção bacteriana é a principal complicação que um procedimento de artroplastia de quadril ou joelho pode apresentar. Mesmo após a incorporação de antibiótico (gentamicina) ao cimento ósseo, as taxas de infecções após este procedimento cirúrgico continuam gerando sérios prejuízos para o hospital e para o paciente. As principais bactérias envolvidas nas infecções relacionadas aos implantes ortopédicos são Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus e Staphylococcus epidermidis. O objetivo deste trabalho foi avaliar a aderência e formação de biofilme de S. aureus, S. epidermidis e P. aeruginosa sobre o cimento ósseo polimetilmetacrilato (PMMA) com e sem antibiótico (gentamicina), de procedência nacional e internacional, por meio de microscópio eletrônico de varredura (MEV) e por cultura. Também, estimar quantitativamente as células viáveis recuperadas dos biofilmes formados. Foram produzidos discos de polimetilmetacrilato de 10,0 mm de diâmetro e 3,0 mm de espessura. Foram utilizadas cepas Pseudomonas aeruginosa - ATCC 27853, Staphylococcus epidermidis - ATCC 12228 e Staphylococcus aureus - ATCC 25932. Para este estudo foram utilizados corpos-de-prova de cimento ósseo de procedência nacional (BAUMER, CMM e BIOMECANICA) e internacional (BIOMET com gentamicina, BIOMET sem gentamicina e SIMPLEX). Biofilmes foram produzidos in vitro a partir da inoculação da suspensão bacteriana (\'10 POT.8\' unidades formadoras de colônia/mL) em Tryptic Soy Broth e incubados nos períodos de tempo de 1, 6, 24, 48, e 72 horas. Após os períodos de incubação os corpos-de-prova foram removidos do meio de cultura, lavados, sonicados e do sobrenadante realizadas diluições seriadas (\'10 POT.-1\' a \'10 POT.-5\'). A seguir, os corpos-de-prova foram preparados para observação por MEV. Os resultados de MEV mostraram bacilos e cocos aderidos e agrupados formando biofilme. Para P. aeruginosa: as contagens das células viáveis em média (UFC/mL) foram de 2,8 \'+ OU -\' 1,7 x \'10 POT.6\' (BAUMER), 1,7 \'+ OU -\' 0,9 x \'10 POT.6\' (BIOMECANICA), 1,7 \'+ OU -\' 0,7 x \'10 POT.6\' (CMM), 1,6 \'+ OU -\' 0,7 x \'10 POT.6\' (BIOMET sem gentamicina), 6,0 \'+ OU -\' 5,5 x \'10 POT.4\' (BIOMET com gentamicina) e 1,9 \'+ OU -\' 0,9 x \'10 POT.6\' (SIMPLEX); para S. epidermidis: 1,3 \'+ OU -\' 0,1 x \'10 POT.6\' (BAUMER), 1,5 \'+ OU -\' 0,2 x \'10 POT.6\' (BIOMECANICA), 2,3 \'+ OU -\' 1,7 x \'10 POT.6\' (CMM), 1,5 \'+ OU -\' 0,7 x \'10 POT.6\' (BIOMET sem gentamicina), 1,5 \'+ OU -\' 0,2 x \'10 POT.6\' (BIOMET com gentamicina) e 1,2 \'+ OU -\' 0,1 x \'10 POT.6\' (SIMPLEX); para S. aureus: 1,7 \'+ OU -\' 0,8 x \'10 POT.6\' (BAUMER), 1,6 \'+ OU -\' 0,7 x \'10 POT.6\' (BIOMECANICA), 1,4 \'+ OU -\' 0,6 x \'10 POT.6\' (CMM), 1,1 \'+ OU -\' 0,5 x \'10 POT.6\' (BIOMET sem gentamicina), 3,0 \'+ OU -\' 6,0 x \'10 POT.5\' (BIOMET com gentamicina) e 1,3 \'+ OU -\' 0,6 x \'10 POT.6\' (SIMPLEX), respectivamente. Os dados obtidos mostraram que o cimento ósseo de polimetilmetacrilato com e sem gentamicina não evitaram a aderência da Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus epidermidis e Staphylococcus aureus e formação de biofilme, como demonstrado pela MEV. Em conclusão, isto é um fator de risco para infecções. / The bacterial infection is the main complication of a procedure for hip or knee arthroplasty can present. Even after the addition of antibiotic (gentamicin) in the bone cement, the rates of infection after the surgical procedure continue causing serious damage to the hospital and the patient. The main bacteria involved in infections related to orthopedic implants are Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis. The objective of this study was to evaluate the adhesion and biolfilm formation of the S. aureus, S. epidermidis and P. aeruginosa on the bone cement polymethylmethacrylate (PMMA) with and without antibiotic (gentamicin) from national and international origin, by means scanning electron microscope (SEM) and by culture. Also, quantitatively estimate the viable cells recovered from biofilms formed. Discs of cement were produced from 10.0 mm in diameter and 3.0 mm thick. Strains used were Pseudomonas aeruginosa - ATCC 27853, Staphylococcus epidermidis - ATCC 12228 e Staphylococcus aureus - ATCC 25932. For this study we used coupons cement of national origin (Baumer, CMM and biomechanics) and international (BIOMET with gentamicin, BIOMET without gentamicin and SIMPLEX). Biofilms were produced in vitro from the inoculation of bacterial suspension (108 Colony-Forming Units/mL) in Tryptic Soy Broth and incubated for the time periods of 1, 6, 24, 48 and 72 hours. After the incubation periods of the coupons they were removed from the medium culture, washed, sonicated and serial dilutions of supernatant taken (\'10 POT.-1\' a \'10 POT.-5\'). Next, the coupons were prepared for observation by SEM. The results of SEM showed adherent cocci bacilli, and adhered to each other form a biofilm. For P. aeruginosa: the couting of viable cells on average (CFU/mL) were 2,8 \'+ OU -\' 1,7 x \'10 POT.6\' (BAUMER), 1,7 \'+ OU -\' 0,9 x \'10 POT.6\' (BIOMECANICA), 1,7 \'+ OU -\' 0,7 x \'10 POT.6\' (CMM), 1,6 \'+ OU -\' 0,7 x \'10 POT.6\' (BIOMET sem gentamicina), 6,0 \'+ OU -\' 5,5 x \'10 POT.4\' (BIOMET com gentamicina) e 1,9 \'+ OU -\' 0,9 x \'10 POT.6\' (SIMPLEX); para S. epidermidis: 1,3 \'+ OU -\' 0,1 x \'10 POT.6\' (BAUMER), 1,5 \'+ OU -\' 0,2 x \'10 POT.6\' (BIOMECANICA), 2,3 \'+ OU -\' 1,7 x \'10 POT.6\' (CMM), 1,5 \'+ OU -\' 0,7 x \'10 POT.6\' (BIOMET sem gentamicina), 1,5 \'+ OU -\' 0,2 x \'10 POT.6\' (BIOMET com gentamicina) e 1,2 \'+ OU -\' 0,1 x \'10 POT.6\' (SIMPLEX); para S. aureus: 1,7 \'+ OU -\' 0,8 x \'10 POT.6\' (BAUMER), 1,6 \'+ OU -\' 0,7 x \'10 POT.6\' (BIOMECANICA), 1,4 \'+ OU -\' 0,6 x \'10 POT.6\' (CMM), 1,1 \'+ OU -\' 0,5 x \'10 POT.6\' (BIOMET sem gentamicina), 3,0 \'+ OU -\' 6,0 x \'10 POT.5\' (BIOMET com gentamicina) e 1,3 \'+ OU -\' 0,6 x \'10 POT.6\' (SIMPLEX), respectively. The data showed that of polymethylmethacrylate bone cement with and without gentamicin did not prevent the adhesion of Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus epidermidis and Staphylococcus aureus and formation of biofilms, as demonstrated by SEM. In conclusion, this is risk factor for infections.

A presença de bactérias patogênicas com capacidade de formar biofilme nos dispositivos de uso médico constitui um dos principais problemas na saúde pública. O biofilme confere proteção contra os mecanismos de defesa do hospedeiro e ação dos antimicrobianos, aumentando a virulência e resistência dos micro-organismos. A erradicação deste tipo de biofilmes é uma das principais estratégias no tratamento de doenças infecciosas associadas a bactérias patogênicas. A erradicação pode ser feita com o uso de biomoléculas produto do metabolismo secundário de diferentes micro-organismos. O objetivo deste estudo foi procurar novas moléculas com o potencial de erradicar biofilmes patogênicos associados a implantes médicos a partir de bactérias associadas ao género Drosera usando como bactérias alvo os patógenos Pseudomonas aeruginosa e Staphylococcus epidermidis. Para isto, foram crescidos 193 isolados bacterianos associados à planta Drosera que cresce na região litoral de Nova Tramandaí (RS) no sul do Brasil. Do total de isolados bacterianos foram usados os 36 que apresentaram atividade proteolítica para a produção de sobrenadantes bioativos. Os sobrenadantes bioativos foram usados para testes de erradicação de biofilme usando placas de 96 poços e a técnica de Cristal Violeta nas duas bactérias alvo. Nove isolados bacterianos associados à Drosera apresentaram atividade de erradicação de biofilme por acima de 40%, três deles para P. aeruginosa e seis para S. epidermidis. Destes isolados foi escolhido o isolado com melhor atividade de erradicação para P. aeruginosa e foram realizados testes para determinação da concentração mínima de erradicação de biofilme, antiformação de biofilme, viabilidade celular e microscopia eletrônica de varredura junto com a identificação da bactéria por médio de genes 16S, bem como o fracionamento bioguiado do sobrenadante. Adicionalmente, o sobrenadante bioativo foi testado in vitro em um modelo de dispositivo médico (cateter). A bactéria Gram-positiva que apresentou maior atividade de erradicação em seu sobrenadante possui 99% de similaridade com o Bacillus pumilus. Esta atividade de erradicação de biofilme de P. aeruginosa, pode ser atribuída à presença de uma molécula o composto de aproximadamente 34 kDa. Esta biomolécula o composto pode constituir uma alternativa complementária ao uso dos antibióticos convencionais. A perspectiva de purificar e caracterizar esta biomolécula ou composto para P. aeruginosa permitirá estudar seu mecanismo de ação e o uso no tratamento deste biofilme patogénico na clínica. / The presence of pathogenic bacteria with the ability to form biofilm on medical devices is one of the major problems in public health. The biofilm protects against the host defense mechanisms and the action of antibiotics, increasing the virulence and resistance of microorganisms. The elimination of this type of biofilms is a main strategy in the treatment of infectious diseases associated with pathogenic bacteria. This elimination can be done by using biomolecules from the secondary metabolism product of different micro-organisms. The objective of this study was to look for new molecules with the potential to eradicate pathogenic biofilms associated with medical implants from bacteria associated with gender Drosera using bacteria as targets Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus epidermidis pathogens. For this, were grown 193 bacterial isolates associated with Drosera plant that grows in the coastal region of New Tramandaí (RS) in southern Brazil. Of total bacterial isolates were used which had 36 proteolytic activity for the production of bioactive supernatants. The bioactive supernatants were used for biofilm eradication tests using 96- well plates and Crystal Violet technique in both target bacteria. Then the supernatant with the best eradication activity to P. aeruginosa was chosen to determine the minimum concentration to eradicate biofilm, biofilm inhibition, cell viability and scanning electron microscopy together with the identification of the bacteria by means of 16S and bioguided the fractionation of the supernatant. Additionally, the bioactive supernatant was tested in an in vitro model using the clinical device. Nine bacterial isolates associated with Drosera showed biofilm eradication activity by over 40%, three for P. aeruginosa and six for S. epidermidis. The Gram-positive bacterium with 99% similarity to the Bacillus pumilus showed the best biofilm eradication activity to P. aeruginosa capacity allocated to the presence of a molecule composed of approximately 34 kDa. These biomolecules can be an alternative to complement the use of conventional antibiotics or the direct use of antibiotic activity is presented as the case of bioactive found for P. aeruginosa supernatant. The prospect of purify and characterize this biomolecule or compound to P. aeruginosa will allow us to study this mechanism of action and the use in the treatment of this pathogenic biofilm in the clinic.

Staphylococcus aureus resistente à meticilina (SARM) é um dos principais patógenos responsáveis pela infecção nosocomial e recentemente tem sido isolada fora do ambiente hospitalar, trazendo uma grande preocupação a médicos e pesquisadores. Esta resistência à meticilina é devida à presença do gene mecA, o qual codifica a PLP2a, uma proteína ligadora de penicilina, que tem baixa afinidade pelos antibióticos β-Lactâmicos. A vancomicina, até recentemente, era o tratamento de escolha para pacientes acometidos pela SARM; porém o isolamento de cepas com resistência intermediária e S. aureus totalmente resistentes à vancomicina, gerou uma grande mobilização da comunidade científica na busca de alternativas para o tratamento destas cepas multirresistentes, através do desenvolvimento de vacinas e soroterapia. A vacina de DNA é uma técnica recente que, entre outras vantagens, não necessita da purificação do antígeno protéico para induzir uma resposta imune, diminuindo o custo de produção, quando comparada às vacinas protéicas. Neste trabalho, demonstramos que a utilização de uma vacina de DNA com um fragmento do gene mecA produz uma resposta imune humoral, com a produção de anticorpos específicos anti-PLP2a em eqüinos imunizados com esta vacina, e que estes anticorpos, após sua purificação, permanecem ativos. Como ainda não existe informação suficiente em relação à segurança do uso das vacinas de DNA diretamente em humanos, o uso desta técnica em eqüinos, com o objetivo de gerar um soro hiperimune, para utilizá-lo após sua purificação no tratamento de pacientes acometidos com infecção provocada por SARM, poderia ser uma alternativa viável e segura no combate a esta bactéria resistente a quase todos agentes antimicrobianos. / Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) is one of the major pathogens responsible for nosocomial infection and has been recently isolated outside the hospital environment, causing a great concern to physicians and researchers. This methicillinresistance is due to the presence of the mecA gene, which codes for PBP2a, a penicillinbinding protein, which has low affinity for β-Lactamic antibiotics. The treatment of choice for patients afflicted by MRSA was, until recently, vancomicyn; however the isolation of vancomycin-intermediate and resistant S. aureus strains generated a great mobilization of the scientific community for the search of alternatives for the treatment of these multiresistant strains, such as, for example vaccines and soroterapy. The DNA vaccine is a recent method that, among others, does not require the purification of the of the proteic antigen to induce a immune response, reducing production costs as compared to protein vaccines. In the present study we demonstrated that the use of a DNA vaccine with a fragment of the mecA gene produces an humoral immune response, with the production of anti-PBP2a specific antibodies in horses immunized with this vaccine, and these antibodies, once purified, maintain their activity. Since there is not sufficient information about the safety of DNA vaccines used directly to humans, the use of this vaccine in horses, with the intent of generating an hyperimmune serum to be used after its purification in the treatment of patients afflicted with infection caused by MRSA could be a possible and safe alternative to fight this bacteria resistant to almost all antimicrobial agents.

Submitted by Ramon Santana (ramon.souza@ufpe.br) on 2015-03-11T19:21:36Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) TESE Natália Gomes de Morais.pdf: 3697171 bytes, checksum: 7270910fb7622716567ee3d66510cabf (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-11T19:21:36Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) TESE Natália Gomes de Morais.pdf: 3697171 bytes, checksum: 7270910fb7622716567ee3d66510cabf (MD5) Previous issue date: 2014-10-24 / CAPES e CNPq / Agressões nutricionais, no período neonatal, interferem com a programação de mecanismos funcionais dos macrófagos, provocando alterações duradouras, detectáveis no organismo adulto mesmo após reposição nutricional. Sabe-se que a desnutrição e infecção por Staphylococcus aureus (S. aureus) multirresistentes estão associadas a altas taxas de mortalidade, porém poucas são as pesquisas que avaliam a sua interação. Em virtude disto, o objetivo deste estudo foi avaliar o efeito da desnutrição neonatal sobre sinalização intracelular, função microbicida e viabilidade de macrófagos alveolares infectados, in vitro, com S. aureus meticilina sensível (MSSA) e meticilina resistente (MRSA). Metodologia: Ratos machos Wistar (n=48) foram divididos em dois grupos distintos: Nutrido (dieta com 17% de caseína) e Desnutrido (à dieta com 8% de caseína), seguidos de reposição nutricional. Aos 90-120 dias de vida, os animais foram submetidos a um procedimento cirúrgico de traqueostomia para coleta de macrófagos (MØ). Após o isolamento dos MØ, foram padronizados 4 sistemas: controle negativo, composto apenas por MØ em cultura; controle positivo, MØ adicionados a 10μL Lipopolissacarídeo (LPS); e dois sistemas teste, MØ mais S. aureus sensível e resistente a meticilina. As células foram incubadas por 24h à 37ºC, com atmosfera úmida e 5% de CO2. Transcorrido este período, foram realizados ensaios para análise da expressão gênica dos receptores TLR-2, TLR-4, NLRP-3, das enzimas iNOS e caspase-1, produção de radicais livres e viabilidade dos macrófagos infectados in vitro. Na análise estatística, utilizou-se teste t Student e análise de variância (ANOVA), admitindo-se p<0,05. O modelo de desnutrição neonatal adotado promoveu redução do crescimento ponderal dos animais, da expressão dos receptores TLR-2, TLR-4, NLRP3, das enzimas iNOS e caspase -1, do estresse nitrosativo e da taxa de macrófagos viáveis. Entretanto, a interação Staphylococcus aureus versus macrófagos promoveu maior expressão dos receptores, das enzimas analisadas e do ânion superóxido. Pode-se concluir que a desnutrição neonatal comprometeu a expressão dos receptores de reconhecimento padrão, produção de óxido nítrico e o percentual de células viáveis. Entretanto, a exacerbação da resposta oxidativa, do receptor NLRP3 e da enzima caspase-1, após infecção por MRSA, pode favorecer o surgimento de lesões teciduais que permitam a permanência e a disseminação destas bactérias. Desta forma, há um maior risco para aquisição de quadros inflamatórios desregulados em infecções por S. aureus multirresistentes em indivíduos desnutridos no período neonatal.

Submitted by Lucelia Lucena (lucelia.lucena@ufpe.br) on 2015-03-13T19:07:33Z No. of bitstreams: 2 dissertaçaofinalAndréa- COMPLETA.pdf: 1298422 bytes, checksum: 5c25bfcc0731b18f44f5b7703e5e752c (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-13T19:07:33Z (GMT). No. of bitstreams: 2 dissertaçaofinalAndréa- COMPLETA.pdf: 1298422 bytes, checksum: 5c25bfcc0731b18f44f5b7703e5e752c (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2012 / Introdução: Staphylococcus aureus resistente a meticilina (MRSA) são atualmente um grave problema de saúde pública. Este micro-organismo além de produzir diversos fatores de virulência tornando-o altamente patogênico, é resistente à quase todos os antimicrobianos utilizados na clínica médica, restando poucas alternativas terapêuticas. Diante deste fato, torna-se urgente a busca por novos agentes antimicrobianos e nesta perspectiva, os compostos de origem vegetal têm sido alvo de várias pesquisas em todo o mundo. Objetivos: Avaliar a atividade antimicrobiana da β-lapachona e sua ação inibitória sobre a biossíntese de catalase, hemolisinas e biofilme por 12 cepas MRSA. Métodos: A concentração inibitória mínima (CIM) da β-lapachona foi determinada frente às cepas MRSA através da técnica de microdiluição em caldo. A biossíntese de catalase foi avaliada semi-quantitativamente através do teste em tubo, colocando em contato o inóculo bacteriano exposto ou não exposto à β-lapachona com o peróxido de hidrogênio a 3% e em seguida foi realizada a aferição da altura da efervescência gerada pela liberação de oxigênio gasoso. Para determinação das hemolisinas extracelulares, foi realizado um teste utilizando hemácias de carneiro para avaliação da atividade hemolítica do sobrenadante das culturas expostas ou não expostas à β-lapachona. A formação de biofilme foi determinada em placas de microtitulação de poliestireno utilizando cristal violeta para coloração do biofilme formado e procedendo-se à leitura espectofotométrica da densidade óptica no comprimento de onda de 595nm. Resultados: A CIM de β-lapachona para as cepas MRSA avaliadas variou de 8μg/mL a 32μg/mL. A biossíntese dos fatores de virulência avaliados foi reduzida significativamente em todas as cepas MRSA. Conclusão: a β-lapachona possui atividade antiestafilocócica e que foi capaz de reduzir a biossíntese de fatores de virulência nas cepas MRSA avaliadas. Assim este composto pode ser incluído no arsenal de substâncias naturais bioativas com potencial de serem utilizadas como alternativa na terapêutica antimicrobiana contra MRSA após estudos de compatibilidade in vivo e toxicidade. Pode servir também como protótipo para produção de novas moléculas mais ativas e menos tóxicas.