Malgré le statut immunologique particulier du système nerveux central (SNC), l'immunothérapie active représente une approche intéressante dans le traitement des tumeurs cérébrales. Loin d'être immunologiquement muet, le SNC possède même son propre réseau de cellules immunocompétentes spécialisées : les cellules microgliales. D'origine myeloïdes, elles sont capables de jouer le rôle de cellules présentatrices d'antigènes (CPA) après activation et sont idéalement situées pour induire une réponse immunitaire cytotoxique anti-tumorale efficace La manipulation de la microglie pour augmenter les réponses immunes représentent donc une approche thérapeutique particulièrement attractive dans le traitement de ces cancers. Afin de mieux caractériser les cellules microgliales, nous avons développé un modèle de souris rendues aplasique par irradiation, au sein duquel seule la microglie peut jouer le rôle de CPA. Ainsi, nous avons pu observé que dans des conditions adéquates (CpG-ODN, GM-CSF, sCD40L) les cellules microgliales sont douées in vivo d'une activité de présentation antigénique croisée et que celle-ci conduit à l'activation des LT CD8+ spécifique. En parallèle, nous avons évalué un protocole d'immunothérapie active dans un modèle préclinique de tumeur cérébrale basé sur l'implantation stéréotaxique de cellules E.G7-OVA. Ce protocole se base sur l'injection de CpG-ODN, une molécule d'origine microbienne permettant d'activer les cellules du système immunitaire et plus précisément les CPA infiltrant les tumeurs, et sur l'élimination temporaire des lymphocytes T régulateurs, des cellules qui assimilent les antigènes tumoraux à des peptides du soi et conduisent à l'anergie du système immunitaire. Les résultats obtenus montrent que ce traitement induit le rejet de la tumeur pour l'ensemble des souris et que ce rejet est dépendant de la présence des cellules NK (" natural killer ").

Il n'existe actuellement aucun traitement efficace pour les patients présentant une blessure au niveau de la moelle épinière. Ce triste constat est, en partie, dû à la présente d'une cicatrice empêchant la repousse des tissus. Dans ce contexte, des biomatériaux (composés non-toxiques) pourraient être implantés afin de réduire la cicatrice en formation et de fournir un support de repousse aux fibres nerveuses. Parmi ces biomatériaux, certains semblent induire de nombreuses améliorations chez le rat. Nous avons renforcé ces résultats, à l'aide de techniques électrophysiologiques. De plus, nous avons développé un nouveau matériau dégradable afin de limiter toutes réactions délétères à long terme. Après avoir synthétisé notre matériau, combinant les qualités de dégradabilité de l'acide poly(lactique) et les propriétés mécaniques du poly(méthacrylate d'hydroxyéthyle), nous avons évalué ses différentes caractéristiques et ses effets thérapeutiques. Les résultats obtenus sont encourageants. Il serait maintenant intéressant de coupler notre biomatériau à des molécules bioactives ou à des cellules. / Currently, there is no treatment for patients with spinal cord injury. This pessimistic statement is, in part, due to the presence of a scar that prevents tissue regrowth. In this context, biomaterials (non-toxic compounds) could be implanted in order both to reduce the scar formation and to provide a growth support for nervous fibers. Among those biomaterials, many seem to induce numerous benefic effects in the rat model. We confirmed these data by the use of electrophysiological techniques. In addition, we developed a new degradable material so as to limit any long term deleterious reactions. After having synthesized our material, combining the degradable quality of the poly(lactic acid) and the mechanical properties of the poly(hydroxyethyl methacrylate), we analyzed its different characteristics and its therapeutic effects. The obtained results are encouraging. Now, it would be interesting to couple bioactive molecules or cells with our biomaterial scaffold.

Les exosomes sont des vésicules d'origine endocytaire sécrétées par les cellules dans leur environnement après fusion des endosomes multivésiculés avec la membrane plasmique. Ils représentent un nouveau moyen de communication cellulaire par le transfert intercellulaire de protéines, de lipides et d'ARN. Dans le laboratoire, nous nous intéressons aux rôles que pourraient jouer les exosomes neuronaux dans le système nerveux central. Nous avons montré que les neurones matures sécrètent des exosomes. Nous avons mis en évidence que cette sécrétion est directement reliée à l'activité synaptique glutamatergique et à une entrée de Ca2+. Nous avons également découvert que la partie C-terminale de la chaîne lourde de la toxine du tétanos peut être sécrétée par voie exosomale. Nous avons observé que les exosomes la contenant sont repris par des neurones en culture. Un tel cargo semble d'ailleurs influencer le devenir des exosomes. De plus, pour étudier la recapture des exosomes, nous avons utilisé des exosomes de cellules N2a exprimant la tétraspanine CD63 fusionnée à la GFP. En incubant des neurones d'hippocampe avec des exosomes GFP-CD63, nous sommes parvenus à démontrer qu'ils étaient endocytés par les neurones receveurs. Cependant, bien que les exosomes semblent avoir été internalisés, nos résultats suggèrent que leur trafic serait indépendant de la voie endocytaire classique. Enfin, nous nous sommes intéressé au contenu en ARN des exosomes de N2a et de neurones. Nous avons démontré qu'ils contenaient majoritairement des ARN courts (≤ 200 nucléotides) parmi lesquels, les microARN 132 et 138. Les microARN sont de puissants régulateurs de l'expression génique. Leur transfert, via les exosomes, représenterait une nouvelle voie de régulation très fine et avec un impact conséquent sur le fonctionnement du système nerveux. Les exosomes neuronaux pourraient donc jouer un rôle dans la physiologie normale de la synapse, en permettant l'échange d'ARN et de récepteurs aux neurotransmetteurs entre neurones. Ils pourraient également être impliqués dans la propagation de protéines pathogènes comme la toxine du tétanos et la propagation de certaines maladies neurodégénératives comme Alzheimer et Creutzfeldt-Jacob. L'ensemble de nos résultats suggère que les exosomes joueraient un rôle-clé dans le système nerveux central, de par leur implication dans des processus physiologiques et pathologiques. / Exosomes are vesicles of endocytic origin released by cells into their environment on fusion of multivesicular endosomes with the plasma membrane. They represent a novel mechanism of cell communication by intercellular transfer of proteins, lipids and RNAs. In our laboratory, we are interested in the roles neuronal exosomes could play in the central nervous system. We first showed that mature neurons secrete exosomes and that this is regulated by synaptic glutamatergic activity and by Ca2+ influx. We next demonstrated that the C-terminal part of the tetanus toxin heavy chain can be released in association with neuronal exosomes which can then be taken up by other neurons. Moreover, such a cargo seems to influence the actual fate of the exosome. In order to further examine exosome reuptake, we used exosomes from N2a cells expressing the tetraspanin CD63 fused to the green fluorescent protein, GFP. By incubating cultured hippocampal neurons with GFP-CD63 exosomes, we succeeded in proving that they were found inside the recipient neurons. However, although exosomes are internalized, our results suggest that their traffic is independent of the classical endosomal pathway. We also studied the RNAs contained in the N2a and neuronal exosomes. These were mainly short RNAs (≤ 200 nucleotides) including microRNAs 132 and 138. MicroRNAs are key regulators of gene expression. Their transfer by exosomes could represent a new way for fine regulation with a potentially powerful impact on the nervous system. Neuronal exosomes could play a crucial role in the normal physiology of synapses, by allowing the exchange of RNAs and neurotransmitter receptors between neurons. They could also propagate pathogenic proteins such as tetanus toxin and be involved in neurodegenerative disorders such as Alzheimer's and Creutzfeldt-Jacob's diseases. Altogether, our results pave the way towards the demonstration that exosomes play an important part in the functioning of the central nervous system via their involvement in physiological and pathological processes.

Le gène gec1/gabarapl1 (glandular epithelial cell 1/gabarap like 1), identifié au sein de notre équipe, est un gène apparenté à la famille atg8 (autophagy related gene 8) et  la  sous-­‐famille  gabarap  (GABAA  receptor  associated  protein)  incluant  les  gènes  gabarap, gabarapl1, gabarapl2 et gabarapl3. Les protéines codées par ces gènes présentent de très fortes identités de séquences et des structures similaires. Le gène gabarapl1 est exprimé préférentiellement dans le SNC dans lequel il est le transcrit de la famille atg8 le plus fortement exprimé. Des études fonctionnelles ont démontré que la protéine GABARAPL1 intervient dans le trafic intracellulaire de récepteurs, et plus particulièrement  du  récepteur  GABAA  et  du  récepteur  aux  κ-­‐opioïdes,  via  son  interaction avec les microtubules. Cependant, le rôle de cette protéine ne se limite probablement  pas  au  seul  transport  de  ces  récepteurs.  Notre  équipe  a  d’ailleurs  récemment démontré que GABARAPL1 est impliquée dans le processus d’autophagie, un mécanisme de dégradation cellulaire. Dans  le  cadre  de  ma  thèse,  j’ai  eu  trois  objectifs :  (1)  l’étude  de  la  spécificité  d’anticorps anti-­‐GABARAPL1 commerciaux disponibles, (2) la cartographie détaillée de l’expression de GABARAPL1 dans le cerveau murin et (3) l’étude de la surexpression de GABARAPL1 dans un modèle neuronal in vitro en conditions de stress mitochondriaux. Etant donné la forte homologie entre GABARAPL1 et GABARAP, aucun anticorps spécifique  commercial  n’était  disponible  lorsque  nous  avons  débuté  mon  projet  de  recherche. Nous avons donc, dans un premier temps, étudié la spécificité des différents anticorps commerciaux anti-­‐GABARAPL1 disponibles et identifié un anticorps capable de détecter de façon spécifique cette protéine in vitro et in vivo. Grâce  à  cet  anticorps  spécifique,  nous  avons  ensuite  entrepris  l’étude  de  l’expression in vivo de la protéine GABARAPL1 dans le SNC de souris chez l’adulte et au cours du développement embryonnaire. Nous avons ainsi démontré que GABARAPL1 est exprimée dans les neurones immatures et les fibres neuronales à partir du 11e jour de  développement  et  son  expression  augmente  progressivement  jusqu’à  un  taux  maximal observé chez l’adulte. Chez l’adulte, GABARAPL1 est exprimée uniquement dans  les  neurones  et  plus  particulièrement  dans  ceux  impliqués  dans  les  fonctions  motrices et neuroendocrines. De plus, nous avons noté que le marquage ponctiforme de  GABARAPL1  co-­‐localise  partiellement  avec  p62  dans  des  cultures  neuronales  primaires, confirmant son association aux vésicules autophagiques in vivo. Pour caractériser la fonction cellulaire de GABARAPL1, nous avons surexprimé cette protéine dans des cellules neuronales SK-­‐N-­‐BE(2). L’étude de ce nouveau modèle neuronal a montré que la surexpression de DsRed-­‐GABARAPL1 semble potentialiser la réponse  autophagique  des  cellules,  ce  qui  permet  une  induction  plus  précoce  suite  à  des traitements induisant l’autophagie. De plus, la surexpression de GABARAPL1 inhibe la mort des cellules soumises à des stress ciblant les mitochondries (CCCP), ce qui  suggère  que  GABARAPL1  pourrait  protéger  les  neurones  contre  certains  stress  aggravant la progression des maladies neurodégénératives. L’ensemble  de  ces  travaux  a  permis  d’identifier  un  outil  spécifique  à  l’immunodétection de GABARAPL1, de cartographier son expression dans le SNC murin au cours du développement et chez l’adulte et finalement, de démontrer un rôle protecteur  de  GABARAPL1  contre  la  mort  neuronale  induite  par  un  stress  mitochondrial. / The gec1/gabarapl1 gene (glandular epithelial cell 1/gabarap like 1), identified within our team, is a gene related to the atg8 (autophagy related gene 8) family and the gabarap  (GABAA  receptor-­‐associated  protein)  subfamily  of  genes  including  gabarap,  gabarapl1, gabarapl2 and gabarapl3. The protein products of these genes present a very  strong  sequence  identity  and  are  structurally  similar.  The  gabarapl1  gene  is  expressed preferentially in the central nervous system, in which it is the most highly expressed  transcript  of  the  atg8  family.  Functional  studies  have  shown  that  the  GABARAPL1 protein is involved in intracellular trafficking of receptors, in particular the  GABAA  receptor  and  the  κ-­‐opioid  receptor,  via  its  interaction  with  cytoskeletal  elements. The role of this protein, however, is clearly not limited to the transport. Our team has also recently shown that GABARAPL1 is involved in the autophagic process, a cellular degradation mechanism. My  thesis  objectives  were  three-­‐tiered:  (1)  the  study  of  the  specificity  of  anti-­‐GABARAPL1 antibodies, (2) the detailed mapping of GABARAPL1 expression in the mouse  brain  and  (3)  the  study  of  GABARAPL1  overexpression  under  conditions  of  mitochondrial stress in an in vitro neuronal model. Given the high homology between GABARAPL1 and GABARAP, no commercially available  specific  antibody  was  available  when  we  started  my  research  project.  As  such, we conducted a study on the specificity of different commercially available anti-­‐GABARAPL1 antibodies and identified an antibody that specifically recognized this protein in vitro and in vivo experiments. With this specific antibody, we then undertook a study of the in vivo expression of the GABARAPL1 protein in the adult mouse central nervous system and throughout embryonic development. In this study, we demonstrate that GABARAPL1 is expressed in immature neurons and neural fibers in the embryo from the 11th day of embryonic development and its expression gradually increases to a maximum in adults. In adults, GABARAPL1 is expressed in neurons, in particular, in those involved in motor control and  neuroendocrine  functions.  The  punctate  labeling  of  GABARAPL1  partially  co-­‐localizes with p62 in primary neuronal cultures, confirming its association with autophagic vesicles in vivo. To  characterize  the  cellular  function  of  GABARAPL1,  we  overexpressed  this  protein in neuronal SK-­‐N-­‐BE (2) cells. The study of our neuronal cell model revealed that  overexpression  of  DsRed-­‐GABARAPL1  appears  to  prime  cells  for  autophagy,  resulting in an earlier induction of autophagy after treatments that induce this processes.  In  addition,  overexpression  of  this  protein  delays  cell  death  in  a  CCCP-­‐induced mitochondrial stress model, suggesting that GABARAPL1 could protect neurons  against  certain  stresses  known  to  contribute  to  the  development  of  neurodegenerative diseases. Together,  this  work  has  identified  a  specific  tool  for  the  immunodetection  of  GABARAPL1, produced a detailed map of GABARAPL1 expression in the developing and  adult  murine  central  nervous  system  and  finally,  demonstrated  a  protective  role  for GABARAPL1 against neuronal death induced by mitochondrial stress.

La mise en place du système nerveux central (SNC) repose sur l’équilibre entre prolifération et différenciation des cellules souches neurales. Chez les mammifères, le SNC suit un développement biphasique avec une phase proliférative pendant laquelle les cellules souches neuroépithéliales s’amplifient par division symétrique puis une phase neurogénique pendant laquelle elles sont converties en progéniteurs neuraux se divisant de manière asymétrique pour générer leurs neurones. De nombreux mécanismes sont impliqués dans la régulation des phases du développement du SNC, mais leur coordination au cours du développement demeure mal comprise. Dans ce contexte, la famille des gènes oncofoetaux s’avère très pertinente. Ces gènes sont exprimés au cours du développement précoce où ils coordonnent la synchronie des évènements développementaux. Ils sont éteints en fin de développement mais leur réexpression dans de nombreux cancers témoigne de leur caractère oncogénique. Les mécanismes contrôlant leur extinction au cours du développement ou leur réactivation lors de la tumorigenèse restent obscurs. Durant ma thèse de doctorat, j’ai utilisé la mouche drosophile pour mieux comprendre comment des gènes aux propriétés oncofoetales sont contrôlés et coordonnent les évènements développementaux du SNC. Mon projet de thèse a permis d’identifier le gène aux propriétés oncofoetales, Chinmo, comme impliqué dans le développement du lobe optique de la drosophile pendant sa phase proliférative et dans le processus cancéreux. Ainsi, ces travaux pourront contribuer à une meilleure compréhension du rôle des gènes oncofoetaux dans le contexte développemental et tumoral chez les mammifères. / The development of the central nervous system (CNS) relies on the tight balance between proliferation and differentiation of the neural stem cells. The mammal CNS develops in two phases: the proliferative phase during which the neuroepithelial stem cells amplify through symmetric divisions and a neurogenic phase during which they are converted into neural progenitors that divide asymmetrically to generate their neuronal progeny. Several mechanisms are involved in the regulation of both phases of the CNS development however their coordination in the course of the development remains unclear. In this context, the oncofetal gene family seems particularly relevant. These genes are expressed during the early development where they coordinate the synchrony of the developmental events. They are switched off during the late development but their reexpression in numerous cancers brings evidence of their oncegenicity. The mechanisms governing their repression along the development and their reactivation in cancers are not well understood. During my thesis, I used the Drosophila model to better understand how oncofetal genes are controlled and regulate the developmental events in the CNS. My thesis project allowed to identify an oncofetal-like gene, Chinmo, involved in the development of the Drosophila CNS during its proliferative and in the cancerization process. This work may contribute to a better understanding of the role of oncofetal genes both in the developmental and the tumoral context in mammals.

La dystrophie myotonique de type I (DM1) constitue la plus fréquente des pathologies musculaires héréditaires chez l’adulte. Bien qu’initialement considérée comme une maladie musculaire, la DM1 présente une atteinte neurologique très handicapante. Cette maladie autosomique dominante résulte de l’expansion anormale d’un triplet CTG dans la partie 3’UTR du gène DMPK. Un effet trans du transcrit DMPK muté entraine une dérégulation de l‘épissage alternatif dans de nombreux tissus. Cependant, les mécanismes pathologiques de la DM1 dans le cerveau restent encore peu compris. Afin de disséquer ce mécanisme, notre laboratoire a créé des souris transgéniques exprimant le transcrit DMPK avec de larges expansions CUG dans de nombreux tissus. Ces souris nommées DMSXL, recréent d’importants aspects pathologiques de la DM1, comme des anomalies du comportement et électrophysiologiques du cerveau. Elles représentent donc un excellent outil pour explorer l’effet pathologique de la mutation dans le SNC. En m’appuyant sur ce modèle, j’ai exploré dans un premier temps l’effet trans des ARNs toxiques et l’ampleur de la splicéopathie dans le SNC. De façon intéressante, certains défauts d’épissage sont régions spécifiques, et ne montrent pas d’aggravation avec l’âge des souris DMSXL. Mes résultats démontrent que les ARNs mutés sont capables de déréguler l’épissage alternatif dans l’ensemble du SNC. La région du cervelet a aussi montré des anomalies de l’épissage dans les souris DMSXL, qui, en plus, présentent des perturbations cognitives dépendantes de cette région cérébrale. Le cervelet des souris DMSXL présente aussi des déficits électrophysiologiques suggérant une dysfonction cérébelleuse et plus précisément une dysfonction des cellules de Purkinje. Dans la recherche des populations cellulaires les plus affectées dans le cervelet, j’ai démontré la présence de signes de la toxicité de l’ARN plus marqués dans la glie de Bergman, entourant les cellules de Purkinje. Pour trouver les voies moléculaires perturbées dans le cervelet, et disséquer le mécanisme derrière les anomalies observées, j’ai réalisé une approche protéomique globale et trouvé une sévère baisse de l’expression du transporteur glial de glutamate GLT1/EAAT2, suggérant une dysfonction du cervelet, en conséquence d’un possible métabolisme anormal du glutamate. L’analyse protéomique globale du cerveau des souris DM1 a aussi identifié des différences d’expression et des modifications post-traductionnelles de protéines impliquées dans la signalisation du calcium. L’étude du métabolisme des ARNm dans la DM1 a mis en évidence la dérégulation de l’épissage de gènes impliqués dans le métabolisme du calcium, soutenant l’hypothèse d’une dysfonction calcique dans le SNC. Pour étudier les conséquences de la mutation sur les variations calciques cellulaires, j’ai caractérisé un modèle cellulaire astrocytaire de la DM1. Ce modèle m’a permis de démontrer une localisation anormale du récepteur GRIN1/NMDAR1, ainsi qu’une réponse calcique anormale dans les astrocytes primaires porteurs des amplifications CTG. Malgré les avancés thérapeutiques dans le muscle, on ne sait pas à quel point les stratégies en cours de développement sont efficaces dans le SNC. Pour étudier ce problème, j’ai utilisé le modèle astrocytaire de la DM1 afin de valider in cellulo une stratégie thérapeutique qui vise à rétablir une activité normale du facteur d’épissage MBNL1 endogène. Mes travaux de thèse ont permis d’avancer dans la compréhension de la neuropathologie de la DM1. Ils ont mis en évidence pour la première fois une dysfonction du cervelet, ainsi que la possible dérégulation de la voix calcique dans le SNC. Mes résultats ont donc contribué à mieux comprendre le mécanisme de la DM1 dans le SNC, pour, à long terme, développer des approches thérapeutiques ciblant des évènements moléculaires précis. / Myotonic dystrophy type 1 (DM1) is the most frequent inherited muscular disorder in adults. Although traditionally regarded as a muscle disease, DM1 presents debilitating neurological manifestations. DM1 is an autosomic dominant disease caused by the abnormal expansion of a CTG triplet within the 3’UTR of the DMPK gene. Many molecular aspects of the DM1 are mediated by a trans effect of the expanded DMPK transcripts, whose accumulation leads to splicing deregulation in many tissues. Despite recent progress in the understanding of DM1 pathogenesis in muscle and central nervous system (CNS), the detailed molecular disease mechanism operating in the brain is still poorly understood. In order to investigate the pathophysiology, our laboratory has generated DMSXL transgenic mice expressing DMPK transcripts containing large CUG expansions in many tissues. DMSXL mice mimic important features of the DM1, notably in the CNS, showing behaviour as well as electrophysiological abnormalities. Therefore, this mouse line represents an excellent tool to investigate the toxic effects of the mutation in the CNS. Taking advantages of this transgenic model, I have first explored the trans effect of the toxic RNA and the extent of DM1-associated spliceopathy in the CNS. Interestingly, some splicing defects were region-specific, and their severity did not increase with the age of the DMSXL mice. My data demonstrate that CUG-containing RNAs have a wide deleterious effect and deregulate alternative splicing in many areas of the CNS. In addition to splicing abnormalities in cerebellum, DMSXL mice also displayed deficits in cerebellum-dependant motor coordination. Plus, DMSXL cerebellum showed electrophysiological abnormalities, suggesting cerebellar dysfunction and more precisely Purkinje cell dysfunction. In the search for the cellular populations showing the greatest susceptibility to RNA toxicity in the cerebellum, I have found extensive foci accumulation as well as pronounced splicing defects in the Bergman glia, surrounding Purkinje cells, in DMSXL and DM1 patients cerebellum. In order to identify molecular pathways and mechanisms behind the behaviour and electrophysiological abnormalities detected, I have performed a global proteomics approach and found a severe decrease in the expression of a glial glutamate transporter GLT1/EAAT2, suggesting that DM1 causes cerebellum dysfunction, through abnormal glutamate metabolism. Global proteomic analysis of DMSXL cerebellum also identified expression and post-translational changes of several proteins involved in calcium signalling. Missplicing of different transcripts involved in calcium metabolism reinforces the idea of calcium dysfunction in the neuropathogenesis of the DM1. To study the effects of toxic RNA on calcium homeostasis and flux, I have established and characterised a brain cell model of DM1. DMSXL primary astrocyte cultures allowed me to show the mislocalisation of the glutamate receptor GRIN1/NMDAR1, as well as abnormal calcium responses to stimulation. Despite recent therapeutic advances in muscle, we do not know the CNS efficiency of the therapeutic strategies currently being developed. To address this problem, I have used the DM1 astrocyte cell model to validate in cellulo a therapeutic strategy aiming to restore the activity of the endogenous splicing factor MBNL1. My thesis work provided a significant step in the understanding of the DM1 pathology in the CNS. My results revealed for the first time signs of cerebellum dysfunction in DM1, as well as signs of calcium homeostasis deregulation in the SNC. My work contributed to better understand the pathological mechanisms of DM1, the brain pathways and cell types most susceptible to toxic RNA. In the long term, my data will contribute to the rational development of therapeutic strategies targeting precise and deleterious molecular events.

La déficience intellectuelle (DI) est définie comme un dysfonctionnement intellectuel général inférieur à la moyenne, qui s'accompagne de limitations significatives du fonctionnement adaptatif (DSM-V). Il s'agit d'un handicap fréquent qui concerne près de 3% de la population générale. L'identification de l'étiologie d'une DI est une question primordiale car elle permet d'optimiser la prise en charge des patients sans risque de passer à côté d'une cause curable, et d'évaluer le risque de récidive dans la famille afin d'offrir un conseil génétique pour les grossesses à venir. Malgré les récents progrès, l'étiologie de la maladie reste inconnue dans près de 40% des cas. Le démembrement des causes génétiques et la compréhension des bases physiopathologiques des DI constituent donc un grand défi scientifique et médical. Par ailleurs, l'identification des gènes impliqués dans les DI et le décryptage des processus cellulaires sous-jacents à ces phénotypes sont une approche de choix pour étudier le développement et la plasticité cérébrale chez l'homme d'une part et entrevoir le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques d'autre part. Le travail de thèse présenté dans ce manuscrit s'inscrit dans cette thématique de recherche et a porté sur l'analyse, par la méthode de Whole Exome Sequencing (WES), de cinq familles indépendantes dans lesquelles ségrège une forme syndromique de DI. La première partie détaille les résultats obtenus pour l'analyse de trois familles consanguines dans lesquelles ségrège une DI autosomique récessive. La seconde partie présente l'étude de deux familles indépendantes dont les enfants atteints présentent une clinique très semblable. Au total, ce mémoire décrit l'identification de i) deux gènes précédemment associés à la DI (WDR62 et AP4M1), ii) deux gènes candidats (RAD54B et HERC2), potentiels modificateurs des symptômes observés, puis iii) la définition d'un nouveau mode d'hérédité, et enfin iv) la caractérisation de deux nouveaux gènes impliqués dans la DI (TTI2 et NONO) suivie des études fonctionnelles des efiets des mutations sur les cellules de patients et l'analyse d'un modèle murin Nonogt. / Intellectual deficiency (ID) is characterized by a broad range of deficits in higher brain functions that result in significant limitations in adaptive and cognitive capacities required for competence in daily living, communication, social interaction and integration, self-direction, and work (DSM-V). ID affects approximately 3% of the population. Identifying ID causes is essential to improve patients' care services with no risk to miss a curable cause, but also to provide genetic counselling to the family for future pregnancies. Little is known about the biological bases of these conditions. Indeed, despite recent advances in cytogenetic and molecular genetics, the cause of the mental handicap remains unexplained in 40% of the cases. Understanding the molecular bases of these disorders is therefore an important medical challenge for the next years. Also, ID genes identification and analysis of the cellular mechanisms underlying these conditions should provide significant insight into the molecular and cellular pathways involved in cognition and may lead to new therapeutic trials aiming at improving the daily living of these patients and their families. The PhD work presented here report on the analysis, using Whole Exome Sequencing (WES), of five different families presenting with syndromic ID. The first part develops results from the analysis of three consanguineous families with an autosomal recessive form of ID. The second part presents the study of 2 unrelated male ID patients who presented the same clinical features. Overall, this work allowed the identification of i) two genes previously associated with ID (WDR62 and AP4M1), ii) two candidate genes (RAD54B and HERC2), potential modifiers of the phenotype, then iii) the definition of a novel hereditary mode, and finally iv) the characterization of two new genes of ID (TTI2 and NONO) followed by the functional analysis of mutations effects in patients' cells and the Nonogt mouse model.

Les récepteurs purinergiques P2X sont des canaux ioniques activés par l’ATP. Ils sont exprimés très largement dans l’organisme, et possèdent de nombreux rôles physiologiques et pathologiques. Les récepteurs P2X4 en particulier ont été impliqués dans les processus de douleur chronique. Suite à une lésion nerveuse, l’expression des récepteurs P2X4 est induite de novo dans la microglie spinale activée, où ils sont responsables de l’hypersensibilité mécanique caractéristique des douleurs neuropathiques.Notre étude montre que les récepteurs P2X4 neuronaux sont également des acteurs centraux dans plusieurs processus pathologiques, et notamment dans la douleur inflammatoire périphérique chronique. Les récepteurs P2X4 sont exprimés par les neurones sensoriels des ganglions rachidiens et semblent impliqués dans la libération du BDNF dans la corne dorsale de la moëlle épinière. Cette libération conduit à l’activation des voies de signalisation de la voie BDNF/TrkB, et en particulier à la diminution de l’expression de KCC2. Ce processus est en partie responsable de l’allodynie tactile et de l’hyperalgésie mécanique observée en cas de douleur inflammatoire chronique. Notre étude a également permis d’étendre cette hypothèse à un modèle d’excitotoxicité in vitro dans l’hippocampe, mimant une activité épileptiforme. Nos résultats indiquent que les récepteurs P2X4 neuronaux pourraient être des acteurs importants de la libération de BDNF dans l’hippocampe lors d’un évènement excitotoxique. / Purinergic receptors P2X are ATP-gated ion channels widely expressed in the organism and involved in many physiological and pathological states. Particularly, P2X4 receptors have been involved in chronic pain. Following nerve injury, their expression is induced de novo in activated spinal cord microglia where they are responsible for the BDNF release leading to tactile allodynia, a characteristic of neuropathic pain. Our study shows that neuronal P2X4 receptors are crucial actors of other pathological processes, including inflammatory pain. We show that P2X4R are expressed in sensory neurons in dorsal root ganglions and seem involved in BDNF release in the spinal cord. This release leads to activation of BDNF/TrkB signalization pathways, and particularly to the downregulation of KCC2. This process underlies the spinal hyperexcitability in chronic inflammatory pain states. These results have been extended to model of excitotoxicity in the hippocampus mimicking the lesions caused by an epileptic activity. Our preliminary results suggest that neuronal P2X4 receptors are likely major actors in the BDNF release in the hippocampus following an excitotoxicitic insult.

L’infection par le cytomégalovirus (CMV) au cours de la grossesse est fréquente et représente la première cause de pathologie neurodéveloppementale. En dépit de cette importance médicale, il n’existe à ce jour aucun traitement préventif ou curatif satisfaisant, et les mécanismes physiopathologiques mis en jeu, en particulier au niveau du cerveau foetal, restent mal connus. Des découvertes récentes sur les modèles murins d’infection cérébrale par le CMV, principalement réalisées pendant la période néonatale, ont apporté des données convergentes sur la physiopathologie de ces infections cérébrales ; notamment, le rôle joué par les cellules immunitaires périphériques dans la résolution de l’infection, et l’implication du système immunitaire cérébral (SIC) au cours du processus infectieux. Afin de compléter et préciser les résultats précédemment obtenus dans différents modèles murins, et de comprendre le rôle joué par le SIC, le premier objectif de ma thèse a consisté à mettre au point et à caractériser un nouveau modèle d’infection cérébrale par le CMV au cours du développement in utero chez le rat. Dans l'ensemble, nos résultats confirment l'altération du SIC au cours de l'infection par le CMV du cerveau en développement, et suggèrent fortement, dans ce modèle, un rôle majeur joué par le système microglie/macrophage dans l'émergence de troubles neurologiques semblables à ceux observés dans la pathologie humaine correspondante. / Cytomegalovirus (CMV) infection during pregnancy is the leading cause of neurodevelopmental disorders (polymicrogyria, microcephaly) and may lead to severe sensorineural consequences (deafness, epilepsy, cerebral palsy and hearing loss). Despite this medical importance, no preventive or curative treatment is satisfactory to date, and the pathophysiological mechanisms, notably in the fetal brain, remain poorly understood. Recent findings in murine brain CMV infection, mostly in neonatal models, have brought converging insights into the pathogenesis of these infections; the possible role played by peripheral immune cells against infection and the involvement of the brain immune system (BIS) have been proposed. The actual roles of BIS during in utero infection, and more specifically that of microglial cells and macrophages, remain unclear. In order to expand and precise the data previously obtained in the murine models, and to clarify the role of BIS, the first objective of my thesis was to design and to characterize a novel model of CMV infection during the fetal development of the rat brain. Overall, our datas confirm the altered state of BIS as a consequence of CMV infection of the developing brain, and strongly suggest, in the rat model studied here, that the microglia/macrophages system plays critical role in the pathogenesis of neurological manifestations similar to those classically seen after human congenital CMV infection.

La distribution de principes actifs dans le système nerveux central (SNC) est entravée par la présence d'une barrière physiologique, la barrière hémato-encéphalique (BHE). L'endothélium cérébral est pourvu d'un large éventail de systèmes de transport, parmi lesquels la trancytose récepteur-dépendante, qui peut être mise à profit pour vectoriser toute une gamme d'agents thérapeutiques vers le SNC de manière non invasive. Dans le cadre de cette approche, le LDLR (Low Density Lipoprotein Receptor), exprimé à la surface de la BHE, est une cible particulièrement intéressante. L'objectif de ce travail est le développement de nouveaux ligands du LDLR en tant que vecteurs potentiels de la BHE. Le criblage d'une librairie de peptides aléatoires dirigée contre le LDLR a permis l'identification d'un peptide 15-mer cyclique ayant une haute affinité in vitro. Une étude des relations structure/activité a ensuite été menée afin d'améliorer l'affinité pour le LDLR et d'augmenter la stabilité plasmatique de ce peptide. Cette étude a abouti à l'identification d'un nouveau peptide « lead » qui a été conjugué à des molécules actives afin d'évaluer la capacité du peptide à vectoriser un principe actif à travers la BHE après administration in vivo chez la souris. / Drug delivery to the central nervous system (CNS) is hindered by the presence of a physiological barrier, the blood-brain barrier (BBB). The brain endothelium is endowed with a series of transport systems, including receptor-mediated transcytosis. This system can also be used to transport therapeutics into the brain as a non-invasive manner. Among receptors expressed on the BBB, the low density lipoprotein receptor (LDLR) is relevant as a drug delivery system. This project is dedicated to the development of new peptide-based ligands of LDLR as potential BBB-vectors. The screening of a random peptide library directed to the LDLR led to the identification of hits such as a cyclic 15-mer peptide with high in vitro affinity. A structure/activity relationship study was then carried out in order to improve its affinity towards the LDLR and to increase its plasmatic stability. This study led to the identification of a new lead peptide which was conjugated to bioactive compounds in order to assess the ability of our peptide to shuttle a drug across the BBB following in vivo administration in mice.