Avances en ingeniería de tejidos y en terapias celulares requerirán el desarrollo de un nuevo abanico de tecnologías. Estas incluirán sistemas de cultivo de líneas primarias en tres dimensiones (3D) con el fin de construir tejidos artificiales, sistemas de transducción eficientes y sistemas de regulación genética compatibles en humanos para ajustar intervenciones moleculares. Todo ello permitirá reprogramar las células animales con el objetivo de obtener fenotipos deseados y de optimizar la productividad celular.El objetivo de esta tesis es (i) estudiar y manipular las propiedades (electro) fisiológicas de los tejidos artificiales de miocardio mediante la regulación de BMP-2 para controlar y regenerar la funcionalidad cardiaca, (ii) estudiar, inducir y caracterizar los procesos de diferenciación y transdiferenciación de microtejidos adiposos y oseos mediante la sobre expresión de los genes BMP-2 y ΔFosB para tratar enfermedades relacionadas con el tejido oseo como la osteoporosis, y (iii) evaluar la productividad de los microtejidos artificiales para optimizar los procesos de producción con células animales. Por último, el objetivo es también automatizar la producción de microtejidos artificials para satisfacer las necesidades de la industria.Microtejidos libres de scaffold no solo presentan una alternativa a la ingeniería de tejidos para terapias celulares y regeneración de tejidos, sino también tienen un gran potencial en estudios celulares para aplicaciones en la industria bio-farmacéutica. Mientras en el área de investigación, los microtejidos artificiales presentan un modelo para el estudio de nuevos genes y proteínas implicadas en diferentes procesos celulares (diferenciación, proliferación, apoptosis, síntesis de proteínas, etc.), en el area de desarrollo, los microtejidos artificiales representan una herramienta para el análisis de dichos genes y proteínas por su acción terapéutica. Finalmente, una vez la proteína terapéutica ha sido identificada, los microtejidos artificiales podrían proveer un ambiente más beneficioso para la producción de proteínas terapéuticas. / Advances in tissue engineering and cell-based therapies will require the development of a range of specific technologies. These include systems for the cultivation of primary cells in three dimensions (3D) to form artificial tissues, efficient gene transduction technologies, and human-compatible gene regulation systems for adjustable molecular interventions all of which should enable the rational reprogramming of mammalian cells to achieve desired cell phenotypes, functionality, and to optimize cellular productivity. The aim of this thesis is to (i) study and modulate the (electro) physiological properties of artificial myocardial microtissues by BMP-2 regulation to control and to regenerate cardiac functionality, (ii) study, induce and characterize differentiation and transdifferentiation processes of adipose- and bone-microtissues by overexpression of BMP-2 and ΔFosB genes in order to treat bone-related diseases such as osteoporosis, and (iii) evaluate artificial microtissue productivity to optimize mammalian production processes. Finally, the purpose is also to automate artificial microtissue production in order to satisfy requirements for industrial scale applications.Scaffold-free artificial microtissues represent an alternative to existing tissue engineering strategies for cell-based therapies and tissue regeneration, as well as for cell-based biopharmaceutical applications. Within a research context, artificial microtissues could be used as a cell culture model to study/screen novel molecules/genes/proteins that are involved in different cellular processes (e.g. differentiation, proliferation, apoptosis, protein synthesis and secretion), while in a development context, artificial microtissues could be used as a tool to evaluate such target molecules/genes/proteins for their therapeutic action. Finally, once a therapeutic molecule/protein is identified, artificial microtissues may provide a more suitable or optimized environment for therapeutic protein production.

Se realiza un estudio de preservación de intestino delgado en ratas Sprague-Dawley con diferentes soluciones a 4° C de temperatura dentro del campo detransplante de intestino delgado.Las soluciones de preservación empleadas han sido: Ringer Lactato, Collinsy Beizer o solución de Wisconsin. El número de animales por grupo ha sido de 15,mediante procedimientos quirúrgicos y microquirúrgicos, se realiza perfusión de laarteria mesentérica hasta la vena porta con la solución empleada y se procede a laextracción del intestino delgado que se introduce hasta 24 horas en la solución depreservación correspondiente a 4°C. Se obtienen piezas de los segmentos duodenal,yeyunal e ileal a las 2, 6, 12, 18 y 24 horas. Se ha realizado limpieza de la luzintestinal en todos los casos con el líquido de perfusión.Se han estudiado, microscópicamente, las alteraciones de las diferentesestructuras del intestino y se han obtenido los siguientes resultados:Existen mayores alteraciones morfológicas en las capas internas del intestinoen comparación con las más externas.Si el tiempo de preservación es inferior a dos horas las tres solucionesobtienen similares resultados.Cuando el tiempo de preservación es mayor a dos horas el Ringer Lactato esinferior a la solución de Collins y a la de Beizer, siendo los resultados de estas dosúltimas similares en cuanto a la viabilidad del injerto.Las soluciones de Collins y de Beizer pueden preservar el intestino delgadoen condiciones de ser transplantado hasta 24 horas con una probabilidad del 73 % deser viable.En preservaciones inferiores a 2 horas se puede utilizar la solución de RingerLactato manteniendo la viabilidad del injerto.Si el tiempo de preservación es mayor de 2 horas, se recomienda utilizar lasolución de Collins por su menor coste económico en relación con la de Beizer.

La lana es una fibra natural que aunque posee propiedades de confort apreciadas por el consumidor, presenta el inconveniente de encoger durante el lavado en medio acuoso. En una época en que la tendencia en el cuidado de las prendas es el "easy-care" (cuidado fácil), es imperativo que cualquier producto textil sea lavable a máquina. Por ello se han desarrollado numerosos tratamientos para prevenir el encogimiento de las prendas de lana. Sin embargo, la estricta legislación ambiental de los países occidentales hace necesaria la utilización de tecnologías más limpias como, por ejemplo, el plasma de baja temperatura. Diversos factores han limitado la implementación a nivel industrial del plasma para tratamientos textiles, y en concreto en tratamientos de lana, entre ellos el elevado coste inicial de la maquinaria de plasma para aplicaciones textiles. Por otra parte se ha constatado que el plasma empeora el tacto de los tejidos de lana, aumentando su aspereza, lo que ha sido también un inconveniente de este proceso. Estudios preliminares mostraron que, a pesar de que un suavizado convencional conseguía mejorar el tacto de los tejidos de lana tratados con plasma, ello revertía en elevados valores de encogimiento. Es por tanto el mecanismo implicado en tal fenómeno, un punto clave a resolver para llegar a diseñar tejidos de lana inencogibles y suaves dentro de parámetros respetuosos con el medio ambiente. Por otra parte, estudios previos revelaron que, aunque en los tratamientos de plasma de radiofrecuencia (en el reactor empleado en este estudio) se trabaja a bajas presiones, los gases utilizados en la generación del plasma se encuentran contaminados con vapor de agua procedente de la degasificación de los tejidos de lana. Para evitar tal contaminación es de interés profundizar en los efectos de los tratamientos con plasma de vapor de agua. Hasta el momento, se han atribuido los efectos beneficiosos del plasma en fibras textiles a las numerosas especies en él presentes, como iones, electrones, átomos, radicales neutros, moléculas excitadas y radiación ultravioleta. Sin embargo, un mejor conocimiento de las especies realmente implicadas en los cambios de superficie producidos por el plasma podría ser clave para el diseño de nuevos procesos optimizados (que pudieran, potencialmente reducir los elevados costes de la maquinaria de plasma para aplicaciones textiles).La importancia de la poliamida 6 dentro de las fibras sintéticas, el hecho de que se utilice en combinación con la lana en gran número de productos textiles, así como el hecho de que compartan, en su estructura química los enlaces peptídicos (amida), aviva el interés de conocer los efectos del plasma en esta fibra química. Por todo ello, la presente Tesis Doctoral profundiza en el estudio de los tratamientos de lana con plasma como alternativa ecológica a los tratamientos de resistencia al encogimiento industriales. Se estudian principalmente las modificaciones superficiales producidas por el plasma en las fibras de lana y las variaciones en el encogimiento de los tejidos. Asimismo se analizan los efectos del plasma en poliamida 6, en concreto en sus propiedades superficiales, microestructura y propiedades tintóreas. Se han identificado las principales especies responsables de los efectos del plasma fibras y tejidos de lana y poliamida 6. Por primera vez se han realizado tratamientos de tejidos de lana y poliamida 6 en la post-descarga del plasma, mostrando la eficiencia de este tratamiento en la modificación superficial de las fibras y en la mejora de la resistencia al encogimiento de tejidos de lana. El estudio detallado del tratamiento con plasma de tejidos de lana y lambswool previamente teñidos revela la compatibilidad de estos procesos. Estudios previos mostraron que el plasma empeoraba el tacto de los tejidos, y por ello se ha estudiado la modificación del tacto de los tejidos tratados con plasma. La aplicación de suavizantes convencionales tipo amina cuaternaria en tejidos tratados con plasma produce tejidos con elevados valores de encogimiento, por lo que se estudia la aplicación de suavizantes de polisiloxanos funcionales. Los resultados obtenidos apuntan a una posible relación entre la resistencia al encogimiento y la hidrofilia de los tejidos de lana tratados con plasma y post-suavizados. Ello se confirma mediante la incorporación de cadenas hidrocarbonadas de distinta longitud a tejidos de lana tratados con plasma.

L'objectiu d'aquesta tesi doctoral ha estat el d'estudiar el comportament in vivo de les cèl·lules mare mesenquimàtiques derivades de teixit adipós (hAMSC), implantades en animals vius durant períodes extensos de temps, per a determinar la seva funcionalitat com a cèl·lules vehicle per a la teràpia gènica en tumors i per a la reparació de teixits.Per a dur a terme aquest objectiu es van marcar permanentment les cèl·lules hAMSC amb un vector lentivíric que contenia dos gens traçadors. Per una banda contenia el gen de la proteïna verda fluorescent (GFP) que ens va permetre la selecció de les cèl·lules marcades mitjançant la separació de cèl·lules activada per fluorescència, i per altra, el gen de la luciferasa de Photinus Pyralis (PLuc) que ens va permetre el seguiment no invasiu in vivo mitjançant la bioluminescència no invasiva (BLI). Aquestes cèl·lules, marcades i seleccionades, es van injectar en ratolins immunodeprimits on es van mantenir durant 8 mesos. Durant aquest període de temps, es va observar que aquestes cèl·lules es mantenien estables, que no formaven tumors i que no presentaven desequilibris cromosòmics greus.Posteriorment vam observar que les cèl·lules hAMSC també podien viure en tumors de pròstata (PC-3), inoculats en els músculs dels ratolins immunodeprimits, durant llargs períodes de temps i mantenir-se de manera estable. La detecció simultània de les cèl·lules tumorals i de les hAMSC va ser possible gràcies al marcatge de les cèl·lules amb diferents luciferases, la PLuc i la luciferasa de Renilla reniformis (RLuc). D'aquí es va concloure que aquestes cèl·lules eren vehicles segurs per a la teràpia cel·lular.Per portar a terme una teràpia gènica citotòxica en tumors, les cèl·lules hAMSC es van marcar amb un gen suïcida (timidina quinasa), de manera que gràcies a la mort d'aquestes cèl·lules suïcides quan s'administrava la prodroga (Ganciclovir) es produïa un efecte adjacent sobre les cèl·lules veïnes tumorals, fet que provocava la reducció dels tumors fins a un 98,5%. Amb la visualització dels dos tipus cel·lulars va ser possible determinar la dosi necessària de cèl·lules suïcides per obtenir un efecte adjacent major. A més, també es va poder quantificar la modulació del creixement que produïen les cèl·lules hAMSC en diferents tumors injectats de manera ortotòpica.Paral·lelament, el procediment de la BLI també ens va permetre determinar canvis en l'expressió d'un gen, el col·lagen 2 (COL2A1), el qual té un paper clau durant la condrogènesi: Les cèl·lules hAMSC es van transduir permanentment amb el gen de la PLuc, dirigit a partir del promotor específic del COL2A1, i es va observar una inducció de l'expressió de l'aquesta luciferasa, acompanyada també d'un canvifenotípic característic dels condròcits, quan es diferenciaven in vitro al llinatge condrogènic. Per tal de poder fer un seguiment in vivo, no invasiu, aquestes cèl·lules marcades es van transduir també amb la luciferasa RLuc, expressada constitutivament, per tal que fos l'indicador de la proliferació d'aquestes cèl·lules. Les cèl·lules hAMSC doblement marcades i sembrades en matrius d'os desmineralitzat (DBM) implantades subcutàniament en ratolins immunodeprimits van demostrar diferents patrons de diferenciació condrogència d'acord amb els resultats de les anàlisis histològiques. Aquest model, doncs facilitaria el desenvolupament de combinacions entre cèl·lules progenitores i esquelets per a la reparació de teixits. / The aim of this thesis was to study the behaviour of the human mesenchymal stromal cells derived from adipose tissue (hAMSCs) implanted in animals during prolonged time to determine their functionality as vehicles for genetic therapy in tumours and for tissue regeneration.For this purpose the hAMSCs were labelled by a permanent transduction with lentiviral vectors for the expression of two reporter gens. The green fluorescent protein (GFP) gene which proved to be useful for the enrichment of labelled cells, histological analysis and recovery of cells from tissue implants and the Photinus pyralis luciferase (PLuc) gene which allowed us the long term monitoring with the non-invasive bioluminescence imaging (BLI).The labelled and selected hAMSCs were injected in immunosupressed mice and maintained during 8 months. During this period, cells maintained a steady state and no detectable chromosomal abnormalities nor tumours formed during the 8 months of residence in the host's tissues.We also observed that hAMSCs could live long periods when implanted within PC-3 tumours, inoculated in the thighs of immunosupressed mice. The use of two luminescent reporters, allowed the simultaneous and independently monitoring in real time of two different cells populations implanted in the same anatomical site of the animal. Thus, from these observations we conclude that the hAMSCs could be safe vehicles for cell therapy.In order to perform a citotoxic gene therapy in PC-3 tumours, hAMSCs were labelled with a suicide gene (thymidine kinase). The addition of the prodrug (Gangiclovir) produced the death of these cells and killing of the neighbouring tumour cells (Bystander effect). This bystander effect produced a reduction of the tumours treated with suicide cells of 98.5% comparing with the control ones. The use of BLI and the dual labelling allowed us to optimize the ratio of the suicide vehicles to tumour cells to obtain a major bystander effect. Furthermore it was possible to quantify the tumour growth modulation produced by the injection of hAMSCs within different types of tumour cells.BLI procedures allowed us to analyze changes in gene expression and monitor cell differentiation in a live animal model of cartilage and bone formation.

La forta exigència de qualitat a que són sotmesos els productes actuals fa que els processos d'inspecció i control industrial ocupin, cada vegada més, un lloc destacat en la seva fabricació. La indústria relacionada amb els materials de superfície texturada i periòdica (malles metàl·liques, plàstics, paper, làmines, roba, etc.) no és aliena a aquest problema i, en l'actualitat, està esmerçant molts esforços en aquest camp. Un cas representatiu dels materials anteriors, que presenta una ampla problemàtica en quan a inspecció i control així com una elevada exigència de qualitat en l'acabat, és el teixit tèxtil.La majoria de defectes que es produeixen en el procés productiu d'un material tèxtil, com en tants altres materials i productes industrials, són detectats encara per inspectors humans. La seva feina és, en general, molt repetitiva i rutinària i, moltes vegades, el consum de temps que hi dediquen és molt elevat. A més cal fixar l'atenció en petits detalls situats en un camp extens, que sovint es troba en moviment, el que acaba produint fatiga visual en l'operari.En les últimes dècades, gràcies al gran desenvolupament tecnològic que hi ha hagut, estem assistint a una sèrie d'avenços, molt ràpids i de gran abast, en el món dels processos d'automatització i control. A conseqüència d'això, cada vegada el procés de producció és més ràpid, el que requereix que el control de qualitat també ho sigui.L'interès industrial en automatitzar les operacions d'inspecció és cada vegada més gran. A tall d'exemple la fira tèxtil internacional que reuneix més interès i expectació a nivell mundial, ITMA-99, celebrada aquest any a París, mostrava en els seus stands diferents productes dedicats a l'automatització dels processos d'inspecció i control de qualitat. Entre les ofertes d'aquesta fira cal citar una gran varietat d'instruments i dispositius: sensors òptics per inspeccionar la qualitat del fil en temps real en processos de filatura, espectrecolorímetres acoblats a l'estampadora i a la màquina de tintar per determinar amb més precisió el color, cameres lineals i cameres 2-D ultraràpides per detectar fils trencats en ordidors. En el camp del tissatge s'ha començat a veure en aquesta fira un sistema d'inspecció format per un conjunt (10 o 12) de cameres 2-D, situades damunt del teler, que detecta defectes locals que es poden produir en la roba durant el procés de producció. Des de la penúltima fira (ITMA-94) ha sigut novetat una màquina de repassar automàtica, on un sistema digital de processat format per 4 cameres i un potent ordinador, permet detectar una més ampla varietat de defectes locals i amb una velocitat nominal que pot arribar fins a 300 metres de roba per minut. Malgrat tot, les novetats aportades per la fira presenten grans limitacions: preu elevat, infrastructura complexa en la captació i processat de la imatge i, els resultats que s'obtenen només han estat validats per casos limitats (teixit de plana i d'un sol color). A més, si es té en compte que molts processos de producció són de tirada curta, canviant constantment el tipus d'article del teler, es necessita un sistema que sigui robust i versàtil, capaç de treballar amb diferents lligaments i colors i que el seu cost sigui més baix que el dels productes actuals.Revisant la última dècada, la més rellevant en el desenvolupament d'aquestes tecnologies, s'observa un clar increment en l'aplicació de tècniques de processat digital de la imatge a l'anàlisi de mostres texturades [Brzakovic-1992]. En el cas de la inspecció de materials tèxtils Chetverikov [Chetverikov-1988] desenvolupà un procés d'inspecció automàtica en teixits tèxtils que combina l'anàlisi de textures i la segmentació d'imatges. Neubauer [Neubauer-1992] segmentà defectes en mostres reals amb l'ajut d'una camera lineal i una xarxa neuronal. Siew et al. [Siew-1988] mesuraren les característiques texturals en catifes a partir d'estadístiques de primer i segon ordre aplicades als nivells de grisos de la imatge. Zhang i Bresse [Zhang-1995] detectaren i classificaren nusos, carreres i trencades mitjançant l'autocorrelació i operacions de morfologia matemàtica. Tsai et al. [Tsai-1995] detectaren i classificaren exactament quatre classes de defectes en teixits tèxtils utilitzant matrius de co-ocurrència i xarxes neuronals. Xu [Xu-1997] mesurà la rugositat en les superfícies de catifes a partir de la dimensió fractal de la imatge. Mitjançant tècniques combinades de filtrat Gaussià, umbralització, equalització de l'histograma i autocorrelació Kang et al. [Kang-1999] determinaren densitats lineals de fils en els direccions de trama i ordit per teixits de plana.La inspecció de materials texturats quasiperiòdics i, en particular els tèxtils, mitjançant tècniques de processat òptic-digital de la imatge és un camp d'investigació relativament poc treballat i que presenta un interès renovat. En aquest apartat es troben poques contribucions entre les que cal destacar Kang et al. [Kang-1999] que trobaven directament, a partir de la llum transmesa pel teixit, el punt de creuament dels fils en teixits de plana i Ciamberlini [Ciamberlini-1996] que operava amb la TF òptica de la llum transmesa pel teixit.Les eines que actualment estan al mercat són insuficients i es centren principalment en la resolució d'un aspecte: la detecció de defectes locals. En la literatura no és troben plantejaments generals que abastin des de models i procediments per caracteritzar les estructures fins a mecanismes que determinin la seva evolució o resistència davant d'agressions, la detecció de defectes globals en l'estructura i la detecció de defectes locals. Creiem que aquest plantejament general, que pot ser vàlid per a una gran varietat de materials, és també necessari. En aquest treball s'han aplicat, principalment a materials tèxtils, un conjunt d'eines inspirades en aquest plantejament.

En aquesta Tesi, un nou biomaterial de disseny composat per seqüències peptídiques repetitives i amfifíliques, que per autoensamblatge forma xarxes de nanofibres (i hidrogels), AcN-RADARADARADARADA-CONH2, s´ha utilitzat com a anàleg de la matriu extracel·lular per al manteniment, proliferació i diferenciació cel·lular. Aquest pèptid s'ha funcionalititzat amb motius biològicament actius procedents de proteïnes de la matriu extracel·lular incloent laminina-1 i colàgen IV. El scaffold peptídic autoensamblant RAD16-I i els seus derivats biològicament actius s´han caracteritzat i provat utilitzant diferents sistemes cel·lulars com pot ser les cèl·lules d'aorta humanes (HAEC), hepatocits madurs i la línea progenitora de fetge (Lig-8). La proteòlisi d'aquest pèptid s'ha avaluat utilitzant tripsina com a enzim proteolític, i els fragments resultants s'han analitzat per MALDI-TOF i AFM. Així mateix, la segona generació de biomaterials basats en el RAD16-I s'ha provat tant amb HAEC com amb hepatocits madurs. Amb aquests sistemes hem demostrat que el desenvolupament d'una matriu biomiètica reforça, a la vegada que manté, les funcions específiques de cada teixit. En particular, els resultats obtinguts en diferenciació, proliferació i manteniment de la funció cel·lular utilitzant pèptids sintètics autoensamblants són comparables amb els resultats que s'obtenen utilitzant matrius biològiques (Colàgen I i Matrigel). Això indica que els nostres anàlegs de la matriu extracel·lular poden substituir als materials naturals, i suggereix l'ús d'aquests materials intel·ligents amb capacitat instructiva en aplicacions terapèutiques. Així mateix s'ha provat que l'ús d'aquests pèptids auto-ensamblants és eficient en la construcció d'un nínxol de cèl·lules mare. Hem sigut capaços de controlar la cinètica cel·lular (de simètrica a assimètrica) induint diferenciació funcional, a la vegada que es mantenia una petita proporció de cèl·lules no diferenciades. Aquests resultats indiquen clarament que hem sigue capaços d'obtenir un nínxol on cèl·lules primitives (Lig-8) es diferencien adquirint funcions d'hepatocits madurs. Hem desenvolupat una plataforma de biomaterials que es podrien utilitzar per la funcionalització amb innumerables biomolècules amb capacitat d'induir processos biològics com la diferenciació, proliferació i funció metabòlica. Aquests biomaterials, preveiem que tindran un gran impacte a l'àrea terapèutica i biología regenerativa. / En esta Tesis, un nuevo biomaterial de diseño compuesto por secuencias peptídicas repetitivas y amfifílicas que por autoensamblaje forma redes de nanofibras (e hidrogeles), AcN-RADARADARADARADA-CONH2 (RAD16-I), se ha utilizado como análogo de la matriz extracelular para el mantenimiento, proliferación y diferenciación celular. Este péptido se ha funcionalizado con motivos biológicamente activos procedentes de proteínas de la matriz extracelular incluyendo laminina-1 y colágeno IV. El scaffold peptídico autoensamblante RAD16-I y sus derivados biológicamente activos se han caracterizado y probado utilizando diferentes sistemas celulares como puede ser células endoteliales de aorta humanas (HAEC), hepatocitos maduros y la línea progenitora de hígado Lig-8. La proteólisis de este péptido se ha evaluado utilizando tripsina como enzima proteolítico, y los fragmentos resultantes se han analizado por MALDI-TOF y AFM. Asimismo, la segunda generación de biomateriales basados en el RAD16-I se ha probado tanto con HAEC como hepatocitos maduros. Con estos sistemas hemos demostrado que el desarrollo de una matriz biomimética refuerza a la vez que mantiene las funciones específicas de cada tejido. En particular, los resultados obtenidos en diferenciación, proliferación y mantenimiento de la función celular utilizando los péptidos sintéticos auto-ensamblantes son comparables con los resultados que se obtienen usando matrices biológicas (Colágeno I y Matrigel). Esto indica que nuestros análogos de la matriz extracelular pueden reemplazar a los materiales naturales, y sugiere el uso de estos materiales inteligentes con capacidad instructiva en aplicaciones terapéuticas. Asimismo, se ha probado que el uso de estos péptidos auto-ensamblantes es eficiente en la construcción de un nicho de células madre. Hemos sido capaces de controlar la cinética celular (de simétrica a asimétrica) induciendo diferenciación funcional, a la vez que se mantenía una pequeña proporción de células no diferenciadas. Estos resultados indican claramente que hemos sido capaces de obtener un nicho donde células primitivas (Lig-8) se diferencian adquiriendo funciones de hepatocitos maduros. Hemos desarrollado una plataforma de biomateriales que se podrían utilizar para la funcionalización con innumerables biomoléculas con capacidad de inducir procesos biológicos como la diferenciación, proliferación y función metabólica. Estos biomateriales preveemos que tendrán un gran impacto en el área terapéutica y biología regenerativa. / In this Thesis, a new designed biomaterial made out of short repetitive amphiphilic peptide sequence AcN-RADARADARADARADA-CONH2 (RAD16-I) that self-assembles forming nanofiber networks (hydrogel scaffold) has been used as synthetic extracellular matrix analog for cell maintenance, proliferation and differentiation. This peptide has been functionalized with biological active motifs from extracellular matrix proteins including laminin-1 and collagen IV. The prototypic self-assembling peptide scaffold RAD16-I and its biologically active derivatives have been characterized and tested using several cellular systems such as human aortic endothelial cells (HAEC), mature hepatocytes and a putative liver progenitor cell line, Lig-8. The proteolysis of the peptide RAD16-I has been evaluated using trypsin as a proteolytic enzyme and the resulting fragments have been analyzed by MALDI-TOF and AFM. Moreover the second generation of RAD16-I-based biomaterials have been tested using HAEC and mature hepatocytes. With these systems we have shown that the development of a biomimetic matrix enhances as well as maintain tissue-specific functions. In particular, the results obtained in cell differentiation, proliferation and maintenance of cell function using the synthetic self-assembling peptide matrices, are comparable with the results obtained using natural biological matrices counterparts (Collagen-I and Matrigel). This indicates that our extracellular matrix analogs can replace the use of naturally-derived materials and suggests the use of these smart biomaterials with instructive capacity for cells in therapeutics. Moreover, the use of the self-assembling peptide RAD16-I in the recreation of a stem-cell niche proved to be highly efficient. We were able to control stem-cell kinetics (from symmetric to assymetric) inducing functional differentiation while maintaining a small proportion of undifferentiated cells. This striking results clearly indicate that we were able to obtain a stem-cell niche where primitive cells (Lig-8) undergo differentiation acquiring mature hepatic functions. We have developed a biomaterial platform that can be used for functionalization with innumerable biomolecules, with capacity to induce biological processes like differentiation, control of proliferation, metabolic function, etc. These biomaterials will have a strong impact in therapeutics and regenerative biology.

La biomimètica o biomimetisme són termes que simbolitzen el concepte “aprendre de la naturalesa”, és a dir, aprendre dels seus sistemes, processos i models, a fi d’utilitzar la natura com a font d’inspiració per solucionar problemes de l’home. El biomimetisme és actualment un concepte recurrent en l’àrea d’enginyeria de teixits i d’ell en sorgeixen idees per obtenir plataformes més elegants i sofisticades que puguin imitar millor les interacciones entre les cèl•lules i el seu ambient. Aquesta tesi pretén desenvolupar models, en dues i en tres dimensions, mitjançant la recreació d’un o més factors característics de l’ambient natural de la cèl•lula i que juguen un paper important en el comportament cel•lular. Se sap que tant les propietats químiques com les mecàniques de la matriu extracel•lular influeixen sobre les funcions cel•lulars. És per això que es va dissenyar un nou film polimèric que pogués combinar un hidrogel, amb propietats mecàniques variables, amb un monòmer reactiu capaç d’immobilitzar biomolècules. Degut a la complexitat del polímer dissenyat, va ser necessari recórrer a una tècnica de polimerització superficial molt versàtil com és la deposició química iniciada en fase vapor (més coneguda pel seu acrònim en anglès iCVD). Els polímers varen ser àmpliament caracteritzats i es va corroborar que podien ser modificats amb petites biomolècules com ara pèptids senyalitzadors. Les superfícies resultants són bioactives i permeten l’adhesió de cèl•lules endotelials. Unes altres superfícies biomimètiques, rellevants en l’àmbit de l’enginyeria de teixits d’os, es varen obtenir a partir d’una hidroxiapatita sintetitzada pel mètode de sol-gel submergint-la en diferents medis fisiològics. La dissolució i posterior reprecipitació dels ions proporcionen una capa d’apatita amb una composició similar a la que es troba in vivo. Els experiments evidencien la importància de partir d’un material relativament soluble. És per això que la hidroxiapatita pura no és capaç d’induir la precipitació d’aquesta apatita biomimètica in vitro. Diversos investigadors han relacionat la capacitat de formar apatita amb la bioactivitat del material, entenent bioactivitat com l’habilitat d’aquests materials de promoure la unió amb l’os. Per a l’enginyeria de teixits, però, és necessari un ambient tridimensional per tal de generar un teixit artificial. S’ha desenvolupat un nou model basat en l’ús d’un gel molt tou per tal d’obtenir un teixit dur com el de l’os. Malgrat que aquests dos conceptes poden semblar contradictoris, les cèl•lules adquireixen l’habilitat d’allargar-se ràpidament i crear una densa xarxa cel•lular dins d’aquest ambient poc restrictiu des d’un punt de vista mecànic. La consegüent contracció del sistema acaba formant un constructe més petit i resistent. Aquest és un sistema biomimètic ja que promou una gran interacció cel•lular i també la condensació de les cèl•lules, esdeveniments que tenen lloc també durant el desenvolupament de l’os i el cartílag. El model es va caracteritzar extensament amb cèl•lules ostoprogenitores MC3T3-E1 que es diferenciaren amb inducció química. A més a més, es va demostrar que l’ambient tridimensional podia promoure l’expressió espontània de marcadors osteogènics. Degut a les interessants propietats del sistema, el mateix model es va utilitzar per induir la diferenciació condrogènica de fibroblastos dermals humans. Aquests tipus cel•lular no ha estat gaire explorat en l’àmbit de l’enginyeria de teixits, malgrat que ofereix un gran potencial en teràpia regenerativa. Aquest treball proporciona proves de la capacitat condrogènica d’aquestes cèl•lules en el sistema tridimensional prèviament desenvolupat. / La biomimètica o biomimetismo son términos que simbolizan el concepto “aprender de la naturaleza”, es decir, aprender de sus sistemas, procesos y modelos, y utilizarlos como fuente de inspiración para solucionar problemas del hombre. El biomimetismo es actualmente un concepto recurrente en el área de ingeniería de tejidos y de este surgen ideas para obtener plataformas más elegantes y sofisticadas que puedan mimetizar mejor las interacciones entre las células y su ambiente. La presente tesis se centra en desarrollar modelos, tanto en dos como en tres dimensiones, mediante la recreación de uno o más factores que caracterizan el ambiente natural de la célula y que tienen su rol importante en el comportamiento celular. Se conoce que tanto las propiedades químicas como mecánicas de la matriz extracelular influyen en las funciones celulares. Debido a esto, se diseñó un nuevo film polimérico que pudiera combinar un hidrogel, con propiedades mecánicas variables, con un monómero reactivo, capaz de inmovilizar biomoléculas. Debido a la complejidad del polímero diseñado, fue necesario recurrir a una técnica de polimerización superficial muy versátil como es la deposición química iniciada en fase vapor (más conocida por su acrónimo en inglés iCVD). Los polímeros fueron ampliamente caracterizados y se corroboró que podían ser modificados con pequeñas biomoléculas como péptidos señalizadores. Las superficies resultantes son bioactivas y permiten la adhesión de células endoteliales. Se obtuvieron otro tipo de superficies biomiméticas relevantes en el ámbito de la ingeniería de tejidos de hueso, a partir de una hidroxiapatita sintetizada por el método sol-gel sumergiéndolas en diferentes medios fisiológicos. La disolución y posterior reprecipitación de los iones proporcionan una capa de apatita con una composición similar a la que se encuentra in vivo. Los experimentos evidencian la importancia de partir de un material relativamente soluble. Precisamente debido a esto la hidroxiapatita pura no es capaz de inducir la precipitación de esta apatita biomimética in vitro. Varios investigadores han relacionado la capacidad de formar apatita con la bioactividad del material, entendiendo bioactividad como la habilidad de estos materiales de promover la unión con el hueso. De todos modos, en ingeniería de tejidos, es necesario un ambiente tridimensional para generar un tejido artificial. Se ha desarrollado un nuevo modelo basado en el uso de un gel blando para obtener tejido duro como el del hueso. Aunque estos conceptos pueden parecer contradictorios, las células adquieren la habilidad de estirarse rápidamente y de formar una densa red celular dentro de este gel tan poco restrictivo desde un punto de vista mecánico. La consiguiente contracción del sistema acaba formando un constructo mucho más pequeño y resistente. Este es un sistema biomimético ya que promueve una gran interacción celular y también la condensación de las células, eventos que también ocurren durante el desarrollo de hueso y cartílago. El modelo se caracterizó extensamente con células osteoprogenitoras MC3T3-E1 que se diferenciaron bajo inducción química. Además, se demostró que el microambiente tridimensional podía promover la expresión espontánea de marcadores osteogénicos. Debido a las interesantes propiedades del sistema, el mismo modelo se usó para inducir la diferenciación condrogénica de fibroblastos dermales humanos. Este tipo celular no ha sido demasiado explorado en ingeniería de tejidos, a pesar de que puede tener un gran potencial en terapia regenerativa. Este trabajo proporciona pruebas de la capacidad condrogénica de estas células en el sistema tridimensional previamente desarrollado. / Biomimetics or biomimicry are terms that imply “learning from nature”, from its systems, processes and models, in order to use nature as inspiration to solve human problems. In tissue engineering, biomimetics is nowadays a recurrent term and a source of ideas to obtain more elegant and sophisticated platforms that could better mimic the interactions between cells and their environment. This thesis is focused on developing models both in two- and three-dimensions by recreation of one or more factors of the cell natural environment that are known to play an important role in cell behavior. Since both the chemical and mechanical properties of the extracellular matrix are known to effectively influence cell function, an innovative polymeric thin film was designed combining a hydrogel with tunable mechanical properties and a reactive molecule, capable to immobilize biomolecules. Due to the complexity of the polymers, a versatile technique such as initiated chemical vapor deposition (iCVD) was required for the synthesis. Extensive characterization revealed that nanostructured hydrogels were obtained and that small biomolecules, such as signaling peptides, could be attached on the surface. The final surfaces are bioactive and support endothelial cell attachment. Relevant biomimetic surfaces for bone tissue engineering could also be obtained from a sol-gel synthesized hydroxyapatite after immersion in different physiological media. The dissolution and posterior reprecipitation of the ions rendered a final apatite layer with a composition similar to that found in vivo. The experiments evidenced the importance of starting from a rather soluble material and, thus, pure hydroxyapatite was not able to promote apatite precipitation in vitro. This capacity has been related to the material bioactivity by many researchers in terms of its ability to bond to bone in tissue engineering applications. However, for tissue engineering a three-dimensional environment is required to build tissue-like constructs. A new model was developed based on the use of a very soft gel to obtain hard tissue. Although the concepts might seem to work in opposite directions, cells gain the ability to rapidly elongate and form a dense cellular network within this unrestrictive environment. Subsequent contraction of the whole system rendered a smaller and stronger final tissue-like construct. This system was considered biomimetic as it promotes high cell-cell interaction and cellular condensation, which are events that occur in bone and cartilage development. This system was extensively characterized with osteoprogenitor MC3T3-E1 cells that could undergo full osteogenic differentiation under chemical induction. More interestingly, the three-dimensional microenvironment was also able to promote by itself spontaneous expression of bone-related markers. Due to the interesting properties of this system, the same model was used to induce chondrogenic differentiation of human dermal fibroblasts. This cell type has been poorly explored for tissue engineering applications, but it might have great potential in future therapeutic platforms. This work provides proof of concept of chondrogenic potential of these cells in this three-dimensional system.

[EN] Nowadays, one of the biggest concerns that permanently keep the attention of main important sectors of human society is health. Modern medical science is compromised with not only providing good adequate treatments but also effective specific solutions for each type of disease or human pathology. In this direction, innovative approaches like tissue engineering or regenerative medicine, controlled drug delivery systems and nanomedicines emerge to bring alternatives to situations hard to solve with conventional treatment and strategies, including the replacement of damaged or diseases tissues and/or organs. Specifically, this research is mainly aimed to design a combined system for controlled, stable and localized release of therapeutic agents that are able to exert their effect selectively on the area that warrants treatment. This construct will have enough versatility to be adapted to almost any kind of treatment, from cancer to tissue regeneration, always that the key requirement of the treatment was the need to provide the treatment of localized, stable and controlled manner. With the purposes of making easier the understanding as well as the design of the system, I was decided, for the proof of concept, to use drugs and materials with known activity applied on tissue regeneration and for the treatment of chronic wounds. The system in question consists of three main elements: 1) The first element is the polymer conjugates of therapeutic agents, which contribute to increasing the selectivity of the therapeutic action of the drug, as well as improved stability, bioavailability and biocompatibility thereof. If the drug is hydrophobic, conjugation contributes to increase its solubility in water, and in the case of proteins used as therapeutic agents, the combination helps reduce the body's immune response, increasing the chance of successful of the treatment. 2) The second element are the biodegradable polymeric microparticles, which in this case act like encapsulation agents for polymeric conjugate , thus allowing to have a second control point in the release kinetics of the therapeutic agents . Simultaneously, the microparticles also play a role in modifying the texture of the final construct, ascribing mechanical and physicochemical properties that help to improve some biological properties of the final material, such as the affinity, adhesion and cell proliferation. 3) The third element consists of a nanoporous membrane made of a biodegradable polymer by electrospinning, which constitute the unifier element of the whole system. This membrane provides manageability to the construct and is itself the last point of control in the release kinetics of the therapeutic agent or agents. Besides, it must be biocompatible and stable at ambient conditions, since this probably is going to be exposed to the environment while protecting the wound, in the case of this kind of application. These three elements, which themselves are complex systems separately, are systematically combined to achieve a synergistic relationship between them so that each one power the qualities of the other two. The resulting construct was characterized and it demonstrated to have characteristic properties that can be used as a control parameter during manufacture of this new material. Also, preliminary biological studies developed "in vitro" indicated that the proposed system may be a good candidate for deeper studies as alternative treatment for chronic wounds and other pathologies that require localized administration for long periods of time. / [ES] Actualmente, una de las mayores preocupaciones que permanentemente laman la atención de los principales sectores de la sociedad humana es la salud. La ciencia médica moderna está comprometida no solo con suministrar tratamientos adecuados, sino más bien ofrecer soluciones efectivas y específicas para cada tipo de enfermedad o patología humana. En este sentido, estrategias innovadoras como la ingeniería de tejidos o la medicina regenerativa, los sistemas de liberación controlada de fármacos y las nanomedicinas, surgen como buenas alternativas para abordar situaciones difíciles de resolver aplicando los tratamientos y estrategias terapéuticas convencionales, como es el caso cuando se hace necesario reemplazar tejidos o incluso órganos dañados por algún traumatismo o enfermedad. Concretamente, el presente trabajo de investigación tiene por objetivo principal diseñar un sistema combinado para la liberación controlada, estable y localizada de agentes terapéuticos que sean capaces de ejercer su efecto de forma selectiva sobre la zona que amerita el tratamiento. Este constructo tendrá la versatilidad suficiente como para poder adaptarse a casi cualquier tipo de tratamiento, desde el cáncer hasta la regeneración de tejido, siempre que el requisito clave del tratamiento sea la necesidad de suministrar el tratamiento de manera localizada, estable y controlada. Para efectos de facilitar la compresión y el diseño del sistema se escogió para la prueba de concepto materiales y fármacos asociados a la regeneración de tejidos, como tratamiento para casos de heridas crónicas. El sistema en cuestión está constituido por tres elementos principales: 1) El primer elemento son los conjugados poliméricos de agentes terapéuticos que contribuirán a aumentar la selectividad de la acción terapéutica del fármaco, así como también a mejora la estabilidad, biodisponibilidad y biocompatibilidad de los mismos. En caso de que el fármaco sea hidrofóbico, la conjugación contribuye a aumentar su solubilidad en agua, y en el caso de usar proteínas como agentes terapéuticos, la conjugación contribuye a disminuir la respuesta inmunológica del cuerpo incrementando las posibilidad de éxito del tratamiento. 2) El segundo elemento son micropartículas poliméricas biodegradables, que en este caso actúan con agentes de encapsulación para los conjugados poliméricos, permitiendo así contar con un segundo punto de control en la cinética de liberación de los agentes terapéuticos. Simultáneamente, las micropartículas también cumplen un papel de modificador de la textura del constructo final, adjudicándole propiedades mecánica y fisicoquímicas que contribuyen a mejorar las propiedades biológicas del material final, como son la afinidad, la adhesión y la proliferación celular. 3) El tercer elemento consiste en una membrana polimérica biodegradable nanoporosa hecha por electrospinning, que constituyen el elemento unificados del sistema, aporta manejabilidad al constructo y es en sí mismo el último punto de control en la cinética de liberación del agente terapéutico. Este último debe ser biocompatible y estable en condiciones ambientales, puesto que probablemente este expuesto al ambiente mientras protege la herida, en el caso concreto de este tipo de aplicación. Estos tres elementos, que en sí mismos constituyen sistemas complejos por separado, se han combinado sistemáticamente para alcanzar una relación sinérgica entre ellos de manera que cada uno potencia las cualidades de los otros dos. El constructo resultante se caracterizó demostrando tener propiedades características que se pueden utilizar como parámetro de control durante la fabricación del mismo. Así mismo estudios in vitro del sistema desarrollado señalan que puede ser un buen candidato para el tratamiento de heridas crónicas entre otras patologías que requieran tratamientos localizados. / [CA] Actualment, una de les majors preocupacions que permanentment llepen l'atenció dels principals sectors de la societat humana és la salut. La ciència mèdica moderna està compromesa no solament amb subministrar tractaments adequats, sinó més aviat oferir solucions efectives i específiques per a cada tipus de malaltia o patologia humana. En aquest sentit, estratègies innovadores com l'enginyeria de teixits o la medicina regenerativa, els sistemes d'alliberament controlat de fàrmacs i les nanomedicines, sorgeixen com a bones alternatives per a abordar situacions difícils de resoldre aplicant els tractaments i estratègies terapèutiques convencionals, com és el cas quan es fa necessari reemplaçar teixits o fins i tot òrgans danyats per algun traumatisme o malaltia. Concretament, el present treball de recerca té per objectiu principal dissenyar un sistema combinat per a l'alliberament controlat, estable i localitzada d'agents terapèutics que seguen capaços d'exercir el seu efecte de forma selectiva sobre la zona que amirita el tractament. Aquest constructe tindrà la versatilitat suficient com per a poder adaptar-se a quasi qualsevol tipus de tractament, des del càncer fins a la regeneració de teixit, sempre que el requisit clau del tractament sega la necessitat de subministrar el tractament de manera localitzada, estable i controlada. Per a efectes de facilitar la compressió i el disseny del sistema es va escollir per a la prova de concepte materials i fàrmacs associats a la regeneració de teixits, com a tractament per a casos de ferides cròniques. El sistema en qüestió està constituït per tres elements principals: 1) El primer element són els conjugats polimèrics d'agents terapèutics que contribuiran a augmentar la selectivitat de l'acció terapèutica del fàrmac, així com també a millora l'estabilitat, biodisponibilitat i biocompatibilitat dels mateixos. En cas que el fàrmac sega hidrofòbic, la conjugació contribueix a augmentar la seua solubilitat en aigua, i en el cas d'usar proteïnes com a agents terapèutics, la conjugació contribueix a disminuir la resposta immunològica del cos incrementant les possibilitat d'èxit del tractament. 2) El segon element són microparticles polimèriques biodegradables, que en aquest cas actuen amb agents d'encapsulació per als conjugats polimèrics, permetent així comptar amb un segon punt de control en la cinètica d'alliberament de l'agent terapèutics. Simultàniament, les microparticles també compleixen un paper de texturitzant del constructe final, adjudicant-li propietats mecànica i fisicoquímiques que contribueixen a millorar la propietats biològiques del material final, com són l'afinitat, l'adhesió i la proliferació cel·lular. 3) El tercer element consisteix en una membrana polimèrica biodegradable nanoporosa feta per electrospinning, que constitueixen el element unificats del sistema, aporta manejabilitat al constructe i és en si mateix el ultimi punt de control en la cinètica d'alliberament de l'agent terapèutic. Aquest últim ha de ser biocompatible i estable en condicions ambientals, ja que probablement aquest exposat a l'ambient mentre protegeix la ferida, en el cas concret d'aquest tipus d'aplicació. Aquests tres elements que en si mateixos constitueixen sistemes complexos per separat, s'han combinat sistemàticament per a aconseguir una relació sinergètica entre ells de manera que cadascun potencia les qualitats dels altres dos. El constructe resultant es va caracteritzar demostrant tenir propietats característiques que es poden utilitzar com a paràmetre de control durant la fabricació del mateix. Així mateix estudis in vitro del sistema desenvolupat assenyalen que pot ser un bon candidat per al tractament de ferides cròniques entre altres patologies que requeriren tractaments localitzats. / Rodríguez Escalona, GDJ. (2016). DEVELOPMENT OF CONTROLLED DRUG DELIVERY SYSTEMS OF POLYMERIC NANOMEDICINES ASSOCIATED TO SCAFFOLDS FOR TISSUE REGENERATION [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/63231