A alveolite seca é uma das complicações pós-operatórias mais comuns e sintomáticas na exodontia, porém, até o momento não possui um protocolo de tratamento definido. A oxitetraciclina (OTC) é um antibiótico de amplo espectro utilizado no tratamento de múltiplas infecções. Entretanto, nos últimos anos as tetraciclinas de primeira geração, tais como a OTC, têm sido evitadas devido ao surgimento de microrganismos resistentes. Afortunadamente, nos últimos anos tem se observado uma tendência contrária graças às medidas de controle no uso de antibióticos. Sistemas de liberação controlada podem evitar o desenvolvimento de resistência bacteriana e diminuir o risco de efeitos adversos. Este estudo teve como objetivo preparar uma nanofibra polimérica de policaprolactona e oxitetraciclina (PCL/OTC), e ainda avaliar suas propriedades físicas e biológicas in vitro e in vivo, visando seu futuro uso no tratamento da alveolite seca. As nanofibras poliméricas carregadas com OTC foram preparadas pelo sistema de eletrofiação, caracterizadas através da microscopia eletrônica de varredura (MEV) e avaliadas sobre seu perfil de liberação do fármaco. A atividade antibacteriana da nanofibra sobre um biofilme misto de Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermédia, Fusobacterium nucleatum, Eikenella corrodens, Streptococcus sanguis e Aggregatibacter actinomycetemcomitans foi analisada mediante a contagem das unidades formadoras de colônias viáveis após os tempos de contato de 1, 4, 24, 30 e 48 h. O processo de reparo alveolar induzido pela nanofibra PCL/OTC foi avaliado de forma histomorfológica e histomorfométrica após o tratamento da alveolite seca em molares de ratos, e comparado ao tratamento com nanofibras de PCL pura e Alvogyl®, 7, 14 e 21 dias após a exodontia. Finalmente, foi realizada a identificação e contagem de osteoclastos através da marcação da fosfatase ácida resistente ao tartarato (TRAP), nos mesmos tempos de avaliação. As nanofibras PCL/OTC apresentaram orientação randômica em camadas e morfologia multiforme. O perfil de liberação do sistema apresentou um efeito de explosão nas primeiras 8 horas, seguido por um período de liberação lenta e prolongada da OTC. A nanofibra PCL/OTC (132 ?g de OTC/mL) reduziu mais de 50% das colônias do biofilme nas primeiras horas de liberação, seguido por um período de manutenção em que a porcentagem de colônias bacterianas permaneceu baixa. O grupo tratado com PCL/OTC apresentou a maior porcentagem de tecido conjuntivo no 7º dia (p<0,05) e maior porcentagem de osso neoformado no 14º e 21º dias após a exodontia (p<0,05), em comparação aos outros grupos. O tratamento de alveolite seca com a fibra PCL/OTC permitiu a regeneração tecidual do alvéolo quase em sua totalidade até o 21º dia, sendo que a cronologia de regeneração tecidual com este material foi mais rápida do que com a fibra de PCL pura, e esta última mais rápida que do que o controle positivo Alvogyl®. O grupo PCL/OTC apresentou uma quantidade menor (p<0,05) de osteoclastos por área em relação aos outros grupos nos três tempos experimentais. O perfil de liberação prolongando de OTC e as propriedades biológicas relevantes apresentadas pela nanofibra PCL/OTC, sugerem que esta poderia ser considerada uma alternativa para o tratamento da alveolite seca. / Dry socket is one of the most common and symptomatic postoperative complications in tooth extraction, however, to date, it does not have an established treatment protocol. Oxytetracycline (OTC) is a broad-spectrum antibiotic, employed in the treatment of multiple infections. Nevertheless, in the last few years, first-generation tetracyclines such as OTC, have been avoided due to the development of resistant microorganisms. Fortunately, in recent years there has been a contrary trend thanks to control measures in the use of antibiotics. Controlled release systems can prevent the development of bacterial resistance and decrease the risk of adverse effects. This study aimed to prepare a polymeric nanofiber of polycaprolactone and oxytetracycline (PCL/OTC), and to evaluate its physical and biological properties in vitro and in vivo, aiming its use in the treatment of dry socket at the future. The OTC-charged polymeric nanofibers were prepared by electrospinning, and characterized by scanning electron microscopy (SEM) and drug release profile evaluation. The antibacterial activity of the nanofiber over a mixed biofilm containing Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia, Fusobacterium nucleatum, Eikenella corrodens, Streptococcus sanguis, and Aggregatibacter actinomycetemcomitans was analyzed by counting the viable colony-forming units after 1, 4, 24, 30 and 48 h of contact. The alveolar repair process induced by the PCL/OTC nanofiber was evaluated histomorphologically and histomorphometrically after the treatment of dry socket in rat molars, and compared to the treatment with plain PCL nanofibers and AlvogylTM, 7, 14 and 21 days after extraction. Finally, the identification and counting of osteoclasts were performed through the tartrate resistant acid phosphatase (TRAP) staining, at the same evaluation time points. PCL/OTC nanofibers presented random orientation in layers and multiform morphology. The release profile of the PCL/OTC system showed a burst effect within the first 8 hours, followed by a prolonged slow release period. The PCL/OTC nanofiber at a concentration of 132 ?g OTC/mL reduced more than 50% of the biofilm colonies in the first few hours of release, followed by a maintenance period in which the percentage of bacterial colonies remained low. The PCL/OTC group presented the highest percentage of connective tissue on the 7th day (p<0.05), and of newly formed bone on the 14th and 21st days (p<0.05) after dental extraction, compared to the other groups. The treatment of dry socket with the PCL/OTC fiber allowed almost complete tissue regeneration up to the 21st day, and the chronology of tissue regeneration with this material was faster than with the plain PCL fiber, and the latter was more rapid than the positive control AlvogylTM. The PCL/OTC group presented a lower amount (p<0.05) of osteoclasts per area than the other two groups in the three experimental periods. The prolonged release profile of OTC and the relevant biological properties presented by the PCL/OTC nanofibers suggest that these may be considered as an alternative treatment of dry socket.

Los antibióticos son ampliamente utilizados en veterinaria, produciendo beneficios inmensos, pero también conllevan riesgos medioambientales debidos a la aparición de residuos "incontrolados" que pueden desencadenar resistencias bacterianas, reacciones alérgicas y otros inconvenientes importantes. En esta tesis se han desarrollado varios sistemas inmunoquímicos para la determinación de residuos de distintos tipos de antibióticos, tanto mediante el formato tradicional en placa ELISA, como mediante el uso de microarrays utilizando CDs como plataformas analíticas. En primer lugar, se han desarrollado inmunoensayos en placa ELISA para sulfonamidas y tetraciclinas. Se han puesto a punto dos inmunoensayos genéricos para la determinación de seis sulfonamidas, con elevada sensibilidad (IC50 entre 1,32 y 12,82 ng mL-1) e inmunoensayos específicos para la determinación de SSZ y SMX con valores de IC50 de 0,51 y 0,16 ng mL-1, respectivamente. Asimismo, se ha puesto a punto un inmunoensayo específico para la determinación de CTC, con un valor de IC50 de 36,40 ng mL-1. Estos ELISAs se han aplicado con éxito a la cuantificación de residuos de sulfonamidas en alimentos (miel), aguas de depuradora y plasma humano. En otro apartado se presentan los resultados de las investigaciones sobre el desarrollo de microinmunoensayos utilizando la tecnología de discos compactos. Este soporte presenta gran área analítica donde depositar miles de biomoléculas sonda y la posibilidad de integrar tanto información numérica como bioquímica (identificando cada punto de cada matriz y almacenando los resultados del ensayo en la misma plataforma física en la que se desarrolla el análisis); por último, su fabricación a gran escala permite obtener productos de alta calidad a muy bajo precio. Además, los resultados analíticos son leídos y cuantificados por un lector comercial de CDs integrado en un ordenador personal convencional. / Gallego Iglesias, E. (2012). Desarrollo de inmunoensayos para antibióticos en microplaca y en disco compacto aplicados a la determinación multirresiduo de contaminantes [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/14720 / Palancia

Submitted by Edineia Teixeira (edineia.teixeira@unioeste.br) on 2017-09-01T19:28:20Z No. of bitstreams: 2 NATHALIE_KESSLER2017.pdf: 1449397 bytes, checksum: c331e85586f45bd807a7022916c9e272 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-09-01T19:28:20Z (GMT). No. of bitstreams: 2 NATHALIE_KESSLER2017.pdf: 1449397 bytes, checksum: c331e85586f45bd807a7022916c9e272 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2017-02-08 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Antibiotics are added to animals’ diet to increase zootechnical development rates in livestock production. Thus, tetracycline class drugs are the most frequently used ones, mainly in swine breeding. It is known that these compounds are not completely digested by the animals’ metabolism, consequently, they take part of wastewater, and eventually, they can reach the soil and change all the dynamics of microorganisms. Thus, this trial aimed at evaluating the effect of tetracycline associated with swine wastewater on enzymatic activity of soil regarding biogeochemical cycle of nutrients under two applications, in different seasons. The experiment was carried out in soil-containing pots, which received, once in summertime, and again in the autumn, doses of swine wastewater (0.2 and 0.3 L) with or without tetracycline doses (35 μg L-1), chlortetracycline (40.9 μg L-1) and doxycycline (14.9 μg L-1). Soil samples were collected at 2, 4, 8, 15, 30, 45 and 75 days after each application of the treatments in order to determine dehydrogenase, β-glucosidase, acid phosphatase and urease enzymes activity. It was observed an increase in the activity of all the studied enzymes when submitted to swine wastewater. And, a decrease of their activity when in antibiotics presence, applied in both experimental periods. There was also a decrease in nutrients bioavailability in soil, which reduces soil quality and fertility / Antibióticos são adicionados à dieta dos animais com objetivo de aumentar os índices de desenvolvimento zootécnico na produção pecuária. Desses, os medicamentos da classe das tetraciclinas são os mais frequentemente utilizados, principalmente na suinocultura. Sabe-se que estes compostos não são completamente digeridos pelo metabolismo dos animais, vindo a compor as águas residuárias e, eventualmente, chegam aos solos e alteram toda dinâmica dos microrganismos. Nesse sentido, o presente trabalho teve como objetivo avaliar o efeito das tetraciclinas associadas à agua residuária de suinocultura sobre a atividade enzimática do solo, relacionada ao ciclo biogeoquímico dos nutrientes sob duas aplicações, em diferentes estações do ano. O experimento foi conduzido em vasos contendo solo, os quais receberam, uma vez no verão e novamente no outono, doses de água residuária da suinocultura (0,2 e 0,3 L), combinadas ou não, com doses de tetraciclina (35 μg L-1), clortetraciclina (40,9 μg L-1) e doxiciclina (14,9 μg L-1). Amostras de solo foram coletadas aos 2, 4, 8, 15, 30, 45 e 75 dias, após cada aplicação dos tratamentos, para determinação da atividade das enzimas desidrogenase, β-glicosidase, fosfatase ácida e urease. Foi verificado aumento da atividade de todas as enzimas na presença de água residuária da suinocultura, e redução da atividade na presença dos antibióticos aplicados em ambos os períodos experimentais. Também foi observada redução na biodisponibilidade de nutrientes no solo, o que reduz a qualidade e fertilidade do solo.

Introdução. A resistência bacteriana a antibióticos é aceita como um dos maiores problemas de saúde pública. As tetraciclinas são antibióticos de amplo espectro, e após seu uso indiscriminado observou-se o surgimento de bactérias resistentes, levando médicos e veterinários a diminuírem seu uso. Objetivos. Verificar o perfil de sensibilidade a tetraciclinas em isolados clínicos e ambientais de Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae e Aeromonas spp., bem como pesquisar os principais genes tet associados à resistência a esta classe de antibióticos e determinar a potencial forma de disseminação destes genes através da caracterização de seu ambiente genético. Material e Métodos. Os perfis de sensibilidade à tetraciclina (TET), doxiciclina (DOX), minociclina (MIN) e tigeciclina (TGC) de 572 isolados foram obtidos através das técnicas de Disco-Difusão e Concentração Inibitória Mínima. Os isolados não-sensíveis à tetraciclina foram submetidos a reações de PCR para pesquisa de grupos Inc, genes tet e para a caracterização de seu ambiente genético pela pesquisa das integrases de classes 1, 2, 3 e 4, e dos elementos genéticos móveis Tn1721, IS26, Tn10 e ISAS5. Perfis de similaridade genética dos isolados foram obtidos através das técnicas de ERIC-PCR e PFGE. Após análise destes resultados 33 cepas foram selecionadas para as técnicas de S1-PFGE e transformação. Resultados. A partir dos 572 isolados 18,5 por cento foram resistentes à TET, 13,5 por cento à DOX, 8 por cento à MIN e nenhum à TGC. Vinte e dois por cento dos isolados clínicos e 16,3 por cento ambientais foram resistentes à TET. Os genes codificadores de bomba de efluxo tet(A), tet(B), tet(C), tet(D) e tet(E), foram observados em 25,5 por cento , 33 por cento , 6,5 por cento , 18,9 por cento e 23,5 por cento dos isolados, respectivamente. Noventa e cinco por cento, 100 por cento , 100 por cento e 4,5 por cento das cepas carreando o gene tet(A), tet(B), tet(D) e tet(E), foram não-sensíveis à DOX, nesta ordem. Resistência à MIN foi observada em 4,2 por cento , 78,8 por cento e 100 por cento dos isolados carreando tet(A), tet(B) e tet(D), respectivamente. O gene tet(A) estava associado a Tn1721, tet(B) à Tn10 e tet(C) e tet(D) à IS26. Nenhuma das integrases pesquisadas estavam associadas aos genes tet detectados. Os grupos IncF, IncFIB e IncA/C foram observados em 54,8 por cento , 41,1 por cento e 28,7 por cento dos isolados, respectivamente. Uma cepa de Aeromonas spp. carreava um plasmídio do grupo IncP. Através dos perfis de similaridade genética foi observado que dentre os isolados hospitalares de K. pneumoniae houve a ocorrência de perfis genéticos idênticos, no entanto nos demais isolados do estudo os perfis genéticos observados eram distintos. Das 33 cepas selecionadas para os experimentos de linearização plasmidial e de transformação, 8 foram transformadas com sucesso, nas quais foi observada a presença dos genes tet em plasmídios. Conclusões. Uma baixa porcentagem de resistência à TET foi detectada. Verificou-se que a TGC foi a tetraciclina mais ativa, seguida da MIN. Os genes tet(A) e tet(B) foram os mais prevalentes. Todas as cepas carreando tet(B) e tet(D) foram não-sensíveis a DOX e MIN. Plasmídios dos grupos IncF, FIB e A/C foram os mais detectados neste estudo. Os resultados sugerem que os genes tet(A), (B), (C) e (D) são disseminados por meio de plasmídios e estão associados aos transposons Tn1721, IS10 e IS26. Estudos adicionais com isolados mais recentes e outros gêneros bacterianos são necessários, para contribuir com informações da resistência bacteriana a tetraciclinas. / Introduction. The antibiotic resistance is accepted as one of the major problems for public health. Tetracyclines are broad spectrum antibiotics, and its indiscriminate use promoted the emergence of resistant bacteria, leading physicians and veterinarians to decrease its use. Objectives. Verify the susceptibility of clinical and environmental isolates of Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae and Aeromonas spp. to tetracyclines, and also search for the main tet genes associated with resistance to these antibiotics and determine the potential mechanism of tet genes dissemination by characterizing their genetic context. Material and Methods. Disk-Diffusion and Minimum Inhibitory Concentration tests were carried out in 572 isolates using tetracycline (TET), doxycycline (DOX), minocycline (MIN) and tigecycline (TGC). PCR was carried out in TET non-susceptible isolates for the detection of Inc groups, tet genes and its genetic context determination through the search of classes 1, 2, 3, and 4 integrases, and Tn1721, Tn10, IS26 and ISAS5 mobile genetic elements. Genetic similarities patterns were determined by ERIC-PCR and PFGE techniques. After analyzing the results 33 strains were selected for the S1-PFGE and transformation experiments. Results. From 572 isolates, 18.5 per cent were TET-resistant, 13.5 per cent DOX-resistant, 8 per cent MIN-resistant and none resistant to TGC. Twenty-two per cent and 16.3 per cent of clinical and environmental isolates were TET-resistant, in that order. Genes tet(A), tet(B), tet(C), tet(D) and tet(E), coding for efflux pump mechanism, were found in 25.5 per cent , 33 per cent , 6.5 per cent , 18.9 per cent and 23.5 per cent of the isolates, respectively. Ninety-five per cent, 100 per cent , 100 per cent and 4.5 per cent of the isolates carrying tet(A), tet(B), tet(D) and tet(E) were non-susceptible to DOX, respectively. Resistance to MIN was observed in 4.2 per cent , 78.8 per cent and 100 per cent of isolates carrying tet(A), tet(B) and tet(D), in that order. The gene tet(A) was associated with Tn1721, tet(B) with Tn10, and tet(C) and (D) with IS26. None of the searched integrases were associated with the tet genes detected. Groups IncF, IncFIB and IncA/C were respectively observed in 54.8 per cent , 41.1 per cent and 28.7 per cent of the isolates. One Aeromonas spp. was carrying an IncP plasmid. The genetic similarities patterns demonstrated that there were identical genetic patterns among the hospital K. pneumoniae isolates, however all the remaining isolates possessed distinct genetic patterns. Of the 33 strains selected for plasmid linearization and transformation experiments, 8 were successfully transformed, in which the presence of tet genes in plasmids were observed. Conclusions. A low level of tetracycline resistance was detected. TGC was the most active tested antibiotic, followed by MIN. Genes tet(A) and tet(B) were the most prevalent among the isolates. All strains carrying tet(B) and tet(D) were non-susceptible to DOX and MIN. Groups IncF, IncFIB and IncA/C were the most detected in this study. The results suggest that tet(A), (B), (C) and (D) are disseminated by plasmids and are associated with Tn1721, Tn10 and IS26. Additional studies assembling recent isolates and other genera are necessary in order to contribute with information about the bacteria resistance to tetracyclines.

Introdução. A resistência bacteriana a antibióticos é aceita como um dos maiores problemas de saúde pública. As tetraciclinas são antibióticos de amplo espectro, e após seu uso indiscriminado observou-se o surgimento de bactérias resistentes, levando médicos e veterinários a diminuírem seu uso. Objetivos. Verificar o perfil de sensibilidade a tetraciclinas em isolados clínicos e ambientais de Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae e Aeromonas spp., bem como pesquisar os principais genes tet associados à resistência a esta classe de antibióticos e determinar a potencial forma de disseminação destes genes através da caracterização de seu ambiente genético. Material e Métodos. Os perfis de sensibilidade à tetraciclina (TET), doxiciclina (DOX), minociclina (MIN) e tigeciclina (TGC) de 572 isolados foram obtidos através das técnicas de Disco-Difusão e Concentração Inibitória Mínima. Os isolados não-sensíveis à tetraciclina foram submetidos a reações de PCR para pesquisa de grupos Inc, genes tet e para a caracterização de seu ambiente genético pela pesquisa das integrases de classes 1, 2, 3 e 4, e dos elementos genéticos móveis Tn1721, IS26, Tn10 e ISAS5. Perfis de similaridade genética dos isolados foram obtidos através das técnicas de ERIC-PCR e PFGE. Após análise destes resultados 33 cepas foram selecionadas para as técnicas de S1-PFGE e transformação. Resultados. A partir dos 572 isolados 18,5 por cento foram resistentes à TET, 13,5 por cento à DOX, 8 por cento à MIN e nenhum à TGC. Vinte e dois por cento dos isolados clínicos e 16,3 por cento ambientais foram resistentes à TET. Os genes codificadores de bomba de efluxo tet(A), tet(B), tet(C), tet(D) e tet(E), foram observados em 25,5 por cento , 33 por cento , 6,5 por cento , 18,9 por cento e 23,5 por cento dos isolados, respectivamente. Noventa e cinco por cento, 100 por cento , 100 por cento e 4,5 por cento das cepas carreando o gene tet(A), tet(B), tet(D) e tet(E), foram não-sensíveis à DOX, nesta ordem. Resistência à MIN foi observada em 4,2 por cento , 78,8 por cento e 100 por cento dos isolados carreando tet(A), tet(B) e tet(D), respectivamente. O gene tet(A) estava associado a Tn1721, tet(B) à Tn10 e tet(C) e tet(D) à IS26. Nenhuma das integrases pesquisadas estavam associadas aos genes tet detectados. Os grupos IncF, IncFIB e IncA/C foram observados em 54,8 por cento , 41,1 por cento e 28,7 por cento dos isolados, respectivamente. Uma cepa de Aeromonas spp. carreava um plasmídio do grupo IncP. Através dos perfis de similaridade genética foi observado que dentre os isolados hospitalares de K. pneumoniae houve a ocorrência de perfis genéticos idênticos, no entanto nos demais isolados do estudo os perfis genéticos observados eram distintos. Das 33 cepas selecionadas para os experimentos de linearização plasmidial e de transformação, 8 foram transformadas com sucesso, nas quais foi observada a presença dos genes tet em plasmídios. Conclusões. Uma baixa porcentagem de resistência à TET foi detectada. Verificou-se que a TGC foi a tetraciclina mais ativa, seguida da MIN. Os genes tet(A) e tet(B) foram os mais prevalentes. Todas as cepas carreando tet(B) e tet(D) foram não-sensíveis a DOX e MIN. Plasmídios dos grupos IncF, FIB e A/C foram os mais detectados neste estudo. Os resultados sugerem que os genes tet(A), (B), (C) e (D) são disseminados por meio de plasmídios e estão associados aos transposons Tn1721, IS10 e IS26. Estudos adicionais com isolados mais recentes e outros gêneros bacterianos são necessários, para contribuir com informações da resistência bacteriana a tetraciclinas. / Introduction. The antibiotic resistance is accepted as one of the major problems for public health. Tetracyclines are broad spectrum antibiotics, and its indiscriminate use promoted the emergence of resistant bacteria, leading physicians and veterinarians to decrease its use. Objectives. Verify the susceptibility of clinical and environmental isolates of Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae and Aeromonas spp. to tetracyclines, and also search for the main tet genes associated with resistance to these antibiotics and determine the potential mechanism of tet genes dissemination by characterizing their genetic context. Material and Methods. Disk-Diffusion and Minimum Inhibitory Concentration tests were carried out in 572 isolates using tetracycline (TET), doxycycline (DOX), minocycline (MIN) and tigecycline (TGC). PCR was carried out in TET non-susceptible isolates for the detection of Inc groups, tet genes and its genetic context determination through the search of classes 1, 2, 3, and 4 integrases, and Tn1721, Tn10, IS26 and ISAS5 mobile genetic elements. Genetic similarities patterns were determined by ERIC-PCR and PFGE techniques. After analyzing the results 33 strains were selected for the S1-PFGE and transformation experiments. Results. From 572 isolates, 18.5 per cent were TET-resistant, 13.5 per cent DOX-resistant, 8 per cent MIN-resistant and none resistant to TGC. Twenty-two per cent and 16.3 per cent of clinical and environmental isolates were TET-resistant, in that order. Genes tet(A), tet(B), tet(C), tet(D) and tet(E), coding for efflux pump mechanism, were found in 25.5 per cent , 33 per cent , 6.5 per cent , 18.9 per cent and 23.5 per cent of the isolates, respectively. Ninety-five per cent, 100 per cent , 100 per cent and 4.5 per cent of the isolates carrying tet(A), tet(B), tet(D) and tet(E) were non-susceptible to DOX, respectively. Resistance to MIN was observed in 4.2 per cent , 78.8 per cent and 100 per cent of isolates carrying tet(A), tet(B) and tet(D), in that order. The gene tet(A) was associated with Tn1721, tet(B) with Tn10, and tet(C) and (D) with IS26. None of the searched integrases were associated with the tet genes detected. Groups IncF, IncFIB and IncA/C were respectively observed in 54.8 per cent , 41.1 per cent and 28.7 per cent of the isolates. One Aeromonas spp. was carrying an IncP plasmid. The genetic similarities patterns demonstrated that there were identical genetic patterns among the hospital K. pneumoniae isolates, however all the remaining isolates possessed distinct genetic patterns. Of the 33 strains selected for plasmid linearization and transformation experiments, 8 were successfully transformed, in which the presence of tet genes in plasmids were observed. Conclusions. A low level of tetracycline resistance was detected. TGC was the most active tested antibiotic, followed by MIN. Genes tet(A) and tet(B) were the most prevalent among the isolates. All strains carrying tet(B) and tet(D) were non-susceptible to DOX and MIN. Groups IncF, IncFIB and IncA/C were the most detected in this study. The results suggest that tet(A), (B), (C) and (D) are disseminated by plasmids and are associated with Tn1721, Tn10 and IS26. Additional studies assembling recent isolates and other genera are necessary in order to contribute with information about the bacteria resistance to tetracyclines.

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No. of bitstreams: 1 brunaluanamarcial.pdf: 8389291 bytes, checksum: 93256796394730c4d8f7a200fe2be582 (MD5) Previous issue date: 2013-07-26 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / As Metaloproteinases de Matriz (MMPs) desempenham um papel crucial nos processos fisiológicos e condições patológicas tais como progressão tumoral e metástases. Nos últimos anos, tem sido proposto uma série de inibidores de MMPs (IMMPs), incluindo as Tetraciclinas Quimicamente Modificadas (CMTs), as quais têm apresentado resultados promissores em ensaios com modelos pré-clínicos de câncer. No entanto, até o presente não havia nenhum estudo da estrutura-atividade desses compostos. Neste sentido, na presente tese foram combinadas as metodologias teóricas da Teoria do Funcional da Densidade (DFT), Docking molecular e simulação de Dinâmica Molecular (DM) para elucidar o mecanismo de interação das CMTs com o sítio ativo das MMPs. Primeiramente a estrutura e estabilidade dos modelos moleculares miméticos do sítio ativo da MMP-2 representados por: [Zn(LHn)(H2O)2]2+x (n = 0, 1, 2 e x = -2, -1, 0) e [Zn(L)(His)3], onde L representa CMT1, -3, -4, -7 e -8, foram calculados usando DFT. O efeito do solvente e do pH foram também avaliados. Os resultados sugerem que a coordenação com o zinco ocorra no sítio VI(O11O12), o qual é igualmente favorável para a CMT-3 (log β = 15,9) e CMT-8 (log β = 21,3). Esta análise inicial evidenciou que a atividade das CMTs como inibidoras de MMP estaria diretamente relacionada à sua estrutura. Na segunda fase do trabalho foi investigada a interação das CMTs diretamente com o sítio ativo da MMP-2 (1QIB) combinando os métodos de docking molecular, simulações de DM e cálculos de energia livre. Um novo conjunto de parâmetros para os átomos de Zn(II) estrutural e catalítico da enzima foi calculado, validado e depositado dentro do campo de forças AMBER. As CMTs foram otimizadas no nível B3LYP/6-31G(d) e “docadas” dentro do sítio ativo da MMP-2. As melhores soluções foram minimizadas e submetidas a 12ns de simulação de DM. A energia livre de ligação foi calculada usando as metodologias de integração termodinâmica e MMPBSA. Os principais resultados mostram que as CMTs coordenam-se ao Zn(II) através do sítio VI(O11-O12), como proposto experimentalmente. Com exceção do análogo CMT-3 que está envolvido em contatos hidrofóbicos e interações de van der Waals com aminoácidos do bolso S1’da enzima e ainda interage com o Zn(II) pelo O11. A análise da energia livre de ligação revela uma maior afinidade entre o análogo CMT-3 com o sítio ativo da MMP-2, seguido pela CMT-7 e CMT-8, sendo que a diferença de energia varia apenas de 3 kcal mol1. De acordo com os resultados, é possível inferir que a ocupação do canal S1’ seria um fator fundamental para a resposta biológica da CMT-3, enquanto que as demais CMTs, por impedimento estérico, não entram no túnel hidrofóbico da enzima. Os resultados apresentados nesta tese tratam do primeiro estudo em nível molecular da interação de CMTs com metaloproteínas, como contribuição para a compreensão das observações experimentais, sobretudo dos testes biológicos, e ainda uma referência direta para o desenho de novos análogos das CMTs com maior potencial biológico. / Matrix Metalloproteinases (MMPs) play a critical role in physiological processes and pathological conditions such as tumor progression and metastasis. In recent years, a number of MMP inhibitors (MMPIs) have been proposed, including the chemically modified tetracyclines (CMTs), which have been evaluated in preclinical cancer models showing promising results. However, until present there were no studies on the structure-activity relationship for these compounds. In this sense, the present thesis focuses on the direct interaction of CMTs with the active site of the MMPs. Density Functional Theory (DFT), molecular docking and molecular dynamics (MD) simulations were accomplished for seven CMT derivatives. Firstly the structure and stability of mimetic molecular models of active site of MMP-2 represented by: [Zn(LHn)(H2O)2]2+x (n = 0, 1, 2 and x = -2, -1, 0) and [Zn(L)(His)3], where L=CMT-1, CMT-3, CMT-4, CMT-7 and CMT-8, were calculated at DFT level. The solvent and pH effects were also evaluated. The results suggested that the coordination at the O11-O12 site (site VI) was quite favorable to CMT-3 (log β = 15,9) and CMT-8 (log β = 21,3). This initial analysis showed that the activity of CMTs as inhibitors of MMP is directly related to its structure. In the second stage of the study, we investigated the interaction of CMTs directly with the active site of MMP-2 (1QIB). New sets of parameters were proposed for structural and catalytic zinc atoms in order to study MMPs and their complexes by means of the AMBER force field. The CMTs ligands were optimized at the B3LYP/6-31G(d) and docked onto the active site of MMP-2. The best solutions were minimized and subjected to 12ns MD simulation. The binding free energy was calculated using the methods of thermodynamic integration and MM-PBSA. The main results showed that the CMTs bind to the catalytic zinc of the MMP-2 enzyme through the O11-O12 moiety (site VI) as proposed experimentally. The exception was the CMT-3 analogue which is involved in hydrophobic contacts and van der Waals interactions with amino acids of the S1’ pocket in the MMP-2 enzyme and also interacts with the Zn (II) by O11. The binding energy calculated in solution predicts the CMT-3 complexes as the most favorable, followed by the CMT-7 and CMT-8 analogues, whose energy difference is within 3 kcal mol-1. These results suggest that the occupancy of S1’ pocket is an important molecular feature for biological response of CMT-3, while the other CMTs do not enter the hydrophobic tunnel of the enzyme due to the steric hindrance. The results presented in this thesis are the first step towards understanding the mechanism of CMTs as MMP inhibitors at a molecular level and could be a significant contribution to the understanding of experimental observations, especially the biological tests and the CMTs action mechanism as MMP inhibitors, allowing the design of new analogues with enhanced biological potency.

La presencia de residuos de sustancias antimicrobianas en la leche puede ocasionar problemas desde el punto de vista de la salud pública (alergias, trastornos digestivos, resistencias a medicamentos, etc.), además de ser la causa de interferencias en procesos de fermentación de la industria láctea. Ante la posible falta de fiabilidad de los métodos para la detección de inhibidores en la leche de oveja, el escaso número de trabajos efectuados en esta especie y los inconvenientes que originan la presencia de sustancias inhibidoras, tanto en los consumidores como para los procesos tecnológicos, se planteó la necesidad de realizar un estudio sobre un método específico de cribado para la detección de inhibidores (EclipseÒ "100ov"), y la aplicación de una técnica multirresiduo (Sistema Microbiológico Multiplaca) para la identificación preliminar de residuos de antimicrobianos en la leche de oveja. El método EclipseÒ, es una técnica microbiológica de difusión en agar, en el que se encuentran esporas de Bacillus stearothermophilus var calidolactis C953, con un indicador ácido-base. La leche se coloca en los pocillos de la microplaca y tras la incubación, se procede a la interpretación del resultado. En el caso de que la leche no contenga residuos de inhibidores, se producirá el desarrollo del microorganismo y aparecerá un cambio en la coloración del indicador ácido-base presente en el medio, y el color azul inicial pasará a amarillo. Si existen inhibidores no se manifestará el cambio de coloración. El SMMP es un método microbiológico que detecta de una forma selectiva la presencia de residuos de diferentes grupos de antimicrobianos en la leche. La muestra es analizada a través de distintas placas: B. Stearothermophilus var. calidolactis C953 (betalactámicos), B. subtilis BGA a pH 8,0 (aminoglucósidos), M. luteus ATCC 9341 (macrólidos), E. coli ATCC 11303 (quinolonas), B. cereus ATCC 11778 (tetraciclinas) y B. subtilis BGA, a pH 7,0 (sulfonamidas). La presencia de residuos / Montero Alonso, A. (2004). Aplicación de métodos microbiológicos en la detección de residuos de antimicrobianos en la leche de oveja [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/1977 / Palancia

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As condições analíticas foram otimizadas através de análise multivariada utilizando planejamentos experimentais fatoriais e o desempenho dos métodos propostos foi avaliado através de parâmetros como linearidade, efeito matriz, precisão, exatidão, limite de detecção, limite de quantificação, recuperação e estudo de interferências. O primeiro trabalho desenvolvido fez uso de um procedimento de injeção em fluxo contínuo para a rápida determinação de tetraciclinas em formulações veterinárias comerciais, visando maior eficiência no controle de qualidade na indústria farmacêutica. Na sequência, foi desenvolvido um método de screening mediante análise por injeção em fluxo empregando uma cela capilar de longo caminho óptico (LWCC) para a detecção de resíduos de tetraciclinas em amostras de leite bovino, sem a necessidade de passos de extração dispendiosos e demorados ou complicados tratamentos de amostras. Finalmente, um novo método de microextração líquido-líquido dispersiva assistida por ultrassom (US-DLLME) foi desenvolvido para a simples, rápida e eficiente extração de resíduos de tetraciclinas a partir de amostras de suplemento de ovos e, posterior análise por injeção em fluxo baseada em uma cela capilar de longo caminho óptico (LWCC), empregando um banho de aquecimento com controle de temperatura. Os métodos descritos apresentaram importantes características como simplicidade operacional, possibilidade de automação, rapidez e baixo custo das análises. Além disso, estes métodos seguiram os princípios da química verde, de modo que permitiram realizar determinações ambientalmente mais limpas, através da redução considerável do consumo de reagentes e amostras, evitando ou minimizando o emprego de solventes tóxicos. Também, os métodos desenvolvidos para a análise de resíduos mostraram excelente desempenho para aplicação no controle de qualidade dos produtos alimentares estudados na indústria alimentícia, a fim de proteger os consumidores. / This work describes the development of environmentally friendly analytical methods using screening systems and flow injection procedures for detection and quantification of tetracycline antibiotics in veterinary pharmaceuticals and animal-derived foods such as bovine milk and egg-based protein supplements. The developed methods were based on the diazo coupling reaction between the tetracyclines and diazotized p-sulfanilic acid in basic medium, resulting in the formation of azo compounds that present maximum absorption around 435 nm, which allows determining these antibiotics by spectrophotometry. The analytical conditions were optimized by means of multivariate analysis using factorial experimental designs. Performance of the proposed methods was assessed through parameters such as linearity, selectivity, precision, accuracy, detection limit, quantification limit, matrix effect and recovery. The first developed work used a continuous flow injection procedure for the rapid determination of tetracyclines in commercial veterinary formulations, aiming greater efficiency in quality control in the pharmaceutical industry. Thereafter, it was developed a screening method by flow injection analysis using a liquid waveguide capillary cell (LWCC) for detecting tetracyclines residues in bovine milk samples, without the need for expensive extraction steps that are time-consuming or complicated sample treatments. Finally, a new ultrasound-assisted dispersive liquid-liquid microextraction (US-DLLME) method was developed for simple, rapid, and efficient extraction of tetracyclines residues from egg supplement samples, followed by flow injection analysis based on a liquid waveguide capillary cell (LWCC), using a controlled temperature heating bath. The described methods presented important features such as operational simplicity, possibility of automation, quickness and low cost of the analysis. Furthermore, these methods followed the principles of green chemistry, making possible to perform environmentally cleaner determinations, due to the considerable reduction of reagents and samples consumption, avoiding or minimizing the use of toxic solvents. Besides, the methods developed for residues analysis showed excellent performance for application in the food industry for quality control of the studied food products in order to protect consumers.