Ce projet de thèse concerne les 2 principales complications rencontrées en pratique clinique dans les suites de l’angioplastie-stenting artériel : la resténose et la thrombose aigüe. Pour remédier à ce problème, des stents enrobés d’agents antiprolifératifs sont déjà sur le marché, mais leurs résultats restent décevants en raison de l’augmentation du taux de thrombose tardive intrastent (RR 1,2 vs stent nu) à l’origine d’une surmortalité (RR 1,32 vs stent nu) [Lagerqvist Bo et al., N Eng J Med 2007]. Dans ce travail, nous proposons d’immobiliser sur le stent une ancre spécifique au substrat métallique soit pour immobiliser i) la molécule thérapeutique, soit pour immobiliser ii) une matrice polymère sur laquelle sera adsorbée une molécule thérapeutique dans le cas d’un système à libération prolongée; cette dernière ciblant la resténose et la thrombose. Cette ancre, issue des protéines permettant l’accroche des moules marinières à tout type de substrat [Waite JH et al., Science 1981], est la base commune pour une immobilisation par liaisons covalentes de la molécule thérapeutique ou du système polymère. La première partie du projet concernait la mise au point de l’ancre chimique spécifique dans le cadre d’une immobilisation de surface. Avec cette technique d’immobilisation, l’ancre dopamine inclue un ester activé, permettant de générer un polymère de longueur de chaine contrôlé et capable d’adsorber une quantité contrôlée et définie de molécule thérapeutique [C Zobrist et al., Macromolecules 2011]. Ce polymère de N-(Acryloyloxy)succinimide a pu être caractérisé et couplé à une molécule de glucosamine, protéoglycane aux caractéristiques pertinentes dans la problématique développée. Ce modèle a été validé sur le plan chimique et biologique. Les résultats restaient décevants concernant la prolifération des cellules musculaires lisses qui sont les cellules cibles dans la resténose.L’ancre dopamine a par la suite était modifiée dans le but de permettre le greffage d’autres fonctions chimiques, notamment amines et acides. Elle a finalement été utilisée en conditions basiques (pH 8,5) permettant d’obtenir une polydopamine [Lee et al., Science 2007].Cette polydopamine a permis l’interaction sur notre surface d’un polymère bien connu au sein de notre unité et déjà employé pour la fonctionnalisation des tissus dans le domaine biomédical, le polymère de cyclodextrine (CD) [Martel B et al., European Polymer Journal 1995]. Les CD sont des oligosaccharides cycliques sous forme de cône tronqué possédant une cavité hydrophobe interne et des groupements hydroxyles à l’extérieur engendrant un caractère hydrophile. Cette structure cyclique leur confère la capacité de former des complexes d’inclusion réversibles avec un grand nombre de molécules hydrophobes. Elles peuvent donc stocker une molécule thérapeutique en grande quantité et ont la capacité de la libérer dans le temps.L’ensemble des paramètres du procédé de fonctionnalisation permettant l’adsorption de ces 2 couches successives : polydopamine et polymère de CD a pu être optimisé. La complexation de deux molécules thérapeutiques d’intérêt à notre plateforme fonctionnalisée a pu être réalisée: la simvastatine et le paclitaxel. La simvastatine, de la famille des statines, est une molécule pléïotrope, régulatrice de la dysfonction endothéliale ; elle limite la réaction inflammatoire locale impliquée à la fois dans les phénomènes de resténose et de thrombose [Balk EM et al., Am J Med. 2004]. Le paclitaxel est un agent immunosuppresseur et antiprolifératif limitant la prolifération de la néointima [Creel CJ et al., Circ Res 2000]. Nous avons comparé notre plateforme avec un système actuellement sur le marché, le système PTX « polymer-free » mise au point par Dake et al. [Dake et al., JVIR 2011]. [...] / This work has focused on 2 major issues encountered after angioplasty and stenting of arterial occlusive disease: intra-stent restenosis and thrombosis.To prevent these postoperative complications, drug eluting stents (DES) have been developed and are currently available for clinical use; they elute antiproliferative drugs overtime which limit smooth muscle cells migration and proliferation. Long-term results of DES are jeopardized by a high late in-stent thrombosis rate (RR 1.2 vs bare metal stent) which is correlated to a higher late death rate (RR 1.32 vs bare metal stent) [Lagerqvist Bo et al., N Eng J Med 2007]. We present an original process of immobilization of a specific anchor on a metallic substrate which has the ability to directly immobilize drugs onto the metallic surface. It can also indirectly using specific biocompatible polymers load drugs onto the metallic surface which would be eluted overtime. The target for both systems is the cellular response involved in the restenosis and thrombosis process.This specific anchor, which is dedicated to several substrates, is developed from marine mussels gel [Waite JH et al., Science 1981]. It is currently a common basis for covalent immobilization of drugs and/or polymer systems able to sustain drug release.The first part of the project involved the development of a specific chemical anchor through an immobilization surface strategy. This dopamine anchor includes an activated ester, which is the starting point of the creation of a polymer with defined and controlled chain length. The generated polymer of N-(Acryloyloxy)succinimide has the ability to absorb a controlled and defined amount of drug; it has been linked with glucosamine to illustrate the potential of the system - glucosamine is a proteoglycan from the extracellular matrix of the arterial wall. The system has then been characterized and optimized for every parameters; unfortunately, results were not as good as expected regarding SMC proliferation.The Dopamine anchor has thus been modified to allow interactions with more chemical functions, including amino- and carboxylic functions. Finally, we used it under alkaline conditions (pH=8.5) where dopamine generated a network of polydopamine [Lee et al., Science 2007].Afterwards, we report an original functionalization of metallic surfaces with a hydrophilic, biocompatible and biodegradable cyclodextrin based polymer. This polymer acts as a reservoir for hydrophobic drugs allowing the sustained release of anti-proliferative drugs and promotes natural arterial wall healing. The polymer of CD is well-known in our research department and has already been used as an active coating onto textile for vascular devices [Martel B et al., European Polymer Journal 1995]. In this setting polydopamine was applied as a first coating layer onto the metallic surface in order to promote a strong anchorage of a cyclodextrin based polymer that was “in situ” generated from the native cyclodextrins and citric acid as a crosslinking agent through a polycondensation reaction. After optimization of the grafting process, the ability of this system to act as a drug eluting system was evaluated with paclitaxel (PTX) and simvastatine. PTX is a reference drug for current vascular drug eluting stents [Creel CJ et al., Circ Res 2000]. PTX is currently coated on vascular stents with a “polymer-free” method [Dake et al., JVIR 2011]. It is a highly lipophilic antiproliferative drug, and that “polymer free” system was compared as a positive control to our functionalized scaffold. We compared the results of our functionalized surface loaded of PTX and Simvastatin. Simvastatin is a pleiotropic molecule with targeted actions on arterial disease, inflammatory process and dyslipidemia [Balk EM et al., Am J Med. 2004]. [...]

CD154 joue un rôle important dans la pathogenèse de plusieurs maladies auto-immunes, ainsi que des dysfonctionnements vasculaires. CD154 est un membre de la famille du facteur de nécrose tumorale (tumor necrosis factor, TNF) d'une importance cruciale dans l'immunité humorale. Cependant, CD154 partage également des fonctions critiques inflammatoires grâce à son interaction avec son récepteur CD40 ou des partenaires de liaison récemment identifiés, à savoir αIIbβ3, α5β1 et αMβ2. Ces réponses impliquent CD154 comme un facteur clé dans les maladies inflammatoires chroniques, notamment les maladies auto-immunes et la thrombose. L’interruption de l'interaction de CD154 avec ses récepteurs par anticorps anti-CD154 inhibe de manière significative le développement de ces maladies, bien que des effets secondaires graves ont été associés à ces traitements. Pour remédier à ces effets indésirables, d'autres approches comme des souris defficientes (Knockout), oligonucléotide antisens et ARNi ciblage ont été développés. Ces approches ont été axées sur l’interaction de CD154 avec CD40 et ne traitent pas l'interaction de CD154 avec ses autres récepteurs. Par conséquent, il existe un besoin de nouveaux traitements pour la prévention/abrogation des maladies inflammatoires ou auto-immunes qui cibles tous les récepteurs de CD154. Notre groupe a profondément étudié l'interaction structurelle/fonctionnelle de CD154 avec ses différents récepteurs. Étant donné l'importance de la structure trimérique de CD154 pour son activité biologique, nous avons généré une forme monomère de la molécule qui peut se lier spécifiquement à un récepteur sans induire l'activation intracellulaire. Cet agent est un outil thérapeutique potentiel pour le traitement de maladies reliées au CD154, tels que les événements thrombotiques. / CD154 has emerged as an important player in the pathogenesis of several autoimmune diseases, as well as vascular dysfunctions. CD154 is a member of the tumour necrosis factor family of pivotal importance in humoral immunity. However, CD154 also shares critical inflammatory functions through its interaction with its classical CD40 receptor or recently identified binding partners, namely αIIbβ3, α5β1 and αMβ2. These responses imply CD154 as a key factor in chronic inflammatory disorders including autoimmune diseases and thrombosis. Disrupting the interaction of CD154 with its receptors through anti-CD154 Abs significantly inhibits the development of these diseases, albeit serious side effects have been associated with these therapies. To overcome these adverse effects, other approaches such as knockout, antisense oligonucleotide and siRNA targeting were developed. These approaches were focused on the CD154/CD40 interaction and did not address the interaction of CD154 with its other receptors. Thus, there is a need for novel CD154 treatments for the prevention/abrogation of inflammatory or autoimmune diseases that address all CD154 receptors. Our group profoundly investigated the structural/functional interaction of CD154 with its various receptors. Given the importance of the trimeric structure of CD154 for its biological activity, we generated monomeric form of the molecule that can specifically bind to one receptor without inducing intracellular activation. This agent represents a potential therapeutic tool for the treatment of CD154-mediated diseases such as thrombotic events.

L’élastine est la protéine de la matrice extracellulaire (MEC) responsable des propriétés de résilience et d'élasticité des tissus élastiques. Durant le vieillissement, les protéines de la MEC vasculaire sont exposées à des réactions délétères qui altèrent leurs propriétés structurales et fonctionnelles. Une des caractéristiques principales des protéines de la MEC est leur longue demi-vie, associée à un renouvellement très lent, comme pour l'élastine. Ainsi, tout dommage survenant sur l'élastine est essentiellement irréparable. La fragmentation des fibres élastiques génère des peptides d’élastine (EDP) bioactifs capables de modifier le comportement des cellules environnantes en se liant au complexe récepteur de l’élastine (CRE), composé de trois sous-unités dont la neuraminidase-1 (Neu-1), sous-unité catalytique du CRE. Cette thèse a consisté en l'étude, chez la souris, du rôle des EDP dans le développement du diabète de type 2 et dans la thrombose, deux pathologies vasculaires liées à l'âge, et s'est également focalisée sur la sous-unité Neu-1 du CRE. Dans un premier temps, nous avons montré que les EDP favorisent le développement d’une insulinorésistance et d’un diabète de type 2. Cet effet implique l'interaction de Neu-1 avec la sous-unité β du récepteur à l'insuline qui diminue son niveau de sialylation altérant ses voies de signalisation. Dans un second temps, nous avons identifié un mécanisme d'action des EDP à deux niveaux (matriciel et plaquettaire) et mis en évidence la présence d'un CRE fonctionnel dans les plaquettes régulant la thrombose. Enfin, nous avons étudié la topologie membranaire de Neu-1 par différentes approches technologiques et identifié un domaine transmembranaire potentiel jouant un rôle important pour sa dimérisation et son activité sialidase. En conclusion, les EDP sont des acteurs clefs du remodelage vasculaire physiopathologique et des pathologies vasculaires associées et de contribuer à faire avancer nos connaissances sur l'organisation de Neu-1 à la membrane plasmique. / Elastin is the extracellular matrix (ECM) protein responsible for resilience and elasticity of tissues such as arteries. During ageing, vascular ECM proteins are subjected to deleterious reactions that alter their structural and functional properties (addition reactions, proteolysis). One of the main features of ECM proteins is their long half-life, associated with a low, or even, inexistent turnover. This is the case for elastin with an estimated half-life at 70 years. Therefore, any damage occurring on elastin will be mostly irreparable. Fragmentation of elastic fibers produces bioactive elastin-derived peptides (EDP) able to modify the behavior of surrounding cells by binding to the elastin receptor complex (ERC). This receptor is composed of three subunits, among which neuraminidase-1 (Neu-1) is the catalytic subunit. The aim of this thesis was to study, in mice, the role of EDP in the development of type 2 diabetes and in thrombosis, two age-related vascular diseases, and to focus on the Neu-1 subunit of the ERC. In a first time, we have shown that EDP promote the development of insulin resistance and type 2 diabetes. This effect involves Neu-1 interaction with the β subunit of the insulin receptor and leads to its reduced sialylation level and signaling. In a second time, we have demonstrated that EDP are regulators of thrombosis. We identified a two-level mechanism (matrix and platelet) and the presence of a functional ERC in platelets. Finally, we have studied the membrane topology of Neu-1 by different biophysical, biochemical and molecular biology approaches, and identified a potential transmembrane domain involved in the dimerization and sialidase activity of Neu-1. In conclusion, this thesis consolidates the concept that EDP are crucial actors of pathophysiological vascular remodeling and related vascular diseases, and expands our knowledge on the plasma membrane organization of Neu-1.

De nombreux dispositifs médicaux implantables sont utilisés chaque jour. Le contrôle de l'interface du dispositif avec les tissus vivants environnants doit encore être amélioré. De nombreux dispositifs médicaux implantés dans le corps sont le siège d’une ou plusieurs complications graves, telles que l'infection ou la thrombose. C’est notamment le cas des cathéters intraveineux. Dans ce contexte, nous avons cherché à développer une stratégie permettant de réduire les complications associées à leur utilisation, via l’immobilisation covalente de polymères sur les matériaux utilisés en implantation (polyuréthane). La réactivité des uréthanes a d’abord été étudiée, permettant d’identifier la réaction de transcarbamoylation comme outil efficace de modification des uréthanes et polyuréthanes en conditions douces. La réaction entre des poly(éthylène glycol) et la surface de polyuréthane, catalysée par des bases, a permis de rendre les surfaces de PU hydrophiles. Les conditions de modification ont été optimisées. Les surfaces ont été analysées: angle de contact, spectrométrie infrarouge, XPS et TOF-SIMS. Les surfaces modifiées ont montrées d’excellentes propriétés antiadhésives avec une diminution significative de l’adsorption protéique, de l’adhésion de cellules, de plaquettes et de bactéries. Les propriétés des surfaces modifiées ont été évaluées et comparées à d’autres systèmes. Cette stratégie est prometteuse pour la modification en une étape de surfaces de polyuréthane. Les tests in vitro montrent le potentiel de cette modification de surface pour obtenir un polyuréthane ayant une biocompatibilité accrue. / Many implantable medical devices (stents, catheters, cardiac valves…) are used everyday in many domains. The control of the interface between the medical device and the surrounding tissue is still to be improved. Many implanted devices are facing serious complications following implantation such as infections or thrombosis. These problematics are especially present for intravenous catheters used to administrate drugs. In this context, we investigated a way to strongly limit the problematics associated with their implantation, by covalently binding polymers at the surface, to reduce protein adsorption and cell adhesion on the materials used in implantation (polyurethane). The reactivity of urethanes was first studied, it allowed identifying the transcarbamoylation reaction as an efficient tool to modify urethanes and polyurethanes in soft reaction conditions. The reaction of poly (ethylene glycol) and the polyurethane surface, catalyzed by bases, allowed us to get hydrophilic polyurethane surfaces. Modification conditions were optimized to obtain a good covering of the surface with PEG. Surfaces were analyzed: contact angle, profilometry, infrared spectroscopy, XPS and TOF-SIMS. Modified surfaces showed excellent antiadhesive properties with a strong reduction of protein adsorption, cell and bacterial adhesion. The properties of modified surfaces were evaluated and compared to other systems. This strategy of modification is promising to allow one step modification of polyurethane surfaces. In vitro tests show the potential of this surface modification technique to obtain a polyurethane with enhance biocompatibility.

Thrombingenerierung bei Patienten mit Lungenkarzinom Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades Dr. med an der Medizinischen Fakultät der Universität Leipzig eingereicht von: Philipp Sinn geb. am 03.11.1985 in Kaltenkirchen angefertigt in der Abteilung Pneumologie; Department für Innere Medizin, Neurologie und Dermatologie am Universitätsklinikum Leipzig Betreuer: Prof. Dr. Hans-Jürgen Seyfarth Ko-Betreuer: Prof. Dr. Sirak Petros Beschluss über die Verleihung des Doktorgrades vom:   Bibliographische Beschreibung Sinn, Philipp Thrombingenerierung bei Patienten mit Lungenkarzinom Universität Leipzig, Dissertation 86 S., 49 Lit., 24 Abb., 23 Tab. Referat: Thrombembolische Komplikationen sind bei onkologischen Patienten allgemein und bei Pati-enten mit Lungenkarzinom im Besonderen eine häufige Komplikation. Das Phänomen einer tumorassozierten Thrombose ist in der Medizin schon lange als Trousseau-Syndrom bekannt. Die Interaktion zwischen Tumorerkrankung und Hämostase ist Gegenstand intensiver medi-zinischer Forschung. Die Expression von tissue factor und die Freisetzung von prokoagulatori-schen Mikropartikeln durch den Tumor scheinen hier von herausragender Bedeutung zu sein. Tissue factor ist im zellbasierten Gerinnungsmodell der Ausgangspunkt der Koagulation und die Generierung von Thrombin ihr geschwindigkeitsbestimmender Schritt. Die Analyse der Thrombingenerierung im Plasma ist daher ein vielversprechender Ansatz, um mehr über die funktionellen Veränderungen des hämostaseologischen Gleichgewichts bei Tumorpatienten zu erfahren. In einer prospektiven Studie wurden Plasmaproben von 100 Patienten mit neu diagnostizier-tem Lungenkarzinom aquiriert und ein Thrombingenerierungsassay durchgeführt. Es erfolgte ein Vergleich mit den Werten gesunder Probanden. Dieser zeigte, dass die Thrombingene-rierung bei Patienten mit Lungenkarzinom hauptsächlich schneller abläuft als bei Gesunden. Darüber hinaus wurde eine Verlaufsbeobachtung über 12 Monate durchgeführt. Eine Assoziation zwischen den Parametern der Thrombingenerierungskurve und dem Auftreten throm-bembolischer Komplikationen im Krankheitsverlauf wurde mittels ROC-Analyse geprüft, oh-ne dass diese nachgewiesen werden konnte. Detailliertes Wissen über das Wechselspiel von Tumorerkrankung und Hämostase ist not-wendig, um in Zukunft jene Patienten mit hohem thrombembolischen Risiko früher identifi-zieren zu können und gegebenenfalls sogar einen weiteren Ansatzpunkt zu haben, für die Eindämmung der Tumorerkrankung.

La sévérité potentielle de la thrombose veineuse superficielle (TVS) des membres inférieurs a récemment été documentée par des études réalisées en soins secondaires et tertiaires. Son épidémiologie reste cependant inconnue en soins primaires. Le premier objectif de ce travail était de mesurer la prévalence de la TVS en soins primaires, ainsi que le taux d'évènements thromboemboliques concomitants au moment du diagnostic. Pour y répondre, un réseau de recherche collaborative entre médecins généralistes et médecins vasculaires de la région stéphanoise a été mis en place. Une étude transversale descriptive a été réalisée au sein de ce réseau pendant un an. La prévalence annuelle de la TVS a été mesurée à 0,64 pour mille habitants. Au moment du diagnostic, 24,6% des TVS étaient associées à une thrombose veineuse profonde symptomatique et 4,7% à une embolie pulmonaire symptomatique. Une seconde étude a recherché une variation saisonnière de la fréquence de la TVS en analysant les données individuelles de trois études aux designs différents ; l'étude STENOX, l'étude POST et l'étude STEPH. Une variation significative n'a été retrouvée que dans l'étude POST, et les peak-to-low ratios étaient inférieurs à 1,2 dans les trois études. Ainsi, si une variation existe, celle-ci parait être de faible envergure, sans conséquence sur la pratique et la recherche / The potential severity of superficial vein thrombosis (SVT) of the lower limbs has recently been shown by studies perfomed in secondary and tertiary care. The epidemiology of SVT remains unknown in primary care. The first objective of this study was to measure the prevalence of SVT in primary care, and the rate of concomitant thromboembolic events at diagnosis. A collaborative research network between general practitioners and vascular physicians from Saint-Etienne has been set up. A cross-sectional study has been conducted within this network during one year. The annual prevalence of SVT was measured to 0.64 per thousand inhabitants. At diagnosis, 24.6% of SVT were associated with symptomatic deep vein thrombosis and 4.7% with symptomatic pulmonary embolism. A second study was looking for a seasonal variation of SVT frequency by analyzing individual data from three studies with different designs; the STENOX study, the POST study and the STEPH study. A significant variation was found only in the POST study, and peak-to-low ratios were below 1.2 in the three studies. Thus, if other more powerful and exhaustive studies could find a seasonal variation, that variation would probably be of low magnitude and without clinical significance

Le syndrome des anticorps antiphospholipides (SAPL) est caractérisé par une atteinte auto-immune systémique à l’origine d’événements cliniques thrombotiques ou obstétricaux en présence d’anticorps antiphospholipides (aPL) persistants sur 2 prélèvements. Ce travail de thèse s’est intéressé à des manifestations cliniques et des tests biologiques dont le but est d’évaluer le risque thrombotique dans ce syndrome. En premier lieu, le risque de valvulopathie associé aux aPL chez les patients lupiques a été étudié. L’existence d’une telle association faisait l’objet d’une controverse non résolue. En ayant recours à une revue systématique de la littérature et à une méta-analyse d’études observationnelles, les fréquences des valvulopathies chez les patients lupiques en fonction de la présence ou non d’aPL ont été comparées. Le résultat principal est, qu’en présence d’aPL chez les patients lupiques, ce risque est multiplié par 3. En second lieu, la valeur pronostique sur le risque de thrombose des thromboses veineuses superficielles (TVS) a été étudiée chez les patients atteints d’un SAPL. Une étude de cohorte prospective monocentrique a montré que la présence d’un antécédent de TVS était prédictive du risque de thrombose ultérieure. D’autre part, l’apport de nouveaux marqueurs biologiques, les anticorps spécifiquement dirigés contre le domaine I de la [bêta]2-Glycoprotéine I ainsi que les paramètres de thrombinographie prenant en compte la sensibilité à la protéine C activée ont été étudiés. Les résultats montrent que ces 2 tests sont prédictifs du risque thrombotique incident. Enfin, les données de qualité de vie d’une cohorte multicentrique de patients atteints de lupus et/ou porteurs d’aPL, ont été analysées. Les résultats montrent que la présence d’un antécédent de thrombose artérielle était associée à une altération de toutes les dimensions de la qualité de vie évaluée par un auto-questionnaire généraliste (MOS-SF36) en comparaison à des patients atteints de maladie auto-immune sans ce type de thrombose. Ces résultats pourront avoir un impact significatif dans la réflexion sur l’évolution des critères de classification de ce syndrome / Antiphospholipid syndrome (APS) is characterized by an auto-immune disorder with thrombotic and obstetrical morbidity in the presence of persistant antiphospholipid antibodies (aPL). This work studied clinical manifestations and laboratory assays for the determination of thrombotic risk in APS patients. Firstly, the risk of heart valve disease associated with aPL in systemic lupus erythematosus (SLE) patients was studied. Since 20 years, data regarding this association yielded conflicting results. A systematic review and a meta-analysis were performed to compare frequencies of heart valve disease in SLE patients with and without aPL. Main result concluded that the presence of aPL in SLE patients is associated with a 3-fold increased risk for heart valve disease in comparison with SLE patients without these antibodies. Secondly, prognostic significance of superficial vein thrombosis (SVT) was studied in APS patients. A prospective cohort study was performed and showed that SVT was predictive of thrombotic events overtime in this population. Moreover, the contribution of new laboratory assays were studied (antibodies directed against the domain I of [beta]2-Glycoprotein I and thrombin generation assay assessing sensitivity to activated protein C). Results demonstrated that these two assays were predictive of thrombotic events in APS patients. Finally, health-related quality of life was assessed in a multicentric cohort study of patients with aPL and/or SLE. Results showed that the presence of a history of arterial thrombosis was significantly associated with an impairment of all dimensions scores assessed by the MOS-SF36 questionnaire in comparison with patients with an auto-immune disease but without arterial thrombosis. This work provides new insights in the field of APS and may have an impact in the evolution leading to new classification criteria for definite APS.

Les néoplasies myéloprolifératives (NMP) sont des maladies hématologiques acquises de la cellule souche hématopoiétique (CSH) caractérisées par une prolifération accrue de cellules sanguines. Une mutation activatrice de la protéine JAK2 (JAK2V617F) a été identifiée chez plus de 50% des patients. La survenue de thromboses au niveau artériel et veineux constitue une des principales complications au cours de ces maladies. Au cours d’un premier axe de travail, nous avons souhaité étudier les conséquences sur la physiopathologie de la thrombose de la présence de la mutation JAK2V617F dans les cellules endothéliales (CE). Utilisant deux approches complémentaires, in vitro avec l’utilisation de cellules endothéliales veineuses, et in vivo avec l’utilisation d’un modèle murin permettant la présence de la mutation JAK2V617F dans le compartiment endothélial, nous avons démontré que la présence de CE JAKV617F favorisait la survenue de thrombose. Cette augmentation de la survenue de thrombose était médiée par une augmentation de l’adhésion des leucocytes au niveau des CE JAK2V617F, secondaire à une augmentation d’expression de P-Sélectine à leur surface. Ce travail a permis de mettre en évidence un nouveau mécanisme de la physiopathologie de la thrombose au cours des NMP JAK2V617F. Au cours d’un second axe de travail, nous avons étudié les polynucléaires neutrophiles (PNN) et le phénomène de NETose (formation de neutrophil extracellular traps ou NET) au cours des NMP. Nous avons démontré que la formation de NET était augmentée dans une cohorte de patients avec NMP, tout comme des marqueurs indirects de NETose (ADN plasmatique, MPO-ADN plasmatique). Nous avons mis en évidence que les taux de MPO-ADN plasmatique étaient plus élevés chez les patients avec antécédents de thrombose par rapport aux patients sans. Nous avons confirmé ces résultats à l’aide de deux modèles murins différents dans lesquels nous avons également retrouvé une formation de NET augmentée. Nous avons mis en évidence que cette formation de NET participait à la physiopathologie de la thrombose, l’administration de DNAse entraînant une réduction de la survenue de thrombose. Enfin, nous avons démontré que les plaquettes JAK2V617F stimulaient la production de NET par les PNN JAK2V617F, suggérant une collaboration de ces deux types cellulaires au cours de la physiopathologie de la thrombose des NMP. / Myeloproliferative neoplasms (MPN) are acquired hematologic diseases of the hematopoietic stem cell (HSC) characterized by blood cell proliferation. An activating mutation of the protein JAK2 (JAK2V617F) has been identified in more than 50% of patients. The occurrence of arterial and venous thrombosis is one of the main complications during these diseases. We first studied the consequences of the presence of the JAK2V617F mutation in endothelial cells (EC) on the physiopathology of thrombosis. We used two complementary approaches, in vitro with the use of human venous endothelial cells, and in vivo with the use of a mouse model allowing the presence of the JAK2V617F mutation only in the endothelial compartment: the PDGFb-iCreERT2;JAK2V617F/WT model. We first observed that PDGFbiCreERT2; JAK2V617F/WT mice displayed a higher propensity for thrombosis. This increased thrombus formation was mediated by an increased leukocyte adhesion in presence of JAK2V617F EC, secondary to an increase in P-Selectin expression at their surface. This work made it possible to highlight a new mechanism of the physiopathology of thrombosis during JAK2V617F MPN. Then we studied neutrophils and the phenomenon of NETosis (formation of neutrophil extracellular traps or NET) during MPN. We demonstrated that NET formation was increased in a cohort of patients with MPN, such as indirect markers of NETosis (plasmatic DNA and MPO-DNA). We found that plasma MPO-DNA levels were higher in patients with a history of thrombosis compared to patients without. We confirmed these results using two different mouse models in which we also found increased NET formation. We found that NET formation was involved in the physiopathology of thrombosis, as DNAse administration resulted in a reduction of thrombosis occurrence. Finally, we demonstrated that JAK2V617F platelets stimulated NET formation by JAK2V617F neutrophils, suggesting collaboration of these two cell types during the physiopathology of thrombosis during MPN.

La maladie veineuse thromboembolique (MVTE) est un problème de santé publique (plus de 100000 cas par an en France). Elle regroupe deux entités cliniques : la thrombose veineuse profonde (TVP) des membres inférieurs et l’embolie pulmonaire (EP). La TVP correspond à la formation inadaptée d’un thrombus veineux (appelé aussi caillot sanguin) dans les veines profondes (poplitées, fémorales, iliaques). Un thrombus est principalement constitué de globules rouges et de plaquettes dans un réseau de fibrine. La complication majeure d’une TVP est la survenue d’une EP, c’est-à-dire que le thrombus s’est détaché de la paroi veineuse, ou s’est fragmenté, et est entraîné par la circulation sanguine jusqu’à une artère pulmonaire. Cette complication a un taux de mortalité assez élevée autour de 10000 à 20000 cas mortels par an en France. La survenue d’une TVP est multifactorielle associant des facteurs génétiques et acquis pouvant être répartis en trois catégories : la stase veineuse, l’altération de la paroi d’une veine et une hypercoagulabilité. En analysant la structure du thrombus, notre projet vise à identifier le facteur principal responsable de la TVP et à évaluer le risque d’EP. Pour caractériser sa structure, nous disposons de deux modes d’imagerie acoustique : l’échographie et l’élastographie (carte de dureté). Nous proposons d’extraire des descripteurs de ces images acoustiques par deux approches, l’une basée sur les ondelettes (le scattering operator) et l’autre sur les statistiques d’ordre supérieur (les multicorrélations). Ces descripteurs sont ensuite analysées par diverses techniques de classification (analyse en composantes principales, k-moyennes, classification spectrale) pour retrouver la cause principale des TVP ou la présence d’EP. / Venous thromboembolism (VTE) is an important public health issue (over 100000 individuals in France per year). VTE is a combination of a deep venous thrombosis (DVT) and a pulmonary embolism (PE). DVT is an inappropriate formation of a thrombus (also called blood clot) in one of the deep veins of the body, usually in the leg (popliteal, femoral, iliac). There are mainly three components in a thrombus: platelets, red blood cells and a mesh of fibrins. The main complication of a DVT is a pulmonary embolism (PE) which occurs when a thrombus breaks loose and travels to the lungs. PE affects an estimated 10000 - 20 000 individuals just in France per year. Three physiopathological mechanisms cancontribute, isolated or combined, to the development of a DVT: venous stasis, endothelial injury and hypercoagulability. Our project is aiming to relate the thrombus structure, its main triggering factor and the risk of a PE. To characterize the thrombus structure, we are collecting ultrasonography (echogenicity) and elastography (stiffness) of human thrombus. We propose to extract features from these to kind of ultrasound images using two approaches: one basedon wavelets (the scattering operator) and another based on high order statistics (multicorrelations). Then, the obtained features are analysed using several classification technics (principal component analysis, k-means, spectral clustering) to find the main cause of the DVT or the presence of PE.

Es wurde ein zweistufiger, indirekter enzymatischer Assay (Fibrinolytische-Kapazität, FC) in zwei Varianten (basal, aktiviert) vorgestellt, der summarisch Störungen der Fibrinolyse erfasst, da in ihn die Gesamtaktivität der Aktivatoren und Inhibitoren des Plasmas einfließt. In der ersten Stufe wird Plasma Urokinase zugeführt, welche mit Plasminogenaktivatorinhibitoren interagiert. Die noch freie Urokinase aktiviert Plasminogen zu Plasmin. Die plasmatischen Antiplasmine, hauptsächlich alpha 2-Antiplasmin, werden oxidativ mit Taurin-Chloramin inaktiviert. Schließlich wird die resultierende Plasminmenge mit einem chromogenen Substrat quantifiziert. In einer zweiten Variante wird die kontaktphasenabhängige Fibrinolyse vorher sehr potent mit Dextransulfat stimuliert. Zur Validierung wurde der Einfluss von PAI-1, Fibrinogen und Plasminogen untersucht. Störgrößen wie Antioxidantien, parenterale Antikoagulantien, Phenprocoumon, Aprotinin, Tranexamsäure, Thrombozyten und Bilirubin wurden ebenfalls untersucht. Zusätzlich wurde der Test anhand eines Normal-, Thrombose- und Schwangerenkollektives sowie zweier kleiner Kollektive (Schwangere und Patienten unter oraler Antikoagulation) im Zeitverlauf untersucht. Beide FC-Varianten bilden dabei die prothrombotischen Faktoren unterschiedlich ab. In der Regressionsanalyse reagiert die basale FC eher auf Veränderungen der PAI-1- und Plasminogenkonzentrationen, die aktivierte FC eher auf Plasminogen und Thrombose. Thrombose wird durch die aktivierte FC besser als durch die basale FC diagnostiziert (beta-Koeffizienten für Thrombose -0,12 vs. -0,26, Zusammenhangsmaß Eta² von FC und Thrombose 5,6% vs. 9,9%, Entscheidungsgrenze (Cut-Off) für Thrombose 33,0% vs. 66,2% für basale bzw. aktivierte FC). Beide FC-Varianten besitzen ähnliche Sensitivität, Spezifität, prädiktive Werte und relative Risikos für Thrombose bei FC-Werten unterhalb der Entscheidungsgrenze. Die Thromboseerkennbarkeit ist für beide Varianten gleichwertig bei einer Übereinstimmung untereinander von 61,3% (Cohen-Kappa-Koeffizient). Bei der Abklärung einer akuten Thrombose ist dieser Fibrinolyse-Globaltest in der Lage, Ursachen innerhalb des fibrinolytischen Systems zu erkennen. / A two-step indirect enzymatic assay (fibrinolytic capacity, FC) was presented in two variations (basal, activated) detecting the total fibrinolytic disturbances by its ability to assess the entire plasmatic activity of activators and inhibitors. In the first step urokinase is added to plasma, which interacts with plasminogen-activator-inhibitors. The remaining urokinase activated plasminogen to plasmin. The plasmatic antiplasmines, mainly alpha 2-antiplasmine were oxidative inhibited with taurine-chloramine. Finally the resulting amount of plasmin was quantified using a chromogenic substrate. In a second variation the contact-phase fibrinolysis was highly stimulated with dextran-sulfate. The influence of PAI-1, fibrinogen and plasminogen were analysed including disturbing substances such as antioxidants, parenteral anticoagulants, phenprocoumon, aprotinine, tranexamic acid, platelets and bilirubine. In addition, validation was performed including healthy individuals, patients with thrombosis and pregnant women and two small cohorts (pregnant women and patients under oral anticoagulation) over time. The prothrombotic factors were differently represented by the two FC-variations. In the regression analysis the basal FC reacted predominantly to alterations in the concentration of PAI-1 and plasminogen. In contrast the activated FC was more likely affected by plasminogen and thrombosis. The activated FC was more sensitive in the detection of thrombosis than the basal FC (with a beta-coefficient for thrombosis -0,12 vs. -0,26, a coefficient of strength of association eta² from FC with thrombosis 5,6% vs. 9,9% and a cut-off for thrombosis 33,0% vs. 66,2% for basal and activated FC respectively). Below these cut-offs both FC-variations had equal sensitivity, specificity, predictive values and relative risks in the detection of thrombosis by FC-values. The ability to detect thrombosis were equally with a correspondence of 61,3% (Cohen-Kappa-coefficient). This fibrinolytic global-test is able to identify the underlying cause within the fibrinolytic system for the a clarification of acute thrombosis.