O gênero Stenotrophomonas inclui doze espécies de bactérias Gram- negativas, não fermentadoras, que podem ser encontradas no ambiente. Até o presente, S. maltophilia é a única espécie com linhagens que são patógenos oportunistas em seres humanos. Essa espécie tem ganhado importância clínica por estar envolvida em um crescente número de infecções em pacientes imunodeprimidos e em UTI neonatais, apresentando altas taxas de morbimortalidade. Isolados ambientais e clínicos de S. maltophilia compartilham 85% de homologia genômica, podendo ser a diferença uma consequência da adaptação da bactéria aos diferentes nichos ecológicos em que é encontrada. Embora infecções e/ou colonizações por S. maltophilia aconteçam principalmente em ambiente nosocomial, diversos estudos têm mostrado um aumento do número de infecções de origem comunitária. Neste estudo, isolados nosocomiais e linhagens clínicas de S. maltophilia foram fenotipados e comparados quanto ao seu perfil filogenético por Multilocus Sequence Typing (MLST). Na análise por MLST utilizaram-se os genes atpD, gapA, guaA, nuoD, ppsA, recA e rpoA, por serem genes constitutivos. O perfil filogenético mostrou alta variabilidade clonal, provavelmente refletindo o processo de adaptação de S. maltophilia ambientais a outros habitats. Verificou-se que dois subgrupos de isolados clínicos de S. maltophilia com grande homogeneidade filogenética apresentam recombinação intergrupos, indicando alta permissividade à transferência horizontal de informação genética, envolvida na resistência a antibióticos e na expressão de fatores de virulência. Mais ainda, para a maioria das amostras clínicas aqui estudadas, inferências filogenéticas podem ser feitas apenas com o uso do gene ppsA. Portanto, o sequenciamento de apenas um fragmento específico para esse gene seria suficiente, em muitos casos, para determinar se a infecção por S. maltophilia foi causada por cepa já presente no ambiente nosocomial ou por bactérias de origem comunitária introduzidas nesse ambiente pela circulação de pessoas e materiais. Finalmente, foi possível mostrar que até mesmo isolados e linhagens clínicas filogeneticamente próximos não compartilham similaridade de perfil metabólico, o que indica sua origem comunitária / The genus Stenotrophomonas comprises twelve species of Gram- negative and non-fermentative bacteria, which can be found in the environment. The species S. maltophilia is the only one, until the present, that includes opportunistic pathogenic strains in humans. S. maltophilia gained clinical importance by being involved in an increasing number of infections in immunocompromissed patients and in NICUs, with high rates of morbidity and mortality. Environmental and clinical isolates of S. maltophilia share around 85% of genomic homology and this difference may be a consequence of adaptation to the different ecological niches where S. maltophilia can be found. Although infection and/or colonization by S. maltophilia occur mainly in the nosocomial environment, several studies have shown a growing number of community-acquired infections. In this study, nosocomial isolates and clinical strains of S. maltophilia were phenotyped and their phylogenetic profiles compared by using Multilocus Sequence Typing (MLST). In order to accomplish the MLST analysis the constitutive genes atpD, gapA, guaA, nuoD, ppsA, recA and rpoA were used. The resultant global phylogenetic profile showed high clonal variability, what correlates with the adaptability process of environmental S. maltophilia to other habitats. It was found that two clinical isolates subgroups of S. maltophilia with great phylogenetic homogeneity present intergroup recombination indicating the high permittivity to horizontal gene transfer, a mechanism involved in the acquisition of antibiotic resistance and expression of virulence factors. Moreover, for most of the clinical samples studied here, phylogenetic inferences can be made with the use of the gene ppsA only. Therefore, the sequencing of just one specific fragment of this gene would allow, in many cases, to determine whether the infection with S. maltophilia ? ? was caused by a strain already present in the nosocomial environment, or by bacteria introduced from the community in this environmental through the movement of people and materials. Finally, phenotyping data showed that even closely phylogenetic related nosocomial isolates and clinical strains do not share the same metabolic profile, thus indicating their community- acquired origin

Orientador: Mara Corrêa Lelles Nogueira / Banca: Alessandra Vidotto / Banca: Fátima Pereira de Souza / Resumo: Acinetobacter baumannii é frequentemente encontrado em infecções hospitalares, ocasionando pneumonia associada à ventilação, bacteremia, infecções de trato urinário e meningite secundária. Nos últimos anos, o uso extensivo de antimicrobianos em hospitais contribuiu para o aumento e emergência de cepas resistentes, incluindo os carbapenêmicos, os principais recomendados no tratamento. Assim, os aminoglicosídeos ganham importância como opção terapêutica. A resistência a estes antimicrobianos é decorrente, principalmente, da produção de enzimas modificadoras de aminoglicosídeos (AMEs) e de enzimas 16S rRNA Metilases. No Brasil, informações sobre o perfil de suscetibilidade e genes que codificam estas enzimas são escassas. Assim, é fundamental a identificação de mecanismos de resistência e reservatórios potenciais, bem como realizar comparação de isolados para controlar a disseminação de A. baumannii no ambiente hospitalar. O presente estudo teve como objetivos avaliar e comparar o perfil de suscetibilidade aos antimicrobianos, genes de enzimas modificadoras de aminoglicosídeos (AMEs), genes de enzimas 16S rRNA Metilases e similaridade genética entre isolados de A. baumannii com importância clínica no Hospital de Base (HB) de São José do Rio Preto, SP. Além disso, estes resultados foram comparados com um estudo anterior realizado no mesmo hospital. Foram avaliados 32 isolados coletados no período entre dezembro de 2013 a maio de 2014. A identificação da espécie foi realizada por metodologias automatizadas e confirmada por Duplex-PCR. Os testes de suscetibilidade aos antimicrobianos foram resultantes de teste automatizado de microdiluição e disco-difusão, para aminoglicosídeos Amicacina (AK), Gentamicina (CN), Tobramicina (TOB) e Canamicina (CAN), de acordo com o CLSI, 2014 e FDA, 2013. Primers específicos e PCRmultiplex foram usados para a detecção dos genes... / Abstract: Acinetobacter baumannii is found in nosocomial infections, causing ventilator-associated pneumonia, bacteremia, urinary tract infections and secondary meningitis. In recent years, the extensive use of antibiotics in hospitals has contributed to the rise and emergence of A. baumannii strains resistant to a wide range of antimicrobials, including carbapenems, main antibiotics recommended on treatment. In this context, aminoglycosides gain importance as therapeutic options. Resistance to aminoglycosides is mainly due to the Aminoglycoside Modifying Enzymes (AMEs) and 16S rRNA Methylases production. In Brazil, high infection rates to carbapenem-resistant A. baumannii are observated, however information about aminoglycoside susceptibility profile and occurance of this genes are scarce. Thus, it is essential to identify resistance mechanisms and potential reservoirs, as well as perform comparison of isolates to control the spread of A. baumannii in the hospital environment. This study aimed to evaluate and compare the antimicrobial susceptibility profile, genes of aminoglycoside modifying enzymes and 16S rRNA Methylases and genetic similarity among A. baumannii isolates with clinical importance at Hospital de Base (HB) in São José do Rio Preto, SP. Additionally, the results were compared to another previous study achieved in the same hospital. 32 isolates collected between December 2013 and May 2014 were evaluated. Specie identification was performed using automated methodology and confirmed by Duplex- PCR. The susceptibility tests were the result of automated and disc-diffusion tests - for aminoglycosides Amikacin (AK), Gentamicin (CN), Tobramycin (TOB) and Kanamycin (K) - according to CLSI, 2014 and FDA, 2013. Specific primers and Multiplex-PCR were used in AMEs' and 16S rRNA Methylases' genes detection and primers REP1-REP2 were used in molecular typing by REP-PCR. All the isolates of this study... / Mestre

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Streptococcus pneumoniae é um importante agente etiológico de infecções invasivas e não invasivas, incluindo meningite, pneumonia e otite média. A cápsula polissacarídica é o principal fator de virulência desse microrganismo, sendo também considerada um importante marcador em estudos epidemiológicos. Dentre os mais de 90 tipos capsulares conhecidos, o sorotipo 14 se destaca pela prevalência elevada em várias regiões, inclusive no Brasil. A avaliação da diversidade genética desse microrganismo também inclui a aplicação de métodos moleculares, como PFGE e MLST. Entretanto, essas metodologias são relativamente onerosas, consomem muito tempo e os resultados obtidos com a técnica de PFGE são de difícil comparação entre diferentes laboratórios. A técnica de análise do polimorfismo numérico de segmentos repetitivos em múltiplos loci [MLVA, do inglês Multiple Loci VTNR (Variable-Number Tandem Repeat) Analysis] se apresenta como uma alternativa, embora ainda necessite de padronização e avaliação mais ampla para a espécie em questão. No presente estudo, 60 amostras de Streptococcus pneumoniae pertencentes ao sorotipo 14, isoladas de diversas fontes clínicas, em diferentes locais e períodos de tempo, foram caracterizadas pelas técnicas de MLVA (baseada na análise de 18 loci distintos), MLST, PFGE e tipagem do gene pspA. O gene pspA2 predominou entre as amostras analisadas, seguido pelo gene pspA1. Os tipos de MLVA, perfis de PFGE, e STs encontrados apresentaram resultados, em geral, concordantes, indicando o elevado poder discriminatório da versão da técnica de MLVA empregada. Cinco complexos clonais (CC) de MLVA e cinco singletons puderam ser definidos. O CC de MLVA denominado de L7 foi o predominante, compreendendo 36,7% da amostragem estudada. O CC L7 mostrou-se relacionado com genes pspA da família 2, com o CC1 de MLST, com o CC Pen14-H de PFGE, e com a não susceptibilidade à penicilina, Entre os complexos clonais de MLST, o CC1 foi o prevalente e incluiu predominantemente o ST156, pertencente ao clone internacional Spain9V-3. O CC L3 e o singleton L17 de MLVA apresentaram-se associados ao CC de PFGE Eri14-A, a família 1 de PspA e ao CC2 de MLST, que por sua vez também estava relacionado com o clone internacional England14-9. O CC L15 de MLVA esteve associado ao CC de PFGE Pen14-A, ao gene pspA2, aos CC3 e CC4 de MLST e ao clone internacional do PMEN Tennessee14-18. A técnica de MLVA revelou-se significativamente mais discriminatória que as técnicas de PFGE e MLST, conforme exemplificado pela detecção de 21 perfis de MLVA, 13 perfis de PFGE e cinco STs, entre as 22 amostras pertencentes ao CC de MLVA L7. Uma versão de MLVA, compreendendo um painel com os oito loci de maior poder discriminatório, pôde ser proposta a partir da análise dos resultados obtidos. Estes aspectos, aliados ao menor tempo e custo de execução, indicam que a técnica de MLVA constitui uma alternativa importante e satisfatória para uso em estudos sobre a diversidade genética de S. pneumoniae. / Streptococcus pneumoniae is a major pathogen causing invasive and non-invasive diseases in humans, including meningitis, pneumonia and otitis media. The polysaccharide capsule of this microorganism is considered a major virulence factor and an important marker for epidemiological studies. More than 90 pneumococcal capsular serotypes are recognized, and serotype 14 is highly prevalent in many regions, including Brazil. Genotyping methods, such as PFGE and MLST, are essential to evaluate genetic diversity of this bacterium. However, these methods are expensive, time-consuming and results from different laboratories are difficult to compare. Multiple Loci VTNR (Variable-Number Tandem Repeat) Analysis (MLVA) appears as an alternative, despite the fact that standardization and wide evaluation for application to this species is still required. In the present study, a total of 60 S. pneumoniae isolates belonging to serotype 14, isolated from different sources, regions and periods of time, were analyzed by MLVA (based on the analysis of 18 distinct loci), MLST, PFGE and pspA typing methods. Gene pspA2 was the predominant, followed by pspA1. Overall, the results of PFGE, MLST and MLVA typing were congruent, and indicated the discriminatory power of the MLVA method used. Five clonal complexes (CC) and five singletons were identified by MLVA. CC L7 was the predominant MLVA CC, comprising 36.7% of all the isolates. L7 was associated with pspA2 gene and non-susceptibility to penicillin, and it was related to MLST CC1, and to PFGE Pen14-H. CC1 was the prevalent MLST CC and included mostly ST156 that belongs to international clone (IC) Spain9V-3. Another MLVA CC, named L3, and the singleton L17 were related to PFGE CC Eri14-A, MLST CC2, and IC England14-9. MLVA CC L15 was related to PFGE Pen14-A, MLST CC3 and CC4, and IC Tennessee14-18. MLVA was found to be more discriminatory than PFGE and MLST, as exemplified by detection of 21 MLVA types, 13 PFGE profiles and 5 STs among the 22 strains belonging to L7, the predominant MLVA CC. A modified version of the MLVA method, based on the analysis of 8 loci only, is proposed. This aspect, in conjunction with reducing time and costs, indicate that MLVA represents an important and satisfactory alternative method to evaluate the genetic diversity of S. pneumoniae.

Submitted by Liliane Ferreira (ljuvencia30@gmail.com) on 2018-03-21T12:04:52Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Thaynara Gonzaga Santos - 2018.pdf: 3745794 bytes, checksum: db8d5a41bb72d586b2468abd5e6ad7b6 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2018-03-22T10:33:07Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Thaynara Gonzaga Santos - 2018.pdf: 3745794 bytes, checksum: db8d5a41bb72d586b2468abd5e6ad7b6 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2018-03-22T10:33:07Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Thaynara Gonzaga Santos - 2018.pdf: 3745794 bytes, checksum: db8d5a41bb72d586b2468abd5e6ad7b6 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2018-02-19 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Urinary tract infections (UTI) are the most prevalent bacterial infections and, in this context, E. coli is the primary an etiological agent. Virulence mechanisms participating in the process of colonization, invasion and tissue damage observed in the UTI. Phylogenetic analyses contribute to the knowledge about the ancestry of a pathogen, as well as allow for the differentiation of various microbial isolates according to the genetic similarity between them. Thus, this study aims to phylogenetic characterization of central UPEC strains isolated from patients in the municipality of Jataí-GO, as well as the comparison between the profile of virulence and antimicrobial resistance. With the completion of the study was possible to verify that one of the samples analysed, 74.42% presented to the virulence gene iucD as well as 69.77% to 44.19% for fimH, papC 20.93% and hlyA. With the phylogenetic typing showed that 3.22% of the samples analysed are proving to be belonging to the groups A and D, 4.84% of the samples analysed, belong to the filogrupo B1, filogrupo B2, 61.29% 6.45% to filogrupo F, and 20.48% not classified in any of the filogrupos searched. Between-group comparisons showed that the isolates belonging to the filogrupo, presented 100% of amplification to iucD and 50% and fimH to papC, referring to group B1 presented 66.67% virulence gene amplification iucD and 33.33% hlyA, that the filogrupo B2 presented 63.16% of fimH, 68.42% amplification to iucD 36.84% to papC, 34.21% hlyA, and that in D, 50% was observed for fimH, papC amplification and iucD and finally filogrupo F 25% presented to fimH, papC hly and 50% and to iucD. As regards culture, the samples analysed presented, resistance to gentamicin (38%), cephalothin (38%), streptomycin (51%), ciprofloxacin (51%), Chloramphenicol (29%), ceftriaxone (22%), amikacin (31%), and tetracycline (40%) and 100% the samples demonstrated susceptibility to Imipenem. In short, except for the antibiotics gentamicin and ciprofloxacin, no increase of resistance of isolates analyzed and not that there was a pattern of resistance in UPEC according to filogrupos research. / As infecções do trato urinário (ITUs) são as infecções bacterianas mais prevalentes e, nesse contexto, Escherichia coli é o principal agente etiológico. Diversos mecanismos de virulência participam no processo de colonização, invasão e lesão tecidual observados nas ITUs. As análises filogenéticas contribuem para o conhecimento a respeito da ancestralidade de um patógeno, assim como permitem a diferenciação de diversos isolados microbianos de acordo com a similaridade genética entre eles. Assim, este estudo tem por objetivo central a caracterização filogenética de cepas UPEC isoladas de pacientes no município de Jataí-GO, bem como a comparação entre o perfil de virulência e resistência aos antimicrobianos. Com a realização do estudo foi possível verificar que dentre as amostras analisadas, 74,42% apresentaram amplificação para o gene de virulência iucD, bem como 69,77% para fimH, 44,19% para papC e 20,93% para hlyA. Com a tipagem filogenética observou-se que 3,22% das amostras analisadas demonstram ser pertencentes aos grupos A e D, 4,84% das amostras analisadas, pertencem ao filogrupo B1, 61,29% ao filogrupo B2, 6,45% ao filogrupo F, e 20,48% não se classificaram em nenhum dos filogrupos pesquisados. As comparações entre grupos demonstraram que os isolados pertencentes ao filogrupo A, apresentaram 100% de amplificação para fimH e iucD e 50% para papC, os referentes ao grupo B1 apresentaram 66,67% amplificação o gene de virulência iucD e 33,33% hlyA, que o filogrupo B2 apresentou 63,16% de amplificação para fimH, 68,42% para iucD, 36,84% para papC e 34,21% para hlyA, que em D, observou-se 50% de amplificação para fimH, papC e iucD e por fim filogrupo F apresentou 25% de amplificação para fimH, papC e hly e 50% para iucD. No que se refere ao antibiograma, as amostras analisadas apresentaram, resistência à gentamicina (38%), a cefalotina (38%), estreptomicina (51%), a ciprofloxacina (51%), a cloranfenicol (29%), a ceftriaxona (22%), a amicacina (31%) e tetraciclina (40%) e 100 % das amostras demostraram susceptibilidade ao Imipenem. Em resumo, exceto para os antibióticos gentamicina e ciprofloxacina, não houve aumento da resistência dos isolados analisados e não que houve um padrão de resistência em UPEC de acordo com os filogrupos pesquisa.

O gênero Stenotrophomonas inclui doze espécies de bactérias Gram- negativas, não fermentadoras, que podem ser encontradas no ambiente. Até o presente, S. maltophilia é a única espécie com linhagens que são patógenos oportunistas em seres humanos. Essa espécie tem ganhado importância clínica por estar envolvida em um crescente número de infecções em pacientes imunodeprimidos e em UTI neonatais, apresentando altas taxas de morbimortalidade. Isolados ambientais e clínicos de S. maltophilia compartilham 85% de homologia genômica, podendo ser a diferença uma consequência da adaptação da bactéria aos diferentes nichos ecológicos em que é encontrada. Embora infecções e/ou colonizações por S. maltophilia aconteçam principalmente em ambiente nosocomial, diversos estudos têm mostrado um aumento do número de infecções de origem comunitária. Neste estudo, isolados nosocomiais e linhagens clínicas de S. maltophilia foram fenotipados e comparados quanto ao seu perfil filogenético por Multilocus Sequence Typing (MLST). Na análise por MLST utilizaram-se os genes atpD, gapA, guaA, nuoD, ppsA, recA e rpoA, por serem genes constitutivos. O perfil filogenético mostrou alta variabilidade clonal, provavelmente refletindo o processo de adaptação de S. maltophilia ambientais a outros habitats. Verificou-se que dois subgrupos de isolados clínicos de S. maltophilia com grande homogeneidade filogenética apresentam recombinação intergrupos, indicando alta permissividade à transferência horizontal de informação genética, envolvida na resistência a antibióticos e na expressão de fatores de virulência. Mais ainda, para a maioria das amostras clínicas aqui estudadas, inferências filogenéticas podem ser feitas apenas com o uso do gene ppsA. Portanto, o sequenciamento de apenas um fragmento específico para esse gene seria suficiente, em muitos casos, para determinar se a infecção por S. maltophilia foi causada por cepa já presente no ambiente nosocomial ou por bactérias de origem comunitária introduzidas nesse ambiente pela circulação de pessoas e materiais. Finalmente, foi possível mostrar que até mesmo isolados e linhagens clínicas filogeneticamente próximos não compartilham similaridade de perfil metabólico, o que indica sua origem comunitária / The genus Stenotrophomonas comprises twelve species of Gram- negative and non-fermentative bacteria, which can be found in the environment. The species S. maltophilia is the only one, until the present, that includes opportunistic pathogenic strains in humans. S. maltophilia gained clinical importance by being involved in an increasing number of infections in immunocompromissed patients and in NICUs, with high rates of morbidity and mortality. Environmental and clinical isolates of S. maltophilia share around 85% of genomic homology and this difference may be a consequence of adaptation to the different ecological niches where S. maltophilia can be found. Although infection and/or colonization by S. maltophilia occur mainly in the nosocomial environment, several studies have shown a growing number of community-acquired infections. In this study, nosocomial isolates and clinical strains of S. maltophilia were phenotyped and their phylogenetic profiles compared by using Multilocus Sequence Typing (MLST). In order to accomplish the MLST analysis the constitutive genes atpD, gapA, guaA, nuoD, ppsA, recA and rpoA were used. The resultant global phylogenetic profile showed high clonal variability, what correlates with the adaptability process of environmental S. maltophilia to other habitats. It was found that two clinical isolates subgroups of S. maltophilia with great phylogenetic homogeneity present intergroup recombination indicating the high permittivity to horizontal gene transfer, a mechanism involved in the acquisition of antibiotic resistance and expression of virulence factors. Moreover, for most of the clinical samples studied here, phylogenetic inferences can be made with the use of the gene ppsA only. Therefore, the sequencing of just one specific fragment of this gene would allow, in many cases, to determine whether the infection with S. maltophilia ? ? was caused by a strain already present in the nosocomial environment, or by bacteria introduced from the community in this environmental through the movement of people and materials. Finally, phenotyping data showed that even closely phylogenetic related nosocomial isolates and clinical strains do not share the same metabolic profile, thus indicating their community- acquired origin

A Mancha marrom é uma das principais doenças do trigo, causada pelo fitopatógeno Bipolaris sorokiniana, responsável por grandes perdas econômicas no cultivo do trigo em todo mundo. Este fungo apresenta uma grande diversidade morfológica, fisiológica e genética. O objetivo do trabalho foi utilizar marcadores moleculares e fenotípicos para avaliar a variabilidade genética em isolados monopóricos e polispóricos de Bipolaris sorokiniana de sementes de trigo oriundos do Brasil e outros países. A caracterização molecular envolveu as metodologias URP-PCR, PCR-RFLP, REP-PCR, BOX-PCR, ERIC-PCR assim como testes isoenzimáticos e de patogenicidade. A análise de patogenicidade revelou que isolados polispóricos são mais severos para as sementes que para as partes aéreas das plantas quando comparados com os monospóricos. A caracterização isoenzimática e molecular através das técnicas URP-PCR, PCR-RFLP, REP-PCR, BOX-PCR, ERIC-PCR exibiram uma grande diversidade intra-populacional. REP-PCR e ERIC-PCR revelaram maior diversidade entre os isolados, com uma similaridade inferior a 70%. No entanto, as amplificações realizadas com o BOX-PCR apresentaram um perfil com uma maior similaridade. Com os resultados obtidos a partir das amplificações com BOX-PCR um par de primers foi desenhado a partir de um fragmento comum a todos os isolados e que foi capaz de amplificar um produto único ao gênero Bipolaris sp. entre as amostras testadas. Com a realização de mais ensaios com outros microrganismos é possível que o mesmo possa ser utilizado como um marcador deste gênero. A técnica de PCR-RFLP utilizando as enzimas HaeIII, HinfI, HhaI, EcoRI e HindIII apresentaram perfis de restrição com variação no número de fragmentos e no peso molecular. Uma possível explicação para à variabilidade observada em todas as técnicas utilizadas pode ser atribuída à condição multinucleada das células de B. sorokiniana bem como a heterocariose, que pode levar a recombinação mitótica e ao polimorfismo. / The brown spot is a major disease of wheat caused by the pathogen Bipolaris sorokiniana, responsible for large economic losses in wheat cultivation worldwide. This fungus has a wide morphological, physiological and genetic diversity. The main objective of this work was to characterize monosporic and polisporic B. sorokiniana isolates of wheat seeds from Brazil and other countries. Pathogenicity tests were conducted to evaluate the feasibility of virulence genes as well as different molecular methodologies were tested as: URP-PCR, PCR-RFLP, REP-PCR, BOX-PCR, ERIC-PCR and isoenzyme patterns of the isolates. The pathogenicity assay reveals that the polysporic isolates caused a more severe disease to seeds than to aerial parts of the plants when compared to single spore isolates. Isoenzyme and molecular characterization through the URP-PCR, PCR-RFLP, REP-PCR, BOX-PCR, ERIC-PCR techniques showed a large intra-population diversity among the isolates. REP and ERIC-PCR revealed greater diversity among the isolates with a similarity below 70%. However, the amplification results using with BOX- PCR showed a highest similarity. The PCR-RFLP using HaeIII, HinfI , HhaI , EcoRI and HindIII restriction enzymes showed a profile variation between all isolates in relation to the number and molecular weight of the fragments. However the results obtained with BOX- PCR amplifications a higher similarity was obtained. With this result a primer was designed, based on a fragment common to all isolates, and the amplifications using these primers produced a unique fragment with the Bipolaris genus among others isolates tested. More phytopatogeneic isolates must be tested in order to confirme the specificity for Bipolaris sp. With the PCR-RFLP assay, using the enzymes HaeIII, HinfI, HhaI, EcoRI e HindIII, variability was observed among the restriction patterns realated to the number of fragments and molecular weight. One possible explanation for the observed variability in all techniques used may be attributed to the condition of multinucleated cells of B. sorokiniana and the heterokaryosis which can lead to mitotic recombination and polymorphis.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:30:28Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2006-11-24Bitstream added on 2014-06-13T20:00:40Z : No. of bitstreams: 1 baeza_lc_dr_arafcf.pdf: 2250737 bytes, checksum: 666c7d374ebfa4ff8507fbfbe951a4b8 (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / As dermatofitoses são processos infecciosos de pele, pêlo e unhas muito comuns no mundo inteiro. Trichophyton rubrum é o dermatófito mais freqüentemente isolado em lesões superficiais de pele e unha. Estudos envolvendo este patógeno são cada vez mais importantes devido ao aparecimento de linhagens resistentes aos medicamentos antifúngicos disponíveis no mercado e ao comportamento invasivo deste agente em pacientes com o sistema imune comprometido. Estes fatos e poucos estudos levam à necessidade de se ampliar o conhecimento sobre a biologia deste agente. Visando colaborar nesse sentido, o presente trabalho teve dois objetivos centrais: 1) Realizar a tipagem molecular de isolados clínicos de T. rubrum com e sem relação epidemiológica por RAPD (Amplificação Randômica de DNA Polimórfico) com duas seqüências randômicas diferentes (denominadas de 1 e 6), bem como a análise dos elementos repetitivos (TRS-1 e TRS-2) do espaço não transcrito (NTS) do DNA ribossomal (DNAr) e 2) Identificar transcritos envolvidos na interação deste patógeno com fonte humana de queratina, através do RDA (Análise de Diferença Representacional). A aplicação do RDA permitiu pela primeira vez a identificação de alguns transcritos expressos, provavelmente relacionados à patogênese deste microrganismo. / Dermatophytosis is common infection process which occurs in skin, hair and nails and Trichophyton rubrum is the most frequently isolated dermatophyte. Studies on this pathogen are becoming increasingly important because of frequent reports on resistant strains to antifungal drugs commercially available and the invasive behavior of these agents in immunocompromised patients. These facts, associated with few studies with this agent, indicate the need to expand the information about the fungal biology. As a contribution to this goal, the present study had two central objectives: 1) To compare different methodologies for molecular typing of clinical isolates of T. rubrum epidemiologically related and unrelated for RAPD (Randomly Amplified Polymorphic DNA) with two different random primers (denominated of 1 and 6); as well as the analysis of the repetitive elements (TRS-1 and TRS-2) of the space non-transcribed (NTS) of the ribosomal DNA (DNAr) and 2) To identify transcripts involved in the interaction of this pathogen with human keratin by RDA (Representational Difference Analysis). The application of the RDA allowed for the first time the identification of expressed transcripts during the microorganism proliferation that could be related to the T. rubrum virulence.

Made available in DSpace on 2015-12-06T23:05:50Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2005 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Objetivos: (a) Padronizar protocolos rápidos da técnica de eletroforese em campo pulsado (PFGE) para tipagem molecular de amostras clínicas de Staphylococcus aureus, Escherichia coli e Pseudomonas aeruginosa; (b) Avaliar a tipabilidade, o poder discriminatório e a reprodutibilidade entre os protocolos rápidos de PFGE versus o protocolo convencional para as amostras de S. aureus, E. coli e P. aeruginosa; (c) Analisar os resultados da tipagem molecular pela técnica do PFGE de acordo com dois critérios distintos de interpretação, os critérios de PFALLER et al. (1992) e os critérios de TENOVER et al. (1995). Métodos: Um total de 60 amostras bacterianas das seguintes espécies bacterianas foi selecionado: S. aureus (n=20), E. coli (n=20) e P. aeruginosa (n=20). Todos amostras foram isoladas da corrente sanguínea de pacientes internados no Hospital São Paulo (HSP) no período de 2000 a 2004. Quinze dos 20 isolados clínicos de cada espécie bacteriana foram selecionados de pacientes previamente caracterizados como não relacionados epidemiologicamente, pela Comissão de Controle de Infecção Hospitalar do HSP. As outras cinco amostras de cada espécie bacteriana foram classificadas como amostras bacterianas possivelmente relacionadas epidemiologicamente, provenientes de uma mesma unidade do HSP em um período de tempo igual ou inferior a três meses. Protocolos convencionais da técnica PFGE foram reproduzidos e protocolos rápidos desta mesma técnica foram padronizados, após digestão destas bactérias com as enzimas de restrição SmaI e SpeI. Os perfis moleculares foram analisados visualmente e interpretados de acordo com os critérios de Pfaller et al (1992) e Tenover et al (1995). Resultados: Os protocolos convencionais e rápidos de PFGE apresentaram resultados idênticos para tipagem das amostras clínicas de S.aureus, E. coli e P. aeruginosa. De acordo com os critérios de Pfaller et al. (1992), foram encontrados nas amostras clínicas de S. aureus, E. coli e P. aeruginosa deste estudo, 17, 13 e 7 padrões diferentes de PFGE, respectivamente. Seguindo os critérios de Tenover et al. (1995) foram encontrados 16, 11 e 6 padrões distintos de PFGE nas amostras de S. aureus, E. coli e P. aeruginosa, respectivamente. As técnicas desenvolvidas tanto pelos protocolos rápidos quanto pelos protocolos convencionais apresentaram percentual de tipabilidade e reprodutibilidade de 100%. O poder discriminatório foi de 95%, 94% e 82% para as amostras clínicas de S. aureus e E.coli e P. aeruginosa, respectivamente. Conclusões: Foram padronizados protocolos rápidos para tipagem molecular de amostras de S. aureus (42hs), E. coli (43hs) e P. aeruginosa (56hs) pela técnica de PFGE. Todos protocolos testados apresentaram excelente tipabilidade e reprodutibilidade. O poder discriminatório foi excelente para as amostras clínicas de S. aureus e E. coli, e satisfatório para as amostras de P. aeruginosa, devido a pouca diversidade clonal. Os critérios de Pfaller et al. (1992) diferenciaram melhor a presença de novos clones quando comparados aos critérios de Tenover et al. (1995). / Objectives: (a) To develop rapid protocols of pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) technique for molecular typing of clinical samples of Staphylococcus aureus, Escherichia coli and Pseudomonas aeruginosa; (b) To evaluate the typeability, the discriminatory power, and the reproducibility between rapid and conventional PFGE protocols for clinical isolates of S. aureus, E. coli and P. aeruginosa, (c) To analyze PFGE results according to two different interpretation criteria, one from Pfaller et al. (1992) and the other from Tenover et al. (1995). Methods: A total of 60 bacteria samples were selected from the following species: S. aureus (n=20), E. coli (n=20), and P. aeruginosa (n=20), isolated from bloodstream infections from patients from Hospital São Paulo (HSP). Among the 20 clinical isolates from each specie, 15 were selected from patients previously characterized by the hospital’s Infection Control Department of HSP as epidemiologically non-related. The other five isolates were characterized as possible epidemiologically related. These samples were collected from the same medical ward of HSP, in a period of time equal to or less than 3 months. The conventional PFGE protocols were reproduced, and the rapid protocols were developed, after DNA digestion with SmaI and SpeI enzymes. The molecular patterns were examined visually and interpreted according to Pfaller et al. (1992) and Tenover et al.(1995) criteria. Results: The rapid and conventional PFGE protocols presented similar results for S. aureus, E. coli, and P. aeruginosa isolates. According to Pfaller et al. (1992), a total of 17, 13, and 7 distinct PFGE patterns were identified for S. aureus, E. coli, and P. aeruginosa, respectively. On the other hand, by Tenover criteria, a total of 16, 11 and 6 distinct PFGE patterns were found for S. aureus, E. coli and P. aeruginosa, respectively. All protocols tested presented 100% of reproducibility and typeability. The discriminatory power was 95%, 94%, and 82% for S. aureus, E. coli, and P. aeruginosa, respectively. Conclusions: Rapid PFGE protocols were developed for S. aureus (42hs), E. coli (43hs) and P. aeruginosa (56hs), and all of them presented excellent reproducibility and typeability. The discriminatory power was excellent for clinical isolates of S. aureus and E. coli, and satisfactory for P. aeruginosa; probably because of the low clonal diversity of this specie identified in this study. Compared to Tenover et al. (1995) criteria, Pfaller et al. (1992) could better differentiate the presence of new bacterial clones. / FAPESP: 2006/57700-0 / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Orientador: Maria José Soares Mendes Giannini / Banca: Clarice Queico Fujimura Leite / Banca: Celia Maria de Almeida Soares / Banca: Paulo Inácio da Costa / Banca: Mário Hiroyuki Hirata / Resumo: As dermatofitoses são processos infecciosos de pele, pêlo e unhas muito comuns no mundo inteiro. Trichophyton rubrum é o dermatófito mais freqüentemente isolado em lesões superficiais de pele e unha. Estudos envolvendo este patógeno são cada vez mais importantes devido ao aparecimento de linhagens resistentes aos medicamentos antifúngicos disponíveis no mercado e ao comportamento invasivo deste agente em pacientes com o sistema imune comprometido. Estes fatos e poucos estudos levam à necessidade de se ampliar o conhecimento sobre a biologia deste agente. Visando colaborar nesse sentido, o presente trabalho teve dois objetivos centrais: 1) Realizar a tipagem molecular de isolados clínicos de T. rubrum com e sem relação epidemiológica por RAPD (Amplificação Randômica de DNA Polimórfico) com duas seqüências randômicas diferentes (denominadas de 1 e 6), bem como a análise dos elementos repetitivos (TRS-1 e TRS-2) do espaço não transcrito (NTS) do DNA ribossomal (DNAr) e 2) Identificar transcritos envolvidos na interação deste patógeno com fonte humana de queratina, através do RDA (Análise de Diferença Representacional). A aplicação do RDA permitiu pela primeira vez a identificação de alguns transcritos expressos, provavelmente relacionados à patogênese deste microrganismo. / Abstract: Dermatophytosis is common infection process which occurs in skin, hair and nails and Trichophyton rubrum is the most frequently isolated dermatophyte. Studies on this pathogen are becoming increasingly important because of frequent reports on resistant strains to antifungal drugs commercially available and the invasive behavior of these agents in immunocompromised patients. These facts, associated with few studies with this agent, indicate the need to expand the information about the fungal biology. As a contribution to this goal, the present study had two central objectives: 1) To compare different methodologies for molecular typing of clinical isolates of T. rubrum epidemiologically related and unrelated for RAPD (Randomly Amplified Polymorphic DNA) with two different random primers (denominated of 1 and 6); as well as the analysis of the repetitive elements (TRS-1 and TRS-2) of the space non-transcribed (NTS) of the ribosomal DNA (DNAr) and 2) To identify transcripts involved in the interaction of this pathogen with human keratin by RDA (Representational Difference Analysis). The application of the RDA allowed for the first time the identification of expressed transcripts during the microorganism proliferation that could be related to the T. rubrum virulence. / Doutor

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:49:41Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-09-30 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / A metodologia do “Multilocus Sequence Typing (MLST)” tornou-se uma ferramenta importante para tipagem molecular para C. albicans porque esta metodologia pode caracterizar grande número de isolados rapidamente e está isenta da interpretação subjetiva de padrões de bandas em géis de eletroforese. Este método é muito útil no entendimento da filogenia e epidemiologia de cepas de C. albicans recuperadas de infecções fúngicas invasivas. Objetivos: 1) aplicar as metodologias de MLST e Tipagem ABC para isolados de C. albicans recuperados de infecções de corrente sanguínea em hospitais terciários no Brasil e 2) determinar se cepas indistinguíveis ou diferentes foram responsáveis pelos episódios de candidemia persistente ou candidemia recorrente em isolados sequenciais de mesmo paciente. Material e Métodos: Nós aplicamos a metodologia do MLST e Tipagem ABC em isolados de C. albicans de 61 pacientes com candidemia coletados durante um estudo multicêntrico realizado em 11 hospitais públicos terciários de 9 cidades brasileiras. Também foram avaliados os isolados sequenciais de 8 pacientes com candemia persistente ou recorrente. Candidemia persistente foi definido como um episódio de fungemia com duas ou mais culturas positivas para C. albicans, em 2 ou mais dias diferentes, a despeito da contínua terapia antifúngica adotada. Candidemia recorrente foi definida como um episódio de candidemia ocorrendo ao menos 1 mês após o episódio incidente e a negativação de duas hemoculturas sequenciais após introdução da terapia antifúngica, envolvendo a mesma espécie de Candida. Resultados: Um total de 48 únicos “diploid sequence types (DSTs)” foram observados, incluindo 10 novos genótipos e 32 novos DSTs. DST 69 foi o mais comum entre os nossos isolados. Isolados clado 1 responderam a 56% da nossa coleção. O clado 3 e clado 8 foram os clados com maior número de isolados depois de clado 1, ambos respondendo por 10% das amostras. O clado 9 e clado 17 foram responsáveis por 6,5% dos isolados cada um. Isolados clado 12 responderam por 5%. Foi isolada uma única cepa (1,5%) do clado 2, clado 4, clado 16 e um isolado categorizado como “solitário”. Para Tipagem ABC, 82% dos isolados foram classificados como tipo A, seguido por tipo B com 16,5% e tipo C com 1,5%. Quanto aos pacientes com candidemia persistente ou recorrente, para todos os pacientes exceto um, verificou-se a permanência dos mesmos DSTs encontrados entre a primeira e última amostra coletada. Um único paciente com coletas sequenciais pelo período de 10 dias apresentou 3 cepas distintas discriminadas pelo MLST. Uma destas 3 cepas foi a única representante do clado 2 em nosso estudo. Conclusão: Mais de 50% dos isolados deste estudo apresentaram novos DSTs, predominando o clado 1 em 56% das amostras. Para a Tipagem ABC, 82% dos isolados foram do tipo A. Este é o primeiro estudo de nosso conhecimento a descrever infecção de corrente sanguínea por 3 cepas distintas de C. albicans documentadas no período de 10 dias. / The DNA sequence-based genotyping technique multilocus sequence typing (MLST) has emerged as an alternative typing tool for C. albicans because can characterize large numbers of isolates rapidly, and does not require the subjective interpretation of banding patterns. This methodology is a very useful tool in understanding the phylogenetics and epidemiology of C. albicans strains from invasive candidiasis. Objective: Our goal was 1) to apply MLST and ABC typing to C. albicans strains recovered from bloodstream infection from public tertiary care hospitals in Brazil and 2) determine whether indistinguishable or different strains were responsible for persistent or recurrent fungemia by performing MLST and ABC typing on sequential C. albicans isolates from the same patient. Methods: We applied MLST and ABC typing, which is based on the presence or absence of an intron in the 25S rDNA region, to C. albicans strains from 61 patients with candidemia collected during a multicenter surveillance study in 11 public tertiary care hospitals, representative of the public health system of 9 of the largest cities in Brazil. We also analyzed C. albicans strains from 8 patients with persistent or recurrent candidemia. Persistent candidemia was defined as two or more blood cultures positive for C. albicans on 2 or more separate days. Recurrent candidemia was defined as an episode of candidemia occurring at least 1 month after the apparent complete resolution of an infectious episode caused by the same Candida species. Results: A total of 48 unique profiles or diploid sequence types (DST) were observed, with 10 new sequence types (STs) and 32 new DSTs. DST 69 was the most common DST isolated. C. albicans clade 1 accounted for 56% of the collection, clade 3 and clade 8 for 10% each, clades 9 and 17 for 6.5% each, and clade 12 for 5%. Clade 2, clade 4, clade 16 and a singleton strain had 1 isolate each (1.5%). For ABC typing, 82% of the isolates were classified as type A, followed for 16.5% type B and 1.5% type C. All the patients’ strains related to persistent or recurrent candidemia but one showed the same MLST diploid sequence type (DST), ABC type and susceptibility profile to antifungals in the first and second samples. One patient with 7 samples collected sequentially over 10 days showed 3 distinct strains, well discriminated by MLST. One of the 3 strains recovered from this patient showed a single C. albicans isolate found in our total collection classified as clade 2, although clade 2 is commonly found worldwide. Conclusion: More than 50% of isolates from this study form a unique set of DSTs and clade 1 was responsible for 56% of the isolates. For ABC typing, 82% of the isolates were type A. To the best of our knowledge, this is the first study describing a blood stream infection with 3 distinct C. albicans strains in the same patient within a short period of time. / CNPq: GM/GD 142025-2005-4 / CNPq: SWE 200669/2007-9 / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações