Influenza virus infects the human population worldwide and causes acute respiratory disease. Currently, the primary strategy for preventing influenza is seasonal vaccination which is capable of providing protection in most populations. However, seasonal vaccines are less efficacious to immunize the elderly and poorly induce cross-protective immunity against the reassorted pandemic virus in the recipients. Neuraminidase (NA) inhibitors have also been widely utilized to limit disease outcome. The currently used NA inhibitors, nonetheless, generate the drug-resistant progeny viruses; moreover, they are unable to directly target the host immune responses which cause immunopathology in severe cases. Therefore, new strategies that provide more effective immunogenicity, cross-protection and therapies against influenza infection must be developed. In this thesis, the adjuvanticity of CpG oligodeoxynucleotide (ODN), type I interferon (IFN) and Complete Freund’s adjuvant (CFA) when coadministered with seasonal influenza vaccines in ferrets is presented. It has been found that the adjuvanted vaccines are efficacious to induce neutralizing antibody responses. Several common and distinguished signaling pathways leading to dendritic cell (DC) maturation and B cell activation have been discovered from their adjuvanticity. Furthermore, it was determined that seasonal H1N1 prior infection more effectively induces cross-protection against the newly emerged 2009 pandemic H1N1 (H1N1pdm) virus in ferrets and mice than the seasonal vaccines. The prior infection-induced cross-reactive but non-neutralizing antibodies are capable of providing substantial protection in the H1N1pdm infected mice when CD8 T cells are absent. Lastly, function of different vaccine adjuvants for controlling H1N1pdm infection in mice has been investigated. Unlike other adjuvants, CFA is capable of protecting the mice from infection through enhancement of Treg cell suppressive molecules galectin-1 and CTLA-4 which downregulated DC costimulation and effector T cell responses. Overall, this thesis has provided novel mechanistic insights for developing protective strategies against influenza infection.

Influenza virus infects the human population worldwide and causes acute respiratory disease. Currently, the primary strategy for preventing influenza is seasonal vaccination which is capable of providing protection in most populations. However, seasonal vaccines are less efficacious to immunize the elderly and poorly induce cross-protective immunity against the reassorted pandemic virus in the recipients. Neuraminidase (NA) inhibitors have also been widely utilized to limit disease outcome. The currently used NA inhibitors, nonetheless, generate the drug-resistant progeny viruses; moreover, they are unable to directly target the host immune responses which cause immunopathology in severe cases. Therefore, new strategies that provide more effective immunogenicity, cross-protection and therapies against influenza infection must be developed. In this thesis, the adjuvanticity of CpG oligodeoxynucleotide (ODN), type I interferon (IFN) and Complete Freund’s adjuvant (CFA) when coadministered with seasonal influenza vaccines in ferrets is presented. It has been found that the adjuvanted vaccines are efficacious to induce neutralizing antibody responses. Several common and distinguished signaling pathways leading to dendritic cell (DC) maturation and B cell activation have been discovered from their adjuvanticity. Furthermore, it was determined that seasonal H1N1 prior infection more effectively induces cross-protection against the newly emerged 2009 pandemic H1N1 (H1N1pdm) virus in ferrets and mice than the seasonal vaccines. The prior infection-induced cross-reactive but non-neutralizing antibodies are capable of providing substantial protection in the H1N1pdm infected mice when CD8 T cells are absent. Lastly, function of different vaccine adjuvants for controlling H1N1pdm infection in mice has been investigated. Unlike other adjuvants, CFA is capable of protecting the mice from infection through enhancement of Treg cell suppressive molecules galectin-1 and CTLA-4 which downregulated DC costimulation and effector T cell responses. Overall, this thesis has provided novel mechanistic insights for developing protective strategies against influenza infection.

Thesis (Ph.D.)--University of Alabama at Birmingham, 2007. / Title from first page of PDF file (viewed on June 26, 2009). Includes bibliographical references.

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:27Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-09-29 / Objetivo: investigar a participação da imunidade inata, através da análise de expressão dos genes TLR4 e MYD88, na disfunção precoce do enxerto renal em humanos. Métodos: A quantificação do mRNA foi realizada por PCR em tempo real, em biópsias pré-implantação do enxerto, na urina e no sangue (leucócitos) do primeiro dia póstransplante, em 75 transplantes (TX) com doador falecido (DF) e 18 transplantes com doador vivo (DV). Os desfechos considerados foram DGF (delayed graft function) e retardo na recuperação da função renal, independentemente de necessidade de diálise. Resultados: Em biópsias, os níveis de expressão de TLR4 e MyD88 foram maiores em rins de DF do que de DV; mas não se correlacionaram com disfunção precoce do enxerto; na urina, não diferiram entre DF e DV, e tenderam a ser mais elevados em casos de TX-DF com disfunção precoce do enxerto; no sangue, não diferiram entre DF e DV e foram mais baixos em casos com disfunção precoce. Conclusão: os resultados sugerem uma participação de TLR4 e MYD88 na patogenia das alterações que ocorrem em rins de DF e que baixos níveis de expressão gênica de TLR4 e MYD88, mensurados em amostra de leucócitos do sangue periférico colhida nas primeiras 24 horas pós-transplante, podem predizer retardo na recuperação da função do enxerto e, portanto, poderão vir a ter utilidade clínica no tratamento de receptores de transplante renal de doador falecido. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Introdução: As reações hansênicas caracterizam-se por eventos imunológicos agudos que ocorrem antes, durante ou após a Poliquimioterapia da hanseníase, sendo desencadeadas principalmente pela interação entre os antígenos do Mycobaterium leprae, PGL-1 e LAM, com os componentes da imunidade do hospedeiro, TLR1 e TLR2, que consequentemente induzem outras células a sintetizar citocinas que favorecem o controle ou disseminação bacilar. Objetivos: Estabelecer e quantificar as relações causais entre os antígenos de M. leprae (PGL-1 e LAM) e os receptores TLR1, TLR2 e seus efeitos na expressão de citocinas IFN-γ e IL-10 nas reações hansênicas. Material e métodos: Por meio da sorologia ELISA foi possível dosar os níveis de IgM anti-PGL-1 e IgG anti-LAM e com emprego da RT-qPCR procedeu-se a análise da expressão gênica de TLR1, TLR2, IFN-γ e IL-10 utilizando amostras do sangue de 17 pacientes com reação hansênica e 17 sem reação (caso-controle) que posteriormente foram subdivididos em 4 grupos. Na comparação entre as médias das variáveis nos diferentes grupos, utilizou-se a análise de variância (ANOVA) e na avaliação do grau de associação entre as principais variáveis, a matriz de correlação de Pearson. Ao final, elaborou-se a análise de trilha para verificar relações causais envolvendo os antígenos e receptores do tipo Toll tendo como efeitos direto e indireto a expressão de citocinas. Resultados: Do total de 34 pacientes, 76,4% (26/34) eram MB e 23,6% PB, sendo que 100% (17/17) dos casos reacionais eram MB e dos controles 53% (9/17). Analisando o grupo reacional, 41,2% (7/17) apresentaram reação tipo 1, enquanto que 58,8% (10/17) tiveram reação tipo 2, destacando que na reação tipo 1, 57,1% (4/7) dos pacientes tiveram reação antes do tratamento (downgrading), 14,2% (1/7) durante e 28,8% (2/7) após PQT. Na reação tipo 2, todos desenvolveram reação após alta. Os níveis de anti-PGl-1 estiveram elevados na reação tipo 1 e na reação tipo 2, com diferença significativa entre as médias desses grupos quando comparados aos controles PB (F=6,42; p=0,002). Em relação ao anti-LAM, esse esteve associado a reação do tipo 2, grupo cujas médias foram mais elevadas, e apresentaram diferenças significativas quando comparado aos demais grupos (F=15,27; p<0,001). Os grupos reacionais expressaram maiores níveis de mRNA de IL-10 (F=3,99; p=0,023), enquanto que o grupo controle expressou mais IFN-γ, especialmente aqueles PB (F=5,30; p=0,008). Não houve diferenças nos níveis de expressão de TLR1 e TLR2 nos diferentes grupos. No grupo reacional, a análise de trilha quantificou os efeitos diretos de anti-LAM (0,623) e anti-PGL-1 (0,605) sobre TLR2, maiores que o efeito residual desse modelo (0,255), indicando que esses marcadores antigênicos influenciaram somente a expressão de TLR2, que consequentemente associou-se a IL-10 nesse grupo. Um mecanismo oposto ocorreu no grupo controle, visto que, constatou-se uma via imunológica que regulou a expressão de IFN-γ dependente da associação entre TLR1-TLR2. Conclusão: Em conclusão, a análise de trilha permitiu demonstrar a relação causal entre antígenos, TLR2 e IL-10 nas reações hansênicas, que podem sofrer influência de falha no mecanismo de associação entre TLR1 e TLR2, objeto de futuras investigações. / Background: The leprosy reactions are acute immunological events that occur before, during or after MDT of leprosy, being triggered mainly by interaction between the antigens of Mycobacterium leprae, PGL-1 and LAM, with the components of immunity of the host, such as, TLR1 and TLR2, that induce cells to produce cytokines related to control or bacillary dissemination. Objectives: The main goal of this research is establish causal relations between antigens of M. leprae (PGL-1 and LAM) and receptors, TLR1, TLR2 and their effects on cytokines expression, IFN-γ and IL-10, in leprosy reactions. Methods: Through ELISA serology it was possible measure the levels of anti-PGL-1 IgM and anti-LAM IgG, and with the use of the RT-qPCR proceeded the analysis of gene expression of TLR1 TLR2, IFN-γ and IL-10 using blood samples from 17 reactional patients and 17 nonreactional patients (Case-control study) that posteriorly were subdivided into 4 groups. For comparison between means of the variables, it resorted to use of analysis of variance (ANOVA) and about the degree of association between the variables, it has applied the correlation matrix. At the end, it was used the path analysis to verify the causal relation evolving antigens and toll-like receptors, whose the direct and indirect effects were the cytokines expression. Results: Among 34 patients, 76.4% (26/34) were MB and 23.6% PB, being that 100% (17/17) of reactional cases were MB and among the controls 53% (9/17). Analyzing the reactional group, 41.2% (7/17) suffered type 1 reaction, while 58.8% (10/17) presented type 2 reaction, emphasizing that, among patients with type 1 reaction, 57.1% (4/7) had reaction before treatment (downgrading), 14.2% (1/7) during and 28.8% (2/7) after MDT, whereas all patients of the type 2 reaction group, developed this occurrence after treatment. The levels of anti-PGl-1 have been elevated in type 1 and type 2 reactions with significant differences between means of these groups when compared to PB controls (F=6.42; p=0.002). Regarding to anti-LAM, this has been associated to type 2 reaction, group whose the means were higher than others, and this data showed significant differences as well (F=15.27; p<0.001). The reactional groups expressed higher levels of IL-10 (F=3.99; p=0,023), whereas the control group produced high levels of IFN-γ, especially the PB control (F=5.30; p=0.008). There were no differences in the levels of TLR1 and TLR2 expression in the comparison among groups. In the reactional group, the path analysis quantified the direct effects of anti-LAM (0.623) e anti-PGL-1 (0.605) on TLR2, which were higher than the residual effect of this model (0.255), indicating that these antigenic markers influenced only the TLR2 expression, which consequently correlated with the IL-10 expression in this group. An opposing mechanism occurred in the control group, insofar as it was found an immunological pathway that regulated the IFN-γ expression dependent on TLR1 and TLR2 association. Conclusion: In conclusion, path analysis allowed to demonstrate the causal relation between TLR2 and IL-10 in leprosy reactions that may suffer influence of failure in the mechanism of association between TLR1 and TLR2, as such occurs in TLR2 polymorphisms, object of future investigations. / Tese (Doutorado)

Achyrocline satureoides (Lam) D.C., popularmente conhecida como \"marcela\", é utilizada popularmente para tratar diversas doenças, como mal estar gástrico e intestinal, inflamações, diabetes e outros. Como os mecanismos de ação do extrato de A. satureoides ainda não são conhecidos, o presente trabalho visou esclarecer os mecanismos antiinflamatórios do extrato bruto hidroalcoólico das inflorescências de A. satureoides, focando na migração e função fagocítica e microbicida de neutrófilos. Para tanto, o extrato hidroalcoólico foi administrado por gavage (50, 100 e 250mg/kg) em ratos Wistar, machos, adultos, e a inflamação foi induzida pela injeção do lipopolisacarídeo de E. coli (LPS; 2mL de solução; 500 &#181;g/mL em PBS) no tecido subcutâneo dorsal (modelo da bolsa de ar). Animais controles receberam volumes equivalentes de veículo do extrato e indometacina (30mg/kg). Foram quantificados o número de neutrófilos (câmara de Neubauer e esfregaços corados por Panótico) e a concentração de Leucotrieno B4 e CINC-1 (ELISA) no foco de lesão; a interação leucócito-endotélio em vênulas da microcirculação mesentérica após estímulo in situ pelo lipopolisacarídeo de E.coli (LPS; 30&#181;g/40&#181;L; por microscopia intravital); a expressão de moléculas de adesão e do toll-like receptor (TLR-4), além da quantificação do burst oxidativo (induzido pelo miristato-acetato de forbol - PMA) e fagocitose em neutrófilos circulantes (citometria de fluxo); análise histológica e quantificação dos marcadores hepáticos (AST, ALT e Gama-GT) e renais (uréia e creatinina) no plasma por espectrofotometria. Os resultados obtidos mostraram que o tratamento com o extrato reduziu o número de neutrófilos e a concentração de LTB4 e CINC-1 na bolsa de ar; reduziu a expressão de TLR4 pelos neutrófilos circulantes e a porcentagem de neutrófilos positivos para L-selectina e &#946;2-integrina; inibiu a adesão e o comportamento rolling de leucócitos ao endotélio microvascular; reduziu o burst induzido por PMA; aumentou o potencial de fagocitose, sem alterar o burst induzido por Staphylococcus aureus, não alterou a morfologia tecidual e a concentração sérica dos marcadores de atividade hepática e renal. Em conjunto, os dados obtidos mostram que dose, aparentemente, não tóxica do extrato de A. satureoides exerce efeito antiinflamatório in vivo frente ao LPS, quantificados pela redução da migração e pelas interferências nas atividades fagocítica e microbicida dos neutrófilos. / Achyrocline satureoides (Lam) D.C., popularly known as \"marcela\", is popularly used to treat several diseases, such as gastric and intestinal disorders, inflammation, diabetes and others. As the mechanisms of the extract of A. satureoides have not been elucidated, this study aimed to investigate the anti-inflammatory mechanisms of the crude hydroalcoholic extract of the flowers of A. satureoides, focusing on migration and phagocytic and microbicidal neutrophils function. The hydroalcoholic extract was administered by gavage (50, 100 and 250mg/kg) into male Wistar rats, adult, and inflammation was induced by injection of lipopolysaccharide E. coli (LPS; 2 mL of solution; 500&#181;g/mL in PBS) into the dorsal subcutaneous tissue (air pouch model). Control animals received equivalent volume of extract vehicle or indomethacin solution (30mg/kg). It was quantified the numbers of neutrophils (Neubauer chamber and stained smears by Panoptic) and concentrations of leukotriene B4 (LTB4) and CINC-1 (ELISA) in the focus of the injury; the leukocyte-endothelium interactions in mesenteric venules of the microcirculation after stimulation by LPS (30&#181;g/40&#181;L; intravital microscopy); the adhesion molecules and toll-like receptor (TLR-4) expressions and quantification of oxidative burst and phagocytosis in circulating neutrophils (flow cytometry); histological analysis and the hepatic markers (AST, ALT and gamma-GT) and kidney (urea and creatinine) concentrations in plasma by spectrophotometry. Data obtained showed that the treatment reduced the numbers of neutrophils and concentrations of LTB4 and CINC-1 in the subcutaneous tissue; reduced the TLR4 expression by circulating neutrophils and the number of &#946;2-integrin- and L-selectin-positive neutrophils; inhibited the leukocyte adhesion and the rolling behavior to vascular endothelium; reduced the burst evoked by PMA; increased the phagocytosis without changing the burst induced by Staphylococcus aureus; and did not alter the tissue morphology and concentration of hepatic and renal enzymes in the serum. Together, these data suggest that dose, apparently non-toxic, of extract of A. satureoides exerts anti-inflammatory effect in vivo, quantified by the reduced migration and by interference in the phagocytic and microbicidal activities of neutrophils.

Células apresentadoras de antígeno (APCs) controlam as respostas de linfócitos T por múltiplos mecanismos, que incluem a expressão de moléculas co-estimuladoras, a produção de citocinas e outros mediadores. Estes mecanismos exercem influência não só na proliferação, diferenciação e polarização dos linfócitos T, mas também interferem na sobrevivência destas células. No presente trabalho, foi demonstrado que fator(es) solúvel(eis) produzido(s) por APCs ativadas via receptores do tipo Toll (TLRs) suprimem a morte induzida por ativação (AICD) de linfócitos T. Este efeito foi observado em APCs não estimuladas, porém foi significativamente maior após estimulação das APCs com lipopolissacarídeo (LPS). Através do uso de diferentes camundongos nocautes, foi mostrado que a produção do fator protetor induzida por LPS é dependente da via de TLR4/MyD88 e independente de TLR2 e CD14. Este fator foi identificado como prostaglandina E2 (PGE2) e foi demonstrado que os sobrenadantes derivados de APC e a PGE2 sintética bloqueiam a expressão de CD95L em linfócitos T estimulados via TCR/CD3. A inibição da expressão de CD95L reduz tanto a AICD como a morte de macrófagos, alvos do ataque citotóxico dos linfócitos T ativados. Foi demonstrado também que, ao invés de bloquear a via do CD95, a PGE2 potencializa a morte induzida por anticorpos anti-CD95 agonistas. Os receptores de PGE2, EP2 e EP4, parecem ser os responsáveis por mediar os efeitos supressores da PGE2 na AICD, já que a estimulação farmacológica destes receptores mimetiza o efeito protetor da PGE2 e seus respectivos antagonistas interferem com a proteção conferida pelos sobrenadantes de APCs e pela PGE2 sintética. A ativação do EP2 e do EP4 age sinergicamente na ativação das vias dependentes da PKA e de EPAC, que contribuem para a inibição da AICD. Por fim, a ativação dos principais fatores de transcrição envolvidos com a expressão de CD95L (NFAT, AP-1 e NF-kB) não é bloqueada por PGE2. Por outro lado, PGE2 induziu a expressão de ICER, um repressor transcripcional, através da ativação de CREB. Em conjunto, estes resultados indicam que as APCs podem modular os níveis de expressão de CD95L através da secreção de PGE2 em resposta ao LPS, através de uma via dependente de TLR4 e MyD88, com conseqüências tanto para a morte de linfócitos T quanto para a sua própria sobrevivência. / Antigen-presenting cells (APCs) control T-cell responses by multiple mechanisms, including the expression of co-stimulatory molecules and the production of cytokines and other mediators that control T-cell proliferation, survival and differentiation. In this present work, it was demonstrated that soluble factor(s) produced by Toll-like receptor (TLR)-activated APCs suppress activation-induced cell death (AICD). This effect was observed in non-stimulated APCs, but it was significantly increased after lipopolysaccharide (LPS) treatment. Using different KO mice, it was found that the LPS-induced protective factor is dependent on TLR4/MyD88 and independent of TLR2 and CD14. The protective factor was identified as prostaglandin E2 (PGE2) and it was shown that both APC-derived supernatants and PGE2 prevented CD95L upregulation in T cells in response to TCR/CD3 stimulation, thereby avoiding both AICD and activated T cell killing of target macrophages. It was also demonstrated that instead of blocking CD95 pathway, PGE2 enhanced T cell death induced by agonistic anti-CD95 antibodies. The PGE2 receptors, EP2 and EP4, appear to be involved in AICD suppression since pharmacological stimulation of these receptors mimics the protective effect on T cells and their respective antagonists interfere with the protection induced by either APCs derived or synthetic PGE2. The engagement of EP2 and EP4 synergistically activates protein kinase A (PKA) and exchange protein directly activated by cAMP pathways to prevent AICD. Finally, the activation of the main transcription factors involved in CD95L expression (NFAT, AP-1 and NF-kB) is not avoided by PGE2. On the other hand, PGE2 induces the expression of ICER, a transcriptional repressor of CD95L, through CREB activation. Taken together, these results indicate that APCs can regulate T-cell levels of CD95L by releasing PGE2 in response to LPS through a TLR4/MyD88-dependent pathway, with consequences for both T cell and their own survival.

Malária é uma das principais causas de doença e morte no mundo, principalmente de crianças. É considerada a força de seleção evolucionária mais forte que se conhece na história recente do genoma humano. Além dos fatores ambientais e do próprio parasito, fatores genéticos do hospedeiro têm um papel fundamental tanto na suscetibilidade como na evolução clínica da infecção. O sistema imune inato reconhece os plasmódios através de um número limitado de receptores de reconhecimento padrão (PRRs) e inicia vários mecanismos de defesa que resultam no desenvolvimento de inflamação e resistência do hospedeiro à infecção. Mas, a eliminação completa do parasito requer respostas imunes adaptativas que são amplificadas pela ativação do sistema imune inato. As manifestações clínicas de malária são dependentes dos níveis de citocinas próinflamatórias circulantes produzidas, as quais em níveis altos contribuem para a imunopatologia da doença. O balanço entre respostas pró e antiinflamatórias dirigidas contra o parasito é considerado crítico para a proteção clínica, assim a resposta imune inata pode contribuir tanto para proteção da malária como para modular a resposta imune adaptativa. Neste estudo, nós investigamos polimorfismos de um único nucleotídeo (SNP) dos genes de três PRRs: TLR, MBL e CR1 de indivíduos infectados por Plasmodium e residentes em áreas endêmicas de malária no Brasil. Os SNPs TLR1 (I602S), TLR4 (D229G), TLR6 (S249P), TLR9 (T-1237C/ -1486C), MBL [exon 1 nos códons 52, 54, e 57 (MBL2*A ou D, A ou B e A ou C, respectivamente); na região do promotor na posição -221 (*X ou *Y); e na posição +4 da região não traduzida (*P ou *Q)] e CR-1(C5507G) foram determinados por PCR-RFLP. Nós observamos associações entre os polimorfismos TLR1 I602S, TLR6 S249P e da região não traduzida +4 (*Q) e manifestações clínicas de malária e entre os polimorfismos TLR9 T-1486C, TLR T-1237C, MBL*D (códon 52) e do diplótipo de produção insuficiente de MBL (XA+O/O) e parasitemias mais altas. Nenhuma associação foi observada entre o polimorfismo CR-1 C5507G e manifestações clínicas de malária ou com parasitemia. Ao analisarmos juntos os polimorfismos de MBL e TLR, observamos que indivíduos com diplótipo de produção suficiente de MBL (YA/YA+YA/XA+YA/O+XA/XA) TLR1 I602S tinham menos manifestações clínicas de malária e indivíduos com diplótipo de produção suficiente de MBL e não carreadores do alelo TLR9 -1486C tinham parasitemias mais baixas do que os indivíduos com diplótipo de produção insuficiente de MBL e carreadores dos alelos variantes de TLR1 I602S e TLR9 -1486C, respectivamente. Juntos, nossos dados indicam que polimorfismos do promotor de TLR-9 e os diplótipos de produção insuficiente de MBL (XA+O/O) devem de algum modo controlar o nível de parasitemia por plasmódios enquanto a deficiência de TLR1 parece predispor para a presença de manifestações clínicas de malária. Também, podemos sugerir que existe uma cooperação entre TLR1, TLR9 e MBL na ativação da resposta imune inata na malária. Estes achados genéticos devem contribuir para o entendimento da patogênese da malária e levantar uma questão potencialmente interessante que é digna de investigações posteriores em outras populações a fim de validar a contribuição genética destes loci na patogênese da malária / Malaria is one of the major causes of disease and death worldwide, mainly of children. It is also the strongest known force for evolutionary selection in the recent history of the human genome. Besides environmental and parasite factors, host genetic factors play a major role in determining both susceptibility to malaria and the course of infection. Innate immune mechanisms directed against Plasmodium parasites both contribute to protection from malaria and modulate adaptive immune responses. The innate immune system recognizes Plasmodium via a limited number of pattern-recognition receptors (PRRs) and initiates a broad spectrum of defense mechanisms that result in the development of inflammation and host resistance to infection. But, the complete control of the infection requires adaptive immune responses; and the innate immune system is also very efficient in instructing the cellular mediators of adaptive immunity to lead a powerful additional strike force against the parasite. Clinical malaria is characterized by high levels of circulating proinflammatory cytokines, which are thought to contribute to the immunopathology of the disease. The balance between pro- and anti-inflammatory responses toward the parasite is considered critical for clinical protection. The innate immune system initiates and thus sets the threshold of immune responses. In this study, we investigated single nucleotide polymorphisms (SNP) in the genes of three PRRs: TLR, MBL and CR1 in Plasmodium-infected individuals living in endemic areas of Brazil. The SNPs TLR1 (I602S), TLR4 (D229G), TLR6 (S249P), TLR9 (T-1237C/ -1486C), MBL [in the coding sequence of exon 1 at codons 52, 54, and 57 (MBL2*A or D, A or B, and A or C, respectively); in the promoter region at position -221 (*X or *Y); and in the untranslated sequence at position +4 (*P or *Q)] and CR-1(C5507G) were determined by PCR-RFLP. We observed associations of the TLR1 I602S, TLR6 S249P and untranslated sequence at position +4 MBL (*Q) variants with clinical manifestations of malaria and of the TLR9 T-1486C, TLR9 T-1237C, MBL2*D and MBL-insufficient diplotype (XA+O/O) with higher parasitemias. No association was observed to the CR-1 C5507G ) and clinical manifestations of malaria or parasitemia. Also, we observed that individuals with MBLsufficient haplotype (YA/YA+YA/XA+YA/O+XA/XA) and not bearing the allele TLR1 I602S had less clinical manifestations of malaria and individuals with MBL-sufficient haplotype and not bearing TLR9 -1486C had lower parasitemias when compared to individuals with MBL-insufficient diplotype and bearing the variant alleles TLR1 I602S and TLR9 -1486C, respectively. Altogether, our data indicate that TLR-9 promoter and MBL-insufficient haplotype (XA+O/O) polymorphisms to some extent may control the level of Plasmodium parasitemia while TLR1 deficiency seems to predispose to mild malaria. Also, they could suggest cooperation among TLR1, TLR9 and MBL in the immune response against malaria. These genetic findings may contribute to the understanding of the pathogenesis of malaria and raise a potentially interesting issue that is worthy of further investigation in other population in order to validate the genetics contribution of these loci to the pathogenesis of malaria

Orientador: Marcio Alberto Torsoni / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-22T22:25:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Santos_GustavoAparecidodos_M.pdf: 1529206 bytes, checksum: e9aae5229598f14274aea766dccadceb (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: A hipoglicemia endotóxica tem papel importante na sobrevivência de ratos e pacientes com sepse. O hipotálamo e uma importante área no sistema nervoso central que regula a homeostase energética. Estudos recentes têm demonstrado à importante papel da proteína quinase ativada por AMP (AMPK) no controle da homeostase glicêmica, sendo um importante sensor energético ativado quando a uma diminuição de disponibilidade energética como é observado na hipoglicemia, e por controlar importantes estímulos que visão restabelecer a glicemia como a modulação da produção de glicose hepática. Até o momento não existem estudos que investiguem o papel da AMPK hipotalâmica na endotoxemia e na hipoglicemia associada a essa enfermidade. Por isso o objetivo do nosso estudo foi o de avaliar a participação das citocinas inflamatórias e da AMPK hipotalâmica na redução da resposta contrarregulatória hepática durante a endotoxemia promovida por LPS. Para isso foram utilizados camundongos (Swiss) e camundongos com mutação no receptor TLR4 (C3H/HeJ) e seus controles selvagens (Wild type (C3H/HeN)) ambos os animais receberam LPS (1mg/Kg) ou salina intraperitonealmente ou/e AICAR por via intracerebroventricular e após os tempos pré-estabelecidos obtivemos os resultados que mostram que a administração periférica de LPS induz o aumento nas citocinas TNF? e IL?, ocorreu a desfosforilação da AMPK hipotalâmica e menor fosforilação da sua proteína alvo a ACC se comparado ao grupo controle; desfosforilação da AMPK hepática e ACC hepática, aumento da fosforilação da STAT3 hipotalâmica e hepática, aumento da fosforilação a TAK1 hipotalâmica e quantidade da MyD88 hipotalâmica proteínas da via do TLR4 se comparado ao grupo controle, também foi observado aumento na fosforilação da JNK hepática, redução da ingestão alimentar, redução da glicemia basal e um possível aumento na captação de glicose observada pelo teste de tolerância à glicose nos animais que receberam LPS, também foi observado à diminuição da quantidade e expressão da proteína PEPCK e diminuição da G6Pase resultado que corroborou o resultado da diminuição da produção de glicose hepática observada no teste de tolerância ao piruvato (PTT). A redução na glicemia nos animais nos gerou uma hipótese de que esse efeito pode ter a participação da insulina onde observamos um significativo aumento nos níveis séricos deste hormônio, a ativação farmacológica da AMPK hipotalâmica reduziu o efeito hipoglicemiante do LPS, onde também observamos que a ativação farmacológica da AMPK inibiu a diminuição das proteínas PEPCK e G6Pase deflagrado pelo LPS sugerindo que a um controle hipotalâmico através da AMPK sobre a secreção de glicose. Nos animais mutantes do receptor TLR4 (C3H/HeJ) não houve diminuição da glicemia e desfosforilação da AMPK hipotalâmica e diminuição da PEPCK hepática como observamos nos animais Wild type (C3H/HeN). Mostrando que o receptor TLR4 possui uma atividade intrínseca na indução à hipoglicemia e desfosforilação da AMPK. Os dados do nosso trabalho mostram que a endotoxemia ocasionada pela administração de LPS exerce uma importante modulação da ação da AMPK hipotalâmica, modulação negativa da ingestão e glicemia plasmática, alem de inibir a produção de glicose e expressão e quantidades de proteínas neoglicogênicas e ativação de vias inflamatórias mostrando que a sepse e/ou endotoxemia por LPS leva a severos danos na homeostase glicêmica, contudo também mostramos que a ativação da AMPK hipotalâmica consegue minimizar os efeitos oriundos da endotoxemia, mostrando que mecanismos que atuem sobre a ativação da AMPK hipotalâmica podem contribuir para o tratamento da Sepse/endotoxemia / Abstract: Endotoxic hypoglycaemia has an important role in the survival rates of septic patients. Currently, the hypothalamus is the main area of the brain that regulates glycemic homeostasis. Previous studies have demonstrated that hypothalamic AMP-activated protein kinase (AMPK) activity is sufficient for nutrient-sensing mechanisms to modulate glucose production. However, the role of hypothalamic AMPK in hypoglycaemia associated with endotoxemia is unknown. The aims of this study were to examine hypothalamic AMPK dephosphorylation in lipopolysaccharide (LPS) treated mice and to determine whether pharmacological AMPK activation could reduce the effects of endotoxemia on the liver metabolism of glucose. Fasted Swiss mice and C3H/HeJ (TLR4-receptor mutant) and C3H/HeN (wild type) mices received intraperitoneal injections of LPS (1mg/kg). LPS-treated mice showed reduced food intake and diminished basal glycemia, increased serum TNF? and IL1? levels and hypothalamic p-TAK and TLR4/MyD88 association. These effects were accompanied by hypothalamic AMPK/ACC dephosphorylation and reduction of glucose production in the liver. Interestingly, the LPS treated mice liver also showed diminished expression of PEPCK/G6Pase and reduction in p-FOXO1, p-AMPK, p- STAT3 and p-JNK level. In contrast, the pharmacological hypothalamic AMPK activation blocked the effects of LPS on the hypothalamic AMPK phosphorylation, liver PEPCK expression and glucose production. Furthermore, the effects of LPS were TLR4-dependent because no effect on hypothalamic AMPK phosphorylation, liver PEPCK expression and basal glycemia was detected in C3H/HeJ (TLR4- receptor mutant) mice. These results suggest that hypothalamic AMPK activity may be an important pharmacological target to control glucose homeostasis during endotoxemia / Mestrado / Clinica Medica / Mestre em Ciências

De par sa capacité à détecter les microorganismes et à mettre en place une défense anti-infectieuse rapide, l’immunité innée représente la première ligne de défense de l’hôte. La réponse immunitaire innée est déclenchée par des motifs microbiens moléculaires universels et conservés reconnus par des récepteurs innés parmi lesquels les "Toll-like Receptors" (TLR). L’activation de ces récepteurs induit une inflammation locale et une réponse antimicrobienne adaptée au pathogène. Ces propriétés biologiques ont permis de d’envisager l’utilisation des TLR comme cible thérapeutique antiinfectieuse. Dans ce contexte il a été montré que la flagelline, le composant majeur des flagelles bactériens et le seul agoniste de TLR5 décrit à ce jour, possédait des propriétés anti-infectieuses. Des études chez la souris ont montré que la flagelline induisait une forte production, par des cellules lymphoïdes innées, d’IL-22, une cytokine impliquées dans la protection des muqueuses. Par ailleurs, la forte expression de TLR5 par les cellules épithéliales laisse présager un rôle de ces cellules dans les propriétés anti-infectieuses de la flagelline. Toutefois, les mécanismes moléculaires et cellulaires effecteurs responsables des effets antimicrobiens de l’agoniste de TLR5 restent à définir.Au cours de ce travail de thèse, nous avons étudié les capacités anti-infectieuses de la flagelline dans deux modèles infectieux chez la souris. Nous avons tout d’abord montré que l’administration systémique de flagelline, en prophylaxie c’est-à-dire préalablement au challenge infectieux, permettait de protéger d’une infection intestinale par Yersinia pseudotuberculosis. La protection induite par la flagelline est observable lors d’une infection par la voie muqueuse mais est absente lors d’un challenge infectieux par la voie systémique, démontrant ainsi le caractère muqueux de la protection. L’effet protecteur de la flagelline dans notre modèle est dépendant de l’expression de TLR5 et indépendant de l’IL-22. Cette étude suggère donc un mécanisme original de protection médié par la flagelline, indépendant de l’IL-22.Nous avons également analysé la capacité anti-infectieuse de la flagelline dans un modèle murin d’infection respiratoire à Streptococcus pneumoniae. Nous avons notamment montré que la flagelline pouvait être utilisée en thérapeutique lorsqu’elle était associée à un antibiotique. En effet, l’association d’amoxicilline ou de co-trimoxazole avec la flagelline (voie intranasale) a permis de protéger des souris infectées par une dose létale de S. pneumoniae comparativement à l’antibiotique seul. L’efficacité de cette thérapie est dépendante de l’activation de TLR5 et est associée à une infiltration pulmonaire importante de polynucléaires neutrophiles. Ce traitement combinatoire améliore également la protection dans un modèle de surinfection pneumococcique post-grippale. Ces résultats montrent que la combinaison agoniste de TLR5/antibiotique améliore la réponse anti-infectieuse pulmonaire et permettent d’envisager de nouvelles stratégies antibactériennes dans le cas d’infections où les antibiotiques montrent leurs limites (infections nosocomiales, bactéries multirésistantes…). / With its ability to sense micro-organisms and to induce a rapid defense against infections, innate immunity represents the first line of host’s defense. The innate immune response is triggered by universal and conserved microbial molecular patterns recognized by innate receptors including the Toll-like receptors (TLRs). Activation of these receptors induces local inflammation and antimicrobial response against pathogens. These biological properties have allowed considering the use of TLR as anti-infective therapeutic target. In this context it has been shown that flagellin, the major component of bacterial flagella and the agonist of TLR5, had anti-infectious properties. It was shown that flagellin induces a strong production by innate lymphoid cells of IL-22, a cytokine involved in the protection of mucosa. Furthermore, the strong expression of TLR5 by epithelial cells suggests a role for these cells in the anti-infectious properties of flagellin. However, the molecular and cellular mechanisms responsible for the antimicrobial effects of the TLR5 agonist remained to be defined.In this thesis, we studied the anti-infectious properties of flagellin in two infectious murine models. We first showed that systemic administration of flagellin, prior to infectious challenge, protect against an intestinal infection with Yersinia pseudotuberculosis. The protection induced by flagellin is observable upon infection by mucosal route but is absent during a challenge by the systemic route, thus demonstrating the role of the mucosa for the protection. The anti-bacterial effect in this model is dependent on the expression of TLR5 and independent of the innate lymphoid cells’ IL-22 production. This study suggests a novel mechanism of flagellin-mediated protection, independent of the IL-22.We also analyzed the anti-infectious abilities of flagellin in a murine model of respiratory infection by Streptococcus pneumoniae. In particular, we showed that flagellin could be used in therapy when combined to an antibiotic. Indeed, the combination of amoxicillin or co-trimoxazole with flagellin protected mice infected with a lethal dose of S. pneumoniae compared to antibiotic standalone. The effectiveness of this therapy was dependent on the activation of TLR5 and was associated with pulmonary infiltration of neutrophils. This combinatory treatment also improved the protection in a model of post-influenza pneumococcal superinfection. These results show that the combination of TLR5 agonist / antibiotic ameliorates pulmonary anti-infectious response and allow to consider new antibacterial strategies against infections when antibiotics reach their limits (nosocomial infections, multiresistant bacteria ...).